Királis vegyületek elválaszt lasztása sa szimulált lt mozgóréteges kromatográfi fiával Veszprémi Egyetem, Vegyipari Mveleti Tanszék Dr. Szánya Tibor Témavezet Gál Gábor PhD hallgató Veszprém, 2006.január 13.
Királis racém keverékek kek elválaszt lasztása sa SMB berendezéssel Környezetvédelem (sóképzésen alapuló elválasztás alternatívái) Enantiomerek: egyik módosulat a gyógyszerhatóanyag a másik gyakran káros Optikai tisztaság (hatósági minségügyi követelmény) milliárd dollár 269 120 100 80 60 40 20 Enantiomerek száma az 500 legkeresetteb gyógyszer között 231 Királis gyógyszerkészítmények eladása egyéb enantiomer 0 1995 1996 1997 1998 2000
Enantiomer elállítási, szétválasztási Aszimmetrikus katalízis mveletek Biotranszformáció Folyadék-folyadék extrakció Kapilláris elektroforézis Membrános elválsztás Kapilláris elektrokromatográfia Szuperkritikus folyadékkromatográfia Gázkromatográfia Kristályosítás Kromatográfia Folyadékkromatográfia Vékonyréteg kromatográfia Centrifugális megoszlásos kromatográfia Szimulált mozgóréteges kromatográfia
A vizsgált anyagok EÉ racém keverék (50%S és 50%R izomer) BÉ keverék (78% 3R5S és 22% 3S5S) AC keverék (75% 4R6S és 25% 4S6S)
Kutatási cél Királis keverékek kek elválaszt lasztása sa SMB berendezéssel Királis kromatográfiás töltet és eluens kiválasztása analitikai HPLC-vel Frontális adszorpciós-elúciós mérések a kiválasztott tölteten Adszorpciós egyensúlyi és kinetikai adatok, NTP, HETP meghatározása laboratóriumi kísérletekkel Az SMB mvelet paramétereinek tervezése, matematikai modellezése (KROM-N, SMB-KROM-N) Az SMB preparatív folyadékkromatográfiás mvelet kísérleti tanulmányozása Kristályosítási kísérletek, tiszta optikai izomerek elállítása A matematikai modellezés összehasonlítása a gyakorlatban elért eredményekkel
S és R (EÉ) izomer
Királis kromatográfiás töltet és eluens A minta kiválasztása Disszociatív? AD, AS, OD Ersen Gyengén Nem Nem Nem Aromás vegyületek Nem Ciklo-alifások Igen Ciklo-alkánok vagy laktonok Foszforsav vagy szulfonsav Nem Primer amin Nem hidroxikarbonsav Nem Aminosav származékok Nem Igen Igen Igen Igen CR MA(+) WH, WE, WM, OD-R Igen Csak aromások Nem Aromás észterek Nem Egyéb OJ, OB Igen Igen Igen OT, OP, OD OJ, OB-H, OB, CA-1 OD-H, OD, AD, OG, OF, AS Igen OB, OA, AS OD-R FORDÍTOTT FÁZIS NORMÁL FÁZIS
Királis kromatográfiás töltet és eluens kiválasztása Chiralcel OD-H 5 m Chiralcel OJ 20 m Chiralpak AS 5 m Chiralpak AD 20 m Cellulóz trisz(3,5-dimetilfenilkarbamát) Cellulóz trisz(4-metilbenzoát) Amilóz trisz((s)-feniletilkarbamát) Amilóz trisz(3,5-dimetilfenilkarbamát) Chiralpak IA Amilóz trisz(3,5-dimetilfenilkarbamát) oldószerállóbb polimerizáció 5 m
