Embrionális neuroektoderma eredetű őssejtek beépülése az agyszövetbe: implantációs vizsgálatok klónozott idegi őssejtek felhasználásával Doktori tézisek Demeter Kornél MTA Kísérleti Orvostudományi Kutató Intézet Idegi Sejt- és Fejlődésbiológia Laboratórium Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Celluláris és Molekuláris Élettan Program Témavezető: Dr. Madarász Emília Hivatalos bírálók: Dr. Takács József, egyetemi docens Dr. László Lajos, egyetemi docens Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Faragó Anna, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Váradi András, osztályvezető, az MTA doktora Dr. Monos Emil, egyetemi tanár, az MTA doktora Budapest, 2006
Bevezetés A sérült idegrendszerben az idegsejtek nem pótlódnak, a kiesett funkciókat csak bizonyos esetekben veszik át más agyterületek. A betegség vagy sérülés okozta idegsejt pusztulás után nem, vagy csak részlegesen regenerálódnak az érintett idegsejtek. Ezért keltett meglepetést és reményt, amikor felfedezték a felnőttkori neurogenezist. Minden adat azt jelezte, hogy az agy néhány pontosan meghatározható helyén a szubventrikuláris zónában (SVZ), hippocampus (HC) gyrus dentatus szubgranuláris zónájában (SGZ) megtalálhatók a felnőttkori idegi őssejtek. A belőlük származó utódsejtek innen jól meghatározható agyi régiókba vándorolnak. A ma leginkább elfogadott nézet szerint az érett szövetek őssejtjei igen ritkán osztódnak, ezért volt nehéz a megtalálásuk, és nehéz ma is az azonosításuk. A szigorúan vett idegi őssejtek 3 alapvető kritérium alapján azonosíthatók: Önmegújító képesség, azaz aszimmetrikus osztódás során az egyik utódsejt őssejt marad, a másik gyorsabban osztódó sokszorozó sejtté alakul, és ennek utódsejtjeiből képződnek a vándorló progenitorok/prekurzorok. Osztódó képesség fennmaradása az egyed teljes élete során, bár az egyes osztódások között eltelt idő (G 1 -G 0 fázis) igen hosszú is lehet. Multipotencia, vagyis az a képesség, hogy az utódsejtekből neuron- és makrogliasejt típusok is kialakulhatnak. A dolgozatomban progenitor sejteknek nevezem azokat a sejteket, amelyek már nem képesek aszimmetrikus osztódásra, ezért csak magukkal azonos utódsejteket hoznak létre. A progenitor sejtek egy adott fejlődési stádiumban levő osztódóképes sejtpopuláció megnövelésére szakosodott átmeneti sejtalakok. Neuronális prekurzor-sejteknek, idegi elő-alakoknak azokat az unipotens sejteket nevezem, amelyek már nem osztódnak, és belőlük kizárólag idegsejtek alakulnak. Az idegi őssejteket in vivo megtalálni, és tiszta sejtpopulációként előállítani fontos feladat mind a kutatások, mind a jövőben lehetséges sejtterápiás eljárások szempontjából. Igazi őssejt-specifikus marker-molekulát azonban még nem ismerünk. Leginkább molekula kombinációkat érdemes keresni, melyek együttes jelenléte jellemezheti az őssejtet. Az idegi őssejtekben mindig megtalálható a nestin intermedier filamentum, de különböző idegi őssejt populációk tartalmazhatnak GFAP-t, hordozhatnak SSEA-1 antigént. - 2 -
Véleményem szerint az őssejt tulajdonság egy sejtélettani állapot, amelyet elsősorban a nagyfokú mitotikus aszimmetria jellemez, és amelyet egy differenciálatlan sejtben a külső környezet indukálhat. Ma nem kizárható, hogy egy adott sejt, vagy annak utódai a szöveti fejlődés különböző stádiumaiban többször is őssejt állapotba juthatnak. Ennek bizonyítása azonban nem a dolgozatom témája. Felnőttkori neurogenezist sok tényező befolyásolja: az életkor változása, növekedési faktorok és hormonok jelenléte, ma még teljesen nem feltárt asztroglia populációk