A természetben előforduló, β-mnnozidos kötést trtlmzó szénhidrátok szintézise doktori (PhD) értekezés tézisei ákó János Témvezetők: Dr. Kerékgyártó János Dr. Szurmi Zoltán Debreceni Egyetem TTK Biokémii Tnszék Debrecen, 2001.
I. Az értekezés előzményei és célkitűzései A szénhidrátok biológii szerepéről lkotott véleményünk z elmúlt néhány évtizedben lposn átértékelődött. Sokáig csk élőlények váznygként, energiforrásként trtottuk számon e vegyületeket. Az ötvenes években zonbn ntibiotikumokbn, bkteriális poliszchridokbn mino-cukrokt mutttk ki. Később, glikokonjugátumok (glikolipidek, glikoproteinek) felfedezése és biológii szerepének tnulmányozás szénhidrátokt, különösen z oligoszchridokt, z érdeklődés középpontjáb helyezte. A glikokonjugátumok élőlények citoplzmájábn, extr-celluláris folydékibn és sejt-membránjábn is megtlálhtók. Utóbbik oligoszchrid komponensei lpvető szerepet játsznk sejtek külvilággl történő kommunikációjábn, enzimek, hormonok, bktériumok, vírusok, toxinok kötőhelyei. Az oligoszchridok, mint sejtek felszíni ntigénjei is fontos szerepet játsznk. Közismert például, hogy vércsoport-ntigének, melyek gliko-szfingolipidek, csk z oligoszchrid komponensek összetételében különböznek. A bktériumok immunológii sjátsági kpszul, vgy külső membrán lipopoliszchridjánk szénhidrát összetételétől függenek. Az oligoszchridok építőelemekre vontkozttott információtároló képessége sokkl ngyobb, mint nukleinsvké, vgy fehérjéké, hiszen monoszchrid egységek polifunkciós vegyületek, melyek gyűrűtgszám és nomerkonfigurációj is különbözhet. Ez okozz zonbn z oligoszchridok szintézisének legngyobb nehézségét is. Az oligoszchridok biológii jelentőségének növekedése forrdlmsított szénhidrátkémiát. A ngy mennyiségben előállíthtó, ngytisztságú szintetikus nyg segítségével ugynis olyn további biológii vizsgáltok, konformációs nlízisek végezhetők el, melyek izolált mintávl nem lehetségesek. 1995-ben kpcsolódtm be KLTE (2001-től Debreceni Egyetem) TTK Biokémii Tnszékén folyó munkáb. A szintetikus csoport egyik legfontosbb kuttási irány β-mnnozidos kötést trtlmzó természetes oligoszchridok szintézise. Ezek közül egy bkteriális oligoszchrid és z N-glikoprotein ntennák core pentszchridjánk előállítás volt feldtom. Ez utóbbi kpcsán külön hngsúlyt kpott β-mnnozidos kötés kilkításánk oxidáció-redukció módszerében olyn rekciókörülmények kidolgozás, melyek lklmzás lényegesen megjvítj redukció sztereoszelektivitását. Modellvegyületek birtokábn, feldtom volt még megvizsgálni izolált helyzetű észter csoportokt is trtlmzó mnnozidok Zemplén dezcilezési rekcióit. 1