Eluens HPLC mérések különböz tölteteken Összetétel Töltet [% V/V] Chiralcel OD-H Chiralcel OJ Chiralpak AS Chiralpak AD Chiralpak IA n-hexán:ipa 70:30 R S=1 n-hexán:ipa 80:20 R S=1,17 R S=1,196 n-hexán:ipa 90:10 R S=1,173 R S=1 R S=1 n-hexán:ipa 97,5:2,5 R S=1,06 n-hexán:ipa 95:5 R S=1,19 R S=1 R S=1,03 n-hexán:et-oh 95:5 R S=1,122 n-hexán:ipa:acn 80:10:10 R S=1 AcN 100 R S=1,31 R S=1 AcN-Me-OH 80:20 R S=1 R S=1 Etanol 100 R S=1 n-hexán:mtbé 80:20 k' 1,2 >20 n-hexán:mtbé 60:40 k' 1,2 =6,10 n-hexán:mtbé:et-oh (60:40)+5% Et-OH k' 1,2 =1,086 n-hexán:ipa RS =1,08 n-hexán:met-oh 99:1 R S=1,12 n-hexán:et-oh 99:1 R S=1,11 n-hexán:dkm 75:25 R S=1,03 n-hexán:ipa:etoh 95:2,5:2,5 α R S = 1,15 n-hexán:ipa:metoh 95:2,5:2,5 α R S = 1,05 n-hexán:etoh:metoh 95:2,5:2,5 α R S = 1,05 GILSON analitikai HPLC detektálás: 254 nm T = 20 C
NTP, HETP és meghatározása elúciós mérésekkel preparatív oszlopon S és R izomer (EÉ) adszorpciós egyensúlyi adatainak meghatározása Töltet: Chiralcel OD (20 µm) Oszlop: SUPELCO gyártmányú preparatív HPLC oszlop (D b = 1cm, L= 25cm) Elúció koncentráció-id görbe regisztrálása: UV spektrofotométer (254nm) Minta: 50 g/dm 3 eluensben oldott királis racém észter Injektálás: 100µl Eluens: n-hexán:ipa=95:5; 90:10; 80:20 Térfogatáram: 2,5-5-10-15-20-30 cm 3 /perc
Elúciós mérések 18 mérés A preparatív oszlopon kicsit magasabb alfákat mértünk, mint a HPLCn NTP: 100-400 között mozognak 8 k', α vs. n-hexán:ipa Chiralcel OD, B=2,5cm 3 /perc 50g/dm 3 racém minta, 100µl injektálás 1,4 7 1,2 kapacitási tényezk (k' 1,k' 2 ) 6 5 4 3 2 1 0 95:5 1 90:10 2 80:203 n-hexán : IPA k'1 k'2 α 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 szelektivitási tényez (α)
Frontális adszorpciós-elúciós kísérletek meghatároztuk az egyensúlyi adszorpciós tulajdonságokat és néhány töltetjellemzt: k, s k, R t R t t 0 0 k s = 1 ε, K ε k R = 1 ε, K R ε S = s = t R R t t 0 0 ε = 0,67 3 cm cm 3 folyadék oszlop a s = K s a R = K R 1 ε ρ H 1 ε ρ H ρ Η = 0,6 cm cm 3 3 töltet oszlop b S = b R értékét becsültük
2,5 2,0 c minta = 5 g/dm 3 B= 5 cm 3 /min RG OD FR 01 Eluens: n-hexán:ipa=95:5 [% V/V] c [g/dm 3 ] 1,5 1,0 0,5 S mért R mért S szim R szim 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 V [cm 3 ] Eluens: n-hexán:ipa=93:7 [% V/V] 7 6 5 c minta = 10 g/dm 3 B= 2,5 cm 3 /min RG OD FR 03 c [g/dm 3 ] 4 3 2 1 S mért R mért S szim R szim 0 0 20 40 60 80 100 120 140 V [cm 3 ]
A szimulált mozgóréteges kromatográfia LR OUT Szliárd recirkuláció IV III II I R B F A+B E A D Szimulált mozgóréteges kromatográfia