megjelenése, inger-gazdag környezet, stressz, stb. Számos idegsejtvesztéssel járó betegséget (Parkinson-, Huntington-kór), sérülést próbáltak már klinikai körülmények között őssejtek felhasználásával gyógyítani, de az implantációs próbálkozások nem hoztak áttörést. Kezdetben humán embrionális idegsejteket használtak fel, amely súlyos etikai problémákat vet fel. Távlati elképzelések szerint (egyes országokban már klinikai gyakorlatban is) köldökzsinór-vérből izolált sejteket lehet sejtterápiás célra használni. Az alkalmazásba gyorsan bevont őssejt-terápia elméleti alapjai azonban még tisztázatlanok. Sem az alkalmazandó őssejtek sajátságait, sem a befogadó szöveti környezet jellemzőit nem ismerik kellőképpen. A világ minden részén intenzív kutatások folynak ezen kérdések tisztázására. Az osztódóképes ős-, progenitorsejtekből előállíthatók sejtvonalak, amelyekből klónozással egyetlen sejtből származó, feno- genotípusukat tekintve homogén sejtek tömege nyerhető. Az ilyen sejt-klónok nagy előnye, hogy reprodukálható kísérletekhez biztosítanak gyakorlatilag korlátlan sejtanyagot. Folyamatosan osztódó, önmegújító, de indukciós hatásokra neuronná fejlődni képes sejtvonalakat azonban nem egyszerű létrehozni: a sejtet immortalizálni kell. Manapság számos ilyen sejtvonal létezik (GT-1, HD 10.6, HiB5, C17, NFB4), köztük a laboratóriumunkban használt és jellemzett NE- 4C idegi őssejtvonal. A homogén idegi sejtvonalakba gyakran transzfektálnak olyan fehérjéket kódoló géneket, amelyek terápiás hatását feltételezik, vagy vizsgálni szeretnék. Sejt-integrációt és idegsejt irányú differenciációt támogató szöveti környezetet mesterségesen is ki lehet alakítani, ha olyan niche -t biztosítunk, amelyben a befogadó szövet szerkezete fellazul, de gyulladásos, nekrotikus, gliótikus folyamatok nem veszélyeztetik a sejteket. A sejthiány lehetővé teszi a beültetett sejtek legalább átmeneti letelepedését, és kedvez a nyúlványnövekedésnek. Legmegfelelőbb őssejt- - 3 -
niche -t eredményező beavatkozásnak az apoptotikus sejtszám csökkentés tűnik, melynek során gyulladásos folyamatok provokálása nélkül lazul fel a szövet. Annak ellenére, hogy idegsejt képzésre képes, multipotens sejtek az egész élet során jelen vannak az emlős agyban, és naponta akár több ezer is képződhet, sérülés vagy betegség során az elpusztult neuronok nem, vagy csak korlátozott mértékben pótlódnak felnőtt korban. Ennek magyarázatára három lehetséges feltevés adódik: 1. A felnőtt központi idegrendszerben fennmaradó neurális őssejtek utódsejtjeiből csak meghatározott fenotípusú neuronok képződhetnek. Az őssejtek az állat életkorával párhuzamosan, az érés/öregedés során elköteleződnek, fejlődési potenciáljuk szűkül. A felnőttkorban születő sejtek késői típusú, rövidnyúlványú idegsejtekké vagy gliasejtekké alakulhatnak, és csupán meghatározott agyi régiók felé vándorolhatnak. 2. A felnőtt központi idegrendszer progenitorsejtjei ugyan létrehozhatnak széles fejlődési potenciállal rendelkező utódsejteket, de ezek szöveti integrációját a felnőtt agy szöveti környezete meggátolja. A megváltozott extracelluláris mátrix, növekedési faktoregyüttes, stb. nem teszi lehetővé az un. korai előalakok beilleszkedését és/vagy túlélését. i. A széles fejlődési lehetőségek közül a felnőtt agyban csak a késői sejtfenotípusok manifesztálódhatnak: a környezet hatására a progenitorokból késői neuronok vagy gliasejtek fejlődnek. Az embrionális típusú sejtek kialakulását az érett szöveti környezet nem indukálja. ii. A keletkező sejtek közül kiválogatódnak azok, amelyekből kis interneuronok és/vagy gliasejtek alakulnak ki. Amennyiben az agyi neurogenezis beszűküléséért a felnőtt korban működő őssejtek korlátozott fejlődési potenciálja és nem a kifejlett agy szöveti környezete a felelős, az agyba juttatott embrionális típusú őssejtekből változatos idegi sejttípusok fejlődhetnek különböző agyterületeken. Ha azonban a kifejlett agyi környezet szűkíti a fejlődési lehetőségeket, az embrionális elő-alakokból is csak a felnőttkori sejtképzésre jellemző fenotípusok alakulhatnak ki. - 4 -