II. Az lklmzott vizsgálti módszerek Szintetikus munkánk során modern preprtív szerves kémi mkro-, félmikro-, és mikromódszereit egyránt lklmztuk. A rekciók követésére, z nygok tisztságánk ellenőrzésére vékonyréteg-kromtográfiát, z nygok elválsztásár kristályosítást illetve oszlopkromtográfiát hsználtunk. Az előállított vegyületek jellemzésére, zonosításár, szerkezetének igzolásár klsszikus eljárások (elemnlízis, olvdáspont és fjlgos forgtóképesség meghtározás) mellett modern spektroszkópii módszereket (I, egy és két dimenziós NM, vlmint tömegspektrometrii technikák) lklmztunk. III. Az értekezés új tudományos eredményei 1. Egy ritk bktériumsejtfl építőelem, 2,3-dicetmido-2,3-didezoxi-D-mnnuronsv β-glikozidjink szintézise A bkteriális oligoszchridok, neoglikoproteinek (mesterséges bkteriális ntigének) előállítás már több évtizedes múltr tekint vissz Tnszéken. Feldtom volt egy ritk bkteriális építőelem, 2,3-dicetmido-2,3-didezoxi-D-mnnuronsv preprálás β-glikozid formájábn. E különleges monoszchrid egység egy Grm-negtív bktérium, Bordetell pertussis ( szmárköhögés kórokozój) sejtflábn fordul elő. A célvegyületet 2,3-dizido-2,3-didezoxi-β-D-mnnopirnozidokból állítottuk elő. A dizido szármzékokt kétféleképpen is sikeresen szintetizáltuk. 2,3-Dizido-2,3-didezoxi-β-D-mnnopirnozidok előállítás direkt úton Az 1 * vegyületből 4 lépésben preprált 5 mnnozil-bromidból, z zido csoport nemrésztvevő jellegét kihsználv jutottunk 6, 7, 8 és 12 β-mnnozidokhoz. A direkt β-mnnozilezések előnye, hogy donort csk egyszer kell előállítni, mellyel különböző glikonok glikozilezhetők. Hátrány zonbn, hogy kevéssé rektív lkoholok esetében szelektivitás és hozm is erősen lecsökkenhet. * A vegyületek számozás z értekezésben hsznált számozást követi. 2
Ph 4 lépés Ac Ac 1 Me 5 Br 5 + MeH vgy b Ac Ac Me 6 5 + H (CH 2 ) 8C H CH 2 Ac Ac (CH 2 ) 8C H CH 2 7 5 + i-pr H vgy b vgy c Ac Ac Ph 5 + H Bn Bz Ac Ac 8 Ph 12 Bz Bn 1. ábr: ) Ag-szilikát, CH 2 Cl 2 ; b) HgBr, CH 2 Cl 2, 4 Å; c) Hg(CN) 2, Toluol/Nitro-metán 1:1 2,3-Dizido-2,3-didezoxi-β-D-mnnopirnozidok előállítás indirekt úton Egy 3-zido-glüko vegyületből (13) β-glükozidokt készítettünk (17 és 23), melyeket megfelelő védőcsoport mnipulációk után (19 és 25) nukleofil szubsztitúcióvl lkítottunk β-mnnozidokká (21 és 27). 3
13 3 lépés Ac Ac Ac Br 16 b Ac Ac Ac Bn Bn 23 Bn Me Ac Ac Ac 17 Me c,d c,d H Bn Bn 25 Bn Me 19 H Me e,f e,f Bn Bn 27 Bn Me 21 Me 2. ábr: ) Metil-2,3,6-tri--benzil-α-D-glükopirnozid, AgTf, 4 Å, CH 2 Cl 2, Toluol; b) HgBr 2, 4Å, MeH; c) NMe, MeH; d) ptsa, 2,2-Dimetoxi-propán; e) Piridin, Tf 2 ; f) DMF, N 4
Az indirekt rekcióút előnye, hogy kevéssé rektív lkoholokt is jó hozmml, kiváló β-szelektivitássl lehet glikozilezni. Hátrány, hogy minden egyes célvegyületnél külön-külön végre kell hjtni C-2 konfigurációjánk megváltozttását. Mnnuronsv szármzékok előállítás A 38 célvegyületet 28 dizido szármzék TEMP oxidációj (36), mjd z zido csoportok kemoszelektív redukciój után (37) N-cetilezéssel, vlmint 40 dicetmido vegyület tritilezését, benzilezését (41), és Jones oxidációját követő (42) ktlitikus hidrogénezéssel is előállítottuk. H H H NHAc Me H AcHN 28 40, b e, f Me H NC Tr NHAc Me Bn AcHN 36 41 Me c g, h NC H H 2 N NH 2 Me NC Bn AcHN 37 42 d i NHAc Me NC H AcHN NHAc 38 Me 3. ábr: ) TEMP, NCl; b) NH; c) Pd-hidroxid, H 2 ; d) MeH, Ac 2 ; e) Piridin, TrCl; f) B, B(H) 2, BnBr; g) Cr 3, H 2 S 4, CH 2 Cl 2 /Aceton; h) NH; i) PdC, H 2 5
