AFP (α-fetoprotein) Biokémiai adatok Az α-fetoprotein (AFP) onkofetális fehérje, egy egyláncú α-globulin 1. 590 aminosavból és egy szénhidrát láncból álló glikoprotein 9,10,11. A magzati keringésben a 6. héten jelenik meg 3. A 12. terhességi hétig a csírazsák, ezt követően (annak degenerációja után) a fetalis máj termeli 1. Az AFP az extracelluláris mátrixban (ECM), a sejtfelületen, a receptoszómákban, az endoplazmatikus retikulumban (ER) és a citoplazmában perinukleárisan lokalizált 16,17,32. A magzati AFP-termelés a csúcsát (a 40 mg/l koncentrációt 3 ) a 14. héten éri el, ezt követően szintézise a szülésig csökken 2, születés után koncentrációja 30µg/l-re esik, a normál felnőttkori szintet (2-10 ng/ml) 1 éves kor végére éri el 4. Azt a megfigyelést, hogy az AFP termelés nem szűnik meg a megszületéskor, azzal magyarázzák, hogy átmenetileg a megmaradt fetalis hepatocyták termelik 2. Az újszülött szérum AFP szintje a felnőtt referencia tartomány négyszeresét is meghaladhatja 2,5-7 és születési súllyal korrelációt mutat 1. Az amnion folyadék a magzati szérum AFP koncentráció tükrének tekinthető, mivel a magzati AFP ide exkretálódik. Az anyai szérum AFP szintje jóval alacsonyabb, s a terhesség 32. hetéig emelkedik. Az AFP génje a négy tagból (albumin, D-vitamin-kötő protein, AFP és α-albumin más néven afamin) álló albuminoid géncsalád tagja 21,22. Ezek a gének egymást követően helyezkednek el a 4q11-q22 régióban, 15 exont és 14 intront tartalmaznak 23. Mindegyik említett fehérje három doménből álló, U-alakú molekula. Szénhidrát oldallánc A humán α-fetoprotein szerkezete. A szaggatott nyíl jelzi a hinge ( csukló ) régiót, ahol nincs diszulfid híd (9 alapján) Dr. Krkos Károly V080115 1

AFP receptorok Négy membrán receptor ismert. Ezek zömmel endothelialisan, vagy az epithelialis sejtfelszínen találhatók 17 20, de kimutattak AFP-receptorokat monocyták, reproduktív és tumor sejtek felszínén is 20 21. Feltehetően nemcsak a natív AFP molekulát képesek kötni, hanem annak különböző variánsait is. Genetikai variánsok A fő fetalis és tumorból származó AFP mrns 2,2 kilobázisú transzkript, mely szénhidrát tartalmától függően 69000 73000 dalton molekulatömegű fehérjévé transzlálódik 25,26, de emellett létezik, 1,35 kilobázisú mrns-ből származó transzkript is, mely intracellulárisan marad. Az intakt molekulához képest ebben a teljes 1. domén és a második domén 1/3-a hiányzik, továbbá nem tartalmaz szénhidrátot. Ez a variáns normál humán AFP mintegy 40%-át teszi ki. Szteroid receptorokhoz képes kötődni 30. A 3. domén hidrofób kötőhelyeket tartalmaz, dimerizációra hajlamos 27,30, más intracelluláris fehérjékkel is képes heterodimert alkotni 28,29. Szabad és kötött molekuláris formák Az AFP szabad és különféle petidekhez (IgG, IgM, aktin, TGF-β, osteonectin, proteáz szubsztrátok és inhibitorok) kötött formában fordul elő 27, emellett dimer-afp-t is kimutattak (in vivo) 31. AFP fragmentumok A plazma proteinek,- így az albumin és az AFP is biológiai válasz-módosító peptid fragmentumok rezervoárjának is tekinthetők. Mindkét molekulában találhatók rövid aminosav-szekvenciák, melyek a neurotenzin és a neuromedin hasadási termékeivel mutatnak nagy hasonlóságot 42 (kinetensin-like segments), de egyéb biológiailag aktív peptid szegmentjének aminosav-szekvenciája is fellelhető a humán AFP molekulában (insulin-like 43, EGF-like 44,45, plasminogen activator-like 27,41, growth inhibitory peptid 33,40, hisztokompatibilitási 38,39 szegment). Ezek mellett a zsírsavkötő 66,74 és az ösztrogénkötő 129,130 helyet is azonosították. A humán AFP aminosav sorrendje és az egyes fragmentumok biológiai aktivitása ABS: aktin-kötő hely, ARP: apoptosisrelated peptid, BBS 1,2: bilirubin-kötő helyek, EBS: ösztrogén-kötő hely, EGFL: EGF -szerű szegment, FBS: zsírsav-kötő helyek, GIP: növekedés-gátló peptid, HCS histocompatibilitási (class II) szegment, HMS 1, 2: nehézfém-kötő hely, ILS: inzulinszerű szegment, KLS: kinesin szerű szegment, LPH: leucine predicted heptads, L-A: laminin-a szegment, L-B1: laminin-b1 szegment, LRE (leu-arg-glu), LDV (leu-aspval) és RGD (arg-gly-asp): sejt-adhéziós szekvenciák, MPS: tej-kazein peptid szegment, NAI: non-albumin identikus szegment, PAS: plazminogén aktivátor szegment, PRS: prolin-gazdag szegment, RBS: humán AFP receptor-kötő hely, SRGD: reverz RGD szegment, ZBS: cinkkötő hely (27, 33, 40, 43-50, 51, 52 alapján) Dr. Krkos Károly V080115 2

Az AFP molekuláris mikroheterogenitása Szénhidrát izoformák Az albuminnal ellentétben a humán AFP 2. doménjén egy, a 232 aszparaginhoz kapcsolt, N-kötött glikánt tartalmaz. A hepatoma sejtekben termelt AFP glikánjának struktúrája különbözik a csírazsák daganatokéban találtaktól 11, ugyanakkor a két molekula variánsban az aminosav-sorrend megegyezik. Ezeket a szénhidrát komponensükben különböző formákat lektinkötésük alapján el lehet különíteni. A leggyakrabban alkalmazott lektin a Lens culinaris agglutinin (LCA), mely a hepatocellularis carcinomára (HCC) jellemző AFP-t köti. Ez a lektin akkor kapcsolódik nagy affinitással az AFP kettős ágú szénhidrát láncával, ha az aszparaginhoz csatolt glikozil-n-acetil (GlcNAc) egy fukózt tartalmaz 1-6 kötésben 12, 73. Az AFP-L3 szénhidrátlánca A galaktóz-specifikus Ricinus communis agglutinin-1 (RCA) akkor köti az AFP-t ha annak kétágú glikánjában az utolsóelőtti helyen galaktóz található 72. Lektin típus Concanavalin A (ConA) Lens culinaris agglutinin (LCA) Ricinus communis agglutinin-1 (RCA) Phaseolus vulgaris erytroagglutinin Cukor specificitás d-mannóz 2 Detektált izoformák száma Klinikai használat PRG, HCC, MHC, YST Irodalom 118,119 d-mannóz (l-fukóz) 2 HCC, MHC, LCH, BLD 73, 118 d-galaktóz 3 HCC, YST 68 Komplex kettőságú glikán 5 HCC, MHC, YST 124, 125 PRG: terhességi izoformák, HCC: primer hepatocellularis carcinoma, MHC: metastaticus hepatocellularis carcinoma (májon kívüli áttéttel), LCH: cirrhosis hepatis, BLD: benignus májbetegség, YST: csírazsák tumor A lektinek nemcsak egyes szénhidrát-csoportra specifikusak, hanem az egész szénhidrát-molekulára. A szénhidrát lánc összetétele nem kódolt genetikailag, annak szintézisében az endoplazmatikus retikulumban (ER) és a Golgi apparátusban lévő glikozilációs enzimek játszanak szerepet. Ezek az enzimek szövet-specifikusak, így a glikán összetétele is szövetspecifikus 68-71, ennek következtében más a szénhidrát-összetétele a máj- és a csírazsák-eredetű AFP-nek. Az amnion-folyadékban található AFP a két említett típus keveréke, melyben a két típus aránya a gesztációs kortól függ. A különböző lektin-affinitáson alapuló módszerek kombinációjával (pl. crossed affinity immonoelectrophoresis) legalább 10 glikoforma különböztethető meg 67. ph izoformák Izoelektromos fókuszálással két fő izoformát lehet megkülönböztetni (izoelektromos pont ph 4,8 és ph 5,2), melyről kiderült, hogy ezeket zsírsavtartalmuk különbözteti meg 74, 75 : a ph4,8 izoelektromos pontú variáns 2,4 mol zsírsavat tartalmaz, míg ph 5,2 izoelektromos pontú nem tartalmaz zsírsavat. Köldökzsinórvér AFP izokromato-fókuszálásával három különböző izoelektromos pontú fromát eluáltak 76 az oszlopról: ph4,5 (52%), ph 4,7 (43%) és ph<4,0. A ph-tól függően konformáció változások figyelhetők meg az AFP molekulán 77. Neutrális ph-n a molekulafelszín hidrofil és a hidrofób szegmentek rejtve maradnak. Dr. Krkos Károly V080115 3