SMB mérések elkészítése szimulációkkal SMB-KROM-N program Kétkomponens S, R rendszer (EÉ) Oszlopkonfiguráció: 1:1:1:1 Nyitott eluens kör Eluens: 95:5 [%V/V] n-hexán:ipa 2 g racém keverék/dm 3 eluens Térfogatáramok: Morbidelli-féle sebességarányok alapján
) 1 ( ε ε = L L T A D m f I ) 1 ( ε ε = L L T A E D m f II ) 1 ( ε ε + = L L T A F E D m f III ) 1 ( ε ε + = L L T A R F E D m f IV A Morbidelli-féle kritériumok
Nem lineáris izotermák esetén
25 Morbidelli paraméterek 20 I. sorozat m III 15 10 5 II. sorozat III. sorozat IV. sorozat V. sorozat VI. sorozat 0 0 5 10 15 20 25 m II
V_01 V_02 V_03 V_04 V_05 VI_01 V_01 V_02 V_03 V_04 V_05 VI_01 V_01 V_02 V_03 V_04 V_05 VI_01 IV_02 30 25 20 15 10 5 0 "S" eluens fajlagos III_01 III_02 III_03 III_04 III_05 III_06 III_07 II_08 szimuláció azonosítója 120 100 80 60 40 20 0 "S" termelékenység IV_02 II_08 III_01 III_02 III_03 III_04 III_05 III_06 III_07 szimuláció azonosítója II_07 II_06 II_05 II_04 II_03 II_02 I_07 II_07 II_06 II_05 II_04 II_03 II_02 I_07 [cm 3 eluens/mg S] [mg S/g töltet nap] V_01 V_02 V_03 V_04 V_05 VI_01 IV_02 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 "S" tisztaság III_01 III_02 III_03 III_04 III_05 III_06 III_07 szimuláció azonosítója "S" kihozatal IV_02 II_08 III_01 III_02 III_03 III_04 III_05 III_06 III_07 II_07 II_06 II_05 II_04 II_03 II_02 I_07 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 szimuláció azonosítója II_07 II_08 II_06 II_05 II_04 II_03 II_02 I_07 [%] [%]
SMB mérések kislaboratóriumi méret SMB készülék 1:1:1:1 oszlop konfiguráció nyitott eluens kör oszlopok: D b = 1 cm, L = 25 cm ρ h = 0,6, ε=0,67 töltet: 20 µm Chiralcel-OD RG OD SMB 01-04 mérési eredmények összefoglaló Azonosító Eluens Minta RG OD SMB 01 RG OD SMB 02 RG OD SMB 03 RG OD SMB 04 n-hexán:ipa=95:5 [% v/v] 5g racém/dm 3 n-hexán:ipa=95:5-ben oldva Taktusid [min] D E F [cm 3 /min] R LR OUT 10 11,55 4,29 0,23 3,57 3,72 10 12,01 4,29 0,30 4,38 3,72 10 11,93 5,06 0,33 4,21 2,94 7,5 15,76 6,59 0,50 6,00 3,64
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Tisztaság [%] Kihozatal [%] Termelékenység [mg B/g töltet nap] Eluens fajlagos [cm 3 eluens/mg B] 0 1 2 3 4 Mérés
Bepárlásos, htéses kristályosítás Azonosító: RG OD SMB 01, 02, 03 A bepárlás utáni maradékok Minta Terület Terület % c [g/dm 3 ] S (B) R (A) S (B) R (A) S (B) R (A) Feed 2 801 895 4 077 607 40,73 59,27 2,50 2,50 E maradék R 1 maradék R 2 maradék 248 856 1 583 448 6 190 263 10 417 195 249 947 706 754 2,33 86,37 89,75 97,67 13,63 10,25 0,22 1,41 5,52 6,39 0,15 0,43 Azonosító: RG OD SMB 01, 02, 03 A kristályokról leöntött anyalúg Minta Terület Terület % c [g/dm 3 ] S (B) R (A) S (B) R (A) S (B) R (A) Feed 2 801 895 4 077 607 40,73 59,27 2,50 