Célkitűzés Az idegi őssejtek szöveti integrációjának vizsgálatára embrionális eredetű, differenciálatlan, geno- és fenotípusát tekintve homogén neuroepitheliális őssejteket implantáltam felnőtt, újszülött és embrionális agy elülső régióiba, illetve különböző neurológiai kórképeket modellező állatok előagyába. Az in vivo modell-rendszer használatával az alábbi kérdésekre kerestem választ: 1. Miként befolyásolja az életkor az idegi őssejtek szöveti integrációját az adott agyi régióban? 2. Hogyan befolyásolja az őssejtek sorsát a befogadó agyszövet fiziológiai állapota? In vitro kísérletekkel vizsgáltam, hogy milyen kölcsönhatások alakulhatnak ki tumorosan transzformált agyi sejtek és az idegi őssejtek között. 1. Befolyásolják-e egymás osztódóképességét a tumorsejtek illetve az idegi őssejtek által termelt szolubilis faktorok? 2. Létesülnek-e közvetlen sejt-sejt kapcsolatok a különböző tumorsejtek és az őssejtek között? Anyagok és módszerek A kísérletekhez felhasznált sejtvonalak (NE-4C, GFP-4C, PLAP-4C, C6, U87, Gl261, LL-glia, asztroglia tenyészet) fenntartása. Az NE-4C sejtek és alklónjai in vitro neuronális indukciója retinsavval Az osztódó sejtek jelölése BrdU-val. Életképesség mérés MTT-redukcióval. Proliferációs képesség mérése 3 H-timidint inkorporációval. Kromoszómaszám meghatározás. A sejtek kontakt-kölcsönhatás vizsgálata függőcseppekben. Fagyasztásos lézió és agyi tumor: pathofiziológiás állatmodell létrehozása. Implantáció felnőtt újszülött és embrionális korú állatokba, és sérült agyi környezetbe. Transzkardiális perfúzió, fagyasztásos metszet készítés. Immuncitokémiai festések. Statisztikai analízis - 5 -
Eredmények A laboratóriumunkban klónozott és jellemzett, p53 -/- 9 napos egérembrió elülső agyhólyagjaiból származó NE-4C idegi őssejtvonalat, illetve annak markergénnel (zöld fluoreszcens fehérje, hőrezisztens placentális alkalikus foszfatáz) jelölt alklónjait (GFP- 4C, PLAP-4C) ültettük be különböző életkorú egerek előagyi régióiba. Ép agyszövetbe ültetett őssejtek sorsa A felnőtt, ép agyszövetbe beültetett indukálatlan NE-4C őssejtek nem vándorolnak, és nem integrálódnak a gazdasejtek közé. Korlátozott mértékben egymás környezetében (saját sejtekből álló aggregátumokban) osztódnak, de hosszú távú (> 6 hét) túlélésre az aggregátumon belül sem képesek. Az idegszöveti differenciáció mértéke elhanyagolható. Az aggregátumon belüli sejtekből eredő nyúlványok ugyanakkor képesek benőni a befogadó parenchimába. Egyedi sejtek csak a felnőtt neurogenetikus területeken (SVZ) élnek túl 6 hétnél tovább. Az implantált sejtek az újszülött állatok agyában kiterjedt aggregátumokat képeztek, a környező befogadó szövetet összenyomták, annak rovására terjeszkedtek. A kolóniák mérete hat héttel a műtét után sem csökkent, sőt, néhány esetben a koponyát is deformálták a tumorszerűen növekedő sejtek. Az implantált NE-4C sejtek osztódási képessége és túlélési ideje jelentősen megnőtt az újszülött agyban. A gazdaszövetbe való beépülést és az idegszöveti differenciálódást azonban a perinatális, majd a fiatal