Infravörös és C spektroszkópia a fehérjeszerkezet vizsgáatában Mi történhet, ha egy mintát fénnye viágítunk meg? megviágító fény (enyet fény) minta átjutott fény Abszorpció UV-VIS, IR, C spektr. Smeer Lászó kibocsátott fény Lumineszcencia (Fuoreszcencia és Foszforeszcencia) szórt fény Raman és Rayeigh szórás Abszorpciós és emissziós spektroszkópia Az átjutott vagy kibocsátott fény anaizáása a huámhossz függvényében. Információ: atomok, moekuák azonosítása, moekuáris szintű szerkezetvátozások (konformációvátozások) detektáása, koncentráció meghatározás Miért nye e i. bocsát ki fényt egy atom v. moekua? Energiaátmenet: d. abonski diagram Gerjesztett eektron- és vibrációs áapot* Gerjesztett eektronáapot Vibrációsan gerjesztett á.* Aapáapot S S 0 E *csak moekuákná!
E Miért nye e i. bocsát ki fényt egy atom v. moekua? S S 0 UV-VIS IR abszorpció Raman Fuoreszcencia Foszforeszcencia T ΔEhfhc/λ 0 0 Abszorpciós spektroszkópia Abszorpciós törvény x dx x +d d d dx d μdx d μdx d μdx n μx + const 0 e μx Abszorpciós spektroszkópia Lambert-Beer törvény Evi aapja: abszorpciós törvény: 0 e -μx aho μ(anyag,c,λ) Lambert-Beer törvény: A g 0 ε ( λ) cx spektrum: A(λ) mérés: spektrofotométer referencia odat ( 0 ) információ: azonosítás koncentráció. Infravörös spektroszkópia Infravörös fény: λ800 nm - mm közép infra tartomány:,5-50 μm abszorpciós spektroszkópia az enyet infravörös sugárzás moekuarezgéseket ket érzékeny a moekuaszerkezetre speciáis detektáás: FT spektrométer (FTIR spektroszkópia)
Az infravörös spektrum mérése: Fourier transzformációs spektrométer fényforrás tk 6.7 ábra tk 6.8 ábra FTIR eve részetesen Fourier transzformáció x/ xretardáció E i const (-cos(πx/λ)) C +const cos(πx/λ) AC 0 n 0 i cos(πx/ λ i d 0( λ) AC cos(πx/ λ) dλ dλ ) n Ai sin( ωit) E A sin(ωt) E 0 da sin( ωt) dω dω Egy f(t) függvény Fourier transzformátja a g(x) fügvény: F( f ( t)) F πiνt f ( t) e dt g( ν ) A Fourier transzformáció inverze: πiνt ( g( ν )) g( x) e dν f ( t)
A Fourier transzformáció szemétetése Fourier transzformáció inverz Fourier transzformáció A spektrum számoása a Fourier transzformációs spektrométerben Az interferométeren keresztüjutott sugárzás: 0 d 0( λ) AC cos(πx/ λ) dλ dλ éppen a d ( 0 λ) mennyiség cosinus transzformátja dλ d A spektrum a ( 0 λ) -nek a mintán vaó dλ áthaadása után megmaradt részének és a d ( 0 λ) dλ -nak a hányadosa (transzmissziós spektrum) Micheson interferométer áó tükör féigáteresztő tükör apertúra fényforrás mozgó tükör FT mintatér fényforrás detektor minta
Moekuarezgések Az eektronok könnyűek, gyorsan követik az atommag mozgását, ezért az atommagok rezgéseit az eektronok nem befoyásoják. A kasszikus fizikai eírásban az atommagok közti kötést, egy rugóva vesszük figyeembe. Moekuarezgések: kétatomos moekua a középiskoábó ismert: m f π m Δ Δ m m Δ Δ + + m m m Δ F F F / /
m + m tehát:, amit az m f π m egyenetbe heyettesítve a rezgési frekvencia: ( m + m) f π mm az m mm mennyiséget redukát redukát m + m tömegnek is nevezik, ezze a frekvencia: f π m redukát A huámhossz: c mredukát λ πc f Az infravörös spektroszkópiában a λ reciprokát, a huámszámot (ν) hasznáják: ν ν: hány huám fér e egységnyi hosszúságon? [cm - ] λ πc m redukát Péda: CO A mért rezgési huámszám: ν 43 cm - λ4,67μm f 6,43 0 3 Hz m C 0-6 kg, m O,7 0-6 875 N/m kg Ha ν ismert, számoható ha ismert, ν számoható Kvantummechanikai eírás Kasszikus fizikai rezgések és energianívók kapcsoata Kasszikus kép Energianívók E ψ n3 E ψ n3 n n n n0 x E hf ( n + ) n n 0,,. f π m redukát rezonancia az f frekvenciájú fénnye ΔE u.a.!!! ΔEhf n n0 x
A rezgési frekvencia függése a tömegtő és a kötéserősségtő Sokatomos moekuák rezgései Tömeg: Infravörös rezgési frekvenciák (cm - ) B-H 400 A-H 750 C-H 3000 Si-H 50 Ge-H 070 N-H 3400 P-H 350 As-H 50 O-H 3600 S-H 570 Se-H 300 F-H 4000 C-H 890 Br-H 650 Kötéserősség: C-N: 00 cm -, CN: 660 cm -, C N: 0 cm -. N atomos moekua: 3N szabadsági fok, 3-3 a tejes moekua transzációja i. rotációja 3N-6 rezgési szabadsági fok (ineáris moekuákná csak 3N-5) normárezgések normákoordináták Víz (O-H): 3600 > nehézvíz: 600 cm - Normákoordináták A kétatomos moekua pédáján bemutatva: x c x O x O Normárezgések Minden atom ugyanazza a frekvenciáva, fázissa, de küönböző ampitúdóva és irányban rezeg. P. víz: m C m O x C Átaános esetben 3N dimenziós koordinátarendszer forgatása Lineáris transzformáció (mátrixműveet) A normá módusok nem hatnak köcsön egymássa.