2,50 E anyalúg R 1 anyalúg R 2 anyalúg 245 665 1 552 999 1 631 666 2 663 823 328 510 407 000 8,44 82,54 80,04 91,56 17,46 19,96 0,22 1,39 1,46 1,63 0,20 0,25 Azonosító: RG OD SMB 01, 02, 03 Minta E kristály R 1 kristály R 2 kristály Kristályok elemzése Terület Terület % c oldat [g/dm 3 ] S (B) R (A) S (B) R (A) S (B) R (A) 0 7 494 662 0,00 100,00 0,00 6,14 186 782 0 100,00 0,00 0,15 0,00 6 544 846 0 100,00 0,00 5,20 0,00
Oldhatósági vizsgálatok
Kristályosítási vizsgálatok 2005.02.10 Arányok tiszta S 549/BK racém Bemérések RG OD KR BK 01 összesen "S" S R [mg] [l] [mg] [mg] [mg] [cm 3 ] [g] 80 20 12 8 4 78,3 21,7 11,3 8 19,94 15,62 4,32 3,9932 2,6355 85 15 14 6 4 84,5 15,5 14,4 6 20,88 17,64 3,24 4,0285 2,6588 90 10 16 4 4 89,5 10,5 16,3 4 20,62 18,46 2,16 3,9962 2,6375 95 5 18 2 4 94,7 5,3 18,1 2 20,26 19,18 1,08 4,0017 2,6411 98 2 19,2 0,8 4 97,9 2,1 19,6 0,8 20,46 20,03 0,43 4,0000 2,6400 "R" oldószer n-hexán 85:15 90:10 80:20 95:5 98:2
"S" RG OD KR BK 01 AL Anyalúg [4 cm 3 n-hexán] "R" Elemzések RG OD KR BK 01 KR Kristály [4 cm 3 n-hexánban oldva] "S" "R" teület [%] [g/dm 3 ] [mg] teület [%] [g/dm 3 ] [mg] teület [%] [g/dm 3 ] [mg] teület [%] [g/dm 3 ] 3 011 482 70,44 2,151 8,60 1 263 889 29,56 0,903 3,61 1 176 244 100 0,84 3,36 0 0,00 0 2 952 880 74,10 2,109 8,44 1 032 192 25,90 0,738 2,95 2 398 314 100 1,71 6,85 0 0,00 0 2 738 796 78,02 1,956 7,82 771 525 21,98 0,551 2,21 2 057 811 100 1,47 5,88 0 0,00 0 4 664 370 88,45 3,331 13,33 609 259 11,55 0,435 1,74 1 279 195 100 0,91 3,65 0 0,00 0 4 793 911 90,78 3,424 13,70 486 721 9,22 0,348 1,39 1 352 037 100 0,97 3,86 0 0,00 0
Htend oldat 20ºC 6 g/dm 3 koncentráció Oldat -20ºC-on Kristály S g/dm 3 R g/dm 3 S:R S g/dm 3 S R g/dm 3 S g 4,8 1,2 80:20 1,2 2,4 2,4 2,4 = 50% 4,8 5,1 0,9 85:15 1,2 1,8 3,0 3 = 5,1 58,8% 5,4 0,6 90:10 1,2 1,2 3,6 3,6 = 5,4 66,7% 5,7 0,3 95:5 1,2 0,6 4,2 4,2 = 5,7 73,7% 5,88 0,12 98:2 1,2 0,24 4,56 4,56 = 5,88 77,6% Htend oldat 20ºC 10 g/dm 3 koncentráció Oldat -20ºC-on Kristály S g/dm 3 R g/dm 3 S:R S g/dm 3 S R g/dm 3 S g 8 2 80:20 1,2 4 4,8 4,8 = 8 60% 8,5 1,5 85:15 1,2 3 5,8 5,8 = 8,5 68,2% 9 1 90:10 1,2 2 6,8 6,8 = 9 75,6% 9,5 0,5 95:5 1,2 1 7,8 7,8 = 9,5 82,1% 9,8 0,2 98:2 1,2 0,4 8,4 8,4 = 9,8 85,7%
Javasolt kristályosítási mvelet 5% IPA
SS és RS (BÉ) izomer
Királis kromatográfiás töltet és eluens kiválasztása analitikai HPLC-vel Mérések: RICHTER, analitikai HPLC Minta: tercier-butil-észter elegy (BÉ) Töltet: Chiralpak IB, Chiralcel OD Eluens: n-hexán:ipa T=20 C Eluens Összetétel [% V/V] t SS -t 0 [perc] t RS -t 0 [perc] 1925/SK (3. számú 1:1-es keverék) RS α SS n-hexán:ipa 95:5 21,14 38,64 1,828 n-hexán:ipa 92:8 10,82 18,58 1,717 n-hexán:ipa 90:10 7,83 12,98 1,658 MTBE:EtOH 99:1 2,08 2,65 1,274 MTBE 3,11 3,85 1,238 n-hexán:mtbe 70:30 - - - n-hexán:mtbe 30:70 9,4 12,21 1,299 n-hexán:etac 85:15 42,63 85,2 1,999 n-hexán:etac 75:25 13,36 25,09 1,878 n-hexán:etac 70:30 8,61 15,72 1,826 n-hexán:kloroform 65:35 9,45 16,07 1,701