A kidolgozott rekcióutk reményt dnk rr nézve, hogy 2,3-dicetmido-2,3-didezoxi-D-mnnuronsvt oligoszchridokb építve is elő tudjuk állítni β-glikozidok formájábn. 2. β-d-glikozid-2-ulózok borohidridekkel végzett redukciójánk sztereoszelektivitását befolyásoló új tényezők, z ktivált DMS különleges szerepe A β-mnnozidos kötés előfordul z összes N-glikoprotein core oligoszchridjábn, bizonyos bktériumok sejtflábn. Kilkítás z oligoszchrid kémi egyik legnehezebb feldt. Az egyik leggykrbbn lklmzott eljárás z oxidáció-redukció módszer, melynek kulcs intermedierjei β-d-glikozid-2-ulózok. Feldtunk volt β-mnnozidos kötés htékonybb kilkítását célul tűzve ki szisztemtikus vizsgáltokt végezni β-d-glikozid-2-ulózok borohidridekkel végzett redukciójánk sztereoszelektivitását befolyásoló új fktorok megismerésére. Bn Bn SEt Me 43 46 All Bn 44 45 Bn All Bn Bn Bn Bn Bn SEt Bn Bn Bn ipr 55 56 4. ábr 6
Ezen vizsgáltokhoz előállítottuk β-d-glikozid-2-ulóz 45-öt és 46-ot. A 43-46, 55, 56 vegyületek különböző körülmények között végzett redukcióink eredményeit következőkben lehet összegezni: igzoltuk z eddig ismert tényezőknek (nomer konfiguráció, keto funkció szomszédságábn levő 3--szubsztituens jellege) rekcióbn betöltött szerepét, vlmint megfigyeltük redukálndó krbonil szomszédságábn lévő 3--benzil és 3--llil étereknek redukció sztereoszelektivitásár gykorolt zonos htását. Továbbá megállpítottuk, hogy 4,6--cetál jelenléte monoszchrid-ulozidok esetében kismértékben, míg diszchrid-ulozidok esetében ngymértékben rontj sztereoszelektivitást. Megfigyeltük z cetoxi-dimetil-szulfónium cetát ( ktivált DMS) különös htását, jelenlétében minden esetben jelentősen jvult β-mnno-szelektivitás ( 43-s és 46-os vegyületnél 7:3 91:9, 44-es és 45-ös ulózok esetében >10:1 >99:1). Egy egyszerű, preprtív szemponból rendkívül vonzó, áltlánosn lklmzhtó eljárást dolgoztunk ki, melynek hsznált kiváló β-mnno-szelektivitást, így z eddigieknél jobb hozmot tesz lehetővé 4,6--cetál védőcsoportok jelenlétében is, mono- és diszchridok esetében egyránt. 3. N-Glikoproteinekben előforduló core pentszchrid teljesen és prciálisn benzilezett glikozil-zidjink szintézise A legtöbb N-glikoprotein glikánbn megtlálhtó ugynzon core pentszchrid. Kuttócsoportunk célul tűzte ki szelektíven védett oligopeptidek és -benzilezett oligoglikozil-minok közötti kpcsolási rekcióknk, mind peptid, mind szénhidrát méretének függvényében történő vizsgáltához teljesen -benzilezett glikozil-zidok (melyek glikozil-minok prekurzori) soroztánk előállítását. Feldtul kptuk