DE OEC Debreceni Klinikai Genomikai Központ Fehérje és antitest termelési core facility Keresztessy Zsolt, PhD MBA K+F projektvezető
1. Küldetés Funkcionális genomika: antitestek/citokinek Minden nagyobb egyetemen van antitest/citokin/rekombináns protein core facility Baross Gábor pályázat pilot projekt Egyetemünkön sokan rendelkeznek hasonló tudással, de Szükség van egy koncentrált szolgáltató kapacitásra Küldetés: technológia és kapacitás kiépítése Belső igények, nemzetközi piacok Spin-off vállalkozás
2. Háttér Baross Gábor Program (REG_EA_KFI_09-INNANTet) Innovatív antitest és citokin előállítási technológiák fejlesztése Futamidő: 2010.05.-2012.04. Támogatás: 78 MFt Projektvezetés: Prof. Dr. Nagy László, akadémikus, BMBI, igazgató, Genomika Központ Dr. Bálint Bálint László, egyet. adjunkt., BMBI, laborigazgató, Genomika Dr. Zahuczky Gábor, tud.mnkts., BMBI, ügyvezető igazgató, UD-Genomed Kft. Dr. Vámosi György, tud.főmnk., Biofizikai Int. Tanácsadók: Prof. Kurucz István, Prof. Rajnavölgyi Éva, Prof. John Scwabe Executive projektvezető: Dr. Keresztessy Zsolt, tud. mnkts, BMBI, ügyvezető, INDEVION Biotech Kft. Laboratóriumi analítikus: Szabó Ibolya, BSc lab. anal.
Baross Gábor Program (REG_EA_KFI_09-INNANTet) Innovatív antitest és citokin előállítási technológiák fejlesztése A projekt célja olyan szerkezeti információkon alapuló antitest tervezési algoritmus kidolgozása, optimalizálása és általa olyan antitest prototípusok előállítása, amelyek natív antigén fehérjék felismerésére képesek, így alkalmazhatóságuk szélesebb körű, hatékonyságuk és megbízhatóságuk pedig sokkal jobb a jelenleg piaci forgalomban lévő készítményekénél. Génexpresszió, kromatin immunoprecipitáció (ChIP), ChIP-seq, ChIP-on-Chip A mai orvos-biológia egyre szélesebb körben használ rekombináns fehérjéket. A fehérje munkák egyik legfontosabb eszköze az antitest. Mára az antitesteket kiterjedten használják a kutatásban, patológiai diagnosztikában, terápiában és a személyre szabott orvoslásban is. Az antitestek mellett a citokinek tekinthetőek az egyik legfontosabb reagens-családnak az immunológiai és az őssejetkutatásban, de terápiás felhasználásuk is kiterjedt.
Biogyógyszer piac 2008 Global Pharma market: $735 billion Biopharmaceuticals: $80-100 billion Recomb. proteins, mabs: $40-50 billion Cytokine drugs: $20 billion Current Drug Development Market for Cytokines, Chemokines and Growth Factors, Current Drug Development Market for Cytokines, Chemokines and Growth Factors Drug and Market Development Publishing, Jan 2007
Baross Gábor Program (REG_EA_KFI_09-INNANTet) Innovatív antitest és citokin előállítási technológiák fejlesztése Céljaink: A Debreceni Egyetemen egy olyan kutatólaboratóriumi facilitást létrehozni, amelyik képes gyorsan, magas minőségben és a szükséges mennyiségben előállítani a kutatás terén helyi és nemzetközi szinten igényelt antitesteket és citokineket. Olyan új, szerkezetbiológiai információkra épülő epitóp tervezési algoritmust meghonosítani az antitest fejlesztésben, melynek segítségével innovatív módon, nagy affinitású antitestek hozhatók létre. Olyan jelölt citokineket létrehozni, amelyeknek az útja nyomon követhető biológiai rendszerekben, ezáltal egy új altípusát létrehozni ennek a reagens családnak.
