Általános genetika Veronika, Deák

Átírás

1 Általános genetika Veronika, Deák

2 Általános genetika Veronika, Deák Szerzői jog 2014 Typotex Kiadó Kivonat Ez a jegyzet a felsőoktatás alapképzéseiben részt vevő, a genetikával a középiskolai tanulmányok után először ismerkedő hallgatók számára készült. A tananyag olyan képzésekhez igazodik, melyekben az általános genetikai tanulmányok megelőzik a molekuláris biológiai és bioinformatikai eszköztár megismerését, ezért ez a tananyag a biokémiai és sejtbiológiai alapok ismeretében elsajátítható. A könyv célja, hogy a genetikai alapok ismertetésével hozzásegítse az olvasót a genetika nyelvezetének és klasszikus eszköztárának megismeréséhez. A hangsúlyt az általános szabályszerűségek, mechanizmusok, összefüggések átadására helyezi. A genetikai szemlélet formálása céljából számos, tudománytörténeti szempontból klasszikus kísérletet mutat be, ezáltal is hangsúlyozva a modellszervezeteken végzett alapkutatás erejét és fontosságát. Minden tudományterületre, így a genetikára is igaz, hogy fejlődése nem áll meg. Ebben a jegyzetben is találkozunk letisztultabb és kevésbé letisztult témakörökkel, ezért több helyen a mai ismereteink szerint hangsúlyozásával találkozhat az olvasó. Terjedelmi korlátok miatt a genetika tudományterületének csak kiragadott szegmenseivel foglalkozunk. Ezt némileg ellensúlyozzák a könyvben fellelhető internetes hivatkozások, melyek segítségével az érdeklődők számos hasznos oktatási és kutatási elektronikus anyagban böngészhetnek. Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Semmelweis Egyetem Copyright: , Deák Veronika, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Szakmai lektor: Barna János ISBN Készült a Typotex Kiadó gondozásában Felelős vezető: Votisky Zsuzsa Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/ számú, Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért című projekt keretében.

3 Tartalom Általános Genetika... xi 1. Bevezetés A genetikai információ molekuláris alapja A genetikai analízis megközelítésmódjai Előrehaladó genetikai analízis Fordított genetikai analízis A genetikában alkalmazott módszerek Genetikai modellszervezetek A gének és a környezet, geno- és fenotípus A fejlődési zaj Egygénes öröklődés Mendel első törvénye: egyenlő szegregáció Gének és kromoszómák Az egygénes öröklődési mintázatok kromoszómális háttere Mitózis Meiózis Nemi kromoszómákhoz kötött egygénes öröklődés Kromoszómális ivar-meghatározási rendszerek Az ivari kromoszómák szerepe emberben a nem meghatározásban Az X kromoszóma inaktiváció A cikk-cakk öröklésmenet A kromoszómaelméletet bizonyító kísérlet Gének független öröklődése. Mendel második törvénye Mendel II. törvénye: a független öröklődés törvénye A független öröklődés törvényének alkalmazásai A független öröklődés törvényének alkalmazásai: geno- és fenotípusok keletkezésének becslése keresztezésekben A független öröklődés törvényének alkalmazásai: tiszta vonalak (pure lines) létrehozása Hibrid vigor A független öröklődés kromoszómális háttere Autoszómális és nemi kromoszómához kötött gének független hasadása Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek Kapcsoltság és intrakromoszómális rekombináció kimutatása genetikai eszközökkel Az intrakromoszómális rekombináció citológiai kimutatása A homológ rekombináció mechanizmusa Kapcsoltsági térképezés (Linkage mapping) Kétpontos térképezés Hárompontos térképezés A kapcsoltsági és a fizikai térképek összeegyeztetése A mendeli genetika kiterjesztése A dominanciaviszonyok különböző változatai Inkomplett dominancia Kodominancia A dominanciaviszonyok magyarázata Többszörös allélizmus Az allélizmus megállapítása vagy elvetése. A komplementáció Letális allélok Penetrancia és expresszivitás Több gén hatása ugyanarra a jellegre Két gén hatása ugyanarra a jellegre független útvonalon Komplementer öröklésmenet Duplikált gének öröklésmenete Recesszív episztázis Domináns episztázis Egy biokémiai útvonal genetikai analízise iii

4 Általános genetika 5.7. Egy genetikai útvonal episztázis analízise Extranukleáris öröklődés A DNS szerkezete és replikációja A DNS mint genetikai anyag A transzformáció felfedezése A Hershey Chase kísérlet A DNS szerkezete Mit tudtak a DNS-ről a Watson Crick modell előtt? A DNS szerkezetének Watson Crick modellje A DNS szintézise A DNS replikáció jóslata A szemikonzervatív replikáció bizonyítása Replikációs villa A DNS-polimerázok A replikációs kezdőpont (origó) Szemidiszkontinuus replikáció A replikáció további enzimei A két új szál szintézisét egyetlen pol III dimer végzi A replikáció pontossága. Proof-reading repair Vírus genomok gördülő gyűrű replikációja Telomerek. Telomeráz A génkifejeződés molekuláris alapjai RNS intermedier létére utaló korai kísérletek Az RNS-molekulák sajátságai RNS-típusok RNS-szintézis A transzkripció lépései Transzkripció iniciáció prokariótákban Transzkripció elongáció prokariótákban Transzkripció termináció prokariótákban Transzkripció eukariótákban áttekintés Transzkripció iniciáció eukariótákban Transzkripció elongáció, termináció és pre-mrns-érés eukariótákban Az eukarióta trns-ek érése Az eukarióta rrns-ek érése A gének és a fehérjék kolinearitása A genetikai kód A genetikai információáramlás utolsó állomása: transzláció rrns-ek és trns-ek a transzlációban mrns-ek a transzlációban A transzláció mechanizmusa Mutációk A mutációk csoportosítása Pont- és kromoszóma-mutációk Forward és reverz mutációk Szomatikus és csíravonal mutációk A mutációk fenotípus szerinti csoportosítása Funkcióvesztéses és funkciónyeréses mutációk A mutációk kialakulása Mutációs ráta és mutációs gyakoriság A Luria Delbrück-féle fluktuációs teszt Spontán mutációk Indukált mutációk Pontmutációk A pontmutációk típusai A pontmutációk hatása a géntermékre A DNS hibáit javító (repair) mechanizmusok Mutagén hatást (genotoxicitást) mérő rendszerek A génkifejeződés szabályozása prokariótákban A transzkripció iniciációjának szabályozása regulátor fehérjék által iv

5 Általános genetika 2. A transzkripció iniciációjának szabályozása speciális szigma (σ) faktorok által A transzkripció terminációjának szabályozása Operonok és regulonok A lac operon szabályozása Negatív szabályozás és indukció a lac operonban Pozitív szabályozás a lac operonban A lac operon működésének felderítése A lac operonon szerzett tudás hasznosítása napjainkban. A lacz mint riporter gén Az ara operon szabályozása A trp operon szabályozása A génkifejeződés szabályozása eukariótákban A génkifejeződés szabályozásának szintjei Transzkripcionális szabályozás Cisz regulátor elemek: a promóter Távolból ható cisz regulátor elemek: enhancerek, silencerek Transz regulátor elemek: a transzkripciós faktorok Epigenetikai szabályozás A dinamikus kromatin DNS-metiláció Szülői imprinting Az emlősök X kromoszóma inaktivációja Pozíciófüggő variegáció Általánosan és nagy mennyiségben előforduló RNS és fehérje molekulák termelődésének szabályozása Poszttranszkripcionális szabályozás Differenciális mrns-érés Az mrns degradációjának szabályozása A gének kifejeződésének szabályozása kis RNS-ek által Transzlációs és poszttranszlációs szabályozás Felhasznált és ajánlott irodalom Ábrák jegyzéke és forrása v

6 Az ábrák listája 1.1. Johann Gregor Mendel apáti öltözékben (posztumusz portré) Genetikai modellszervezetek (felső sor balról jobbra: fágok, kukorica, laboratóriumi fonalféreg, zebradánió; alsó sor: baktériumok, egér, muslica, lúdfű) A vad típusú és két szemméret mutáns muslica reakciónormája A sárga és zöld magszín öröklődésének szemléltetése Egy tulajdonságpár öröklődése és magyarázata Interfázisos kromoszómák által elfoglalt territóriumok csirke diploid sejtmagban (az egyes homológokat eltérő fluoreszcens festés jelöli) A kromatin szerveződése A mitózis és meiózis szerepe állat, növény és gomba szervezetekben A mitózis és meiózis áttekintése Az X kromoszóma inaktiváció mozaikos fenotípust okoz Cikk-cakk öröklésmenet a muslica X nemi kromoszómáján lévő white gén példáján Két tulajdonságpár öröklődése Mendel kísérletében Egy dihibrid öröklésmenet szemléltetése Punnett táblázattal Mendel második törvénye szexuálisan szaporodó haploid eukariótákra alkalmazva A villás elágazás módszerének alkalmazása utódok geno- és fenotípusának becslésére Beltenyésztés során a heterozigóták aránya generációról generációra csökken, a homozigóták aránya pedig nő Egy négyszeresen homozigóta növényvonal nemesítési sémája Hibrid kukorica (középen) a két beltenyésztett szülői vonallal (két szélen) Két gén független öröklődésének magyarázata a kromoszómák szintjén Négy példa allélpárok elrendeződésére egy homológ kromoszómapáron (kék az egyik, piros a másik homológ; A, B, C és D négy lókusz) Thomas Hunt Morgan és Alfred H. Sturtevant a légyszobá -ban A kapcsolt gének alléljai nagy gyakorisággal együtt öröklődnek. Új allélkombinációk a homológok közötti szakaszok kicserélődésével jöhetnek létre A homológok közötti szakaszcsere citológiai igazolása kukorica kromoszómán Kiazmák a homológok között A homológ rekombináció Holliday-modellje Két lókusz közötti crossing over átlagosan 50% rekombináns terméket eredményez Kétpontos térképezés kísérleti sémája Hárompontos térképezéssel egyszerre három gén egymáshoz viszonyított távolságát és sorrendjét lehet meghatározni A Drosophila melanogaster kapcsoltsági géntérképe Árpa kapcsoltsági térképe (hét kromoszóma, bal oldalon a térképtávolság cm egységekben megadva, sárgával kiemelve a morfológiai markerek, a többi molekuláris marker) ábra: Az egér 16-os kromoszómájának egy kevesebb, mint 1 cm-nyi szakasza. A régióban számos gén és molekuláris marker található (kék színnel jelölve). Az eredeti tárhelyen az egyes gének részletes adatait is megtaláljuk ( Jobb oldalon fekete betűkkel a humán ortológok és azok kromoszómális lokalizációja van feltüntetve Inkomplett dominancia A C génnel összefüggő szőrszín fenotípusok Sárga (A Y A) és vad típusú (AA) egerek Farkatlan manx macska % penetrancia (minden egyed foltos) és változó expresszivitás (a foltosság mértéke egyedenként változó) kutyákon Nem teljes penetrancia és változó expresszivitás szemléltetése. Minden ovális egy egyedet képvisel, és minden egyed azonos genotípusú Csirke tarajformák Komplementer génhatás egy reakciósor két tagjánál A redundáns gének termékei azonos funkcióval rendelkeznek Recesszív episztázis egy reakciósor tagjai között W allél domináns episztázisa D gén felett Auxotrófok kiválogatása vi