core pentszchrid teljesen és prciálisn benzilezett glikozil-zid formábn történő előállítását. Célvegyületeink (91 és 93) szintézisének lpját 3 és 6 helyzetben llil időleges védőcsoportot hordozó 60 diszchrid-tioglikozid preprálás képezte. A 62-es glükofurnóz llilezése szolgálttt 63-s szármzékot, mely vegyületet öt lépéses szintézisben lkítottunk 68-s glükopirnozil-bromiddá. A 68 glikozil donor és 69 glikozil kceptor kondenzációj, mjd z cetil csoport eltávolítás után β-mnnozidos 7
kötést z előző fejezetben ismertetett eredményekre lpozv, 71 szármzék oxidációt követő redukcióvl történő C-2 epimerizációjávl lkítottuk ki. A 73-s vegyület H All 5 lépés All Bn All Ac 68 Br + b Bn H Bn SEt 69 62 63 H All 3 Bn 3 2 1 Bn Bn SEt 1 2 3 c d e f g h 70 71 Ac H H H 72 73 H H 60 H Bn 84 H Bn 85 H Bn All All All All All H Ac 5. ábr: ) Bu 2 Sn, AllBr, Bu 4 NBr,Toluol b) AgTf, 4 Å, Toluol, CH 2 Cl 2 ; c) K 2 C 3, MeH/THF; d) DMS, Ac 2 ; e) Bu 4 NBH 4, THF; f) BnBr, Ag 2, KI, DMF; g) (PPh 3 ) 3 hcl, EtH;h) Piridin, Ac 2 benzilezése vezetett 60 diszchrid lkiltio-glikozidhoz, melynek llil csoportjit eltávolítottuk, szbd H funkciókt cetileztük ( 85). A 61 szelektíven védett glikozil-zidot megfelelő lkiltio-glikozid nomer centrumánk ktiválásávl állítottuk elő. A 85 glikozil donor és 61 kceptor kondenzációj szolgálttt 86 triszchridot, mjd z cetil csoportok eltávolításávl jutottunk 87 triszchridhoz, mely cél pentszchridok előállításához lklms glikozil kceptor. 8
85 + Bn H Bn 61 Bn Bn Bn Bn Bn Bn b 86 87 Ac H 6. ábr: ) NIS, AgTf, 4 Å, CH 3 CN, CH 2 Cl 2 ; b) K 2 C 3, THF/MeH A 87-es triszchrid kceptor és 88 donor kondenzációj vezetett 90 pentszchridhoz, melynek ftálimido csoportjit eltávolítottuk, mjd z mino csoportokt cetileztük ( 91). A 91 pentszchrid és kuttócsoportunk áltl már korábbn előállított mono-, di-, és triszchrid zidok nomer zid funkcióink kemoszelektív redukciój (Pt 2 /H 2 ) vezet teljesen -benzilezett glikozil-minokhoz. Ezen glikozil-minok és szelektíven védett oligopeptidek kpcsolási rekcióink vizsgáltát z mino funkciók in situ cspdáb ejtésével közeljövőben tervezzük. Mgsbb tgszámú glikozil-zidok előállítását célul tűzve ki 87-es triszchrid kceptor és 92 ezüst-triflát promoter jelenlétében végzett kondenzációjávl előállítottuk 93 pentszchridot is, mely vegyület 2 és 2 helyzetben időleges cetil csoportokt trtlmz, így lklms mgsbb tgszámú glikozil-zidok előállításár. 9
88 92 1 2 SEt Bn Cl Ac Bn Bn Bn 2 + 87 1 Bn Bn Bn 2 ill. b Bn Bn Bn Bn 2 Bn Bn Bn 1 1 2 Bn Bn 1 c, d 90 91 93 NHAc Bn Bn Ac 7. ábr: ) MeTf, 4 Å, CH 2 Cl 2 ; b) AgTf, 4 Å, CH 2 Cl 2, Toluol; c) Etilén-dimin, n-buh; d) Piridin, Ac 2 4. Zemplén dezcilezési rekciók vizsgált mnnozidok körében A Zemplén dezcilezés szénhidrátkémi leggykrbbn lklmzott rekciói közé trtozik. A Tnszék munktársi figyelték meg, hogy glüko- és glkto- vegyületek esetében z izolált helyzetű cil csoportokt nem lehet metnolbn ktlitikus mennyiségű nátrium-metiláttl eltávolítni. Feldtom volt néhány α- (101) és β-mnnozidot (96 és 97) előállítni, mjd z izolált helyzetű észter funkciók viselkedését ezeken és két diszchrid modellvegyületen (104 és 106) tnulmányozni Zemplén rekció körülményei között. 10