Denaturált intermedierek és az MGF Az intracelluláris kompartmentek változó környezetében a fehérjemolekula enyhén denaturált (unfolded) állapotban lehet, melyet molten globule formának (MGF) neveznek 32. Ezt a fehérje harmadik termodinamikai állapotának 32,92 tartják, mely a harmadlagos szerkezet kialakulásának kinetikai köztes állapota 92. Ennek a formának számos élettani aktivitásban (fehérje transzlokáció, membránba történő insertio, hősokk fehérjék felismerése és az azokkal történő kapcsolódás, lysosomalis protein degradáció) szerepet tulajdonítanak. Laboratóriumi vizsgálatok igazolják, hogy az AFP konformációját mikrokörnyezeti változások [pl. hidrofób ligandumok (ösztrogének, zsírsavak) szérumkoncentrációjának megemelkedése] módosítják 34,79,80. Az AFP MG állapotában megtartja natív másodlagos szerkezetét, ugyanakkor a molekula kevésbé rigiddé válik, mint az a natív harmadlagos szerkezetre jellemző, s egyes rejtett csoportjai hozzáférhetők lesznek, így a hidrofób alifás és aromás oldalláncok, melyek a natív állapotban rejtettek. Feltehetően a fehérjék MG formát vesznek fel, mikor töltött felszínt vagy membránt közelítenek meg 32,91. Amint átjutnak a membránon visszanyerik natív formájukat. Az MG forma tehát szerepet játszik a fehérje adherenciában, transzlokációban, bilipid membránfelületbe ékelődésben 32. A humán AFP natív és MG állapotának sematikus ábrázolása (32,78-80, 89, 90, 92, 94 alapján NATÍV AFP AFP MGF A) kompakt szerkezet A) kevésbé tömör forma B) merev szerkezet B) flexibilis szerkezet C) rejtett oldalláncok C) hozzáférhető oldalláncok D) mozdulatlan izomer D) rotációra képes izomer E) Zárt hurkok E) kinyíló hurkok Denaturáló állapot lehet a hypoxia, a ph, az ozmózis kifejezett változása, glükóz- és hősokk, magas ligandum (pl. ösztrogén) koncentráció. A ligandummal telített AFP interakciója a sejtfelületi receptorral konformációváltozást okoz, mely az AFP-ligandum komplex disszociációjával jár. A ligand ezután transzlokálódik a közeli ligand- akceptor helyre. A ligand- mentes AFP leválik a receptorról és endocytosissal a sejtbe jut 32,93. Dr. Krkos Károly V080115 4

A molekuláris chaperonok szerepe Az MGF kialakulásával molekulafelszínen hozzáférhetővé váló non-poláris molekularészek lehetővé teszik a hő-sokk proteinekkel történő kapcsolódást 94,95. Közvetlen bizonyíték van arra, hogy a chaperoninok elősegítik a naszcens polipeptid lánc korrekt harmadlagos szerkezetének (a protein folding) kialakulását 96. A chaperoninok meggátolják, hogy a folding ne a megfelelő időben és ne a megfelelő sejt lokalizációban történjen. A chaperoninok közé nemcsak a hő-sokk és glükóz-sokk fehérjék (HSP90, HSP70, HSP60 és BiP) tartoznak, de a co-chaperoninok, kalcium-kapcsolt proteinek (calnexin, calmodulin) és két enzim (a protein-diszulfid izomeráz és a peptidil-prolil izomeráz) is 96,97. A chaperoninok nem enzimként működnek és nem gyorsítják a fehérjék harmadlagos szerkezetének kialakulását, hanem elősegítik a folding korrekt menetét, meggátolják az újonnan szintetizálódott polipeptid láncok non-specifikus aggregációját. A chaperoninok segítenek a fehérjék hő- és egyéb sokkhatást követő túlélésében és reparálódásában 98,99. Mivel az MG forma hajlamos az aggregációra, a chaperoninok meggátolják az MGF molekulák összecsapódását, stabilizálják ezt az állapotot, inkább késleltetik, mint gyorsítják a folding folyamatát 99,100. Celluláris adhéziós szekvenciák az AFP molekulában Az AFP 2. doménjén extracelluláris mátrix (ECM) proteinekkel közös rövid peptid szekvenciákat találtak (celluláris adhéziós motívumok, CAMs). Számos tanulmány kimutatta, hogy a CAM felismerési szignál kritikus biológiai aktivitások sorát modulálja 53-60. Az ECM fehérjecsalád tagjai (laminin, fibronektin, kollagén, vitronektin, thrombospondin stb.) adhéziós makromolekulák 47, melyek szerepet játszanak a fejlődésben, és a növekedéssel, differenciálódással, sejtmigrációval, daganat áttétképződéssel kapcsolatos állapotokban. Néhány CAM sejtdifferenciálódást, tumornövekedést, angiogenezist