Fehérjék stabilitása: stabilitási fázisdiagram, extrém körülmények, termofil és iezofil enzimek meller László Destabilizáló környezeti araméterek Fizikai magas hőmérséklet alacsony hőmérséklet nyomás Kémiai urea nagy koncentrációban GuHl [guadinium klorid] nagy konc. Fizikai araméter: hőmérséklet Kétállaotú modell: natív N és denaturált D HH D -H N H H H + d + d Az átmeneti hőmérsékleten -n: G N G D azaz: G G D -G N G H D - N ha független a hőmérséklettől: H + d H + H + d + ln
H d H H + + H H H + + ln d H H H H G ln ln G c G c G max NAÍV DENAURÁL DENAURÁL ABILI ABILIÁ G N D e w w
Hideg denaturáció Gyakran alatt Méréstechnikai roblémák Megoldás: más denaturáló ágens használata: destabilizáció, c emelkedik. a víz fázisdiagramjának kihasználása: nyomás alatt akár - -ig le lehet menni Mioglobin PGK
A víz fázisdiagramja A nyomás-hőmérséklet fázisdiagram Miért érdekes a nagy nyomás? Milyen nagy nyomás? Miért ne? termodin. aram.,,.. A bioszférában 1 bar 1 kbar echnikailag nehéz 1 bar-os atmoszférában élünk emberi élet 1 bar 1 kpa max. nyomás a bioszférában:1 kbar mélytengerek 1 Ma fehérje szerkezetváltozások 5-1 kbar.5-1 GPa a víz megfagy szobahőm.-en 1 kbar 1GPa Olyan adatok nyerhetők amelyek 1bar-on is értelmezhetőek a bolygók közontjában ~ Mbar 1 GPa a laboratóriumban elért néhány Mbar n.1 GPa 1 bar,1 MPa 1 kbar 1 MPa 1 kbar 1GPa 1Mbar1GPa
Milyen hatása van a nyomásnak? Le-hatelier-Braun-elv nyomás <-> térfogat nyomás V 1 V nyomás <-> térfogat nyomás Milyen hatása van a nyomásnak a fehérjékre? Nyomásdenaturáció V 1 V Fehérje oldatok G ln K R V V ln K + konst. R V rotein V atom +V void +V hydration
Nyomásdenaturáció: lizozim Nyomásdenaturáció: lizozim Amide II 75mg/ml back to.1 MPa Amide I max. osition [cm -1 ] 1/ 6.95 kbar 695 MPa @3 Amide II intensity [a.u.] 1/ 5.83 kbar 583 MPa @3 amide I 9 MPa.1 MPa A nyomás-hőmérséklet fázisdiagram A hőmérsékleti és nyomásdenaturáció egységes termodinamikai leírása A kétállaotú modell: N <-> D GG D -G N Egy referenciaontból indulva integráljuk ki a dg -dt+vd mennyiséget a, ontig: G, G + dt + Vd
1 ln G V G + + + + α β ahol: V β / V / / α / az ún. komresszibilitási faktor, a hőtágulási együttható, az állandó nyomáson mért fajhő esetén: 1 ln + G V G + + + α β Ha α > β /,akkor a G, ontok a síkon egy elliszist határoznak meg A denaturációs ontokon: G Másodfokú -ben is és -ben is!
