IN SITU HIBRIDIZÁCIÓS HISZTOKÉMIA (ISHH)

IN SITU HIBRIDIZÁCIÓS HISZTOKÉMIA (ISHH) Dobolyi Árpád SE Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet

AZ ISHH ÖSSZEHASONLÍTÁSA A FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓVAL (FISH) RNS és nem DNS vizsgálata Tipikusan radioaktiv vagy kromogén jel, nem pedig fluoreszcens szignál Kromoszomális rendellenességek kimutatása Géntérképezés, genetikai betegségek diagnózisa A kromatin organizációjának és struktúrájának tanulmányozása Tanulmányozhatóak az expresszió mértékének változásai meghatározott sejttípusokban

AZ IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ ELVE

AZ ISHH FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI Az RNS helyének a meghatározása a SZÖVETBEN Messenger RNS eloszlásának vizsgálatával megcélozható egy gén expressziós mintázatának leírása Vizsgálhatóak dupla jelöléssel az illető gént kifejező sejtek ismert markerei Tanulmányozhatóak az expresszió mértékének változásai meghatározott sejttípusokban

MODELLRENDSZEREK AZ ISHH FELHASZNÁLÁSÁNAK BEMUTATÁSÁRA I. TRANSFORMÁLÓ NÖVEKEDÉSI FAKTOR-BETA (TGF-b)

MODELLRENDSZEREK AZ ISHH FELHASZNÁLÁSÁNAK BEMUTATÁSÁRA II. TIP39 ÉS AMYLIN ANYAI NEUROPEPTIDEK

TIP39 NEURONOK A POSTERIOR TALAMUSZ SUBPARAFASCICULÁRIS TERÜLETÉN

ISHH ÖSSZEHASONLÍTÁSA MICRODISSZEKCIÓT KÖVETŐ RT-PCR ANALÍZISSEL MICROPUNCH TECHNIKA TIP39 - VALÓS IDEJŰ RT-PCR 6 5 4 3 2 subparafascicular area m edial paralem niscal n. lateral hypothalamus medial hypothalamus septum pituitary spinal cord no DNA control 1 0 20 25 30 35 40 cycle number

TIP39 NEURONOK A POSTERIOR TALAMUSZ SUBPARAFASCICULÁRIS TERÜLETÉN

ISHH ÖSSZEHASONLÍTÁSA IMMUNFESTÉSSEL TIP39 SUBPARAFASCICULAR AREA immunofluorescence MEDIAL PARALEMNISCAL NUCLEUS DAB immunfestés

ISHH KIVITELEZÉSE DNS proba előállítása Szövet speciális előkészítése Jelzett (pl. radioaktív) antisense RNS proba készítése Az RNS probával hibridizáció A nem-specifikusan kötődött proba lemosása Autoradiográfiás analízis

DNS PROBA ELKÉSZÍTÉSE I. HIBRIDIZÁCIÓS PROBÁK TERVEZÉSE TIP39 IN SITU HIBRIDIZÁCIÓJÁHOZ Két, nem átfedő probe és egy maximális hosszúságú antisense probe

DNS PROBA ELKÉSZÍTÉSE II. T7 / T3 (Sp6) PROMOTER PROBÁBA ÉPÍTÉSE A próbának kiválasztott PCR terméket plazmidba transzformáljuk. Megfelelő plazmidot választva (lásd pl. a PCRII- TOPO plazmid az ábrán), az eleve tartalmaz T7 és T3 (Sp6) promoterszekvenciát. Így maga a plazmid használható DNS probának (templátnak).

DNS PROBA ELKÉSZÍTÉSE III. T7 / T3 PROMOTER PROBE-BA ÉPÍTÉSE PCR-RAL Elkerülhetjük a plazmidból rárakódó felesleges darabokat, ha a plazmidot egy olyan PCR reakcióban használjuk templátnak, ahol a primer az eredeti primerszekvenciánk kiegészítve a T7 / T3 szekvenciákkal. Ekkor ezen PCR reakció terméke lesz a DNS probe (templát), amire a primer vitte fel a T7 / T3 szekvenciákat.

