zilárd fázisú peptidszintézis polisztirol-divinilbenzol gyantán funkcionalizálás x x x els aminosav felkapcsolása W-H-CH 1 -C W-H-CH 1 -C W-H-CH 1 -C hasítás semlegesítés H 2 -CH 1 -C H 2 -CH 1 -C H 2 -CH 1 -C W-H- -CH karboxilcsoport aktiválás 1,4-divinil-benzol W-H- -CH-CH 1 -C W-H- -CH-CH 1 -C W-H- -CH-CH 1 -C ismétlés n-szer W-H-CH n -C H-CH 1 -C W-H-CH n -C H-CH 1 -C W-H-CH n -C H-CH 1 -C hasítás, tisztítás, stb. 1
zükséges feltételek a sikeres szilárd fázisú peptidszintézishez A) Hordozó polimer 1. Tartalmazzon funkcionalizálható reaktív rész 2. A kialakított peptid-polimer kötés hatékonyan hasítható legyen 3. tabil legyen fizikai behatásokra és a kémiai szintézis körülményei között 4. A növekv peptidlánc jó hozzáférhetsége az oldószerek és a reagensek számára B) Védcsoport kombináció 1. A peptid-polimer kötés stabil legyen végig a szintézis alatt 2. Átmeneti α-aminocsoport védelem 3. A szintézis során stabil oldallánc védcsoportok 4. A peptid-polimerkötés és az oldallánc védcsoportok egylépéses hatékony hasíthatósága C) eagensek 1. Aktiválószerk 2. Hasítóelegyek 2
zilárd fázisú peptidszintetikus stratégiák ét alapvet, széles körben használt stratégia a Boc/benzil és az Fmoc/t-butil kémián alapuló módszer. Boc/benzil stratégia Merrifield gyanta: H 3 C C H CH C híg savakra érzékeny (TFA/DCM) ers savakra hasad HF, TFMA A benzilészter típusú peptid-gyanta kötés elegenden stabil az ismételt savas hasításokra és részleges hasadásuk következik be. A Pam-típusú handle savra sokkal ellenállóbb peptid-gyanta kapcsolatot eredményez. PAM-gyanta: C C H fenilacetamidometil handle DCC Boc-aa 1 CH + H 2 néhány lépés Boc-aa 1 H és H 3 C CH vagy H 2 CH vegyületekbl kiindulva C-terminális peptidamidok elállítására más típusú szilárd hordozó szükséges MBHA-gyanta (4-metil-benzhidril-amin) savas hasítás (HF, TFMA) CH C 1 H CH 3
TFMA + H -hidroximetil-ftálimid 2 H 4 H 2 aminometil-gyanta antakapacitás meghatározása jeldahl meghatározás pikrinsavas titrálás jeldahl meghatározás: gyanta roncsolása cc. H 2 4 -val, 24 óra az oldat lúgosítása H 3 kidesztillálása, elnyeletés vízben titrálás 0,004M H 2 4 oldattal 4
Általánosan alkalmazott oldallánc-védcsoportok a Boc kémiában Funkciós csoport Védcsoport -H (er, Thr) Bzl Meb -H (Cys) Mob C H Acm -- (Met) - + C Bzl -CH (Asp, Glu) C chex -H 2 (Lys) H C (Cl) Z, ClZ 5
H C H 2 H Tos H C H 2 (Arg) H 3 C H H C H 2 H Mts H 3 C H (Tyr) C BrZ Br For H (Trp) CH 2 Tos (τ) π H (His) 2 2 Dnp (τ) τ Bom (π) 6
Boc-szintézis protokollja I. Peptid szekvencia: MW (védett peptid): (szabad peptid): II. iindulási polimer Boc C C H (PAM-gyanta) szubsztitúció (mmol/g): gyanta mennyiség (g): össz. mmol: III. Lánchosszabbítás DCC/HBt eljárással dátum: / / Aminosav Boc-származék MW: lépés reagens/oldószer id (perc) ismétlés A. hasítás 35% TFA/DCM 35% TFA/DCM 2 20 B. mosás DCM 1 C. semlegesítés 10% DIEA/DCM 1 D. mosás DCM 1 Boc-aminosav (3 ekv, g) E kapcsolás minimális térfogat DCM DCC/HBt (3 ekv, g) minimális térfogat DMF 30 F. mosás DMF 1 G. mosás DCM 1 H. ellenrzés ninhidrin negatív pozitív egatív teszt: folytatás az A lépéstl a következ aminosav-származékkal Pozitív teszt: újrakapcsolás (ismétlés a C lépéstl) 7