7 Általános genetika Aminosav auxotrófok kiválogatása Arginin auxotrófok kiválogatása Az 1:1 arányú hasadás igazolja, hogy egyetlen gén mutációja okozza az arginin auxotrófiát Az arginin auxotrófok komplementációs csoportokba sorolásának kísérleti vázlata Az arginin és két rokonvegyület, az ornitin és citrullin szerkezeti képlete Az arginin bioszintézis útvonal elemeinek sorbarendezése C. elegans vulvaless, vad típusú és multivulva egyedei (fentről le) A C. elegans vulvájának kialakulása Kettős mutánsok fenotípusának megállapítása Egy jelátviteli útvonal elemeinek sorbarendezése a mutáns fenotípusok alapján A jelátviteli útvonal elemek közötti aktiválási és gátlási viszonyok megállapítása A vulvafejlődést konzervált jelátviteli útvonal szabályozza Kloroplaszt gének citoplazmatikus öröklődése Variegált fenotípusú csodatölcsér növény Watson és Crick a fizikai modell építése közben A DNS elsődleges (jobbra) és másodlagos (balra) szerkezete A DNS térkitöltő modellje A szemikonzervatív replikáció bizonyítása baktériumban E. coli cirkuláris kromoszóma θ replikációja A DNS-szál szintézise 5 3 irányban történik Az eukarióta kromoszómák replikációja több origóból indul balra: sematikus ábrázolás, jobbra: elektronmikroszkópos felvétel A replikációs villában az egyik szál szintézise folyamatos, a másik szálé szakaszos Primáz, primer, ligáz szerepe a replikációban A replikáció áttekintése A két új szál szintézise egyetlen pol III dimer által, az elmaradó szál templátjának kihurkolódásával valósul meg A replikáció alatt azonnali hibajavítás működik (proof-reading repair) Lineáris DNS-molekulák végreplikációs problémája A telomer szerkezete, és újjáépülése a telomeráz komplex által Kromoszóma a fodrásznál A DNS mindkét szála szolgálhat genetikai kódként Egy szakaszon a DNS egyik és másik szála eltérő kódot jelent, eltérő RNS-szekvenciát határoz meg A transzkripció áttekintése Az E. coli RNS-polimeráz σ70 alegysége által felismert promóterek konszenzusszakaszai RNS-szintézisnél a DNS kettős hélix lokálisan felnyílik (transzkripciós buborék) Intrinsic (ρ-független) transzkripció termináció Transzkripció iniciáció eukariótákban Capping: az RNS 5 végi módosítása Poliadeniláció: az RNS 3 végi módosítása Az exonok közé ékelődő intron szakaszok az érés során kivágódnak A gén és a róla képződött érett mrns hibridizációjakor a DNS-molekula intron szakaszai kihurkolódnak, mert az érett mrns-ben nincs homológ szakaszuk Egy génről egyszerre több RNS-transzkriptum képződik, ez mikroszkóposan fenyőfára emlékeztető struktúraként jelenik meg (a fa teteje a gén elejének, alja a gén végének felel meg, egyre hosszabb ágakkal, vagyis leváló transzkriptumokkal). A splicing ko-transzkripcionálisan zajlik, ez a bal oldali felvételen megfigyelhető A splicing folyamatának áttekintése A splicing két egymást követő transzészterifikálási reakcióval valósul meg Alternatív splicing formák Egy trns-prekurzor és érett formája Eukarióta rrns-ek érése A gén és a fehérje közötti kolinearitás igazolása Yanofsky kísérletében A kódszótár Prokarióta riboszóma sematikus ábrázolása a kötött mrns-sel és a növekvő peptidlánccal Prokarióta riboszóma nagyfelbontású szerkezeti modellje (fent). Antibiotikumok, melyek a peptidlánc kivezető csatornánál blokkolnak (lent) trns másodlagos és harmadlagos szerkezete Aminoacil-tRNS szintézise vii

8 Általános genetika A kodon antikodon kapcsolódásban lötyögés is előfordul Prokarióta (monocisztronos) és érett eukarióta mrns-ek szerkezete A transzláció lépéseinek áttekintése Transzláció iniciáció (prokarióta) Transzláció elongáció Transzláció termináció Sárga-fekete mozaikos Labrador retriever (lent) és szülei (fent) Mutációs ráta (1/7) és mutációs gyakoriság (1/4) szemléltetése A fluktuációs teszt kivitelezése A fluktuációs teszt eredményének magyarázata Replikázással igazolható, hogy a fágrezisztenciát okozó mutáció spontán, a fággal való találkozás előtt létrejön a baktériumokban A bázisok normál és ritka tautomer formáinak párosodása Ismétlődéseket tartalmazó szekvenciák replikációjánál a szálak elcsúszása inszercióhoz vagy delécióhoz vezethet Két szomszédos bázispár közé ékelődő etídium-bromid torzítja a kettős spirál szerkezetét Fehérjekódoló gének kódoló régióját érintő pontmutációk típusai A pontmutációk megváltoztathatják a gén exon intron szerkezetét Az Ames-féle mutagenitási teszt alapja Az Ames-teszt továbbfejlesztett változata A β-galaktozidáz enzim a laktózt galaktózra és glükózra hidrolizálja A lac operon felépítése és negatív szabályozása A szabályozható lac promóter és környezetének szerkezete szekvencia szinten A LacI represszor tetramerként kötődik a tükörszimmetrikus szekvenciájú operátor régióhoz A sejtek két cukorforrás közül előbb a glükózt fogyasztják A camp CRP komplex a kötőhelyének és a promóter távolságának függvényében kétféleképpen segítheti a transzkripció iniciációt A camp CRP komplex tükörszimmetrikus szekvenciához kötődik A β-galaktozidáz enzim két kromogén szubsztrátja (X-gal, ONPG) és a lac promóter kiváló indukálószere (IPTG) A trp operon negatív szabályozása a represszor fehérje és a triptofán mint korepresszor által A trp operon szabályozása attenuációval a) a leader mrns szerkezete b) és c) a leader mrns szekvenciája és a transzkripció terminációs szabályozás szemléltetése Dolly, az első klónozott emlős az egyik anyjával Az eukarióta gének transzkripcionális szabályozása az egyszerűbb mechanizmusoktól a komplex szabályozási rendszerekig valósulhat meg a) Egy eukarióta sejt egyszerű transzkripcionális génszabályozási rendszere b) Egy többsejtű eukarióta szervezet génszabályozási elemei (részletek később a szövegben) Egy eukarióta gén szerkezete a magpromóterrel és promóter proximális elemekkel Az enhancerhez kötődő aktivátor fehérjék távolba hatása a DNS meghajlása révén valósul meg A Drosophila Antennapedia mutánsa Transzkripciós faktorok DNS-kötő doménjeinek szerkezete Állati szervezetek transzkripciós faktor adatbázisában jelenleg fellelhető transzkripciós faktorok (TFs), kofaktorok (CoFs) és kromatin remodeling faktorok (CRFs) száma taxonómiai egységenként Növényi szervezetek transzkripciós faktor adatbázisában jelenleg fellelhető transzkripciós faktor és más transzkripcionális regulátor (kofaktorok, kromatin remodeling faktorok) családok Egy gén szövetspecifikus transzkripciója a szabályozó transzkripciós faktorok jelenlététől és aktivitásától függ A kromatin szerkezetét befolyásoló epigenetikai jelenségek A hisztonok kovalens módosítása (metiláció, acetiláció, foszforiláció) és hiszton változatok (például CENP-A) beépülése a nukleoszómába befolyásolja a kromatin szerkezeti és funkcionális sajátságait A DNS-metiláció egy epigenetikai jelenség, mely befolyásolja a kromatin szerkezetét és a gének kifejeződésének mértékét A pozíciófüggő variegáció (PEV) egy gén helyének megváltozásával járó génkifejeződés megváltozásából adódik Xenopus laevis oocyta sejtmagjának elektronmikroszkópos felvétele. A fekete pöttyök az extrakromoszómális nukleóluszok (nukleolin antitest festés) A Drosophila ivarmeghatározási rendszerében az alternatív splicing jelentős szerepet játszik mrns-ek féléletidejének függése a 3 UTR-ben jelen lévő AUUUA motívum számától viii

9 Általános genetika ben a Science magazin a szabályozó RNS-eket tekintette az év tudományos áttörésének mirns-ek keletkezése, érése és hatása ix

10 A táblázatok listája 2.1. Hét tulajdonságpár öröklődési mintázata Mendel kísérleteiben Kodominancia az M N vércsoportrendszer kialakításában Többszörös allélizmus (i, IA, IB) az AB0 vércsoportrendszernél A menekítési kísérlet eredményeinek összefoglalása (+ van növekedés, - nincs növekedés) A kettős mutánsok fenotípusának összefoglalása A fluktuációs teszt eredménye Különféle szigma faktorok és az általuk felismert promóter szekvenciák jellemzői A lac operon működésének genetikai analízise I A lac operon működésének genetikai analízise II x

11 Általános Genetika Deák Veronika Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014 Deák Veronika Typotex Kiadó, ISBN: Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/ számú, Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért című projekt keretében. xi

12

13 1. fejezet - Bevezetés Mindennapos megfigyelés, hogy az egerek egér utódokat, az emberek pedig ember utódokat hoznak létre. Ami ebben döbbenetes, az az, hogy mind az egér, mind az ember fejlődése egyetlen sejtből, a spermium által megtermékenyített petesejtből létrejövő zigótából indul. A zigóták az egér és az ember esetében kísértetiesen hasonlítanak is egymásra. Minden többsejtű élőlény, növények és állatok egyaránt, fejlődési folyamaton mennek keresztül, melynek során egy sejtből kialakul a felnőtt egyed. Az egyedfejlődés során a nagyszámú sejtosztódásnak, illetve a differenciálódásnak köszönhetően különféle sejttípusok jönnek létre, melyek morfológiailag és biokémiailag is eltérőek (egyedi megjelenéssel és funkcióval bírnak, például vérsejtek, idegsejtek, izomsejtek stb.). A sejtek szövetekbe és szervekbe szerveződnek, melyek felépítése és funkciója az adott fajra jellemző. Egy szervezet biológiai sajátsága tehát egy fejlődési folyamat lépéseinek a végeredménye. A megtermékenyített petesejtnek tartalmaznia kell a fejlődési programra vonatkozó információkat. Ez az információ az ivarsejteken (gamétákon) keresztül jut a szülőkből az utódokba. Bármi legyen is ennek az információnak a fizikai természete, bármi legyen a generációról generációra történő átjutásának módja, az információ hordozójának négy fontos tulajdonsággal rendelkeznie kell: Képesség nagyszámú, különféle struktúra kialakítására A fejlődési programra vonatkozó információhordozónak rengeteg forma (sejt-, szövet-, szervtípus, különféle biokémiai folyamatok) létrehozására kell képesnek lennie, hogy meghatározza egy komplex szervezet minden részletét. Képesség a sokszorozódásra (replikációra) A zigótából kifejlődött ivarérett egyed óriási számú gamétát hoz létre, melyek alkalmasak arra, hogy létrehozzák a következő generációt. Az információhordozó struktúra hű másolására van tehát szükség, mivel a másolatoknak sok-sok generáción keresztül kell átadódniuk és megőrződniük. Képesség a változásra (mutábilitás) Egy faj egyedei nem teljesen azonosak (gondoljunk a különféle földrajzi rasszokra az ember esetében). A jelenkori európai ember őse több tízezer évvel ezelőtt vándorolt át Afrikából Eurázsiába, így a vándorlás körüli időben feltehetően az afrikai elődökre hasonlított. A későbbiekben sok-sok ponton megváltozott a fejlődési programra vonatkozó információ, melynek legszembetűnőbb következményei a külső jegyekben (bőr, haj) bekövetkező eltérések. Az információhordozó struktúra tehát változásra, azaz mutációk kialakulására képes. Az evolúciós elmélet szerint a ma élő fajok közös ősi fajokból keletkeztek, karakterek sokaságának megváltozása során. Az egérnek és az embernek például kb. 75 millió évvel ezelőtt élt a közös őse. A múltban bekövetkező mutációk változást okoztak a genetikai információban, és ezek a változások generációrólgenerációra átöröklődtek. Egy mutáció okozhat kisebb eltéréseket (például bőrszín) és bizonyos struktúrákban bekövetkező nagyobb változásokat is (például olyan tulajdonságok, melyek különböznek az egérben és az emberben). Több mutáció felhalmozódása eredményezheti egy teljesen új struktúra kialakulását is (például a gerincesek végtagja). Képesség az információ kifejezésére Ahhoz, hogy egy autó elkészüljön, nem elég a tervrajz, szükség van a gyári gépekre, munkásokra, energiára. Ennek analógiájára mondhatjuk, hogy az élőlényekben jelen van olyan gépezet, mely a genetikai információ alapján a biológiai struktúrák sokaságát létrehozza. Az információ tehát lefordítódik. Továbbá az információ lefordítása az élőlény életének meghatározott szakaszában történik meg, és csak a szervezet bizonyos részein, míg más részein nem. Például a hemoglobin (a vérben található oxigénszállító fehérje) kémiai szerkezetére vonatkozó információ a magzati kor meghatározott szakaszában átfordításra kerül a csontvelőszövetekben, ugyanakkor az idegsejtekben nem. A genetika mint tudományterület kialakulását Johann Gregor Mendel morvaországi szerzetes és apát munkásságához kötjük (1.1. ábra). Talán nincs még egy tudományterület, melynek kezdeteinél ennyire sziklaszilárdan egyetlen személy állna. Mendel 1865-ben publikálta az eredményeit, melyeket veteményborsó vonalak kontrollált keresztezéseivel ért el. Korának elképzeléseivel ellentétben Mendel arra a helyes következtetésre jutott, hogy a fejlődésre vonatkozó információkat a szülőktől az utódokba diszkrét faktorok 1

