PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR www.aok.pte.hu MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK 2 FLUORESZCENCIÁN ALAPULÓ MODERN MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK BIOFIZIKA 2. 2015. márciu 24. Dr. Bugyi Beáta Biofizikai Intézet Fluorezcencia mikrozkópia FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA fénymikrozkópia + fluorezcencia A képalkotához látható fényt (400 800 nm) é üvegbõl kézült lencéket alkalmaz. A vizgált mintát a fluorezcencia emiziója révén képezi le. Elõnyei: fluorezcencia biztoította pektráli flexibilitá kontrazt kevéé invazív peciáli alkalmazáok (FRAP, FRET, FLIM) peciáli technikák révén a felbontóképeég javítható (konfokáli, TIRFM, STED, SIM, PALM, STORM) 1873 diffrakció határ Ernt Abbe, Carl Zei 2014 Nobel díj Stefan Hell, Eric Betzig é William Moerner "for the development of uper-reolved fluorecence microcopy" Hogyan tudjuk javítani a mikrozkóp felbontóképeégét? avagy megkerülhetjük-e a fizika törvényeit? Z d z ~ 800 nm EMISSZIÓ Y d x,y ~ 200 nm http://www.nobelprize.org/nobel_prize/chemitry/laureate/2 014/ µm érdeke réz Ernt Abbe emlékmű, Jena XY irány lateráli Z irány axiáli,0.610.61 ~200 22 ~800 GERJESZTÉS AXIÁLIS KONFOKÁLIS ELV EVANESZCENS MEZŐ TÖBB FOTON X LATERÁLIS STIMULÁLT EMISSZIÓ(STED) EGYEDI MOLEKULA LOKALIZÁCIÓ (PALM, STORM) STRUKTURÁLT MEGVILÁGÍTÁS(SIM) Alapelv: konjugált fókuz íkok 1
kép detektor SZÉLESLÁTÓTERŰ MIKROSZKÓPIA egy tárgyík van fókuzban de az öze ík hozzájárul a képhez kép detektor APERTÚRA KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA egy tárgyík van fókuzban APERTURA(pinhole): térbeli zűrő a tárgyíkkal konjugált fókuzíkban egy ík járul hozzá a képhez fényforrá APERTÚRA fényforrá apertúra mérete ~ 1 Airy egyég Airyunit:diameteroftheAirydik objektív objektív tárgy fókuzík fókuzíkból érkező fluorezcencia emizió fókuzík előtti íkból érkező fluorezcencia emizió fókuzík mögötti íkból érkező fluorezcencia emizió tárgy fókuzík fókuzíkból érkező fluorezcencia emizió fókuzík előtti íkból érkező fluorezcencia emizió fókuzík mögötti íkból érkező fluorezcencia emizió HAGYOMÁNYOS felbontá hagyományo konfokáli lateráli, nm 200 200 axiáli, nm 800 500 3D képalkotá optikai zeletek TÁRGY KONFOKÁLIS ok2dkép 3DKÉP http://zei-campu.magnet.fu.edu/tutorial/opticalectioning/confocalwidefield/index.html 3D képalkotá Evanezcen mezõ mikrozkópia Alapelv: telje belõ vizaverõdé TIRFM total internal reflection fluorecence microcopy tengericillag peteejt meiotiku oztódá kromozóma aktin mikrotubulu 2
Evanezcen mezõ mikrozkópia telje belő vizaverődé Evanezcen mezõ mikrozkópia HAGYOMÁNYOS! < hagyományo, in (é) in (öé) 90 ~100 optikailag ritkább (vize közeg) TIRFM () TIRFM egyedi molekulák formin, aktin (TIRFM) optikailag űrűbb (immerzió olaj) () exp ( ) exponenciáli lecengé () 4 B16/F1 melanoma cell actin filament felbontá hagyományo TIRFM lateráli, nm 200 200 axiáli, nm 800 100-200 Stimulált emizió mikrozkópia Alapelv: timulált emizió STED timulated emiion depletion microcopy 2014 Nobel díj Stefan Hell, Eric Betzig é William Moerner "for the development of uper-reolved fluorecence