blokkoló hatású. Az ECM molekulák egy része (laminin, kollagén, fibronektin) olyan multiplex, biológiailag aktív peptid szekvenciákat tartalmaz, mely hatása sejttípustól függően változó 95. Az AFP-ben található ezekkel egyező szekvenciák arra utalnak, hogy az AFP is játszhat hasonló szerepet, mint az adhéziós molekulák 27. Az AFP feltehetőleg a fejlődő szervezet szerkezeti interstitialis útvonalainak finom beállításában működik közre. Érdekes, hogy ugyancsak a 2. doménben, a non-cam aktív régióban található a zsírsav 27,65,66 - és a bilirubin-kötő hely. Az ECM fehérjékben és a humán AFP-ben található sejt-adhéziós szekvenciák (CAM-ok) A molekula neve / a kezdő szekvencia az AFP-ben Laminin-S/ 197 Fibronektin/ 241 Fibronektin/ 252 Kollagén I és IV/ 261 Laminin B1/ 268 Laminin B1/ 309 Aminosavfelismerő szekvencia Leu-Arg-Glu / Leu-Arg-Glu Leu-Asp-Val / Leu-Asp-Val Arg-Gly-Asp / Cys-Arg-Gly-Asp Asp-Gly-Glu-Ala / Asp-Gly-Glu-Lys Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg / Tyr-Ile-Cys-Ser-Gln Pro-Asp-Ser-Gly- Arg / Pro-Asn-Leu-Asn- Arg Feltételezett funkció Elősegíti a ciliaris ganglionok adhézióját 47 Elősegíti a a velőcső sejtek és a lymphocyták adhézióját és szóródását Elősegíti a sejt-adhéziót, gátolja a daganatáttét képződést, csökkenti a thrombocyták fibrinogénhez történő tapadását, befolyásolja az angiogenezist Blokkolja a thrombocyták kollagénhez (de nem a fibronektinhez és lamininhoz) történő tapadását, gátolja a ráksejtek adhézióját a kollagénhez Nem reagál a neuralis sejtekkel, gátolja a tumor áttétképződést (a növekedést és az angiogenezist),és elősegíti a sejtmigrációt Gátolja a chorio-allantoin membránon a tumor növekedést és áttétképződést, angiogenezist Irodalom 54,55 52, 53, 55, 60, 61 63, 64 49, 58, 95 62 Dr. Krkos Károly V080115 5

Kevert RGD/ 316 Laminin A/ 351 Leu-Gly-Asp-Arg / Leu-Gly-Asp-Arg Ser-Ile-Lys-Val-Ala- Val/ Ile-Leu-Arg-Val-Ala- Lys RGD (Arg-Gly-Asp) antagonista / inhibitor; MHC Class II rokon A neuralis sejtekkel reagál, fokozza a daganatáttét képződést, a plazminogén aktivációt és a kollagenáz aktivitást 52 48 Az AFP élettani szerepe Mint az albominoid géncsalád többi tagja, az AFP is ligand transzport funkcióval rendelkezik, de ezenkívül számos egyéb folyamatban is szerepet játszik: kemotaxis, eszteráz aktivitás, oxigén szabadgyök eltávolítás, leukocyta adherencia, réz-stimulálta lipid peroxidáció, zsírsav-, nehézfém-, aktin-kötés 26-28. Ligandumok kötése és transzportja az AFP egyik fő feladat a magzati fejlődés során. Az AFP nemcsak magzati/anyai molekulákat képes megkötni, hanem a populációra nézve jelentős, környezetből származó molekulákat is (fito-ösztrogének, flavonoidok, dioxin-származékok 106 ) Az AFP mint növekedés regulátor Az AFP egy onko-fetalis fehérje, mely elősegíti a növekedést különböző in vitro (sejt) és in vivo (állat) modellekben 11,27,107. Feltehetően alapvető szerepe van a terhesség normális lefolyásában. Mint autokrin faktor viszont elősegítheti különböző daganatok növekedését bizonyos koncentrációban és bizonyos körülmények között 107,109-111, ugyanakkor az AFP és az abból származó peptidek gátolni is képesek a proliferációt 11,27,39. Az AFP tehát a növekedés kettős regulátora, képes mind fokozni, mind gátolni azt 65,108,112-114. A növekedés és differenciálódás up- és down- modulációja dózisfüggő 115-120,128. Az AFP a növekedést számos mechanizmuson keresztül képes szabályozni: apoptosis reguláció, citoplazma szignál moduláció, receptor deszenzitizáció. Az AFP-mediálta apoptozis Ca 2+ - és tirozinkináz-independens úton valósul meg, nem igényel proteinés/vagy RNS-szintézist 121 és intakt TNF-receptort 123. Az AFP apoptosist képes indukálni caspase-3 aktivációjával, a FAS és TNF receptor dependens szignál kikerülésével 124,125, az