14 Bevezetés közvetítik. Ma ezeket a diszkrét faktorokat géneknek nevezzük. A gén terminológia 1909-ből Wilhelm Johannsen-től származik. Egy organizmus teljes genetikai állománya az adott élőlény genomja. A genetika tudományterülete a genetikai információ működésével foglalkozik ábra - Johann Gregor Mendel apáti öltözékben (posztumusz portré) A Mendel által leírt öröklődési faktorok fizikai természetére vonatkozó ismeretek csak a 20. század elején kezdtek felhalmozódni. Mint később látni fogjuk, fokozatosan világossá vált, hogy egy élőlény tulajdonságait meghatározó, a szülőktől az utódokra átöröklődő faktorokat a sejtmagban található kromoszómák tartalmazzák. Bizonyítást nyert, hogy a kromoszómák szétosztása az ivarsejtek képződésekor (a meiózis során) párhuzamba állítható a Mendel által leírt öröklődési faktorok viselkedésével. A genetikai anyag kémiai szerkezete, és a genetikai információ kifejeződésének molekuláris háttere csak a 20. század közepétől kezdett ismertté válni. Ennek ellenére már a korai genetika eszköztárával is igen eredményesen lehetett tanulmányozni sokféle biológiai tulajdonságot, napjainkban pedig a kísérleti lehetőségek óriási tárháza áll rendelkezésre. Mivel az élő szervezetek szinte minden strukturális és funkcionális aspektusát a gének határozzák meg, ezért egy adott biológiai sajátság hátterében álló gén vagy gének azonosítása és szerepük felderítése igen jelentős lépés az egyes biológiai folyamatok megértésében. Ma a genetikusok nemcsak az öröklődési mechanizmusokkal, hanem mindenféle biológiai mechanizmusokkal foglalkoznak, és bármely, biológiai rendszerrel foglalkozó szakembernek járatosnak kell lennie a genetika tudományterületén. Adott biológiai sajátság genetikai analízisének kulcsa a jelleget érintő mutációk (genetikai információban bekövetkező öröklődő változások) hatásának vizsgálata. Már a korai genetikai munkában felismerték és kihasználták a kutatók azt, hogy egy élőlényt röntgen sugárzással, vagy bizonyos kémiai anyagokkal kezelve nagy számú mutáció keletkezik. Sok mutáció okoz látható változást az élőlényekben. Némely esetben a látható változáshoz a kromoszómák szerkezetében bekövetkező változásokat (meghatározott szakaszok kiesése vagy megduplázódása) tudtak kötni. Az egyes mutáns változatokkal (ún. törzsek) végzett kontrollált, jól megtervezett keresztezések segítségével olyan kulcskérdésekre kaptak választ például, hogy két függetlenül izolált mutáció különböző vagy azonos géneket érint-e, vagy hogy két vagy több mutáció kombinálásának (egy egyedben való megjelenésének) milyen fejlődési és élettani vonatkozásai vannak. Az efféle indukált mutációkkal végzett kísérletes technikák igen hatékony módszernek bizonyultak egy adott élőlény fejlődési, fiziológiai, biokémiai útvonalainak megértésében. Vegyünk egy példát! Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) az egyik jól ismert genetikai modellszervezet. Az as években olyan muslica mutánsokat izoláltak, melyeknél az antenna lábszerű struktúrává fejlődött. Más mutációk extra szárnypár megjelenését okozták, így a muslica két szárny helyett négy szárnnyal rendelkezett. Az ilyen típusú, a szervek transzformációját (egymásba alakulását) eredményező mutációk tanulmányozásával sikerült feltárni például, miként fejlődnek a végtagok. Az új ismeretek rávilágítottak arra is, hogy a különféle élőlényekben a szárnyak, antennák és lábak egy fejlődésbiológiai alapprogram változatai, és az evolúció során képesek egymásba átalakulni. Az 1920-as évektől nagyjából az 1950-es évekig tartó időszakban végérvényesen bizonyítást nyert, hogy a genetikai információ hordozója a DNS (dezoxiribonukleinsav). A DNS kémiai szerkezetének feltárása (1953), és a genetikai információ kifejeződésének egyre mélyebb megértése óriási mértékben növelte a genetikai 2

15 Bevezetés analízis magyarázóerejét az elmúlt évtizedekben. Rengeteg ismeretanyag halmozódott fel a gének kifejeződésének szabályozásáról, vagyis arról, hogy egy biokémiai szignál alapján a genetikai információ mely része, milyen időszakban, az élőlény mely sejtjeiben, hogyan és miért fejeződik ki. Fontos hangsúlyozni, hogy egy élő szervezet életében nincs olyan időszak, amikor a genetikai információ kifejeződése szünetel. A sejteket felépítő és a különféle sejtfunkciókat végző molekulák folyamatosan képződnek. Ennek egyrészt az az oka, hogy az élőlény fiziológiai állapota folyamatosan változik, másrészt az, hogy a molekulák élete véges, így szükség van a pótlásukra. Az egyes sejtek élettartama is véges, tehát egy közel állandó sejtszámmal rendelkező szervezetnek osztódással kell az elpusztult sejtjeit pótolnia, és az új sejt molekuláris összetételét a funkciójának megfelelően ki kell alakítania. Mindezek miatt a DNS replikációja, az ezzel járó mutációk képződése, és a genetikai információ kifejeződése egy élőlény teljes életében folyamatosan zajlik. Ezért a biológiai folyamatok genetikai hátterének tanulmányozása nem csupán az egyedfejlődés során (a zigótától a kifejlett egyed kialakulásáig), hanem az egyed teljes élethosszában igen nagy jelentőségű. Látni fogjuk újra és újra, hogy a genetikai analízis magyarázóereje utolérhetetlen a biológiai problémák hátterének feltárásában. A genetika nem csupán egy terület a biológián belül. A genetikai megközelítés olyan módszer, melynek segítségével egy élő szervezet csaknem minden tulajdonsága vizsgálható. 1. A genetikai információ molekuláris alapja Egy élőlény felépülése és élettani működése legnagyobbrészt fehérjék által történik egyszerűen szólva: minden, amit a sejtben látunk, fehérje vagy annak terméke. A fehérjék szintézisére vonatkozó információt a DNS tárolja. A DNS két molekuláris fonal által kialakított kettős helikális struktúra (dupla hélix). A fonalak gerincét cukormolekula (dezoxiribóz) és foszfát csoport alkotja, ezek egymással váltakozva következnek egymás után a láncban. Minden cukor-foszfát csoporthoz egy nukleotid bázis tartozik. A DNS-ben négyféle bázis fordul elő: adenin (A), timin (T), guanin (G) és citozin (C). A DNS kettős hélixében a cukor-foszfát gerinc a hélix külső részén található, a nukleotid bázisok pedig a hélix belsejében helyezkednek el. A két szálhoz tartozó bázisok szigorú szabályok szerint páronként kapcsolódnak hidrogén-hidakkal egymáshoz. A bázisok kémiai tulajdonságaiból és térkitöltésükből adódóan az adenin timinnel, a citozin pedig guaninnal párosodik. A párt alkotó bázisokat egymással komplementernek mondjuk. Ez a molekuláris struktúra valósítja meg az örökítőanyag szükséges funkcióit: Nagyszámú struktúra kialakítására alkalmas információt tartalmaz Habár csak négyféle nukleotid bázis vesz részt a DNS szerkezetének kialakításában, ezek egy öröklődési egység (gén) hosszában bármilyen sorrendben elhelyezkedhetnek, és a gének bázisokban kifejezett hossza is változó lehet. Például tegyük fel, hogy egyik gén esetében a bázisok sorrendje egy szakaszon TTACGGACCT, egy másik génnél ugyanezen a szakaszon GCATACGATC nukleotid sorrend található. Ha az említett gének összesen 100 bázispár hosszúságúak (valójában ennél sokkal hosszabbak), akkor a lehetőségek száma (körülbelül 60 jegyű szám). Még ha figyelembe is vesszük azt, hogy a különböző szekvenciák nem jelentenek minden esetben eltérő genetikai információt (lásd később a kódszótár redundanciáját), ez akkor is óriási számú különböző, azaz eltérő információtartalmú szekvenciát jelent. Képesség a sokszorozódásra (replikációra) Mivel A csak T-vel, C csak G-vel párosodik, a kettős spirál egyik szálának bázissorrendje tökéletesen meghatározza a komplementer szál szekvenciáját. A DNS megkettőződésekor a kettős spirál mindkét szála mintaként szolgál az új szál szintéziséhez. A folyamatban az eredeti kettős spirállal teljesen megegyező két kópia dupla hélix képződik. Mutábilitás A DNS megkettőződésekor nem megfelelő bázis is beépülhet, vagy kieshetnek bázisok, illetve beépülhetnek újak. Ha ilyen esemény történik, akkor a képződött új szál szekvenciája, majd a következő replikációkor a róla másolt szál szekvenciája eltér az eredeti szálétól, azaz öröklődő változás, mutáció keletkezik. A genetikai információ átfordítása A négyféle bázisból kialakított szekvencia alapján a sejtnek meghatározott elsődleges szerkezettel (aminosavsorrenddel) rendelkező fehérjéket kell előállítania. A DNS-molekula bizonyos szakaszai szignálként működnek a tekintetben, hogy az adott sejtféleségben mely életszakaszban, milyen fiziológiás körülmények között, mely géneket szükséges fehérjévé fordítani. Hogyan használja egy sejt masinériája a bázisok 3

16 Bevezetés szekvenciáját mind a fehérjék aminosavsorrendjét meghatározó, mind pedig a fehérjeszintézis helyére és idejére vonatkozó információként? A későbbiekben ezekre a kérdésekre is választ kapunk. Egy protein aminosavsorrendjének meghatározása A nukleotid szekvenciában tárolt genetikai információ aminosavsorrenddé történő átfordítása két egymást követő mechanizmussal történik: ez a transzkripció és a transzláció. Transzkripció A DNS-ben kódolt genetikai információ a transzkripció (átírás) során hírvivő RNS-sé (messenger, mrns) íródik át. Az RNS (ribonukleinsav) szintén cukorfoszfát gerincből és nukleotid bázisokból épül fel, akárcsak a DNS, de alapvető szerkezeti különbségük, hogy az RNS-ben a cukor ribóz (és nem dezoxiribóz), továbbá hogy az RNS timin bázis helyett uracilt tartalmaz. Az mrns a DNS-sel ellentétben egyszálú polimer. A transzkripció során a DNS kettős szála lokálisan szétcsavarodik, és általában csak az egyik szál szolgál mintaként a komplementer egyszálú mrns szintéziséhez. A DNS-ről átíródó mrns-molekulát transzkriptumnak nevezzük. Ez az ún. elsődleges transzkriptum a transzkripciót követően módosulhat (eukarióták esetében), s ezeket a módosításokat szokás érésnek is nevezni. Az egyik legfontosabb ilyen módosítás az eredeti transzkriptum meghatározott szakaszainak (az intronoknak) a kivágása, így ezek a szakaszok nem fordítódnak át aminosavsorrenddé. Az érett mrns a DNS munkakópiájának tekinthető, mely három fontos feladatot lát el: Megnöveli a genetikai információ kópiaszámát egy sejtben az adott időpillanatban. Egy kópia DNS-ről számos mrns-másolat képződik, s egy mrns-molekulát a sejt transzlációs apparátusa többször is felhasználhatja az adott fehérje szintézisére. Szállítja a genetikai információt a sejtmagban lévő DNS-től a sejt citoplazmájába, ahol a fehérjeszintetizáló apparátus található (eukarióta szervezeteknél). Az mrns stabilitása és féléletideje szabályozza, hogy az adott fehérjéből mennyi termelődjön. Transzláció Egy aminosav lánc szintézise a mrns nukleotid szekvenciája alapján a transzláció (átfordítás) során történik. Hogyan határozza meg a négyféle bázis sorrendje, hogy a fehérjéket alkotó húszféle aminosav milyen sorrendben épüljön be a peptidláncba? A mrns információtartalma a transzláció során három nukleotidjával kerül leolvasásra. Ezeket a hármas csoportokat (tripleteket) kodonoknak nevezzük. Mivel három nukleotid pozícióban a négyféle nukleotidból 4 3 variáció lehetséges, a lehetséges kodonok száma 64. Ebből az következik, hogy egy aminosavat több kodon is kódolhat. Például az AUC, AUU és AUA kodonok mindegyike leucin aminosav beépítését határozza meg. Léteznek ún. STOP kodonok is (például UAG), melyek a transzláció befejező szignáljai. A fizikai megfeleltetést a kodon és a hozzá tartozó aminosav között a kis méretű, speciális térbeli szerkezetű trns (szállító, transzfer RNS) molekulák végzik. A trns szekvenciájának kitüntetett része tartalmazza a kodonnal komplementer, ún. antikodon tripletet. A trns másik kitüntetett részéhez az adott kodonnakantikodonnak megfelelő aminosav kapcsolódik. Ha a trns-hez kapcsolódik a megfelelő aminosav, akkor azt a trns-t töltöttnek nevezzük. Az aminosavak összekapcsolása az mrns által meghatározott kódsorrend szerint a riboszómák segítségével zajlik. A riboszómák fehérjékből és RNS-ekből álló szupramolekuláris gépezetek (rrns, riboszómális RNS). A riboszóma végigcsúszik az mrns-láncon, és az egyes kodonoknál a komplementer antikodonnal rendelkező töltött trns által szállított aminosavat beépíti a készülő polipeptid láncba. Ez addig folytatódik kodonról kodonra, amíg a transzláció végét jelző STOP kodon nem következik. Itt a riboszóma leválik az mrns-ről. A felhasznált, már nem töltött trns-molekulák recirkulálnak, azaz újra hozzájuk kapcsolódik az antikodonnak megfelelő aminosav. Egyszerre több riboszóma is haladhat az mrns mentén. A polipeptidtől a fehérjéig A transzláció során keletkező aminosavszekvencia a polipeptid lánc, mely egy fehérje elsődleges szerkezetének felel meg. A biológiailag aktív fehérjék kialakulásához a polipeptidlánc meghatározott térszerkezet vesz fel. Ez a folyamat a folding. (A kifejezés magyar megfelelője, a hajtogatódás, nem használatos). Génszabályozás 4