apcsolási módszerek és kapcsoló reagensek C C H DCC + -acil-izourea C H -acil-urea H HBt -CH H 2 -Q szimmetrikus anhidrid + DCU H 2 -Q C H peptid Q H 2 -Q Bt HBt aktívészter +DCU + H C H DCU H 3 C H 3 C CH F C DIPCDI F HC HBt H BP (H 3 C) 2 PF - 6 P + ( ) 2 ( ) 2 (H 3 C) 2 HBTU C + ( ) 2 PF - 6 + - F Pfp F F H HAt PF - 6 P + (H 3 C) 2 C + ( ) 2 BF - 4 + - Dhbt PyBP TBTU 8
7-aza-1-hidroxibenzotriazol (HAt) Apoláros, nehéz szekvenciáknálm sokkal jobb eredmény, mint HBTU, TBTU, BP H AP, HATU, TATU Z-Gly-Phe-H + H-Pro-H 2 DCC-HBt kollidin DMF 3,2% LDL DCC-HAt 1,5% DCC-HAt TFE-DCM (1:3) 2,8% BP DIEA DMF 4,1% HBTU 3,9% HATU 1,6% HATU kollidin 0,8% HAPyU DIEA 1,3% HAPyU kollidin 0,6% PyAP-HAt 0,3% HAPyU-HAt <0,1% 9
In situ semlegesítés chnölzer M. et al.: Int Pept Protein es. 40, 180 (1992) Problémák a semlegesítés és a kapcsolás alatt: C-terminális 1 v. 2 pozícióban Pro diketopiperazin képzdés, dipeptidvesztés a gyantáról piroglutaminsav képzdés láncletörés HBTU v. TBTU kapcsolódás útján acetilezdés (Boc-AA-k EtAc-ból kristályosítva bomlástermékként HAc-t tartalmaz 100% TFA hasítás 2x1 perc DMF mosás folyamatos v. többször kapcsolás, aktivált Boc-AA, DIEA 10 perc DMF mosás DIC/HBt esetén 1,5 ekv DIEA a gyantakapacitásra számolva HBTU esetén pl. 0,2 mmol gyanta, 0,8 mmol Boc-AA-H 0,76 mmol HBTU, 1,2 mmol DIEA A problémákat kiküszöbölték és racemizációt sem tapasztaltak! 10
Boc stratégia végs hasítási protokollja Tartalmaz-e a peptid His(Dnp) részt? Dnp eltávolítása; tiofenol-diea-dmf (3:3:4), 6x1óra;csak ezután TFA-hasítás Van-e Boc csoport az -terminálison? Boc-csoport hasítása; 50% TFA- Cl 2, 20 perc Hasító reagens kiválasztása HF TFMA TMTf Peptid Trp(CH) részt tartalmez-e? Trp(CH) deformilezése piperidin-dmf (1:1) 1-2 perc, 0 C Low-high TFMA Hasítás: HF-gyökfogó (pl. 10% anizol) 1 óra, -5-0 C 1M TMTf-tioanizol/TFA EDT, m-krezol 60-120perc, C tandard TFMA-hasítás: TFA-TFMA-gyökfogó (80:12:8); 30-120 perc, szobahmérsékleten 11
Mellékreakciók az 1 típusú hasításnál HF H + HC 2+ H Hasításnál karbokation keletkezik, amelyet megfelel gyökfogóval ki lehet iktatni a rendszerbl. HF alkilál: Tyr, Trp, Met, Cys C + H 2 + aromás amidok acilje Asp szukcinimid (α-, β-peptid) Glu Pyr C ( ) 2 H CH C C + ( ) 2 H CH C C ( ) 2 H CH C Glu-anizol adduktum H + H HF H CH C intramolekuláris H CH C H CH C intermolekuláris H H CH C karbokation elektrofilicitási sorrend Bu t < BrZ < chex < 2,6-ClBzl < Bzl 12 0,05% 0,1% 0,5% 5,0% 20% (%: 3-alkiltirozin mennyisége)
Tioanizol (1M) szerepe a hasításban pull-push mechanizmus ime 3 3 CF 3 CF 3 3 - ime 3 + C H 2 + H 2 H pl. = H 2 -CH-C 2 H Védcsoporthasítási reakció TMTf-tioanizol/TFA eleggyel TMTf gyorsabb, mint TFMA TFMA szobahmérséklet, a gyantáról való tökéletesebb hasításhoz BHA gyantáról hasítanak kielégíten m-krezol, EDT gyökfogók használata ajánlott 13