A víz normárezgései Néhány tipikus rezgési frekvencia Ezek nem rezgések, hanem gátot forgások (ibráció) Péda: Formadehid Anaitikai akamazások szintézis: közti és végtermék azonosítás szerkezet bizonyítás metaboit kimutatás gyógyszereenőrzés (tisztaság vizsgáat) Megj.: Lambert-Beer tv. itt is igaz, koncentráció meghatározás is ehetséges. forrás: www.spectroscopynow.com
Moekua azonosítás moekua azonosítás C 4 H 8 O Fingerprint (ujjenyomat) tartomány forrás: www.spectroscopynow.com Makromoekuák rezgései Az N-metiacetamid mint a fehérjeánc gerincének modeje Gobáis rezgések (bonyoutak) Lokaizát rezgések, p: CH rezgések a ipidekben amid rezgések a fehérjékben (acetamid rezgések)
Fehérjék rezgési spektroszkópiája A víz abszorpciós spektruma Gerinc: amid rezgések konformáció (másodagos szerkezet) H/ csere, (harmadagos szerkezet) Odaáncok köcsönhatások más moekuákka p Ca + kötés Fontos technikai megj.: nehézvíz ( O) Víz és nehézvíz spektrumok A fehérjék amid rezgései Bandekar BBA 0 (99) 3
A fehérjék amid rezgései Az amid I vibráció és a másodagos szerkezet amid I CO rezgés H-híd miatt konformációérzékeny amid II N-H nyújtási rezgés H- cserére érzékeny Szerkezet kompaktsága (harmadagos szerk.) β emez α heix A másodagos szerkezeti eemekhez tartozó jeegzetes amid I je Intramoekuáris szerkezet β-emez rendezeten α-héix Intermoekuáris kücsönhatás Intermoekuáris antiparae β-emez 600 700 ν cm - 600 700 ν cm -
Az amid I sáv átapoó komponensek összege: dekovoúció Akamazások ipid fázisátaakuás fehérjedenaturáció A A ν ν Fourier öndekonvoúció Vonaak szétváasztása vonakeskenyítésse Meersman és mtsai. Biophys. BPTI bovine pancreatic trypsin inhibitor aggregáció Miogobin (Nyomáscikus)
Ca + kötés Parvabumin aggregáció Absorbance 8 C 43.8 C 67.5 C 80.7 C 90 C 30 C 600 580 560 540 Wavenumber (cm - ) 50 C Cirkuáris dikroizmus spektroszkópia Síkban poáros: Poáros fény Cirkuárisan poáros
in. po jobbra+ bara cirk. po. A jobbra és bara forgó cirkuárisan poarizát fénysugarakka a kiráis moekuák küönbözőképpen hatnak köcsön: ΔAA L -A R Δε c x Δεε L -ε R Eipticitás: θ tg θ b/a b a θ.303 ( A ) 80 L AR 4 π Lambert-Beer tv.: θ c θm (θ m : moáris eipticitás) [deg] A C spektrométer vázata C és a fehérjeszerkezet Figure 4 The far-uv C spectra associated with various types of secondary structure eements in proteins. Red: α-heix; bue: antiparae β-sheet; green: type I β-turn; orange: irreguar structure. (ata taken from the Encycopedia of Life Sciences)
A) triosephosphate isomerase B) hen egg ysozyme C) myogobin ) chymotrypsin red:heix. green:strand, yeow:other. The Structure and C spectrum of Subtiisin heix sheet coi 57.9 6. 5.85 Vége