17 Bevezetés Egy élőlény teljes élete során (a zigóta állapottól a halálig) szükség van a genetikai információ kifejeződésének térbeli és időbeli szabályozására. A szabályozott működéshez szükséges információkat a genom tartalmazza. A genomot kitevő DNS legnagyobb része regulációs funkcióval rendelkezik. Minden esetben a sejt fiziológiai állapota, illetve a sejtet érő környezeti hatások határozzák meg, mely génekről képződjön transzkriptum. 2. A genetikai analízis megközelítésmódjai A biológiai rendszerek tulajdonságai igen hatékonyan vizsgálhatóak genetikai boncolással. A genetikai boncolás kifejezés arra utal, hogy egy biológiai struktúra vagy folyamat részekre bontható, nem szikével, hanem átvitt értelemben, a jelleget érintő változatok, mutánsok által, felfedve a vizsgált tulajdonság kialakításának hátterében álló géneket. Az alkalmazott módszerek, illetve a megközelítési módok szerint kétféle technika használatos: az előrehaladó (forward) és a fordított (reverz) genetikai analízis Előrehaladó genetikai analízis A forward genetikai vizsgálatok a kérdéses tulajdonságot érintő változatok (morfológiai vagy élettani) izolálásával kezdődnek. A biológiai változatok a genetikai vizsgálatok nyersanyagai. A forward genetikai vizsgálatra felhasználhatók a természetben előforduló változatok. Egy fajon belül, annak populációiban, az egyes egyedek között számos tulajdonságban természetes módon előforduló változatok vannak jelen. Becslések szerint a szexuálisan szaporodó fajok populációiban a fehérjekódoló gének egyharmadában van jelen olyan variáció az egyedek között, mely a fehérje aminosavsorrendjében lévő változásokat jelent. Ezeket a természetes variációkat genetikai polimorfizmusoknak nevezzük. Például egy rovarpopuláció egyedei között eltérés mutatkozhat egy rovarölőszerrel szembeni érzékenységben. A változatok vizsgálata elvezethet odáig, hogy azonosítják azt a gént, amely az élettani különbség hátterében áll. További vizsgálatokból kiderülhet, hogy a rovarölőszert hatástalanító meghatározott enzim változatairól van szó. Forward genetikai analízist a leggyakrabban olyan a kérdéses tulajdonságot érintő abnormális változat felhasználásával végeznek, mely ritka, a faj egyedeinek nagy részére nem jellemző. A ritka abnormális megjelenésű egyedet mutánsnak, a tulajdonság tekintetében normális, átlagos megjelenésű egyedeket pedig vad típusnak nevezzük. Legtöbbször laboratóriumi körülmények között nagy energiájú sugárzással vagy bizonyos kémiai anyagokkal növelik a mutációk képződésének esélyét. Egy tulajdonság kialakulása több ponton, több okból, többféleképpen megváltozhat. Ennek oka az, hogy a legtöbb tulajdonság kialakítása egymást követő molekuláris lépésekből áll, következésképpen több gén termékének együttes munkájától függ. Minél többféle rendellenes megjelenésű mutánst sikerül találni egy jelleg vizsgálata során, annál több, a vizsgált folyamat hátterében álló gént azonosíthatunk. Egy klasszikus példával, az ecetmuslica szemszínének kialakulásával szemléltetjük a forward genetikai boncolás alapjait. A vizsgálandó, azaz a boncolás alatt álló tulajdonság a példában a légy szemszíne. A kérdés az, hogy hány, mely gének terméke, és milyen módon alakítják ki a normál (téglavörös) szemszínt? A kutatók begyűjtöttek olyan mutánsokat, melyek különleges: tűzvörös, barna, fehér szemszínnel rendelkeztek. Úgy találták, hogy az egyes mutánsokban más-más gén érintett (ennek módját a későbbiekben tárgyaljuk). Megállapították azt is, hogy a tűzvörös és a barna megjelenést okozó génváltozatok kombinációja (egy egyedben való előfordulása) fehér szemszín kialakulásához vezet. Ebből arra következtettek, hogy a téglavörös szemszín kialakulásához kétféle pigmentanyag szükséges, a tűzvörös és a barna. A tűzvörös szemű mutánsban nem termelődik a barna pigment, a barna szemszínű mutánsban pedig nem termelődik a tűzvörös pigment. Ha egyik pigmentanyag sem termelődik, a légy fehér szemű. Ezekre a következtetésekre néhány jól megtervezett keresztezéssel, a genetikai törvényszerűségek ismeretében jutottak. Arra is rájöttek, hogy van egy harmadik gén, melynek hibája függetlenül a másik két géntől fehér szemszín kialakulásához vezet. E jelenség magyarázható úgy, hogy a pigment termelődés útvonalában e harmadik gén terméke a másik kettő alatt (downstream) hat, befolyásolhatja például a színanyagok lerakódását. A génváltozatok további kombinálásával a vizsgált biokémiai útvonal egyre precízebben feltárható. Az analízis utolsó stádiuma az egyes génváltozatok DNS-szintű vizsgálata. A DNS-változás okozhat a fehérje szerkezetében bekövetkező változást, vagy befolyásolhatja például a fehérje termelődésének mértékét Fordított genetikai analízis A fordított genetikai analízis egy ismert genetikai változás hatását vizsgálja. Első lépésben a DNS-t meghatározott helyen és módon molekuláris genetikai eszközökkel megváltoztatják, majd ennek következményeit tanulmányozzák az élőlény felépítésének különböző szintjein. 5

18 Bevezetés 3. A genetikában alkalmazott módszerek A gének tanulmányozása hatékony eszköz a biológiai rendszerek megismerésében. A legfontosabb módszereket az alábbiakban foglaljuk össze: A vizsgált folyamatot érintő mutációk izolálása Minden mutáns gén felfedi a vizsgált folyamat egy komponensét, és az együttesük pedig megmutatja, hogy mely fehérjék vesznek részt az adott folyamatban. A vad típus és mutánsok kontrollált keresztezéséből származó utódok analízise Ezzel a módszerrel azonosíthatjuk a géneket, meghatározhatjuk kromoszómális elhelyezkedésüket, és az öröklődési mintázatokat. A sejt biokémiai folyamatainak genetikai analízise Az élet alapvetően kémiai reakciók összessége. Evvel a módszerrel arra keressük a választ, hogy miként befolyásolja a sejt működését egy adott génmutáció, és ebből az információból következtetünk a gén eredeti funkciójára. Mikroszkópos eszközök Ezzel a módszerrel vizsgálható a kromoszómák szerkezete. Az újabb technikákkal megjelölhetők a gének vagy azok termékei, ezáltal mennyiségük, sejtbeli lokalizációjuk mikroszkóppal vizualizálható. A DNS direkt vizsgálata A molekuláris szintű vizsgálatok nagy részéhez szükséges, hogy a vizsgálandó DNS-szakasz nagy mennyiségben rendelkezésre álljon. A rekombináns DNS-technológia (génklónozás) eszköztárát széles körben alkalmazzák DNS-molekulák felszaporítására. Ez esetben in vivo (élő szervezetben, baktériumokban) történik az adott DNS-fragment felszaporítása. Bizonyos korlátozásokkal használható DNS-sokszorosításra a polimeráz láncreakció (PCR, polimerase chain reaction), amely in vitro (élő szervezetet nem igénylő, kémcsőben zajló) módszer. A gén analízisének fontos pontja a DNS szekvencia meghatározása. A DNS szekvenciájának analízisét számos élőlény esetében a teljes genomra kiterjesztették. Ezzel új terület jött létre a genetikán belül, a genomika, mely teljes genomok struktúráját, funkcióját, evolúcióját vizsgálja. Az összehasonlító genomika különböző fajok teljes genomjának összehasonlításával foglalkozik. A genomika területéhez szorosan kapcsolódik a bioinformatika, hiszen ilyen nagy mennyiségű adat tárolása és elemzése komputeres eszközök nélkül elképzelhetetlen. Próbák alkalmazása A genetika területének legfontosabb makromolekuláit (DNS, RNS, fehérjék) specifikus jelölőkkel, ún. próbákkal lehet vizualizálni. Ezek a próbák specifikus kölcsönhatás révén csak a keresett makromolekulához kötődnek a vizsgált biológiai mintában. A próbákat valamilyen módon megjelölik (például radioaktív atomok vagy fluoreszcens részek beépítésével), hogy a számunkra fontos molekula könnyen észlelhetővé váljon. 4. Genetikai modellszervezetek Ami igaz a coliban, igaz az elefántban jelentette ki Jacques Monod, Nobel-díjas tudós, az operonelmélet leírója Bár ez a megállapítás csak részben állja meg a helyét, jól kifejezi azt, hogy az élő szervezetek működése, főleg molekuláris szinten, sok hasonlóságot mutat. Mivel technikai vagy etikai ok folytán számos élőlény nem vizsgálható, a genetikai (és molekuláris biológiai, biokémiai) ismereteink nagy része viszonylag kisszámú modellszervezet tanulmányozásából származik. A modellszervezetek által feltárt mechanizmusok zöme általános, azaz érvényes a rokon fajok nagy csoportjára. Egyetlen szervezetben nem vizsgálható minden biológiai kérdés, ezért van szükség több, az egyes nagyobb taxonómiai csoportokat képviselő modellszervezetre. Előnyös, ha a választott élőlény kis testméretű, könnyen fenntartható, rövid a generációs ideje, sok utódot hoz 6

19 Bevezetés létre és a kontrollált keresztezések könnyen kivitelezhetőek. Ezen okok miatt az emlősök genetikájának tanulmányozására előnyösebb az egér, mint például az elefánt. A tudománytörténet első genetikai modellszervezete a Mendel által tanulmányozott veteményborsó (Pisum sativum). Segítségével Mendel az élővilág nagy részére általánosan érvényes öröklődési szabályszerűségeket tárt fel. További genetikai modellszervezetek Vírusok (és ezek egy csoportja, a bakteriofágok) Vizsgálatukból származik a DNS fizikai és kémiai szerkezetére vonatkozó ismereteink nagy része, továbbá a DNS replikáció és a mutáció képződés alapvető mechanizmusainak feltárása. Prokarióták Ezek egysejtes szerveződésű haploid életformák. A legfontosabb modell a csoportban az Escherichia coli baktérium. Eukarióták Élesztők (Saccharomyces cerevisiae) Fonalas gombák (Neurospora crassa) A baktériumok, élesztők, fonalas gombák fontossága viszonylag egyszerű, könnyen tanulmányozható biokémiai rendszerük miatt kiemelkedő a genetikában. Soksejtű szervezetek. Bizonyos folyamatok (a sejtek, szövetek, szervek differenciálódása, a testrészek kialakulása) csak e modellszervezeteken tanulmányozhatóak. Legfontosabb soksejtű eukarióta modellszervezetek az alábbiak: Lúdfű (Arabidopsis thaliana) Ecetmuslica (Drosophila melanogaster) Laboratóriumi fonalféreg (Caenorhabditis elegans) Zebradánió (Danio rerio) Egér (Mus musculus) A legfontosabb genetikai modellszervezetek teljes genom szekvenciája ismert ábra - Genetikai modellszervezetek (felső sor balról jobbra: fágok, kukorica, laboratóriumi fonalféreg, zebradánió; alsó sor: baktériumok, egér, muslica, lúdfű). 7