iniciátor caspase-1,8 és-9 aktiválásától függetlenül 50,126. IL-2 és más immunregulátoros szerek képesek viszont ezt hatást felfüggeszteni 122. Az AFP nagy dózisban (>100µg/ml) képes különböző tumorsejtek növekedését gátolni 127, kis dózisban viszont ez a hatás elmarad. Az AFP ösztradiol-indukálta konformáció változása az MCF-7 emlőrák-sejtek növekedésének további szignifikáns szuppresszióját okozta 127. Az AFP meghatározás klinikai jelentősége Mivel az AFP onkofetalis fehérje, szérumkoncentrációjának meghatározását elsősorban bizonyos daganatok nyomon követésére valamint fejlődési rendellenességek szűrésére használják. Az AFP mint tumor marker Az AFP-t főként endodermalis sinus (régebbi elnevezés szerint csírasejt) tumorok és a hepatocellularis carcinoma stádium besorolására, nyomon követésére, prognózisának megállapítására használják. Felnőttkori referencia tartománya: 2 10 ng/ml. Felezési ideje a szérumban: 5 nap 4. A szérum AFP számos nem rosszindulatú betegségben is emelkedett lehet: vírus hepatitis, krónikus aktív hepatitis, postnecroticus és primer biliaris cirrhosis, tyrosinaemia, ataxia teleangiectasia 4. Specifikusabb, érzékenyebb a hepatocellularis carcinoma kimutatására az AFP-L3 glikoforma arányának meghatározása, mely Lens culinaris aggluitinint (LCA) alkalmazó 12,13 lektin-affinitás elektroforézissel lehetséges. Dr. Krkos Károly V080115 6

Az AFP glikoformák és klinkai jelentőségük Glikoforma Affinitása a LCA-hez Klinikai jelentősége AFP-L1 alacsony Krónikus gyulladásos májbetegségek AFP-L2 átmeneti Csírasejt tumorok, májáttétek AFP-L3 magas Hepatocellularis carcinoma Az AFP L-3% cut-off értéke: 10% Jelenleg az AFP, az AFP-L3% és a DCP [dez-γ-karboxi-protrombin, régi nevén PIVKA-II (protein induced by vitamin K absence)] együttes meghatározása jelenti a legszenzitívebb módszert a hepatocellularis carcinoma monitorozására 14. Az anyai szérum AFP vizsgálata Kromoszóma számbeli rendellenességek esetén (elsősorban Down szindrómában és Edwards szindrómában 146 ) a normális terhességhez képest szignifikánsan alacsonyabb AFP-szint mérhető a terhesség második trimeszterében. Az AFP önmagában nem elég megbízható a szűrésre, azt további két (hcg és nem-konjugált ösztriol, tripla teszt 132-137,139 ) vagy három (előbbi kettő +inhibin A, négyes teszt 138 ) paraméterrel kiegészítve megfelelő hatékonyságú szűrőteszt áll rendelkezésre. A kockázatbecslést megfelelő statisztikai programmal kell végezni. A programok nem a paraméterek közvetlen koncentrációját használják, hanem azoknak az adott gesztációs korra meghatározott mediánjára normált értékét (a multiples of the median-t, MoM-t). A paraméterek mediánját nemcsak a gesztációs kor befolyásolja, hanem az anyai testsúly 135, a dohányzás 135, az anya esetleges diabétesze (csak az IDDM) 136, etnikai hovatartozása 134, előző Down terhesség 134, ikerterhesség 134. Mindezeket a tényezőket általában figyelembe veszik a ma használatos programok. A tripla teszttel 69%-os a négyes teszttel 76% detektálási ráta (DR) érhető el 5% fals-pozitív arány (FPR) mellett 134. Down szindrómában az Alzheimer kórhoz (AZD) hasonlóan amyloid fibrillumok akkumulálódnak az agysejtekben 102. AZD-ben a HSP70 fokozott szintézisét és akkumulációját észlelték 103, s arra a következtetésre jutottak hogy rossz harmadlagos szerkezetű (misfolded) chaperon keletkezhet 104. A proamyloid prekurzor génje a 21-es kromoszóma hosszú karján található, amely triplikált formában van jelen Down kórban. Úgy tartják, hogy ennek a génnek az overexpressziója vezet az emelkedett proamyloid/amyloid képződéshez, felszaporodásuk az endoplazmatikus retikulumban pedig stressz szignált jelent és a hő-sokk gének aktivációját eredményezi 105. Általában a fehérjék mintegy 1%-ának nem megfelelő a harmadlagos szerkezete 