ökfogók (scavangers) enge szerves bázisok gyökfogóként peptidek ers savas hasításánál Alkilezdés elleni védelem* enge bázis körülbelüli pa Tyr Trp Met Met() redukciója Trp(For) védcsoport hasítása fenol -8 m-krezol -8 p-krezol -8 anizol -7 tiofenol -9,0 p-tiokrezol -9,0 3,4-ditiotoluol -9,5 1,2-ditioetán -8,5 etántiol -8,5 tioanizol -8,0 dimetilszulfid -7,0 tetrahidrotifén -6,5 1,4-tioxán -6,5 difenilszulfid 0 metionin -7 indol -2 toluol -13 2-tiopiridin -9,5 piridin +5 *: jó, : közepes, : gyenge -minél kisebb negatív érték a pa, annál kevésbé protonálja (inaktiválja) a sav a gyökfogót -azonos típus hatékony (Met, Trp) -tiofenol típus a legjobb, de stabilak gyökátvivk, más gyökfogóval együtt alkalmazva -DTT (Cleland-reagens) 1,4-dimerkapto-2,3-butándiol H szilárd, büdös, kissé polimerizál -javaslat: 10 ml HF : 1 g p-krezol: 0,1 g DTT CH CH H H 14 H
Low-High HF hasítás Tam.P. et al.: Int.. Pept. Prot. es., 20, 57 (1383) zármazékok Arg(Mbs), -(Mts), -(Pme), -(Z,Z) Arg(Tos), -( 2 ) Asp(Bzl) Asp(cHxl) Cys(MeBzl) Cys(Acm), -(MeBzl), -(Bzl) Glu(Bzl) Glu(cHxl) His(Mbs), -(Mts), -(Tos) His(Bom) His(Dnp) Lys(ClZ), -(Z) Lys(Tfa) Met() er(bzl) Thr(Bzl) Trp(For) Tyr(BrZ), -(Bzl) Tyr(2,6-Cl 2 Bzl) - -gyanta, - -PAM-gyanta -p-metilbenzhidrilamin-gyanta -benzhidrilamin-gyanta -p-aciloxibenzhidrilamin-gyanta Hasítás mértéke (%) 100 <10 100 <10 <80 <2 100 <10 100 <60 teljes (??) 100 <1 100 100 100 100 100 85 <85 <10 <10 <10 1. 0,2 mmol peptid-gyanta 1 ml p-krezol, 6,5 ml DM ( Trp(For) : 0,75 p-krezol 0,25 p-tiokrezol) 2. 2,5 ml HF 3. 2-3 óra 0 C-on hasítás 4. HF, DM elszívatás ( hosszadalmas lehet) 5. 10 ml HF (friss scavanger) 6. 45 perc 0 c-on hasítás 7. HF elpárologtatás HF-DM-p-krezol (25:65:10 v/v), 0 C, 3 óra low HF 2 típusú reakció high HF 1 típusú reakció low HF: Met() Met Trp(For) Trp képzdik közben karbokation low TFMA: 15% TFMA, 30% DM, 55% TFA 15
Fmoc/t-butil stratégia hasítás bázissal (piperidin/dmf) H H 3 C zerves szekunder aminok: Piperidin, morfolin, dietilamin DBU, TBAF CH C TFA-ra hasad A para-alkoxi szubsztituens csökkenti a peptid-gyanta kötés savval szembeni stabilitását A piperidinnel kiváltott Fmoc hasítás mechanizmusa + C 2 + H 2 H H C H piperidin dibenzofulvén-piperidin addukt ers UV-elnyelést mutat 304 nm-nél, ami alkalmas a detektálásra zámos lehetséget dolgoztak ki a peptid-gyanta közötti kapcsolat kialakítására, amelyek segítségével szabad karboxil vagy amid C-terminálisú peptidekhez, illetve védett peptidfragmensekhez juthatunk: 16
zerkezet Hasítás eletkez C-terminális H TFA CH p-alkoxi-benzil (Wang) gyanta H CH TFA CH 3-(4-hidroximetil-fenoxi)propionsav handle [Albericio & Barany, IP, 23, 342 (1984)] CH CH TFA H 2 4-(4 -metoxi-benzhidril)fenoxi-ecetsav handle [Breipohl et al., TL 28, 5651 (1987)] H 2 ( ) 4 CH TFA 5-(4-aminometil-3,5-dimetoxi-fenoxi)-valeriánsav handle [Albericio & Barany, IP 30, 206 (1987)] 1% TFA Cl 2 CH H ( ) 3 CH 4-(4 -hidroximetil-3-metoxi-fenoxi)-butánsav handle [Flörsheimer & iniker, Peptides 1990, 131 (1990)] 17