20 Bevezetés 5. A gének és a környezet, geno- és fenotípus Hogy különbséget tehessünk az öröklődő gének és a fejlődés során létrejövő sajátságok között, a kutatók megalkották a genotípus és a fenotípus fogalmát. A genotípus leírja a gének összességét, amit egy egyed örökölt, míg a fenotípus leírja az egyed morfológiájának, fiziológiájának, viselkedésének minden vonatkozását. A genotípus lényegében állandó az élet folyamán, míg a fenotípusok legnagyobb része változik. Ha két egyed génjei megegyeznek, azonos genotípusuk van, ha a megjelenésük egyezik meg, azonos fenotípusról beszélünk. A gyakorlatban általában részleges fenotipikus leírással foglalkozunk (például a szem színének leírásával), és nem az egyed összes génjéről beszélünk, hanem annak egy géncsoportjáról (például a szem pigmentjeit kialakító génekről). Amikor geno- vagy fenotípust említünk, általában mindig csak részleges geno- és fenotípust kell ezen érteni, ami csak az éppen vizsgált néhány jelleget vagy gént foglalja magában. Döntően a gének szabják meg azt, hogyan nézzen ki egy adott élőlény. Ez a genetikai determináltság. A szülők az ivarsejtjeikben tovább adják az utódaiknak azokat a speciális ismereteket, amelyek segítségével a környezet anyagaiból hozzájuk hasonló élőlényeket hozhatnak létre. A speciális ismeretek gének formájában vannak jelen a megtermékenyített petében. A gének és a petesejt együttes információi alapján alakul ki a faj egy egyede. Nincs olyan környezet, melyben egy oroszlán ló utódokat hozna létre. Az erdőben, ugyanazon környezetben, a makk mindig tölgyfává, a mohaspóra pedig mohává fejlődik. A genetikai program úgy képzelhető el, mint egy tervrajz. Analógiaként mondhatjuk, hogy ugyanazon építőanyagokból különböző tervrajz alapján más-más épület építhető. Tehát a gének okozzák és tartják fenn a különbséget a fajok között, és a fajon belül az egyedek között. Azonos környezeti hatások mellett A terv (genotípus) alapján A élőlény, B terv (genotípus) alapján pedig B élőlény fejlődik. A gének azonban nem önmagukban határozzák meg egy szervezet működését, a környezetnek is jelentős szerepe van ebben. Elméletileg két azonos genotípusú egyed fejlődhet különbözőképpen eltérő környezetben, illetve két eltérő genotípus fejlődhet azonos módon is a környezettől függően. A valóságban az egyedek általában sem génjeikben, sem környezetükben nem egyeznek teljes mértékben. 1. példa A muslica szemének fejlődését a genotípus mellett a környezet is jelentősen befolyásolja. A vad típusú legyek összetett szemét alkotó facetták száma a tartási hőmérséklet függvényében (15 és 30 C között) között változik (1.3. ábra). Ha megvizsgálunk két szemméret mutánst, melyek szeme az alacsonyabb facettaszám miatt kisebb, tehát úgynevezett résszeműek (ezeket infrabar és ultrabar mutánsoknak nevezték el), akkor azt tapasztaljuk, hogy az infrabar genotípus esetén a facettaszám között, az ultrabar genotípusnál pedig között változik a hőmérséklet függvényében (1.3. ábra) ábra - A vad típusú és két szemméret mutáns muslica reakciónormája 8

21 Bevezetés A genotípus, a környezet és a fenotípus összefüggéseit grafikusan ábrázolva kapjuk a reakciónormát. A fenti példában a vad típusú muslicák reakciónormája minden vizsgált hőmérsékleten (azaz környezetben) eltér a mutánsok reakciónormájától, vagyis a reakcónormák nem átfedőek. Ugyanakkor, van olyan környezet (16 C), melyben a két mutáns ugyanúgy fejlődik, tehát az infrabar és ultrabar mutánsok reakciónormája átfedő. Ebből következik, hogy genotípust a fenotípussal azonosítani csak jól definiált környezetben lehet. A genetikai vizsgálatokban lehetőség szerint kerülni kell az átfedő reakciónormával rendelkező mutánsok alkalmazását. Előnyösebb a nem átfedő reakciónormával rendelkező törzsek vizsgálata, mert esetükben a fenotípusból egyértelműen következik a genotípus. 2. példa A közönséges cickafark (Achillea millefolium) növényen vizsgálták az egyes genotípusok reakciónormáit. Hét különböző genotípusú növényt dugványozással szaporítottak (lényegében klónoztak, így a genotípusuk biztosan azonos), és minden genotípust háromféle környezetben (három különböző tengerszint feletti magasságban) neveltek. A növények magasságát vizsgálták mint fenotípust. A hét genotípus reakciónormái nagymértékben átfedtek. Ez a kísérlet is alátámasztja, hogy a természetben a reakciónormák a leggyakrabban átfedők, illetve példázza, hogy a genotípust csak szigorúan körülírt környezetben lehet a fenotípussal azonosítani A fejlődési zaj Láthattuk, hogy a tulajdonságok a gének tervrajza alapján, de a környezettel kölcsönhatásban bonyolult egyedi fejlődéstörténet során alakulnak ki. Ebben némi szerep még a véletlennek is jut. Ezt a véletlenszerű hatást 9

22 Bevezetés fejlődési zajnak nevezzük. Példa erre az, hogy a vad Drosophila két szemében is lehet kisebb eltérés a facetták számában, holott azonos a genotípus és azonos a környezet. 10

23 2. fejezet - Egygénes öröklődés Egy gén felfedezése mérföldkőnek számít a biológiai folyamatok vizsgálatában. A gén (gének) azonosítását követően további kutatások során felderíthető, hogy pontosan mely lépésben és hogyan vesz részt az adott gén egy adott tulajdonság kialakításában. A génazonosítás egyik leggyakoribb módja az egygénes öröklődési mintázat azonosítása. Ebben a fejezetben ezzel az öröklődési mintázattal foglalkozunk. Az ilyen öröklődési mintázat viszonylag egyszerűen detektálható meghatározott módon kivitelezett kontrollált keresztezésekkel. Az analízisben központi szerepük van a mutánsoknak, vagyis az olyan egyedeknek, melyek a vizsgálat tárgyát képező tulajdonság normális formájától eltérést mutatnak. Egy tulajdonság normális formáját vad típusnak nevezzük (ez a vadonban, vagyis a természetben fellelhető egyedek leggyakoribb megjelenési formája). A genetikai analízis útja a következő: 1) a vizsgált tulajdonság tekintetében vad típusú egyedet (például piros virágú növényt) párosítanak a faj olyan egyedével, mely e tulajdonságban mutáns megjelenési formát mutat (például piros helyett fehér virágú); 2) e keresztezés utódait egymás között párosítják; 3) a második párosítás utódai között megállapítják a vizsgált tulajdonság két megjelenési formáját mutató (ebben a példában piros és fehér virágú) egyedek arányát. Meghatározott arány (erről később lesz szó) esetén megállapítható az egygénes öröklődés. Ez esetben a vad tulajdonság egy gén vad típusú formája által meghatározott, a mutáns tulajdonság pedig ugyanezen génnek egy másik formája által, melyben az adott gén területén egy mutációs esemény folytán megváltozott a DNS-szekvencia. E gén mutáns változata tehát lehetővé tette, hogy a vizsgált tulajdonság (itt a virágszín) kialakításában részt vevő egyetlen gént azonosítsunk. Más szóval egy mutáns génváltozat ráirányítja a figyelmet egy biológiai folyamat hátterében álló elemre, azaz egy génre. További például a virágszínt tekintve a vad típustól eltérő megjelenésű mutánsok analízisével számos további virágszín-gén azonosítható hasonló genetikai boncolással. Minden génazonosítási munka kiindulási lépése az adott kutatás középpontjában álló biológiai folyamatban érintett mutánsok megtalálása, izolálása. Ezt nevezik a kutatók a mutánspark létrehozásának. Ez leggyakrabban vizuális szűréssel (screening) történik egy adott faj egyedeinek nagyszámú csoportjából. Egy tulajdonság kialakulása (például egy növényben a virág fejlődése) sokféleképpen megváltozhat. Minél többféle rendellenesen fejlődő mutánst sikerül találni egy vizsgálat során, annál több, a vizsgált folyamat hátterében álló gént azonosíthatunk. Az egygénes öröklődésre vonatkozó ismeretek alkalmazása nemcsak az alapkutatásokban, hanem az alkalmazott genetikai kutatásokban is nagy szerepet kap. Például számos emberi betegség hátterében egyetlen gén mutáns változata áll. Az egygénes öröklődési mintázat felismerése családfaanalízissel történik, további munkával molekuláris szinten azonosítható a gén, szerepének pontos megismerése pedig elvezethet új terápiás eszközök kidolgozásához. A mezőgazdasági ágazatokban szintén fontos az egygénes öröklődésre vonatkozó ismeretek alkalmazása. Például gyakran előfordul, hogy egyetlen gén megváltozása jobb táplálkozástani tulajdonságok, vagy a betegségekkel szembeni nagyobb ellenállóképesség kialakulásához vezet. Ilyen előnyös mutációkat sok esetben felhasználnak a termesztett növényfajták és a tenyésztett állatfajták nemesítése során. Az egygénes öröklődés szabályszerűségeit Gregor Mendel tárta fel az 1860-as években. Mendel Ágoston-rendi szerzetes volt a morvaországi (ma a Cseh Köztársaság területe) Brünn (Brno) városában. A kolostor kertjében végezte kísérleteit veteményborsó növényekkel. A mendeli analízis a mai napig alkalmazott kísérleti megközelítés prototípusának tekinthető. Mendel munkásságának zseniális vonása, hogy úgy végzett genetikai analíziseket, hogy nem ismerte a gének molekuláris természetét, nem tudta, hogy a gének hogyan befolyásolják az egyes tulajdonságok kialakulását, hogyan adódnak át sejtről sejtre. Ma már tudjuk, hogy a gének nagy része fehérjéken keresztül végzi feladatát. Azt is tudjuk, hogy a gének a kromoszómák részei, melyek precízen másolódnak és adódnak át az utódsejtekbe. Ahhoz, hogy az egygénes öröklődés alapjait megértsük, először tekintsük át Mendel erre vonatkozó munkásságát, majd pedig a gének és a kromoszómák viszonyára vonatkozó mai ismereteket. 1. Mendel első törvénye: egyenlő szegregáció Mendel a kísérleteihez Pisum sativum (veteményborsó) növényeket használt. Praktikus választás volt ez a részéről, hiszen ez a növény viszonylag könnyen szaporítható, és sokféle változatát be lehetett szerezni a kertészetekből. Ezek a változatok szolgáltatták a mutánsparkot a genetikai vizsgálatokhoz. Fontos kiemelni, hogy Mendelt nem a borsónövény meghatározott tulajdonságai érdekelték, nem végzett genetikai boncolást, hanem egy sokkal általánosabb kérdést tett fel, nevezetesen azt, hogy milyen szabályszerűségek szerint jutnak át generációról generációra az egyes tulajdonságokat meghatározó öröklődési faktorok. 11

24 Egygénes öröklődés Mendel hét tulajdonság öröklődését vizsgálta. Minden egyes tulajdonság esetében két, egymástól jól megkülönböztethető formát szerzett be (lásd ezeket zárójelben az alábbi felsorolásban). Ma úgy mondjuk, hogy minden egyes tulajdonság esetében két-két fenotípust vizsgált. A Mendel által vizsgált sajátságok: 1. borsószem színe (sárga vagy zöld) 2. borsószem alakja (sima vagy ráncos) 3. hüvely színe (sárga vagy zöld) 4. hüvely alakja (felfújt vagy becsípett) 5. virág színe (lila vagy fehér) 6. növény magassága (magas vagy alacsony) 7. virágos hajtás elhelyezkedése (axiális vagy terminális) Mendel kísérleteihez tiszta vonalakat használt. Ez azt jelenti, hogy a szóban forgó fenotípus tekintetében az adott vonal egyedeinek utódai ugyanazt a fenotípust mutatják, elméletileg végtelen számú generáción keresztül. Például a sárga szemű vonal esetében az utódok sok-sok generáción keresztül mindig sárga szemű magvakat hoznak. A borsóval végzett kontrollált keresztezések meglehetősen nagy munkával járnak. A növény hímnős virágokkal rendelkezik (Pillangósvirágúak családja), így két tiszta vonal keresztezése úgy kivitelezhető, hogy az egyik növény virágaiból a portokokat még pollenérés előtt el kell távolítani (ez lesz az anya a keresztezésben), majd a másik növény (apa a keresztezésben) pollenjeit finom ecsettel át kell helyezni az előző növény bibéjére. Önmegtermékenyítéshez pedig egyszerűen hagyni kell a polleneket egy virágon belül a saját bibére szóródni. Mendel mind a hét tulajdonságpárra vonatkozóan elvégzett egy több generációs keresztezési sort, az alábbiak szerint: egy tulajdonságban két eltérő fenotípusú tiszta vonalat keresztezett egymással; ezt szülői generációnak nevezte (P, parental=szülő); a keresztezést mindkét irányba elvégezte, vagyis egyik esetben az egyik, másik esetben a másik fenotípusú növényt választotta anyának megvizsgálta az utódok fenotípusát a vizsgált jelleg tekintetében; az első utódnemzedéket F1-nek (F, filial=utód) nevezte el az F1 nemzedék egyedeit önmegtermékenyítéssel tovább szaporította megvizsgálta a következő generáció, azaz az F2 utódok fenotípusát A keresztezések eredményeit a 2.1. táblázat foglalja össze, egy konkrét keresztezést pedig a 2.1. ábra szemléltet táblázat - Hét tulajdonságpár öröklődési mintázata Mendel kísérleteiben Szülői fenotípusok F1 F2 F2 fenotípus arány 1. sárga zöld szem mind sárga 6022 sárga; 2001 zöld 3,01 : 1 2. sima ráncos szem mind sima 5474 sima; 1850 ráncos 2,96 : 1 3. zöld sárga hüvely mind zöld 428 zöld; 152 sárga 2,82 : 1 4. felfújt becsípett hüvely mind felfújt 882 felfújt; 299 becsípett 2,95 : 1 5. lila fehér sziromlevél mind lila 705 lila; 224 fehér 3,15 : 1 12