RG OD FR BÉ 01 3,0 2,5 Eluens: n-hexán:ipa=80:20 c minta = 5 g/dm 3 B= 5 cm 3 /min c [g/dm 3 ] 2,0 1,5 SS mért RS mért SS szim RS szim 1,0 0,5 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 V [cm 3 ] 1,2 1,0 Eluens: n-hexán:ipa=80:20 c minta = 1,11 g/dm 3 B= 4 cm 3 /min RG OD FR BÉ 03 k' SS =3,057 a SS =3,4137 b SS =0,0139 k' RS =5,1939 a RS =5,7998 b RS =0,0574 0,8 c [g/dm 3 ] 0,6 0,4 SS mért RS mért SS szim RS szim 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 V [cm 3 ]
SMB szimulációk
Tisztaság [%] Kihozatal [%] Termelékenység [mg A/g töltet nap] Eluens fajlagos [cm 3 eluens/mg A] SMB SZIMULÁCIÓK 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 szimuláció sorszáma
A szimuláció és a mérés 120 Tisztaság [%] Kihozatal [%] Termelékenység [mg A/g töltet nap] Eluens fajlagos [cm 3 eluens/mg A] összehasonlítása 100 80 60 40 20 0 SMB_SZIM_08 BÉ SMB 01 mérés
4R6S és 4S6S (AC) izomer
Királis kromatográfiás töltet és eluens kiválasztása analitikai HPLC-vel Mérések: GILSON analitikai HPLC, T = 20 C detektálás: 254 nm UV hullámhosszon minta térfogat: 20 µl minta koncentráció: 5 g/dm 3 eluensben oldva térfogati sebesség: 1 cm 3 /min, = 0,67, D b = 0,46 cm, L= 25 cm, t o = 2,78 min Minta: acetonid elegy (AC) Eluensek: n-hexán, IPA, EtOH, MeOH, MTBÉ, ACN Töltetek: Chiralcel OD-H, OJ Chiralpak IA, AS, AD Legjobb mérés: Eluens [% v/v] Töltet (d sz = 10 µm) t R B [min] k B t R A [min] k A 4R6S k' A α 4 S 6S = k' B n-hexán 99 : IPA 1 Chiralpak AD 7,62 1,7 4 9,20 2,31 1,33
Eluens: n-hexán:ipa=99:1 c minta = 4,456 g/dm 3, c A(RS) =3,2 g/dm 3, c B(SS) =1,256g/dm 3 B= 2 cm 3 /min 4,0 RG AD FR AC 01 k' A(RS) =3,294 a A(RS) =3,6785 b A(RS) =0,072 k' B(SS) =2,2733 a B(SS) =2,5385 b B(SS) =0,079 3,5 3,0 2,5 c [g/dm 3 ] 2,0 1,5 A (RS) szim B (SS) szim A (RS) mért B (SS) mért 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 V [cm 3 ]
kihozatal [%] tisztaság [%] eluens fajlagos [cm3 eluens/mg A] AD SMB AC SZIMULÁCIÓK I.-IV. sorozat 100 500 90 450 80 400 70 350 60 300 50 250 40 200 30 150 20 100 10 50 0 I_1 I_2 I_3 I_4 I_5 I_6 II_1 II_2 II_3 II_4 II_5 II_6 II_7 II_8 IV_1 IV_2 IV_3 IV_4 IV_5 V_1 V_2 szimuláció sorszáma 0
8 7 6 miii 5 4 lineáris morbidelli háromszög torzult Morbidelli 3 munkapont, [4,609; 5,381] 2 2 4 6 8 mii