JELZETT HIBRIDIZÁCIÓS PROBA ELŐÁLLÍTÁSA IN VITRO TRANSZKRIPCIÓVAL Általában RNS probe-ot használunk (és nem DNS-t) in situ hibridizációs hisztokémiához, mert jobb a jel/zaj arány. Kvantitatív kiértékeléshez szinte mindig radioaktívan jelzett probát használunk. A jelzett RNS probát in vitro transzkripcióval állítjuk elő 35 S-UTP jelenlétében a DNS probe-ról mint templátról. Ehhez általában a T7 vagy T3 (Sp6) bacteriofág RNS polimerázát használjuk. A DNS proba (templát) kell, hogy tartalmazza a T7 vagy T3 (Sp6) RNS polimeráz promoter szekvenciáit, hogy el tudjon indulni az enzim.

ISHH KIVITELEZÉSE DNS proba előállítása Jelzett (pl. radioaktív) antisense RNS proba készítése Szövet speciális előkészítése Az RNS probával hibridizáció A nem-specifikusan kötődött proba lemosása Autoradiográfiás analízis

SZÖVET ELŐKÉSZÍTÉSE Fixálás nélkül, frissen kivett szövet fagyasztása és tárolása -80 o C-n. 12 mm vastag metszetek vágása kriosztáton és azonnal tárgylemezre vétele. Metszetek szárítása majd tárolása -80 o C-n. Felolvasztás és fixálás paraformaldehidben. Acetilálás a nem-specifikus RNS kötődés csökkentése és szöveti RNáz aktivitás eliminálása céljából. Zsírtalanítás felszálló alkohol soron és szárítás.

HIBRIDIZÁCIÓ Hibridizációs elegyet készítünk, ami tartalmazza a következőket: radioaktív RNS proba, formamid, dextrán szulfát, nukleinsav keverék (lazac spermium DNS, élesztő trns és total RNS), Denhardt oldat (Ficoll, polivinil pirrolidin, bovine serum albumin), nátrium dodecilszulfát, dithiothreitol, nátrium-tioszulfát, EDTA és TRIS puffer. A hibridizációs eleggyel lefedjük a metszeteket tartalmazó tárgylemezeket. Nedveskamrában inkubálunk 50-60 o C-on egy éjszakát.

NEM SPECIFIKUSAN KÖTŐDŐTT JELZETT PROBA KIMOSÁSA Sokszoros öblítés pufferban. Inkubálás RNáz A-ban 37 o C-on 30 percig. Az RNáz A elbontja az egyszálú (nem hibridizálódott RNS-t). Mosás egyre csökkenő koncentrációjú pufferban, ami egyre jobban kedvez a gyengén kötődött RNS eltávolításának. Inkubálás 60-70 o C-on 30-60 percig alacsony koncentrációjú pufferban. Metszetek víztelenítése felszálló alkohol soron.

RADIOAKTÍV JEL ELŐHÍVÁSA I. FILM Metszeteket a 35 S bomlásának energiájára érzékeny filmhez (vagy foszfo-imager lemezhez) nyomjuk 3-5 napra. A film előhívása után azon kis nagyításban látszik hol van a metszeten RNS. A filmen denzitometriás analízist végezhetünk, így mérhető az adott területen expresszálódó RNS összmennyisége.

AZ OREXIN mrns FILM AUTORADIOGRÁFIÁS KÉPE

RADIOAKTÍV JEL ELŐHÍVÁSA II. EMULZIÓ A metszeteket a 35 S bomlásának energiájára érzékeny autoradiográfiás emulzióba mártjuk, szárítjuk, és 1-8 hétig tároljuk. A tárgylemezeket előhívjuk és megszárítjuk. Háttérfestést végzünk (pl. Giemsa festékkel), és lefedjük a tárgylemezeket. Lekaparjuk a tárgylemezek hátoldaláról az emulziót és mikroszkóppal kiértékeljük a metszeteket.

SPECIFICITY OF TGFbeta3 mrna LABELING: THE ABSENCE OF SIGNAL WITH A SENSE PROBE TGFbeta 3 probe A TGFbeta 3 sense probe A

DISTRIBUTION OF TGFbeta-3 mrna IN THE THALAMUS WITH 2 NON-OVERLAPPING PROBES TGFbeta-3 probe A TGFbeta-3 probe B

AZ ISHH FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI Az RNS helyének a meghatározása a szövetben Messenger RNS eloszlásának vizsgálatával megcélozható egy gén expressziós mintázatának leírása Tanulmányozható az expresszió mértékének változása Vizsgálhatóak dupla jelöléssel az illető gént kifejező sejtek ismert markerei

EXAMPLES OF LTBP-3 EXPRESSION

DISTRIBUTION OF TGFbetas AND LTBPs I.