microcopy" Stimulált emizió mikrozkópia STED laer gerjezté timulált emizió gerjeztı laer http://www.nobelprize.org/nobel_prize/chemitry/laureate/2 014/ Stimulált emizió mikrozkópia Alapelv: PSF illezté PALM photo-activated localization microcopy STORM tochatic optical recontruction microcopy felbontá hagyományo STED lateráli, nm 200 50 axiáli, nm 800 500 () 2 1 STEDimaging howing two color colocalizedrecording of nuclear pore complexe in amphibian cell at reolution of 20 nm (red) and ~30 nm (green channel). The imaging i decribed in BiophyJ 105, L01 - L03, (July 2013). Göttfertet al Confocal and gated STEDimage of Hitone 3 (green) and microtubule (red) in HeLa cell viualized with Chromeo505 and BD HorizonV500, repectively. 3
Alapelv: PSF illezté PALM photo-activated localization microcopy STORM tochatic optical recontruction microcopy Szabályozható (fotokonvertálható) fluorofórok STANDARD FOTOAKTIVÁLHATÓ FOTOKAPCSOLHATÓ http://www.olympufluoview.com/application/opticalhighlighter.html felbontá hagyományo egyedi molekula lokalizáció lateráli, nm 200 10 axiáli, nm 800 100-200 http://zei-campu.magnet.fu.edu/tutorial/uperreolution/palmbaic/indexflah.html () 2 Több foton mikrozkópia Alapelv: gerjezté több fotonnal Több foton mikrozkópia Alapelv: gerjezté több fotonnal EGY FOTON MIKROSZKÓPIA gerjezté: 1 foton abzorpció: t = 10-15 E = E gerjeztett E alap foton hullámhoza: λ EGY FOTON MIKROSZKÓPIA gerjezté: 1 foton abzorpció: t = 10-15 E = E gerjeztett E alap foton hullámhoza: λ KÉT FOTON MIKROSZKÓPIA gerjezté: 2 foton abzorpció: t = 10-15 E = E gerjeztett E alap foton hullámhoza: 2*λ t = 10-18 4
Több foton mikrozkópia Több foton mikrozkópia ELŐNYÖK jobb Z irányú felbontá nagyobb behatolóképeég(nagyobb hullámhoz - kiebb zóródá) konfokáli~µm két-foton ~mm kevébé invazív(nagyobb hullámhoz kiebb energia) mély zöveti képalkotá (deep tiue imaging) intravitáli képalkotá élőlényekben (intravital microcopy, IVM) véráram élő egér májában dextran, hepatociták (intravitálimikrozkópia) Alapelv: fluorezcencia kioltá FRAP fluorecence recovery after photobleaching KIOLTÁS KIFEHÉREDÉS (bleaching) a fluorofórnak agerjezté miatt bekövetkező irreverzibili fotokémiai detrukciója KIOLTÁS: LÉZER hátrányok! kifehéredé elleni komponenek haználata (pl. glükóz-oxidáz kataláz merkaptoethanol) alaconyabb expozíció idő alaconyabb gerjeztéi intenzitá ellenálló fluorofór előnyök! FRAP, FLIP http://en.wikipedia.org/wiki/fluorecence_lo_in_photobleaching http://micro.magnet.fu.edu/primer/java/fluorecence/photobleaching/ VISSZATÉRÉS : DIFFÚZIÓ + KIOLTÁS: LÉZER KINETIKAI ELEMZÉS FLUORESZCENCIA INTENZITÁS VISSZATÉRÉS : DIFFÚZIÓ + IDŐ 5
Laiet al EMBO Journal 2009 Özefoglaló Modern mikrozkópiai módzerek kulcfogalmak A fluorezcencia mikrozkóp diffrakció határának kiterjeztée: PSF redukció lehetõégek Alapelvek: TIRFM STED Egyedi molekula mikrozkópiai módzerek alapelve Speciáli fluorezcencia mikrozkópiai technikák Két-foton mikrozkópia FRAP www.aok.pte.hu Javaolt internete anyagok http://www.olympumicro.com/index.html http://www.microcopyu.com / http://zei-campu.magnet.fu.edu/index.html http://www.ibiology.org/ www.aok.pte.hu 6