Antitest termelési workflow Upstream Midstream Downstream TARGET SELECTION EPITOPE DESIGN PEPTIDE SYNTHESIS IMMUNISE HYBRIDOM A TESTING PRODUCE PURIFY CHARACT. PRODUCTS SMRT RXR PPAR RAR VDR ER AR ACTR Conventiona l Innovative Companies Peptides Conjugation MONOCLO NAL Mouse Myeloma Spleen PEG fusion TECAN Screen1 ELISA Freeze/Clon e Monoclonal c. Screen2 ELISA SDS/PAGE Western blot Dot blot ELISA Titers Control lysates Control Abs CELLCULT URE CHO, HEK FERMENTATI ON Mouse ascites PROFINIA Protein A Q ionexchange Desalting Storage IHC IP MSA ChIP ChIP-Seq CHT ionexch ChIP-on- Chip AGILENT MS POLYCLON AL, MONOCLO AL ANTIBODIE S Protocols Kits Controls Control regions Grow/Freeze CD POLYCLON AL Rabbit Bleed Rabbits Serum proteins Peptide affinity
Antitest pipeline TARGET SELECTIO N EPITOPE DESIGN PEPTIDE SYNTHESI S IMMUNISE HYBRIDOM A TESTING PRODUCE PURIFY CHARACT. PRODUCT S SMRT Anti-SMRTc pab SMRT mab PPAR Anti-PPAR pab RXR RXR mab RAR VDR ER AR ACTR
Anti-SMRT antitest helyzete TARGET SELECTIO N EPITOPE DESIGN PEPTIDE SYNTHESI S IMMUNISE HYBRIDOM A TESTING PRODUCE PURIFY CHARACT. PRODUCT S SMRT Conventiona l Recombinan t POLYCLON AL: Rabbit Bleed SDS/PAGE Western blot Rabbits PROFINIA Protein A IHC IP ANTIBODIE S Protocols Dot blot Q ionexchange MSA Kits ELISA CHT ionexch ChIP Controls Titers Desalting ChIP-Seq Control regions Control lysates Storage ChIP-on- Chip Control Abs AGILENT MS Ready In progress Next step Serum proteins Peptide affinity CD
3. Infrastruktúra LOCATION Klinika Telep, Elméleti Tömb, 3. emelet, 315. labor EQUIPMENT Általános molekuláris biológiai háttér Sejtkultúrás labor Small-scale bakteriális és emlőssejt fermentáció Protein tisztítás BIO-RAD PROFINIA automated protein affinity purification system Protein karakterizálás SDS/PAGE, Western, ELISA, Multiscreen, biológiai aktivitás
3. Infrastruktúra PROFINIA
3. Infrastruktúra PROFINIA
3. Infrastruktúra STAFF Dr. Keresztessy Zsolt, MSc Biol-Biotech, PhD CelMolBiol, MBA - protein engineering, design, rekombináns DNS tehnológia, protein expresszió, tisztítás, biokémia, szerkezet, folding, karakterizálás www.zkeresztessy.wordpress.com Szabó Ibolya, BSc laboratóriumi analítikus, MSc MolBiol hallgató - hibridóma technológia, sejtkultúra
4. Távlati fejlesztések Sejtkultúrás fermentációs kapacitás Hibridóma screening robotok Large scale protein tisztítás Cloning kapacitás Humán erőforrás fejlesztés
5. Mintaprojekt Futó alprojektek Anti-SMRT antitest tisztítás és karakterizálás Epitóp tervezési algoritmus mab fejlesztés (2) Rekombináns protein termelés fejlesztés (2) Rekombináns IL-4 termelés
Citokin termelési workflow TARGET SELECTION CLONING EXPRESSIO N TESTING PRODUCTIO N PURIFY CHARACTER. LABELLING PRODUCTS IL-4 GM-CSF LIF FLT3- LIGAND IL-2 IL-9 Human cdna Gene Design Gene synthesis Constructs E. COLI Rosetta INSECT Sf9 MAMMALIA N HEK, CHO SDS/PAGE Western Blot ELISA Biological act. Transfection Selection FACS sorting Stable celllines Cell supernat. FERMENTATI ON PROFINIA IMAC Q ionexchange CHT ionexch Desalting Storage SDS/PAGE Western blot ELISA Biological act. MS CD Fluorescent Q-Dot CYTOKINES LABELLED CYTOKINE S IL-15
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt TARGET SELECTION CLONING EXPRESSIO N TESTING PRODUCTIO N PURIFY CHARACTER. LABELLING PRODUCTS IL-4 Human cdna Gene Design Gene synthesis Constructs E. COLI Rosetta INSECT Sf9 MAMMALIA N HEK, CHO SDS/PAGE Western Blot ELISA Biological act. Transfection Selection FACS sorting Stable celllines Cell supernat. FERMENTATI ON PROFINIA IMAC Q ionexchange CHT ionexch Desalting Storage SDS/PAGE Western blot ELISA Biological act. MS CD Fluorescent Q-Dot CYTOKINES LABELLED CYTOKINE S