131. Amennyiben chaperonint érint a misfolding, más fehérjék (így az AFP) nem megfelelő harmadlagos szerkezetű variánsának aránya megnő (akár 20% is lehet 101 ). A misfolded AFP feltehetőleg nem immunoreaktív, immunoassay módszerekkel nem detektálható, így alacsonyabb AFP szint mérhető 35-37. Emelkedett az anyai AFP-szint a második trimeszterben a magzat velőcső záródási rendellenessége esetén 140-144. Egy Nagy-Britanniában végzett kollaboratív tanulmány 141 alapján, ha az AFP MoM érték 2,5 és e feletti, 85% detektálási rátával és 1,4% fals-pozitív aránnyal szűrhetők az ebbe a körbe tartozó fejlődési rendellenességek (cranialis málformációk: anencephalia, encephalocele, craniorachischisis totalis, spinalis megjelenési formák: spina bifida aperta, myelomeningocele, meningocele, myeloschisis, lypomyelomeningocele, nyitott gerinc málformációk, diastematomyelia, diplomyelia, caudalis agenesis). Amennyiben az emelkedett anyai szérum- AFP- szint alapján kiszűrt terhesség szonográfiás vizsgálatakor nem dönthető el biztosan, van-e velőcső-záródási rendellenesség, az amnion folyadék AFP és acetilkolin-eszteráz (AChE) vizsgálata megerősíti a diagnózist 143,144. (Emelkedett AChE aktivitás és 2 AFP MoM: 99% DR és 0,3% FPR.) A magasabb AFP szint a placentalis dysfunctio indikátora is lehet, nem-várt halva-szülést jelezhet és közvetlen összefüggést mutat a hirtelen újszülöttkori halál szindróma (sudden infant death syndrome, SIDS) rizikójával 8. Dr. Krkos Károly V080115 7

IRODALOM 1. Bellini C, Bonacci W et al.: Clin Chem 1998 44(12): 2548-2550 2. Blair JI, Carachi R et al.: Arch Dis Child 1987 62:362-369 3. Liu FJ, Nakamura RM et al. In Cancer Diagnostics (ed. by RN Nakamura, WW Grody, JT Wu RB Nagle- Humana Press, Totowa, New Jersey) p135 4. Liu FJ, Nakamura RM et al. In Cancer Diagnostics (ed. by RN Nakamura, WW Grody, JT Wu RB Nagle- Humana Press, Totowa, New Jersey) p136 5. Blohm ME, Vesterling-Hörner D et al.: Pediatric hematology and oncology 1998 15(2): 135-142 6. Ohama K, Nagase H et al.: Eur J Ped Surg 1997 7(5): 152-158 7. Bader D, Riskin A et al.: Clin Chim Acta 2004 349(1-2): 15-23 8. Gordon CS, Smith MD et al.: NEJM 2004 351(10): 978-986 9. Morinaga T, Sakai M et al.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 1983 80: 4604-4608 10. Yang F, Luna VJ et al.: Nucleic Acids Res 1985 13: 8007-8017 11. Mizejewski GJ: Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1995 5: 281-316 12. Li D et al.: Clin Chim Acta 2001 313(1-2): 15-19 13. Khein VV et al.: In J Biol Markers 2001 16(2): 105-111 14. Lamerz L et al.: Anticaner Res 1999 19:2489-2494 15. Mizejewski GI: J Theor Biol 1995 176: 103-113 16. Torres JM, Anel A et al.: J Cell Physiol 1992 150: 456-462 17. Naval J, Villacampa MJ et al.: Proc Natl Acad Sci USA 1985 82: 3301-3304 18. Torres JM Caracq N et al.: Biochem Biophys Acta 1992 1159: 60-66 19. Suzuki Y, Zeng CQY et al.: J Clin Invest 1992 90: 1530-1536 20. Moro R Tamaoki T et al.: Tumor Biol 1993 14: 116-130 21. McLeod JF, Cooke NE: J Biol Chem 1989 264:21760-21769 22. Lichtenstein HS Lyons DE et al.: J Biol Chem 1994 269: 18149-18154 23. Smith CJP, Kelleher PC: Biochim Biophys Acta 1980 605: 1-32 24. Mizejewski GJ: Proc Soc Exp Biol Med 1997 215:333-362 25. Petropoulus C, Andrews G et al.: J Biol Chem 1983 258: 4901-4906 26. Petropoulus C, Yaswen P et al.: Cancer Res 1985 45: 5762-5768 27. Belanger L, Roy S et al: J Biol Chem 1994 269: 5481-5484 28. Seal W, Hanstein B et al.: Mol Endocrinol 1998 12: 1551-1557 29. Resnick EM Schreihofer DA et al.: J Biol Chem 2000 275: 7158-7166 30. Mizejewski GJ Bioessays 1993 15: 427-432 31. Goncharova O, Didich E et al.: Tumor Biol 1999 20: 42-52 32. Bychkova VE, Ptitsyn OB: Chemtracts, Biochem Mol Biol 1993 4: 133-163 33. Butterstein GM, Mizejewski GJ: Comp Biochem