fejlődő és érő szöveti környezet nem segítette. Laboratóriumunk korábbi eredményei azt mutatták, hogy az NE-4C sejtek beépülnek a korai embrionális csirkeagyba, és ott idegsejtekké differenciálódnak. Ezért megkíséreltem egér embriók agyába, in utero implantálni az NE-4C sejteket. Az embrionális egéragyba történő implantáció nehézségeit az eredmények változatossága is tükrözte. Mivel a sejteket a méh falán átszúrt kapilláris segítségével jutattuk az embrió agyába, az implantálható embriók körét meghatározta az embrió kora. In utero beültetést 13-16 napos egérembriókon tudtunk végezni. A magzatokat születés előtti napon császármetszéssel kiemeltük a méhszarvból, hogy az esetleg sérült állatokat se veszítsük el. Így az általunk használt protokoll csak 3-6 napos túlélést, azaz egy rövid fejlődési időszakot biztosított a beültetett sejteknek a prenatális agy szöveti környezetében. A beültetett sejtek nem határolódtak el élesen a befogadó agyszövettől, - 6 -
és a magzati agyi környezet nem késztette fokozott proliferációra az implantált NE-4C sejteket. Adataim egyértelműen megmutatták, hogy a beültetett sejtek sorsa a befogadó környezettől függ. További kísérletekben a szöveti környezet tulajdonságait változtattuk meg: mesterségesen létrehozott agyi lézió környezetében és tumorok közelében vizsgáltuk az NE-4C őssejtek in vivo sorsát. Megváltoztatott fiziológiai állapotú agyszövetbe ültetett őssejtek sorsa Az agyi sérülés modellezéséhez fagyasztásos léziót alkalmaztunk. Az NE-4C sejteket a penumbra régióba implantáltuk, a sértés szélétől 1mm-re laterálisan. A beültetett 10 000db GFP-4C sejt túlélését, osztódását, differenciálódását az implantációt követő 7. 14. 23. és 55. napon vizsgáltuk. Az implantáció utáni első két hétben a GFP- 4C sejtek kolóniákat képeztek a penumbra régióban. A sértés mag-régiójában nem találtunk jelölt sejtet. 5-8 héttel az implantáció után GFP-4C sejtek nőttek a lézió teljes területére, ideértve az egykori mag és penumbra területeket is. A beültetett sejtek élesen elhatárolódtak a lézió és az ép agyszövet határán kialakult gliális hegtől. Az ép kéregben nem találtunk egyetlen GFP-4C sejtet sem. Az implantációt követő első két hét alatt a GFP-4C sejtcsoportokban idegszöveti differenciációt nem láttunk. 3-6 hetes túlélés után megjelentek GFAP immunpozitív GFP-4C eredetű sejtek, de érett neuronokra jellemző sajátságokat egyetlen beültetett sejtben sem láttunk. Annak eldöntésére, hogy a sérült agyban tapasztalt fennmaradó sejtosztódást a beültetett sejtek közül szelektálódott, megváltozott sejtpopulációk okozták-e, az implantációt követő 55. napon 4 állatból kivettük és in vitro tovább tenyésztettük a GFP-4C sejteket (GFP-RC: rekultivált GFP-4C). A sejtek morfológiai és immuncitokémiai vizsgálatai szerint az eredeti GFP-4C és a GFP-RC sejtek azonos sajátságokat mutattak. A sejtszámváltozást jelző életképesség-mérések adatai szerint, osztódásuk mértéke és duplikációs idejük is megegyezett az eredeti sejtvonaléval. Nem találtunk eltérést a kromoszómaszámban és a GFP-RC sejtek differenciációs képessége is megegyezett a GFP-4C sejtek indukciós folyamatával. Felnőtt, ép egerek kérgébe újra beültettük a visszatenyésztett sejteket. Az ép agyba visszaültetett sejtek tumorosan nem osztódtak, és 6 hétnél tovább nem maradtak fenn. A sejtek nagyobb mértékű növekedését, jobb túlélését a károsított agyszövetben kizárólag a lézionált agy megváltozott szöveti környezete okozta. - 7 -