25 Egygénes öröklődés 6. magas alacsony szár mind magas 787 magas; 277 alacsony 2,84 : 1 7. axiális terminális virágos hajtás mind axiális 651 axiális; 207 terminális 3,14 : 1 A reciprok keresztezésekből származó F1 utódok mindig ugyanazt az eredményt adták, tehát függetlenül a keresztezés irányától, az összes vizsgált jelleg tekintetében az F1 generáció minden tagja az egyik szülő fenotípusát mutatta (például sárga magszínt). Az F1 önmegtermékenyítéséből származó F2 generációban mindkét szülői fenotípus megjelent: ¾ arányban az egyik (amelyik fenotípust az F1 összes egyede mutatta, például sárga magszín) és ¼ arányban a másik (amelyik fenotípus az F1 generációban nem mutatkozott, például zöld magszín). Az a szülői fenotípus, amelyik eltűnt az F1-ben, újra megjelent az F2-ben, ami arra utal, hogy e fenotípus kialakításáért felelős genetikai elem jelen volt, de nem fejeződött ki az F1 egyedekben ábra - A sárga és zöld magszín öröklődésének szemléltetése 13

26 Egygénes öröklődés Mendel tovább vizsgálta az F2 egyedeket is önmegtermékenyítéssel. Azt tapasztalta, hogy az F2-ben ¼ arányban megjelenő egyedek (például a zöld magvúak) tisztán tenyésztek (tehát a következő generációkban is zöld magot hoztak). Az F2-ben ¾ arányban megjelenő egyedek (például a sárga magvúak) viszont 14

27 Egygénes öröklődés kétféleképpen viselkedtek: 1/3-uk tisztán tenyészett (a következő generációkban is sárga magot hozott), 2/3-uk pedig az F1 egyedekhez hasonlóan - 3:1 arányban hoztak utódokat (3/4 sárga, ¼ zöld mag). További informatív keresztezés az volt, amikor Mendel az F1 egyedeket keresztezte azzal a tiszta vonalú szülővel, melynek fenotípusa eltűnt az F1-ben, majd újra megjelent az F2-ben (például a zöld mag). Ekkor az utódok 1:1 arányban mutatták a kétféle fenotípust (1/2 sárga : ½ zöld magszínű lett) (2.1. ábra). A fentiekben bemutatott 3:1 és 1:1 arány általánosnak bizonyult, a magszínen kívül az összes többi, Mendel által vizsgált tulajdonságpár esetén érvényesült. Nem túlzás kijelenteni, hogy a genetika tudományának születése annak volt köszönhető, hogy Mendel tökéletesen átgondoltan végezte a munkáját, precízen feljegyezte az eredményeit, felismerte a számarányok fontosságát, megismételte a kísérleteket, briliáns módon segítségül hívta az eredményei értelmezéséhez a matematikát, és modellt épített. Modellje helytállónak bizonyult, mert tökéletesen alátámasztotta és előrejelezte a kísérletes eredményeket. Mendel öröklődésre vonatkozó modellje mai terminológiával megfogalmazva az alábbi megállapításokat foglalja magába: 1. Egy öröklődési faktor, azaz gén szükséges egy tulajdonság kialakításához. 2. Minden növényegyed két példányát tartalmazza ennek a génnek, azaz az egyedekben minden gén párban van jelen. 3. Egy gén két formáját az adott gén alléljainak nevezzük; a magszín génjének egyik allélját Y-nal jelöljük (a yellow = sárga angol kifejezés kezdőbetűjéből), ez az allél áll a sárga magszín hátterében, a másik allélt pedig y- nal jelöljük, ez felelős a zöld magszín kialakításáért. 4. Egy növény bármely kombinációban hordozhatja egy gén két allélját, azaz lehet: Y/Y, y/y, Y/y (a / jel jelöli, hogy az általa elválasztott allélok egy gén változatai). 5. A Y/y növények fenotípusa megmutatja azt, hogy melyik génváltozat dominál (erősebb, uralkodik a másik felett). Mivel a Y/y növények fenotípusa sárga magszín, ezért a Y a domináns allél, és y a recesszív allél. 6. A génpár tagjai a meiózis során szétválva jutnak a gamétákba: a gaméták egyik fele a génpár egyik tagját, másik fele a génpár másik tagját hordozza. Ez Mendel első törvénye, melyet az egyenlő szegregáció törvényeként is ismerünk. 7. Az ivarsejtek tehát minden génnek csak egy allélját tartalmazzák. 8. Megtermékenyítéskor a gaméták véletlenszerűen fuzionálnak, függetlenül attól, hogy mely allélokat hordozzák. A továbbiak megértéséhez meg kell ismerkednünk az alábbi fogalmakkal is: Zigóta: a hím és a női ivarsejt összeolvadásából keletkező első sejt, amelyből a többsejtű egyed kifejlődik. Homozigóta egy génpárra nézve az az egyed, amely az adott gén ugyanazon két allélját tartalmazza. Heterozigóta egy génpárra nézve az az egyed, amely egy gén két különböző allélját hordozza (egy génben heterozigóta egyedre használatos még a monohibrid kifejezés, illetve két gén tekintetében heterozigóta egyedre a dihibrid kifejezés). Egy egyed lehet homozigóta domináns (például Y/Y), heterozigóta (például Y/y), vagy homozigóta recesszív (például y/y). A fenotípus alapjául szolgáló allélkombinációt genotípusnak nevezzük (tehát Y/Y, Y/y, y/y genotípusok). A 2.2 ábra bemutatja, hogy Mendel egyenlő szegregációra vonatkozó törvénye miként magyarázza a fent ismertetett számarányokat. A szülői tiszta vonalak homozigóták: egyik szülő Y/Y genotípusú, ami sárga magszín fenotípussal párosul, a másik szülő y/y genotípusú, ami zöld magszínt határoz meg. Ezen vonalak egyike csak Y, másika csak y allélt tartalmazó gamétákat hoz létre (ezért tenyésznek tisztán). Ha e két vonalat keresztezik egymással, akkor az F1 utódgeneráció minden tagja heterozigóta (Y/y). Mivel Y a domináns allél, ezért minden F1 egyed sárga színű magokat terem. Az F1 egyedek önmegtermékenyítése (jelen esetben egymás közti keresztezése is) Y/y Y/y keresztezést jelent (ez egy monohibrid keresztezés). A Y/y genotípusú egyedek 15

28 Egygénes öröklődés gamétaképzése során (a borsó kétivarú virágában hím és nőivarú gaméták egyaránt keletkeznek) a Y és y allélok egyenlően szegregálnak, azaz a gaméták egyik fele Y, másik fele y allélt tartalmaz. A hím és női gaméták random találkoznak. Ennek megfelelően az F2 generációban keletkező geno- és fenotípusok a következők lesznek: ¼ Y/Y homozigóta domináns, tisztán tenyésző sárga magvú; 2/4 Y/y heterozigóta, sárga magvú; ¼ - homozigóta recesszív, tisztán tenyésző zöld magvú. Láthatjuk, hogy a 3:1 fenotípus arányhoz 1:2:1 genotípus arány társul ábra - Egy tulajdonságpár öröklődése és magyarázata Itt vezessük be a Y/- ( nagy ipszilon per valami ) genetikai jelölést, melyben a kötőjel bármelyik allél lehet. Ennek a jelölésnek azért van jelentősége, mert a domináns Y allél, a másik alléltól függetlenül, egységesen sárga fenotípushoz vezet. A monohibrid keresztezésből származó számarány tehát kétféleképpen is felírható: ¼ Y/Y 2/4 Y/y ¼ y/y vagy ¾ Y/- ¼ y/y Megjegyezzük, hogy az allélok egyenlő szegregációja ugyan csak a heterozigóta egyedek gamétaképzésekor detektálható, de természetesen a homozigóta egyedekben is érvényes (½ Y: ½ Y, illetve ½ y: ½ y). Az eddigiek alapján az is megérthető, hogy az F1 Y/y heterozigóta (sárga magvú) és a tiszta vonalú y/y (zöld magvú) növények keresztezéséből miért és hogyan keletkeznek 1:1 arányban sárga magvú (Y/y), illetve zöld magvú (y/y) utódok (2.2. ábra). Mivel a y/y szülő csak y allélt hordozó gamétákat képez, ezért az utódok genoés fenotípusát az határozza meg, hogy a másik, a Y/y heterozigóta szülő felől melyik allélt kapja. Megfelelően nagyszámú utód esetén a Y/y és a y/y genotípusok az utódpopulációban közelítenek az 1:1 arányhoz. Fontos hangsúlyozni, hogy Mendel a fenti munkájával nem a borsó bizonyos tulajdonságainak genetikai hátterére volt elsősorban kíváncsi, mégis azonosított egy olyan gént, amely a borsószem színéért felel (ez az Y gén), valamint a többi jelleg tekintetében további géneket is. Ez a példa tökéletes volt arra, hogy lássuk: egy biológiai sajátság kialakításának hátterében álló gén(ek) azonosításában az egygénes öröklődés szabályainak ismerete, és az egygénes öröklődés tényének felismerése igen jelentős egy keresztezési kísérletsorban. 16

29 Egygénes öröklődés Mendel munkásságával megelőzte a korát, eredményeit korának tudóstársadalma nem értette. Az általa leírt szabályszerűségeket 1900-ban egymástól függetlenül újra publikálta három kutató, Carl Correns, Hugo de Vries és Erich von Tschermak. A tudománytörténet ezeket a munkákat Mendel törvényeinek újrafelfedezéseként tartja számon. Rövid időn belül számos élőlényen tesztelték, és találták érvényesnek Mendel öröklődésre vonatkozó törvényeit. Ma már tudjuk, hogy az egyenlő szegregáció törvénye a kromoszómák meiózisban mutatott szegregációjából fakad. A következőkben ezért áttekintjük az egygénes öröklődés kromoszómális alapjait. 2. Gének és kromoszómák Ebben a fejezetben a későbbiek megértéséhez szükséges fogalmakkal ismerkedünk meg. Egy élőlény teljes genetikai információját (DNS-ét) az adott szervezet genomjának nevezzük. Eukarióta szervezetekben a DNS döntő része a sejtmagban helyezkedik el. Ez a sejtmagi DNS meghatározott egységekre osztott, s ezek az egységek alkotják a kromoszómákat. Az egy fajba tartozó szervezetekre meghatározott számú és megjelenésű kromoszómák jellemzők. A legtöbb állat és növényfaj diploid (jele: 2n), ami azt jelenti, hogy testi sejtjeik két komplett génkészlettel, és ennek megfelelően két azonos kromoszóma szettel rendelkeznek. Az ivarsejtekre egyszeres, haploid (jele: n) kromoszóma készlet jellemző. Embernél n=23, és 2n=46. Egy élőlény haploid genomjának bázispárokban (bp) kifejezett mérete a C-érték. A humán genom C-értéke: 3, bp. Általánosságban igaz, hogy a nagyobb rendszertani csoportok között a komplexitásnak megfelelően változik a minimális haploid genom mérete (minél komplexebb a csoport, annál nagyobb a genom mérete). Ki kell azonban emelni, hogy egyes taxonómiai csoporton belül látszólag indokolatlanul túl nagy az egyes fajok genomméretének a különbsége. Ezt a jelenséget illetik a C-érték paradoxon kifejezéssel. A méretbeli eltérések egyrészt bizonyos genomrészek mennyiségi különbségeiből fakadnak (ezek: intergénikus (gének közötti) szakaszok, a génekben található nem kódoló szakaszok (intronok), mozgó genetikai elemek), további oka lehet a poliploidia (többszörös genomkészlet). A diploid élőlények sejtmagjában lévő azonos megjelenésű kromoszóma-párok tagjait homológ kromoszómáknak, vagy egyszerűen homológoknak nevezzük. A homológ kromoszómák azonosak abban a tekintetben, hogy ugyanazokat a géneket tartalmazzák ugyanolyan elrendeződésben, de a DNS-szekvenciájuk nem teljesen azonos, s a köztük lévő eltérések adják az egy fajon belül fellelhető genetikai variációt. Diploidokban tehát minden gén párban található. Fontos megjegyezni, hogy a testi sejtekben a homológ párok fizikailag nem állnak párba, hanem a sejtmagon belül meghatározott, nem feltétlenül egymáshoz közeli territóriumot foglalnak el (2.3. ábra) ábra - Interfázisos kromoszómák által elfoglalt territóriumok csirke diploid sejtmagban (az egyes homológokat eltérő fluoreszcens festés jelöli) 17