Physiol 1999 124A: 39-45 34. Hsourigui M, Thabie N et al.: Biochim Biophys Acta 1992 1125: 157-165 35. Smalley JR, Sarcione EJ: Biochem Biophys Res Commun 1980 92: 1429-1434 36. Sarcione EJ, Zlotty M et al.: Cancer Res 1983 43: 3739-3741 37. Sarcione EJ, Hart D: Int J Cancer 1985 35: 315-318 38. Vollner CM, Eilber FC et al.: Cancer Res 1999 59: 3064-3067 39. Butterfield LH, Koh A et al.: Cancer Res 1999 59: 3134-3142 40. Mizejewski GJ: Life Sci 1994 56: 1-9 41. Campbell ID, Bork P.: Curr Opin Struct Biol 1993 3: 385-392 42. Carroway RE, Mitra SP J Biol Chem 1987 262: 5969-5973 43. Terentiev AA, Tagirova AK et al.: Tumor Biol 1999 20:42 44. Salmasi JM, Kazimirski AN et al.: Tumor Biol 1999 20:43 45. Terentiev AA, Tatarinov YS: Tumor Biol 1999 20:44 46. Mizejewski GJ, Dias JE et al.: Mol Cell Endocrinol 1996 118: 15-23 47. Yamada Y, Kleinmann HK: Curr Opin Cell Biol 1992 4: 819-823 48. Tashiro K, Sephel GC et al.: J Biol Chem 1989 264:16174-16182 49. Nomizu M, Yamamura K et al.: Cancer Res 1993 53: 3459-3461 50. Tuszynski GP, Rothman VL et al.: J Cell Biol 1989 120: 513-521 51. Beck K, Hunter I et al.: FASEB J 1990 4: 148-160 52. Kijimoto-Ochiai S, Noguchi A: Biochem Biophys Res Commun 2000 267:689-691 53. Main AL, Harvey TS et al.: Cell 1992 71: 671-678 54. Leahy DJ, Hendrickson WA et al.: Science 1992 258: 987-999 55. Bilozur ME, Hay ED: Dev Biol 1988 174: 1159-1162 Dr. Krkos Károly V080115 8

56. Vandenberg P, Kern A et al.: J Cell Biol 1991 113:1475-1483 57. Joseph DR, Baker ME: SASEB J 1992 6:2477-2481 58. Iwamoto Y, Robey FA et al.: Science 1987 238: 1132-1134 59. Stack S, Gray RD et al.: Biochemistry 1990 30: 2073-2077 60. Minguel JJ, Hardy CI et al.: Biochem Biophys Acta 1993 1151: 120-126 61. Aota S Nagai T et al.: J Biol Chem 1991 2626: 15938-15943 62. Hadley MA, Weeks BS et al.: Dev Biol 1990 140: 318-327 63. Phillips DR, Charo IF et al.: Cell 1991 65: 359-362 64. Mizejewski GJ: Proc Soc Exp Biol Med 1999 222: 124-128 65. Mizejewski GJ, Vonnegut V et al.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 1983 80: 2733-2737 66. Nashihira J, Koyama Y et al.: Biochem Biophys Res Commun 1993 196: 1049-1059 67. Taketa K: Electrophoresis 1998 19: 2595-2602 68. Smith CJ, Kelleher PC et al.: Br Med J 1979 1: 920-921 69. Rouslahti E, Engvall E et al.: Int J Cancer 1978 22: 515-520 70. Ishiguro T, Sakaguchi H et al.: Am J Reprod Immunol 1983 3: 61-64 71. Ohta M, Kawahara N et al.: Acta Med Okayama 1998 52: 27-33 72. Breborowitz J, Mackiewicz A et al.: Scand J Immunol 1981 14: 15-20 73. Kumada T, Nakano I et al.: J Hepatol 1999 30: 125-130 74. Parmelee DC, Evensen MA et al.: J Biol Chem 1978 253: 2114-2119 75. Barde CB, Nagai M et al.: J Biol Chem 1979 254: 12609-12614 76. Leal JA, Eddy KB et al.: Anal Biochem 1991 192: 411-418 77. Zizkovsky V, Strop P et al.: Ann NY Acad Sci 1983 417: 49-55 78. Uversky NV, Kirkitadze MD et al.: FEBS Lett 1995 364: 165-176 79. Uversky NV, Narizhneva NV et al.: Biochemistry 1997 36: 13638-13645 80. Dudich IV, Semenkova LN et al.: Tumor Biol 1998 19: 34 81. Demarest ST, Boice JA et al.: J Mol Biol 1999 294: 213-221 82. Greene LH, Grobler JA et al.: Protein Eng 1999 12: 581-587 83. Demarest SJ, Raleigh DP: Protein Struct Func Gen 2000 38: 189-196 84. Griko YV, Remeta DP: Protein Sci 1999 8: 554-561 85. Uversky VN, Narizhneva NV et al.: Fold Design 1997 2: 163-172 86. Mathews BW: FASEB J 1996 10: 27-34 87. Wang C, Lascu I et al.: Biochemistry 1998 37: 8457-8464 88. Dockal M, Carter DC et al.: J Biol Chem 2000 275: 3042-3050 89. Bychkova VE, Dujsekina AE et al.: Biochemistry 1996 35: 6058-6063 90. Kindu B, Guptasarma P: Protein Struct Func Gen 1999 37: 321-324 91. Van der Groot FG, Gonzales-Manas JM et al.: Nature 1991 354: 408-410 92. Ptitsyn OB, Bychkova VE et al.: Phil Trans Roy