Miután a lézionált agyban túlélt a beültetett NE-4C őssejtvonal GFP-t hordozó alkónja, feltettük a kérdést, vajon alkalmas-e ez az őssejtpopuláció az irodalmi adatokból ismert tumorcélzásra: felhasználható-e arra hogy segítségével tumorellenes anyagokat juttassunk a tumorba, vagy annak közelébe. Ehhez meg kellett vizsgálni, hogy a tumoros agyszöveti környezetben képesek-e vándorolni az NE-4C sejtek, megtalálják-e a tumort, és be tudnak-e hatolni a tumorsejtek közé. Mindezekhez meg kellett vizsgálni, hogy az őssejtek és tumorsejtek találkozása nem vált-e ki váratlan növekedést akár a tumor-, akár az őssejt populációban. Vajon a kétféle sejt membránfelszínei és szekretált faktorai befolyásolják-e egymás proliferációját, vándorlását és a közvetlen sejt-sejt kapcsolatok alakulását? A kölcsönhatások in vitro elemzéséhez C6 patkány glióma, Gl261 egéreredetű glioblasztóma, spontán immortalizált egérglia (LL-glia) és U87 humán asztroglióma sejtvonalakat valamint NE-4C, GFP-4C, és egér eredetű primer asztroglia sejteket használtunk. NE-4C sejteket, illetve tumor vagy primer asztroglia sejteket szérummentes tápoldatban növesztettük 24 órán át, és a sejtek által kondicionált médiumokkal (KM) eltérő típusú sejteket kezeltünk. A sejtciklusra ható, szekretált faktorok hatását 3 H- timidin beépülés mérésével vizsgáltuk. A különböző gliómasejtekről és az asztrogliáról származó KM nem befolyásolta az NE-4C sejtek 3 H-timidin felvételét. KM NE-4C növelte a 3 H-timidin beépülést az asztroglia és a C6 gliómasejtek esetében, míg a Gl261 és U87 tenyészetekre ilyen hatása nem volt. Az őssejtek anti-tumor terápiás felhasználásához igazolni kell, hogy a beültetendő sejtek képesek a tumorsejtekkel keveredni, ezért az idegi őssejtek és különböző glióma illetve primer asztroglia sejtek adhezív kölcsönhatásait közvetlen sejt-sejt kapcsolatokat biztosító tenyésztési feltételek mellett, függőcsepp tenyészetben vizsgáltuk. A kapcsolódó sejtfelszíni molekula-összetétel alapján az egymással nem vagy gyengén kapcsolódó sejtek szegregálódnak. A primer asztrogliasejtek mindegyik gliómasejttípussal keveredtek, de az NE-4C sejtektől elkülönültek. A C6, U87 glióma és az LLimmortalizált glia sejtekkel készült kiméra aggregátumokon belül az NE-4C sejtek szegregálódtak, a Gl261 glioblasztóma sejtek és az NE-4C őssejtek azonban egyenletesen elkeveredtek egymással. Az in vitro elő-kísérletek alapján az NE-4C őssejtek lehetséges alkalmazását tumorok in vivo célzására a Gl261 gliómákon vizsgáltuk. - 8 -
Az NE-4C sejtek tumor környezetben várható viselkedését két eltérő implantációs protokoll segítségével, PLAP-4C sejtek beültetésével vizsgáltuk. i.) A PLAP-4C sejteket már kialakult Gl261 tumor közelébe ültetve, hét nap után 5 állatból háromban megtaláltuk a glióma közelében. A 14. posztoperatív napon vizsgált állatokban (n=5), azonban egyetlen PLAP-4C sejtet sem találtunk. A glióma és őssejt telepek a korábbi időpontban is egymástól elkülönülten fordultak elő. A tumorsejtek kemoattraktív hatást nem gyakoroltak, jelenlétük az őssejtek migrációs aktivitását nem fokozta. ii.) Ha Gl261 glioblasztóma és PLAP-4C őssejtek kevert szuszpenzióját ültettük be egészséges egerek agyába, a hetedik műtét utáni napon minden állatban megtaláltuk a PLAP-4C és Gl261 sejteket. Két hét túlélés után minden állat megnövekedett graftállományt hordozott. A kialakult tumoron belül a PLAP-4C sejtek aránya csökkent a Gl261 sejtekhez képest. A tumorba ágyazódva az NE-4C őssejtek a felnőtt agyban túléltek. A Gl261 glióma kedvező szöveti környezetet biztosít az NE-4C őssejtek fennmaradásához. Azonban olyan kemotaktikus anyago(ka)t, amely(ek) segítené(k) az őssejtek vándorlását a