30 Egygénes öröklődés A haploid eukarióta szervezetek (például gombák, algák) sejtmagja egy kromoszómaszettet tartalmaz. A haploidok fontos szerepet töltöttek és töltenek be a genetikai kutatásokban mint modellszervezetek, hiszen genetikai vizsgálatuk egyszerűbb, mint a diploid szervezeteké. Minden kromoszóma egy DNS molekulából áll (kivéve a sejtosztódást megelőző megkettőződött állapotot). Ha a sejtmagi teljes DNS-t agaróz gélelektroforézissel analizáljuk, a sávok száma megfelel a haploid kromoszómaszámnak (a homológ párok DNS-e azonos méretüknél fogva egy sávként jelenik meg). A sejtmagban lévő DNS-molekulák hossza nagyságrendekkel meghaladja a kromoszómák méretét. Az ember 23 kromoszómáját alkotó DNS hossza összesen nagyjából 1 m (!) hosszúságú. A DNS tehát tömören csomagolt állapotban van jelen a kromoszómákban (2.4. ábra). A csomagolt szerkezet kialakításában a DNS mellett bázikus oldalláncokkal rendelkező hiszton fehérjék vesznek részt. A hisztonok több bázikus oldalláncú aminosavat (arginint, lizint, hisztidint) tartalmaznak, és a pozitív töltéseknek köszönhetően elektrosztatikus kölcsönhatás jöhet létre a negatív töltésekkel rendelkező (foszfát csoportok) DNS-molekulával. A hiszton fehérjék a leginkább konzervált (hasonló aminosavsorrenddel rendelkező) fehérjék közé tartoznak, távoli rokon fajokban is csak csekély eltéréseket mutatnak, hosszúságuk 100 aminosav körüli. A tömörülés legkisebb egysége a nukleoszóma, mely hiszton-oktamer (8 hiszton fehérje) köré csavarodott DNS-szakasz. 1 nukleoszómára 160 bp jut, a DNS kettős hélix két fordulatot tesz a hiszton oktamer körül, a nukleoszóma átmérője 10 nm. A nukleoszómák további, többszintű csavarulása alakítja ki a kromatint, a kromoszómák anyagát. A nukleoszómákat a (kb. 200 aminosav hosszú) H1 nevű hiszton kapcsolja össze 30 nm-es szolenoid tekerccsé, melyben csavarulatonként hat nukleoszóma helyezkedik el. A 30 nm átmérőjű szolenoid hurkokat alakít ki egy központi fehérje vázhoz (scaffold, vagy magyar átiratban szkaffold) kapcsolódva. A scaffold szerkezete kevésbé ismert, a topoizomerázii és más, ún. nemhiszton fehérjékből épül fel. A SAR (= scaffold attachment region) szakaszok azok a részek a DNS mentén, melyek a scaffoldhoz kapcsolódásban vesznek részt. Két SAR közötti szakasz nagyságrendileg és nagy általánosságban néhány tízezer bp hosszúságú. A gének a SAR-ok között helyezkednek el (2.4. ábra) ábra - A kromatin szerveződése 18

31 Egygénes öröklődés A kromoszómák hossza mentén a kromatin kompaktsága (azaz a tömörülés mértéke) eltérő. A DNS-sel reagáló festékek ennek megfelelően különböző intenzitással festik a kromoszómák egyes részeit. A leginkább festődött szakaszoknál a DNS szorosabban csomagolt állapotban van jelen, ilyen kromoszómaszakasz például a centromer, ahol a kromatin jellemzően összeszűkül. A centromernek fontos szerepe van a sejtosztódás során a kromoszómák szegregálódásában. A szorosan csomagolt kromatinszerkezetet heterokromatinnak, a lazább szerkezetet eukromatinnak nevezzük. Bizonyos kromoszómák sajátos régiója a nukleólusz organizátor (NOR régió). Ezek a laza kromatin szerkezetű szakaszok riboszómális RNS-géneket tartalmaznak, melyek 19

32 Egygénes öröklődés folyamatosan, és nagy mennyiségben íródnak át. Környezetükben az rrns-ek nagy számban vannak jelen. Ez a funkcionális egység a nukleólusz (sejtmagvacska) része, ahol a riboszómák összeszerelése zajlik. A kromoszómák további kitüntetett részei az azok végein található telomer szakaszok. A telomerek szerkezeti védelmi szerepe rendkívül fontos, és a replikációs mechanizmusuk egyedi (erről később szólunk részletesebben). Bizonyos festési eljárásokkal a kromoszómák erősebben és gyengébben festődő keresztirányú sávozottságot mutatnak. Ez a mintázat fontos támpontot nyújt a kromoszómaszerkezeti eltérések vizsgálatában. A sávozottság kromatinszerkezeti mintázatot tükröz. A gének a kromoszómák DNS-ének RNS-re átíródó szakaszai. Egy gén vagy egyéb kitüntetett genomszakasz helyét a kromoszómán az adott gén vagy szakasz lókuszának (latin locus = hely) nevezzük. A gének száma az egyes fajokban ezres nagyságrendű, az egysejtű gomba Saccharomyces cerevisiae kb génnel, az ember kb fehérjekódoló génnel rendelkezik. (Megjegyezzük, hogy a humán genom ezen kívül tartalmaz még körülbelül nem fehérjekódoló gént, ezekről különféle típusú RNS-termék képződik, valamint körülbelül ún. pszeudogént, melyek a fehérjekódoló génekhez hasonlóak, de az evolúció során felhalmozódott mutációk következtében nem funkcióképesek. A legújabb eredmények alapján a humán genomnak körülbelül a 80%-a íródik át RNS-re. A folyamatosan frissülő génszámok megtalálhatók a internetes oldalon.) A gének közötti át nem íródó régiók (NTS, non transcribed spacers) mennyisége, hossza, DNS-összetétele fajonként igen változó. Az utóbbi idők kutatásainak megdöbbentő eredménye, hogy eukariótákban az intergénikus régiók nagy részét mobilis DNS-elemek, ún. traszpozábilis elemek teszik ki. A mozgó genetikai elemek nagyban hozzájárulnak a genetikai állomány átrendeződéséhez, az azonban máig sem világos, hogyan képesek a genomok ezt tolerálni. Az egyes eukarióta genomokra jellemző további érdekes kérdés a génekben lévő intronok száma és mérete. Az intronok nemkódoló szakaszok, melyek a gének kódoló szakaszai között helyezkednek el. Az intronok is átíródnak, de poszttranszkripcionálisan kivágódnak az RNS-ből. Míg az egyes fajokban a gének kódoló szakaszának (exonjainak) hossza szembetűnően szűk mérattartományba esik (1-3 kbp = kilobázispár), addig az intronok száma és mérete igen tág határok között változik. Egy extrém példa az emberi disztrofin gén (melynek hibája okozza az izomdisztrófia nevű betegséget): a gén kódoló szakaszait 78 darab intron szakítja meg, melyek együttes hossza 2500 kbp. 3. Az egygénes öröklődési mintázatok kromoszómális háttere Mendel tehát megállapította, hogy egy génpár tagjai egyenlően szegregálnak a gamétaképződés során. A gamétaképződés hátterében álló szubcelluláris eseményekről Mendel idejében még semmit nem lehetett tudni. Ma már ismert, hogy a génpárok kromoszómapárokon helyezkednek el, és a kromoszómapárok tagjai szegregálnak a meiózis során, az általuk hordozott génekkel együtt. Ismételjük át a sejtosztódás genetikai szempontból fontos eseményeit! Ahhoz, hogy megértsük a gének szegregációjának sejtbiológiai hátterét, világosan látnunk kell a hasonlóságokat és a különbségeket az eukarióta sejtekre jellemző kétféle sejtmagi osztódásforma között. A mitózis a szomatikus sejtekre jellemző osztódási formának a sejtmagot érintő szakasza. Mitózis diploid és haploid sejteknél is lehetséges. Eredményeképpen egy kiindulási sejtből két utódsejt (gyakori kifejezés erre még a leánysejt) keletkezik, melyek genetikai állományuk tekintetében teljesen azonosak egymással és a kiindulási sejttel. Összefoglalva a mitózist a genetikai állomány szempontjából: 2n 2n + 2n vagy n n + n. A meiózis a szexuálisan szaporodó élőlények speciális diploid sejtjeire, a meiocitákra jellemző sejtmagi osztódási forma. A meiocitákból származnak az ivarsejtek: növényekben és állatokban ezek a spermiumok és a petesejtek, gombáknál és algáknál pedig a szexspórák. A 2.5. ábra áttekintést nyújt az állatok, növények és gombák életciklusáról, rávilágítva a mitózis és meiózis szerepére ábra - A mitózis és meiózis szerepe állat, növény és gomba szervezetekben 20

33 Egygénes öröklődés A diploid meiocitákból két egymást követő osztódással keletkezik négy haploid utódsejt (tetrád). A genetikai állomány szempontjából a meiózis négy haploid utódsejt kialakulását jelenti egy kiindulási diploid sejtből, két egymást követő osztódás során: 2n n + n + n + n. A mitózis és meiózis történéseit leegyszerűsítve, a genetikai állomány szempontjából tekintjük át Mitózis A mitózist megelőzően, a sejtciklus S (=szintézis) fázisában megtörténik a teljes sejtmagi DNS-állomány replikációja, és ezzel a teljes kromatinállomány megkettőződése. Ekkor minden egyes kromoszómának megfelelő kromatin két teljesen azonos példányban van jelen a sejtmagban. Ismét kiemeljük, hogy a kromatin állomány a sejtciklus nagy részében enyhén kondenzált formában van jelen. A sejtmagi osztódás idejére történik meg az a nagyfokú kondenzáltság, melyben a kromatinállomány mikroszkóposan megfigyelhető diszkrét struktúraként, azaz kromoszómákként láthatóvá válik. A mitózisba lépve tehát már minden egyes kromoszóma megkettőződött formában van jelen. Az egymással teljesen azonos kópiákat testvérkromatidáknak nevezzük. A testvérkromatidák a centromer részüknél fogva fizikailag össze vannak kapcsolódva. A két testvérkromatidát ebben az állapotban diád-nak (a kettő szó görög megfelelőjéből) nevezzük. A mitózis során a testvérkromatidák egymástól szétválva jutnak az utódsejtekbe (2.6. ábra) Meiózis A mitózishoz hasonlóan itt is megtörténik a replikáció az S-fázisban. A kromoszómák tehát itt is kétkromatidás (diád) formában lépnek az első meiotikus osztódásba. Az első fontos eltérés a meiózis és mitózis között az, hogy a meiózis első osztódásának profázisában a homológ kromoszómapárok fizikailag párosodnak. Ekkor tehát kialakul egy két diádból (összesen négy kromatidából) álló komplex (szinapszis, tetrád, bivalens). A homológok precíz párosodását egy DNS-ből és fehérjékből álló struktúra, a hogy ebben a tetrád állapotban történnek meg biztosítja. A tetrádok száma megegyezik a homológ kromoszómapárok számával. Fontos kiemelni már most (később részletesebben is foglalkozunk a témával), hogy ebben a tetrád állapotban történnek meg a kromatidák közötti átkereszteződések (crossing over). Az átkereszteződő részek citológiailag is láthatóak akkor, amikor a tetrád kezd felbomlani, és már csak az átkereszteződő részeken kapcsolódnak egymással a kromatidák. Azt a pontot, ahol az átkereszteződés látható, kiazmának is (a görög kiazma, kereszt szóból) nevezzük. A crossing over során a nem-testvér kromatidák között szakaszok cserélődnek ki, s ennek következményeként új allélkombinációval rendelkező (ún. 21

34 Egygénes öröklődés rekombináns) kromatidák jönnek létre. A mechanizmust homológ rekombinációnak nevezzük. Legújabb ismereteink szerint a crossing over megtörténte a homológok precíz szegregációjának is előfeltétele, mely folyamat az osztódás következő fázisában zajlik. Az első meiotikus osztódás során a tetrádokat alkotó két diád (azaz két kétkromatidás homológ) egyike az egyik, másika a másik utódsejtbe kerül. Itt tehát a mitózissal ellentétben a testvérkromatidák nem válnak szét a centromerüknél fogva, hanem együtt szegregálnak az első meiotikus osztódáskor. Az első osztódás során létrejött két utódsejtben minden kromoszómából csak egy darab lesz jelen, mégpedig kétkromatidás, rekombináns formában. A második meiotikus osztódást nem előzi meg DNS-replikáció. Az idáig a centromerüknél végig együtt álló testvérkromatidák ebben az osztódási lépésben válnak szét, és kerülnek külön utódsejtekbe. A második meiotikus osztódás befejeztével tehát négy darab olyan sejt keletkezik, melyek az anyasejt diploid kromoszóma szerelvényének a felét tartalmazzák, tehát haploidok ((2.6. ábra). Összefoglalva a meiózist genetikai szempontból az egyszerűség kedvéért egyetlen kromoszómapárral rendelkező (2n = 2) diploid anyasejt esetén: kiindulás: két homológ, azaz egy homológ pár (két darab egykromatidának megfelelő két DNS-molekula) replikáció: két diád (két darab, egyenként kétkromatidának megfelelő, négy DNS-molekula) párosodás: egy tetrád (négy DNS-molekula) az első osztódást követően: egy-egy diád mindkét utódsejtben (két DNS-molekula sejtenként) a második osztódást követően: egy homológ (egy db egykromatidának megfelelő, egy DNS-molekula) 2.6. ábra - A mitózis és meiózis áttekintése Tekintsük át, hogyan feleltethetőek meg a meiózis szabályszerűségei Mendel első törvényének! Vegyünk egy A/a heterozigóta egyedet. Mi történik az egyes allélokkal a meiózis fázisaiban? kiindulás: egyik homológ hordozza a A, másik pedig a a allélt replikációt követően: egyik diád AA, másik diád aa párosodás: A/A/a/a tetrád első osztódást követően: egyik sejt AA, a másik pedig aa (a crossing over ezt az allélkombinációt módosíthatja, de ez a végső arányokon nem változtat) második osztódást követően: négy sejt, közülük kettő A, kettő pedig a 22