Extraktumok és Raffinátumok elemzése RG AD SMB AC 01 mérés 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 c [g/dm 3 ] 1,00 0,80 A (RS) komponens B (SS) komponens 0,60 0,40 0,20 0,00 E I. E II. E III. E IV 2/1. E IV 2/2. E IV 2/3. E IV 2/4. R I. R II. R III. R IV 2/1. R IV 2/2. R IV 2/3. R IV 2/4. frakció
Azonosító: RG AD SMB AC 01 A bepárlás utáni maradékok Minta Terület Terület % c [g/dm 3 ] A (RS) B (SS) A (RS) B (SS) A (RS) B (SS) Feed 3 419 822 1 275 983 72,83 27,17 3,64 1,36 E maradék R maradék 40 384 0 3 757 3 757 91,49 0,00 8,51 100,00 0,043 0,000 0,004 0,004 Azonosító: RG AD SMB AC 01 A kristályokról leöntött anyalúg Minta Terület Terület % c [g/dm 3 ] A (RS) B (SS) A (RS) B (SS) A (RS) B (SS) Feed 3 419 822 1 275 983 72,83 27,17 3,64 1,36 E anyalúg R anyalúg 3 763 245 0 100,00 0 1 903 021 0,00 0,00 100,00 4,01 0,00 0,00 2,03 Azonosító: RG AD SMB AC 01 Minta E kristály R kristály Kristályok elemzése Terület Terület % c oldat [g/dm 3 ] A (RS) B (SS) A (RS) B (SS) A (RS) B (SS) 59 678 839 326 6,64 93,36 0,06 0,89 0 121 443 0,00 100,00 0,00 0,13
Összefoglalás EÉ BÉ AC Céltermék B (S) izomer A (RS) izomer A (RS) izomer c Feed [g/dm 3 ] 10 10 10 D [cm 3 /min] 20 20 20 Kapcsolási id [min] 6 3,84 2,9 Tisztaság [% m/m] 99,9 99,9 99,9 Kihozatal [%] 99 86,44 96,63 Eluens fajlagos [cm 3 eluens/mg termék] 2,7 1,24 1,84 Termelékenység [mg termék / g töltet nap] 190,9 504,4 331,2
Tisztaság, kihozatal [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Tisztaság [% m/m] Kihozatal [%] 0 EÉ BÉ AC
termelékenység [mg termék/g töltet nap] 600 Eluens fajlagos, termelékenység eluens fajlagos [cm 3 eluens/mg termék] 3 500 2,5 400 2 300 1,5 200 1 100 0,5 0 EÉ BÉ AC = 1,2-1,3 = 1,8-2,2 = 1,3-1,5 0
További célok Egyensúlyi izotermák adatainak pontosítása További SMB mérések az AC és BÉ mintával Csatolt bepárlásos, htéses kristályosítás további vizsgálata AC és BÉ minták esetén
Publikációk,konferenciák Mszaki Kémiai Napok 05 Veszprém, 2005. ápr. 26-28, Eladás teljes szöveg megjelenéssel (konferencia kiadvány 100-104. oldal) Gál Gábor, Szánya Tibor, Hanák László, Argyelán János, Strbka Andrásné, Aranyi Antal, Temesvári Krisztina Enantioszelektív szimulált mozgóréteges folyadékkromatográfia gyógyszeripari alkalmazásának vizsgálata Diplomadolgozat Horváth Mária Királis észterek elválasztása szimulált mozgóréteges folyadékkromatográfiával VE Mérnöki Kar Vegyipari Mveleti Tanszék 2005 RICHTER díjjal kitüntetett diplomadolgozat Balaton Symposium 2005 Siófok, 2005. szeptember 7-9., Poszter G. Gál, L. Hanák, J. Argyelán, A. Strbka, T. Szánya1, A. Aranyi, K. Temesvári Simulated Moving Bed (SMB) Separation of Pharmaceutical Enantiomers