tumor felé nem, vagy nem elegendő mennyiségben szekretál. Következtetések i i i i i Doktori munkám legfontosabb eredményeit az alábbiakban foglaltam össze: Az ép felnőtt agyszövetben az indukálatlan őssejtek csak a neurogenetikus zónákban maradnak fenn hosszú ideig. Az agyszövet sejtvándorlást gátló hatásai miatt a parenchimába ültetett őssejtek új idegsejtek képzésére nem képesek. Fiatal posztnatális agyi környezetben az implantált sejtek tumorszerűen expandáló aggergátumokat képeznek. A fiatal agyszövet az őssejtek proliferációját támogatja, de a neuronális differenciálódást nem segíti. A korai embrionális agyszövetbe beültetett sejtek beépülnek a gazdaszövetbe. A lézionált felnőtt agyban az NE-4C őssejtek a fejlődő posztnatális környezetben látott módon viselkednek. Tartós és célzott jelenlétük génbevitelre alkalmassá teszheti őket, de a sértett agyszövet elemeinek pótlására nem használhatók. Az NE-4C őssejtek tumorok célzására (anti-tumor hatóanyagok célzott lokális termeltetésére) csak meghatározott glioblasztómák esetén lehetnek alkalmasak, és - 9 -
csak akkor, ha az épen maradt szövet migrációt gátló hatásait sikerül felfüggeszteni. Kísérleteinkkel bizonyítottuk, hogy a befogadó agyszövet életkori/fejlődési, fiziológiai állapota alapvetően megszabja a beültetett őssejtek sorsát. További vizsgálatainkkal kívánjuk tisztázni, hogy az őssejtek in vitro elő-differenciáltatásával nyert idegi előalak-sejtek milyen módon válaszolnak az eltérő szöveti környezet hatásaira. Köszönetnyílvánítás Köszönettel tartozom mindenekelőtt Dr. Madarász Emíliának, témavezetőmnek, hogy az általa vezetett kutatócsoportban végezhetem doktori munkámat. Ezen felül tanárom, tanácsadóm, kritikusom, bátorítóm volt az elmúlt évek során, segítségére bármikor számíthatok. Köszönetet mondok a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudomány Kutatóintézet és a Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, vezetőinek, hogy a doktori képzésében vehettem részt. A legtöbb segítséget, munkámban való közreműködést az Idegi Sejt- és Fejlődésbiológia Laboratóriumban dolgozó kollégáimtól kaptam, kiemelve dr. Zádori Anita, Dr. Herberth Balázs, dr. Ágoston Viktor munkatársaimat. Továbbá köszönöm, Barabás Kornélia, Johnatan Davis, Gaál Katalin, Hádinger Nóra, Dr. Jelitai Márta, Dr. Környei Zsuzsanna, Laczkó Ferencné, Dr. Inna Levkovets, Markó Károly, Nyámándi Piroska, Orsolits Barbara, Dr. Schlett Katalin, Szlávik Vanda, Tárnok Krisztián, Varga Balázs, Dr. Varju Patrícia, Vörös Erzsébet együttműködését, segítőkészségét, és a gördülékeny labormunka háttrének biztosítását. Köszönöm a hivatalos bírálóknak, illetve a házi opponenseknek a dolgozatom gyors, alapos és kritikus bírálatát, építő észrevételeit. Köszönöm családomnak, Feleségemnek és Szüleimnek hogy bátorításukkal, szeretetükkel mindig mögöttem álltak, egyengették utamat. Végül köszönöm barátaim támogatását, imádságait és Isten kegyelmes szeretetét. - 10 -
Saját publikációk jegyzéke Demeter K, Herberth B, Duda E, Domonkos A, Jaffredo T, Herman JP, Madarász E. 2004. Fate of cloned embryonic neuroectodermal cells implanted into the adult, newborn and embryonic forebrain. Exp Neurol. 188(2):254-67. Demeter K, Zádori A, Ágoston VA, Madarász E. 2005. Studies on the use of NE-4C embryonic neuroectodermal stem cells for targeting brain tumour. Neurosci Res. 53(3):331-42. Ágoston VA, Zádori A, Demeter K, Nagy Z, Madarász E. Altered behaviour of neural stem cells in intact and lesioned brain areas. Közlés alatt a Neuropathology and Applied Neurobiology folyóiratban. - 11 -