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt 1. Gene design, optimisation, sythesis 2. Subcloning into expression vector
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt 3. Production in Rosetta 2, (HEK293T) slow induction lower temperature extended expression soluble protein. 4. Purification: IMAC, Desalting 5. Testing: SDS/PAGE, Western, ELISA 6. Biological activity TF-I proliferation assay THP-1 cells, STAT6 phosforilation 7. Expression optimisation 8. Large scale production
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt Purification: IMAC + Desalting
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt Testing: ELISA
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció Kollaboráció Pályázatok Konzultáció Szolgáltatások Termékek ELÉRHETŐSÉGEK: E-mail: zsolt.keresztessy@med.unideb.hu Tel: +36 52 411-717 /54616, 56772 Mobil: +36 30 371 6208
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 1. ANTITESTEK from target sequence to antibody service epitóp tervezés
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 1. ANTITESTEK from target sequence to antibody service epitóp tervezés hibridóma könyvtárak, sejtvonalak termelés CHO sejtekben antitest tisztítás (SMRT) Monoklonális antitestek Poliklonális szérumok és tisztított antitestek (SMRT)
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 2. CITOKINEK citokin tartalmú tápfolyadék (IL-4) citokintermelő stabil sejtvonalak (IL-4) tisztított citokinek (IL-4) jelzett citokinek
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 3. REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK production to characterisation Termelés (bakteriális, rovarsejt, emlőssejt expresszió) Tisztítás (LC, FPLC, HPLC affinitás, gélszűrés, ioncserés kromatogr. stb.) Karakterizálás (SDS/PAGE, WESTERN, ELISA, CE, CD, MS, biológiai aktivitás) Expression vectors: pet, ptriex, pgex Hosts: Rosetta 2, Rosetta Gami B, BL21, DH5α... Cell lines: HEK293, CHO, Sf9 Purification/tags: His-tag, GST, Fc Cartridges: IMAC, GST, SUPrA, UNOsp.Q, CHT I, Desalting
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció Speciális szolgáltatások, konzultáció 4. PROTEIN ENGINEERING (mutagenesis, IVE, structure-based design) 5. PHAGE DISPLAY TECHNOLOGY (peptide and protein display) 6. HIGH THROUGHPUT SCREENING (Tecan) 7. LARGE SCALE FERMENTATION (2-100 L bakteriális, 2-10 L emlőssejt)
6. Szolgáltatások Termékek - Kollaboráció Tervezett szolgáltatások - kapacitásnövelés függvényében GENE TO PROTEIN Services from custom DNA to engineered proteins 1. Géntervezés és optimalizálás 2. GÉNEXPRESSZIÓ Génszintézis 3. Paraméter Szubklónozás Optimális 4. Kodon Plazmid minőség: preparálás - adaptált kódonhasználat 5. GC Fehérje tartalom: expresszió optimalizálás - kiegyensúlyozott 6. DNS Rekombináns motívumok: fehérje termelés, - szekvencia tisztítás, ismétlődések karakterizálás kizárása Piaci árak - példák - más motívumok kizárása Gene-to-protein: mrns szerkezet: 5000-10000 - másodlagos Euro szerkezet kizárása Recombinant IL-4 (mg): 35 000 USD Stable cell lines: 15 000 Euro
6. Szolgáltatások Termékek - Kollaboráció Tervezett szolgáltatások - kapacitásnövelés függvényében GENE TO PROTEIN Services from custom DNA to engineered proteins 1. Géntervezés és optimalizálás 2. Génszintézis 3. Szubklónozás 4. Plazmid preparálás 5. Fehérje expresszió optimalizálás 6. Rekombináns fehérje termelés, tisztítás, karakterizálás Piaci árak - példák Gene-to-protein: 5000-10000 Euro Recombinant IL-4 (mg): 35 000 USD Stable cell lines: 15 000 Euro
Futó kollaborációk Funkcionális genomika Epigenetika Antitest fejlesztés Rekombináns fehérje termelés DE OEC KBMPI