Soc (Lond-B) 1995 348: 35-41 93. Eilers M, Hwang S, Schatz G: EMBO J 1988 7: 1139-1144 94. Uversky VN, Ptitsyn OB: Fold Design 1996 1:117-122 95. Thomasson WA: Fed Am Soc Exp Biol, Bethesda, MD. 1998 Vol 1 (Suppl), pp 1-12 96. Buchner J: FASEB J 1996 10: 10-19 97. Caplan AJ: Trends Cell Biol 1999 9: 262-268 98. Lorimer GH: FASEB J 1996 10: 509 99. Ellis RJ, Hartl FV: FASEB J 1996 10: 20-26 100. Shortle D: FASEB J 1996 10: 27-34 101. Kronquist KE, Dreazen E et al.: Prenat Diag 1990 10: 739-751 102. Rumble B, Retallock R et al.: NEJM 1989 320: 1446-1452 103. Perez N, Sugar J et al.: Mol Brain Res 1991 11: 249-254 104. Liautard JP: Med. Hypothesis 1994 43: 372-380 105. Ananthan J, Goldberg AL et al.: Science 1985 317: 522-523 106. Sotnichenko AI, Severin SE et al.: FEBS Lett 1999 450: 49-51 107. Wang XW, Xie H: Int J Cancer 1998 75: 596-599 108. Greenberg F, Faucett A et al.: Am J Obstet Gynecol 1992 167: 509-511 109. Gershwin NME, Castles JJ et al.: J Natl Cancer Inst 1980 64: 145-149 110. Mizejewski GJ: Clin Immunol Newslett 1981 2: 37-39 111. Mizejewski GJ, Jacobson HI: In: Mizejewski GJ, Jacobson HI, Eds, Biological Activities of Alpha- Fetoprotein, Boca Raton, FL, CRC Press. Vol 1: pp 71-82, 1987 Dr. Krkos Károly V080115 9

112. Mizejewski GJ, Warner AS: J Reprod Fertil 1988 85: 177-185 113. Mizejewski GJ, Keenan JF et al.: Biol Reprod 1990 42: 887-898 114. Leffert HI, Sell S: J Cell Biol 1974 61: 823-829 115. Toder V, Bland M et al.: Placenta 1983 4: 79-86 116. Hamel S, Hoskin DW: In: Mizejewski GJ, Jacobson HI, Eds, Biological Activities of Alpha- Fetoprotein, Boca Raton, FL, CRC Press. Vol 1: pp 167-177, 1987 117. Leal JA, May JV et al.: Endocrinology 1980 126: 669-671 118. Keel BA, Eddy KB et al.: Endocrinology 1991 129: 217-225 119. Jacobson HI, Bennett JA, Mizejewski GJ: Cancer Res 1990 50: 415-420 120. Semenkova LN, Dudich EI: Tumor Biol 1997 18: 30-40 121. Semenkova LN, Dudich EI: Tumor Biol 1998 19: 261-274 122. Semenkova LN, Dudich EI: Eur Cytokin Network 1998 9: 448 123. Dudich I, Dudich E et al.: Eur Cytokin Network 1998 9: 489 124. Dudich E, Semenkova L et al.: Eur Cytokin Network 1998 9: 488 125. Dudich E, Semenkova L et al.: J Interferon Cytokine Res 1999 19: 1140 126. Dudich E, Semenkova L et al.: Tumor Biol 1998 19: 30-40 127. Goncharova O, Dudich E et al.: Tumor Biol 1999 20(S2): 42 128. Bennett JA, Zhu S et al.: Clin Cancer Res 1998 4: 2877-2884 129. Nishi S, Matsue H et al.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 1991 88: 3102-3105 130. Nishi S, Shahbazzadeh D et al.: Tumor Biol 1993 14: 234 131. Penque D, Mendes F et al.: Lab Invest 2000 80: 857-865 132. Wald NJ, Cuckle HS et al.: BMJ 1988 297: 883-887 133. Palomaki GE, Knight GJ et al.: Am J Obstet Gynecol 1997 176: 1045-1049 134. Wald NJ, Kennard A et al.: J Med Screen 1997 4 181-246 135. Bartles I, Hoppe-Sievert B et al.: Prenat Diagn 1993 12(2): 123-130 136. Sancken U, Bartels I: Prenat Diagn 2001 21: 383-386 137. Canick JA, Rish S Prenat Diagn 1998 18: 413-415 138. Wald NJ, Huttly W: Prenat Diagn 1999 19: 1081-1090 139. Onda T, Tanaka T et al.: Prenat Diagn 1998 18: 956-958 140. Wald NJ, Kennard A: Prenatal screening for neural tube defects and Down s syndrome in: Rimoin DL, Connor JM and Pyseritz RE eds. Emery and Rimoin s principles and practice of medical genetics. 3 rd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1996: 546-562 141. Wald LJ, Cuckle H et al.: Lancet, 1977; i: 1323-1332 142. Bond EB, Thumpson W et al.: BJOG 1977 84(8): 547-577 143. Muller F: Child s Nervous System 19(7-8): 433-435 144. Wald LJ, Cuckle H et al.: Prenat Diagn 1989 9: 813-829 145. Buamah PK, Skillen AW et al.: Clin Chem 1985 31(4): 614-615 146. Sancken U, Bartels I et al.: Prenat Diagn 1999 19(10): 947-954 Dr. Krkos Károly V080115 10