AZ ISHH FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI Az RNS helyének a meghatározása a szövetben Messenger RNS eloszlásának vizsgálatával megcélozható egy gén expressziós mintázatának leírása Tanulmányozható az expresszió mértékének változása Vizsgálhatóak dupla jelöléssel az illető gént kifejező sejtek ismert markerei

EMULZIÓS AUTORADIOGRÁFIÁS METSZETEK KVANTITATÍV KIÉRTÉKELÉSE I. Kis nagyítású fényképen sötét látótérben denzitometriás analízist végzünk. Ez arányos az egy területen levő összes RNS mennyiségével. TIP39 mrns a subparafasciculáris területen különböző életkorban

EMULZIÓS AUTORADIOGRÁFIÁS METSZETEK KVANTITATÍV KIÉRTÉKELÉSE II. TIP39 mrns-t tartalmazó sejtek a subparafasciculáris területen Nagy nagyítású képen megszámuljuk az egy sejt felett levő pontok átlagos számát. Ez arányos az egy sejtben levő RNS mennyiségével.

KVANTÁLÁS: AMYLIN mrns EXPRESSZIÓ A PREOPTIKUS TERÜLETEN in situ hybridization, bright field luxol fast blue-cresyl violet staining

KVANTÁLÁS: AMYLIN mrns SZINTEK VÁLTOZÁSA ANYAPATKÁNYOKBAN

KVANTÁLÁS: AMYLIN mrns SZINTEK VÁLTOZÁSA ANYAPATKÁNYOKBAN Amylin mrns-t kifejező sejtek száma Amylin mrns mennyisége az amylint tartalmazó sejtekben

TIP39 mrns INDUKCIÓJA ANYAPATKÁNYOKBAN KONTROLL NŐSTÉNY LAKTÁLÓ ANYA KÖLYKÉTŐL ELZÁRT ANYA

TIP39 mrns SZINTEK A POSTERIOR TALAMUSZBAN RT-PCR Periventricular gray (PVG) Posterior intralaminar complex (PIL)

AZ ISHH FELHASZNÁLÁSI LEHETŐSÉGEI Az RNS helyének a meghatározása a szövetben Messenger RNS eloszlásának vizsgálatával megcélozható egy gén expressziós mintázatának leírása Tanulmányozható az expresszió mértékének változása Vizsgálhatóak dupla jelöléssel az illető gént kifejező sejtek ismert markerei

NEMRÁDIOAKTÍV ISHH: RNS PRÓBA KÉSZÍTÉSE REPORTER CSOPORTOKKAL

DUPLA IN SITU HIBRIDIZÁCIÓS HISZTOKÉMIA Hibridizáció radioaktív és nem radioaktív RNS próba keverékével A nem radioaktív RNS próba vizualizálása immunfestés felhasználásával (pl. anti-dig ellenanyag használatával)

LTBP-2 mrns EXPRESSZIÓ A LATERÁLIS HYPOTHALAMUSBAN

AZ OREXIN mrns A LATERÁLIS HYPOTHALAMUSZBAN

LTBP-2 ÉS OREXIN EGYÜTTES EXPRESSZIÓJÁNAK VIZSGÁLATA A LATERAL HYPOTHALAMUS DUPLA ISHH TECHNIKÁVAL Orexin + LTBP-2 dupla in situ hibridizációs hisztokémia

LTBP-2 ÉS MCH EGYÜTTES EXPRESSZIÓJÁNAK VIZSGÁLATA A LATERAL HYPOTHALAMUS DUPLA ISHH TECHNIKÁVAL MCH + LTBP-2 dupla in situ hibridizációs hisztokémia

ISHH ÉS IMMUNFESTÉS KOMBINÁCIÓJA Nehézségek: 1. Az immunfestés alatt lebomolhat a szövetben lévő mrns 2. Az in situ hibridizációhoz szükséges reagensek eltávolíthatják az antitesteket, és károsíthatják az epitópokat. Kompromisszumos megoldásként az ISHH-t csináljuk először az emulzióba mártásig. Ezen a ponton hajtjuk végre az immunfestést, majd fejezzük be az ISHH-t.

TGFbeta INDUKCIÓ MCAO HATÁSÁRA

TGFbeta mrns-t EXPRESSZÁLÓ SEJTEK TÍPUSÁNAK AZONOSÍTÁSA