zerkezet Hasítás eletkez C-terminális H H Pd 0 CH hidroxikrotonil-aminometil gyanta (HYCAM gyanta) [unz et al., Peptides 1988, pp. 154-156] Cl Cl AcH CH 2-klór-tritil gyanta [Barlos et al., TL, 30, 3947 (1989)] AcH, híg TFA CH H Fmoc 4-(2,4 -dimetoxi-fenil-aminometil)-fenoxi gyanta [ink, TL, 28, 3787 (1987)] CH H AcH, híg TFA H Fmoc 4-(2,4 -dimetoxi-fenil-aminometil)-fenol handle [ink, TL, 28, 3787 (1987)] 18
Általánosan alkalmazott oldallánc-védcsoportok az Fmoc kémiában Funkciós csoport Védcsoport -H (er, Thr) -H (Cys) t Bu H (Tyr) -CH (Asp, Glu) C t Bu -H 2 (Lys) H C Boc -H (Cys) Ph Ph Trt Ph 19
H 3 C H C H 2 Mtr H H 3 C H 3 C H C H H 2 H C H H 2 Pmc H 3 C (Arg) H 3 C H C H Adoc 2 C Boc (τ) H π τ Bom (π) (His) Ph Trt (τ) Ph Ph 20
Fmoc-szintézis protokollja I. Peptid szekvencia: MW (védett peptid): (szabad peptid): II. iindulási polimer Fmoc -CH2-Φ- CH2-Φ- (Wang-gyanta) szubsztitúció (mmol/g): gyanta mennyiség (g): össz. mmol: III. Lánchosszabbítás DIC/HBt eljárással dátum: / / Aminosav Fmoc-származék MW: lépés reagens/oldószer id (perc) ismétlés A. hasítás 20% piperidin/dmf 20% piperidin/dmf 1 20 B. mosás DMF 1 C. kapcsolás Fmoc-aminosav (3 ekv, g) minimális térfogat DMF DIC/HBt (3 ekv, g) minimális térfogat DMF 30 D. mosás DMF 1 E. ellenrzés ninhidrin negatív pozitív egatív teszt: folytatás az A lépéstl a következ aminosav-származékkal Pozitív teszt: újrakapcsolás (ismétlés a C lépéstl) 21
Fmoc stratégia végs hasítási protokollja Tartalmaz-e a peptid Fmoc csoportot az -terminálison? Fmoc csoport hasítása; 20% piperidin/dmf 30 perc; szobahmérséklet Tartalmaz-e a peptid Arg, Met, Trp aminosavakat vagy Trt védcsoportot? Arg, Met tartalom a peptidben Hasítóelegy A: 95% TFA, 5% gyökfogó* Hasítóelegy B: 10 ml TFA 0,25 ml EDT 0,5 ml tioanizol 0,5 ml H 2 0,75 g fenol Trp vagy Trt védcsoportot tartalmaz-e a peptid? Hasítóelegy C: 95% TFA, 2,5% EDT, 2,5% H 2 *H 2, anizol, stb. 22
Ciklopeptidek kialakítása gyantán Bzl chex Boc-ALLEDPVG- MBHA Fm Bzl chex Boc-ALLEDPVG- MBHA Bzl H-ALLEDPVG- MBHA Bzl 0,2M TBAF/DMF (20 perc) 1) 40% TFA/DCM (1+20 perc) 2) 5% DIEA/DCM (3x1 perc) chex BP (6 ekv), DIEA (12 ekv)/dmf chex ALLEDPVG- MBHA HF-anizol (9:1) (1 óra, 0 C) Bzl chex Boc-ALLEDPVG- MBHA Bzl 1) 33% TFA/DCM (2+20 perc) 2) 1M TMTf-tioanizol/TFA (30 perc, 0 C) 3) 10% DIEA/DCM (3x1 perc) chex H-ALLEDPVG- BHA BP (6 ekv), DIEA (12 ekv)/dmf 1 éjszaka chex ALLEDPVG- BHA HF-p-krezol-DTT (10:1:0,1) (1 óra, 0 C) ALLEDPVG-H 2 ALLEDPVG-H 2 23
Diszulfidhíd kialakítása polimer hordozón Boc 1 7 10 Fm Fm Meb Meb 13 18 21 PAM Fmoc 1 Acm Acm 2 7 3 13 Tmob Tmob PAL Boc piperidin-dmf (1:1) 25 C, 3 óra Meb Meb PAM H H Acm 1) Fmoc hasítás 2) TFA-DCM-Et 3 ih-h 2 (7:92:0,5:0,5) H Acm PAL HF p-krezol (9:1) 0 C, 1 óra 0,02M CCl 4 -Et 3 /MP 20 C, 4 óra H H H H H Acm Acm PAL leveg oxidáció ph=8,0 25 C, 36 óra Tl(tfa) 3 (2ekv)/DMF-anizol (19:1) 4 C, 18 óra H H H PAL PAL: trisz(alkoxi)benzilamid linker 5-(4-Fmoc-)aminometil-3,5- dimetoxi-fenoxi-valeriánsav Tmob: 2,4,6-trimetoxi-benzil Tl(tfa) 3 : tallium(iii)-trifluor-acetát TFA-DCM-Et 3 ih-h 2 (95:4:0,5:0,5) 25 C, 2 óra H H 2 MP: -metil-pirrolidon 24