Ac Ac All Ac H H All Ac 96 97 Ac Ac Bn Me ktil Ac H H Bn 98 99 Me ktil 101 Me 102 Ac Me 103 H Bz Bz Bz -(CH 2 ) 7 -CH 3 Ac Ac Ac Ac 104 Bz Bz Bz -(CH 2 ) 7 -CH 3 H H H H 105 11
8. ábr: ) NMe, MeH Ac Ac Ac Ac 106 Ac Bn Bz -(CH 2 ) 7 -CH 3 H H H H 107 Ac Bn Bz -(CH 2 ) 7 -CH 3 9. ábr: ) NMe, MeH Megállpítottuk, hogy C-2 izolált helyzetű cil csoportj β-mnnozidokbn sokkl stbilisbb, mint z α-nomerekben. Úgy tűnik, hogy z cil csoportok nomális viselkedéséhez lpvetően nem z nomercentrum szomszédság, hnem izolált helyzete döntő tényező. Ez megfigyelés egyezik más kuttók tpsztltivl. Feltételezhető, hogy nem izolált helyzetű cil csoportok esetében (például 2,3,4,6-tetr--cetil-α-D-mnnopirnozil egységen) cil vándorlás mitt ngyon gyors z átésztereződés sebessége. 12
IV. Közlemények 1. Zoltán Szurmi, János ákó, Károly Ágoston, Alin Dnn, nd Dniel Chron β-glycosides of 2,3-dizido-2,3-dideoxy-D-mnnose, synthetic precursor of rre bcteril cell-wll building unit rg. Lett., 2 (2000) 1839-1842. 2. János Kerékgyártó, János ákó, Károly Ágoston, Gyöngyi Gyémánt, nd Zoltán Szurmi New fctors governing stereoselectivity in borohydride reductions of β-d-glycoside- 2-uloses - The peculir effect of ctivted DMS Eur. J. rg. Chem., 2000, 3931-3935. 3. Károly Ágoston, András Dobó, János ákó, János Kerékgyártó, Zoltán Szurmi Anomlous Zemplén decyltion rections of α- nd β-d-mnnopyrnoside derivtives Crbohydr. es., 330 (2001) 183-190. V. Elődások és poszterek 1. János Kerékgyártó, János ákó, Károly Ágoston, Johnnis P. Kmerling, nd Johnnes F. G. Vliegenthrt Synthesis of fully -benzylted glycosyl zides s precursors for the preprtion of N-glycopeptides Annul Meeting of the Committee of Crbohydrte Chemistry of the Hungrin Acdemy of Sciences. 14-15, My 1998, Mátrfüred, Hungry 2. János ákó, Zoltán Szurmi, János Kerékgyártó Improved stereoselectivities in Bu 4 NBH 4 reduction of β-d-glycoside-2-uloses Annul Meeting of the Committee of Crbohydrte Chemistry of the Hungrin Acdemy of Sciences. 9-10, My 1999, Mátrfüred, Hungry 3. János ákó, Zoltán Szurmi, nd János Kerékgyártó Improved stereoselectivities in Bu 4 NBH 4 reduction of β-d-glycoside-2-uloses 10th Europen Crbohydrte Symposium. July 11-16, 1999. Glwy, Irelnd Abstrcts PA074 4. János ákó, Károly Ágoston, Gyöngyi Gyémánt, Zoltán Szurmi, János Kerékgyártó New fctors governing stereoselectivity in borohydride reductions of β-d-glucoside- 2-uloses. The peculir effect of ctivted DMS. 6 th Europen Trining Course on Crbohydrtes. July 8-14, 2000. Debrecen, Hungry 13