Kísérleti eredmények - fázisdiagramokra Mennyire igaz ez a kétállaotú modell a valódi fehérjékre, fehérjeoldatokra? Mioglobin Lizozim sak egy denaturált állaot létezik? Intermolekuláris kölcsönhatások? Mioglobin: FIR sektroszkóia Mioglobin: fázisdiagram hideg hő nyomás
Lizozim: FIR ektroszkóia Lizozim: nyomásdenaturáció Amide II 75mg/ml back to.1 MPa Amide I max. osition [cm -1 ] Amide II intensity [a.u.] 1/ 6.95 kbar 695 MPa @3 1/ 5.83 kbar 583 MPa @3 amide I 9 MPa.1 MPa Lizozim: hődenaturáció Lyzozim: - fázisdiagram P1.5 kbar []
Nyomás-hőmérséklet fázisdiagram: a valóság G G P hideg ˆ β + nyomás + ˆ α hő A +... V + V + intermolekuláris kh.: aggregáció conc! nyomás- és hidegdenaturáció: V hődenaturáció: P Aggregációra hajlamos intermedierek keletkezése nyomáskezelés hatására mioglobin Absorbance 158 16 16 164 166 168 17 17.3..1 ν [cm -1 ] Nyomáskezelt kontrol 1 3 4 5 6 7 8 9 1 11 [ ] heat Intermolekuláris kölcsönhatások és a nyomás Intermolekuláris kölcsönhatások és a nyomás tiikus nyomás kbar MPa
Aggregátumok disszociációja nyomással élda: mioglobin Aggregátumok disszociációja nyomással élda: mioglobin A nagy nyomás technikája vastag falú edény kis térfogató gyémántcella A nagy nyomás technikája Nagyon vastag és szilárd falú edény bomba kb 1 cm minta 1 mm 3 otikai ablak
A nagy nyomás technikája DA diamond anvil cell Nagyon kicsi felület ill. térfogat,5mm ~1 nl Alkalmazások
ermofil és iezofil fehérjék Extremofil mikroorganizmusok Nyomáskezelt izza az egyik nagynyomásos konferencián Nyomáskezelt élelmiszerek egy jaán áruházban extrém hőmérsékleten >1 extrém nyomáson több 1 bar extrém kémiai körülmények savas v. lúgos között élnek. Pl. a tenger mélyén, hőforrások közelében, stb. Ezekből izolálhatók a termofil és iezofil fehérjék Hogyan változik a fázisdiagram? hermohiles, a tye of extremohile, roduce some of the bright colors of Grand Prismatic ring, Yellowstone National Park he first extremohile to have its genome sequenced was Methanococcus jannaschii, a microbe that lives near hydrothermal vents,6 meters below sea level, where temeratures aroach the boiling oint of water and the ressure is sufficient to crush an ordinary submarine. Image credit: NOAA
Példa: HP16,5 fehérje a Methanococcus jannaschii-ból Nyomástűrés Nem túl nagy kihívás: bioszférában max. 1 kbar normál fehérjestabilitás kb 5 kbar. Mélytengeri élőlények Pl: Enzimműködés és extrém körülmények Figure 3. Heat-ressure iso-rate contour lots of 95 % inactivation of urified banana PME in mm ris-hl buffer, H 7. for a total rocess time of 3 min k.99858 min-1 based on A the classical thermodynamic model eq 4; B the third-degree thermodynamic model eq 6; From: Binh Ly-Nguyen1 et al, Effect of Mild-Heat and High-Pressure Processing on Banana Pectin Methylesterase: A Kinetic tudy Irodalom Privalov PL. old denaturation of roteins. rit Rev Biochem Mol Biol. 199;54:81-35. Meersman, F., meller, L., Heremans, K 5 Extending the ressure-temeratura state diagram of myoglobin Helv. him. Acta 88, 546-556 ölgyesi, F., Böde s., meller, L., Kim, K. K., Heremans, K., Fidy, J. 4 Pressure activation of the chaerone function of small heat-shock roteins ell. Mol. Biol. 5, 361-369. F. Meersmann, L. meller, K. Heremans A comarative study of cold-, ressure- and heat-induced unfolding and aggregation of myoglobin Biohys. J. 8 635-644. L. meller Pressure-temerature hase diagram of biomolecules Biohys. Biochim. Acta 1595 11-9. L. meller, P. Rubens, K. Heremans 1999 Pressure effect on the temerature induced unfolding and tendency to aggregate of myoglobin Biochemistry 38 3816-38. meller László: A fehérjék konformációs és dinamikai tulajdonságai. Új eredmények nagy nyomással kombinált infravörös és fluoreszcencia sektroszkóiai módszerekkel. MA doktori értekezés Ly-Nguyen B, Van Loey AM, mout, Verlent I, Duvetter, Hendrickx ME. Effect of Mild- Heat and High-Pressure Processing on Banana Pectin Methylesterase: A Kinetic tudy J Agric Food hem. 3 Dec 31;517:7974-9. htt://bartlettlab.ucsd.edu/research.html