35 Egygénes öröklődés Tehát egy A/a heterozigóta genotípusú meiocita meiotikus termékei: ½ A és ½ a allélt tartalmazó haploid sejtek, ami megfelel a Mendel által megfogalmazott egyenlő szegregáció törvényének. Az egygénes öröklődés szabályszerűségének ismerete két irányban is alkalmazható: Utódok fenotípus arányaiból következtetünk a szülők genotípusára Ismert genotípusú szülők utódainak fenotípus arányait előre jelezhetjük A mezőgazdasági nemesítésben mindkét irányú eljárás általánosan alkalmazható. Embereknél hasznos annak megállapítására, hogy az utód milyen valószínűséggel örököl egy egygénes betegséget. További gyakori probléma, ha egy domináns fenotípust mutató egyed genotípusa ismeretlen (homozigóta domináns vagy heterozigóta, sematikusan A/-). Ilyenkor tesztelő keresztezéssel (test cross), azaz homozigóta recesszív egyeddel keresztezve a domináns fenotípusú egyedet az ismeretlen genotípus könnyen azonosítható: P: A/- a/a Ha F1-ben minden utód domináns fenotípusú (A/a genotípus), akkor az ismeretlen genotípusú szülő homozigóta volt. Ha F1-ben ½ domináns fenotípus (A/a genotípus) és ½ recesszív fenotípus (a/a genotípus), akkor az ismeretlen genotípusú szülő heterozigóta volt. Amennyiben nem áll rendelkezésre a tesztelő (homozigóta recesszív) szülő, akkor egyszerűen az ismeretlen genotípus beltenyésztéséből származó utódarányból következtetünk a genotípusra. A tesztelő keresztezés alkalmazását a későbbiekben is látni fogjuk komplexebb genotípusok elemzésekor. 4. Nemi kromoszómákhoz kötött egygénes öröklődés 4.1. Kromoszómális ivar-meghatározási rendszerek Eddig a szabályos kromoszómákról, az ún. autoszómákról beszéltünk, amelyek a genetikai állomány nagy részét kiteszik. A legtöbb állat és növényfajban a nemek kialakulásával összefüggésben álló speciális kromoszómapár is jelen van. Ezeket ivari vagy szexkromoszómáknak nevezzük. Az ivari kromoszómák az autoszómákkal megegyező módon szegregálnak a meiózis során, de az általuk hordozott gének esetében az utódok fenotípus aránya az autoszómális génekhez képest eltérő. A legtöbb állatfaj és sok növényfaj ivari dimorfizmust mutat (vannak női ivarú és hím ivarú egyedek). A legtöbb esetben az ivar kromoszómálisan meghatározott (Léteznek egyéb szexdeterminációs rendszerek is, melyekre itt nem térünk ki.). A nemi kromoszómákkal kapcsolatos első megfigyelést 1891-ben Hermann Henking tette. Egy rovar (Pyrrhocoris, poloska) sejtmagban figyelt fel egy páratlan, erősen festődő képletre, amelyet X testnek nevezett el. Clarence Erwin McClung ismerte fel, hogy az X test valójában kromoszóma. Innen származik az X kromoszóma elnevezés. McClung azt is észrevette, hogy a nősténynek eggyel több kromoszómája van, mint a hímnek, és ezt kapcsolatba is hozta a nem meghatározásával. Más rovarok hímjeiben és nőstényeiben azonos számú kromoszómákat láttak: a hímekben egy X és egy kisebb, más alakú kromoszómát (ezt az ABC következő betűjéről Y kromoszómának nevezték el), a nőstényekben pedig két X kromoszómát. A hímekben és nőstényekben tehát rendhagyó (egyes fajokban pár nélküli, más fajokban pedig heteromorf) kromoszómák találhatók. Nettie Maria Stevens és Edmund Beecher Wilson megfigyelték, hogy az X és az Y kromoszómák a gaméta képződés során nem jutnak ugyanabba az ivarsejtbe, az egyik ivarsejtbe X, a másikba Y kerül. A nőstény ivarsejtjeinek mindegyike egy X kromoszómát kap. Ebből arra következtettek, hogy mivel a nemi jellegek ugyanúgy öröklődnek, mint más tulajdonságok, azokat a kromoszómák közvetítik. Háromféle, ivari kromoszómákon alapuló, nem-meghatározást ismerünk: 1. XX-X0 23

36 Egygénes öröklődés 2. XX-XY 3. ZZ-ZW Az XX-X0 nem-meghatározás a nőstények két X kromoszómát (XX) hordoznak a hímek egy X kromoszómát (X0-lal jelöljük, ahol 0 jelöli a másik ivari kromoszóma hiányát) hordoznak Ivarsejt képződésekor a nőstényekben minden petesejtbe kerül egy X kromoszóma, a hímekben pedig a spermiumok egyik felébe kerül X, a másik felébe nem. Vagyis az ivari kromoszómák tekintetében a petesejtek egyfélék, a spermiumok kétfélék. Ennek megfelelően a nőstények a homogamétás (egyforma gamétájú), a hímek pedig a heterogamétás (kétféle gamétájú) nem. Az utódok nemét a hímivarsejt szabja meg. Ez a rendszer jellemző sok rovarfajra. Itt említjük meg, hogy a fontos genetikai-fejlődésbiológiai modellszervezet, a laboratóriumi fonalféreg (Caenorhabditis elegans) hermafrodita egyedei XX ivari kromoszómával rendelkeznek, így az egy egyedben termelődő hím és női ivarsejtek is egy X kromoszómát tartalmaznak. Hím egyedek a természetes populációban ritkán, de előfordulnak, melyek X0 ivari kromoszómákkal rendelkeznek (A ritka előfordulás oka az, hogy az XX kromoszómák hiba folytán nem szegregálnak, aminek következtében XX és 0 ivarsejtek jönnek létre; Ez utóbbiak egy normál, X kromoszómával rendelkező ivarsejttel fuzionálva hozzák létre az X0 hím egyedeket). Az XX-XY nem-meghatározás a nőstények XX nemi kromoszómákkal rendelkeznek (homogamétás: a petesejtek mindegyike X kromoszómát hordoz) a hímek XY nemi kromoszómákkal rendelkeznek (heterogamétás: a spermiumok fele X, másik fele Y kromoszómát hordoz) Az utód nemét a spermium szabja meg. Ez a rendszer jellemző az emlősökre (az emberre is), az egyik fontos genetikai modellszervezetre, a muslicára (Drosophila melanogaster), továbbá a kétlaki növényekre (például Fehér mécsvirág, Melandrium album). Az X és Y kromoszómák citológiailag jól megkülönböztethetők: az Y kromoszóma jóval kisebb az X-nél. Mindkét kromoszóma tartalmaz homológ (hasonló) és nem-homológ (differeciális, megkülönböztető) részeket. A nem-homológ szakaszok olyan géneket hordoznak,amelyeknek nincs megfelelője a másik nemi kromoszómán. A nem-homológ szakaszokra eső gének hemizigóta (pár nélküli) állapotban vannak a hímekben. Az X és Y kromoszóma a homológ szakaszaik mentén képesek párosodni a meiózis I. profázisában, és ennek köszönhetően kromoszómapárként viselkedve külön utódsejtekbe szegregálnak. Tehát annak köszönhetően, hogy az X és az Y heteromorf kromoszómák mendeli módon szegregálódnak az ivarsejt képzés során, az X és Y kromoszómát hordozó spermiumok fele-fele arányban jönnek létre. A ZZ-ZW nem-meghatározás a hímek ZZ nemi kromoszómákkal rendelkeznek (homogamétás nem) a nőstények ZW nemi kromoszómákkal rendelkeznek (heterogamétás nem) (Ez a fordítottja annak, amit az XX-XY nem-meghatározás esetén láthattunk.) Ez a rendszer jellemzi a madarak, lepkék, ezen kívül a hüllők, kétéltűek, halak egy részének ivari meghatározottságát Az ivari kromoszómák szerepe emberben a nem meghatározásban Az emberre az XX-XY ivari kromoszómás nem-meghatározás jellemző. Hogy pontosabban megértsük az ivari kromoszómák szerepét a nemek kialakításában, tekintsünk át néhány rendellenességet, melyek az ivari kromoszómákkal kapcsolatosak. 24

37 Egygénes öröklődés A Turner-szindrómás személyek X0 ivari kromoszómákkal rendelkeznek. A nőkre jellemző nemi sajátosságokat mutatnak, de általában sterilek. Az újszülött lányok között 1/3000 gyakoriságban fordul elő a rendellenesség. További jellemzőik: alacsony növésűek, vaskosak, hajuk a homlokukba nő, gyakran bőrredő húzódik a nyakuk mindkét oldalán, szellemi képességeik általában normálisak. Triplo-X-szindrómás (XXX) személyek 1/1000 gyakorisággal születnek. Ez az ivari kromoszómarendellenesség nem jár súlyos abnormális állapottal, de a szellemi visszamaradottság gyakoribb, mint az XX nők között. Általában magas, karcsú alkatú, fertilis nők. A Klinefelter-szindróma (XXY) 1/1000 gyakoriságú a fiú újszülöttek között. Női másodlagos nemi jellegeket mutatnak, általában magasak, arcszőrzetük ritka, intelligenciájuk normális. A fentiek alapján emberben az ivari kromoszómák szerepéről az alábbi megállapításokat tehetjük: Az X kromoszóma nélkülözhetetlen géneket hordoz mindkét nem számára. Az X kromoszóma teljes hiánya emberben az élettel összeegyeztethetetlen. Egyetlen Y kromoszóma elegendő a férfiasság kialakulásához, még akkor is, ha több X kromoszómával együtt fordul elő (lsd. Klinefelter-szindróma). A férfi nemi jellegeket meghatározó géneket az Y kromoszóma hordozza. Az Y kromoszóma hiánya női jelleget eredményez. Mindkét nemi kromoszóma fontos termékenységi géneket hordoz. A nők termékenységéhez két X kromoszóma szükséges. A férfiak termékenységéhez szükséges és elégséges egy Y kromoszóma. Az X kromoszóma hordoz olyan géneket, melyekből kettőnél több káros hatású mindkét nemben. Az ember férfi-meghatározó génje A férfi jellegekhez tehát az Y kromoszóma jelenléte nélkülözhetetlen. Előfordulnak Y kromoszóma nélküli, két X kromoszómát hordozó férfiak. Ezekben a férfiakban az Y kromoszóma egy kis darabja beékelődött az X kromoszómába. A férfi jelleghez nem szükséges tehát a teljes Y kromoszóma, annak elég egy kis darabja. Ez a kromoszóma szakasz hordozza az SRY (sexdetermining region on Y vagy sex reversal on Y) gént. Ez a gén a főkapcsoló. A SRY hatására a gonádkezdemény herévé fejlődik. A here az androgén hormont, a tesztoszteront és a Müller-féle gátló faktort termeli. A tesztoszteron jelenlétében a férfi jellegek kifejlődnek, a Müller-féle gátló anyag hatására a női szaporító vezeték visszafejlődik. A SRY hiányában a gonádkezdeményből petefészek lesz, és női jellegek alakulnak ki. Egérben a SRY gén beültetése XX embrióba hím fejlődését váltja ki Az X kromoszóma inaktiváció Az XX egyedekben az X kromoszómához kötött gének dózisa kétszerese az XY (illetve az X0) egyedekéhez képest, mely dóziskülönbség kompenzálódik. A dóziskompenzáció az élővilágban többféle mechanizmussal is megvalósulhat az ivari kromoszómákon lévő gének aktivitásának befolyásolásával. Emlősöknél a nőstényekben a kompenzáció az egyik X kromoszóma inaktiválásával valósul meg (lásd még a génkifejeződés szabályozásáról szóló fejezetben). Az inaktiválás a korai embrionális fejlődés alatt történik (2.7. ábra). Az inaktivált X heterokromatikus rögként látszik, amelyet Barr-testnek nevezünk (a hímek sejtjeiben nincs Barr-test). Az inaktiváció azáltal vezet az X kromoszómán lévő gének elcsendesítéséhez (kifejeződésük, átírásuk csökkentéséhez), hogy az adott X kromatin erősen csomagolt, heterokromatin szerkezetet vesz fel. Véletlenszerű, hogy egy adott embrionális sejtben a kettő közül melyik X kromoszóma inaktiválódik, és az erre vonatkozó információ a további sejtosztódások során az utódsejteknek átadódik. Ennek az lesz a következménye, hogy a nőivarú emlős egyedek testében nagyobb összefüggő sejtcsoportokban (ún. szektorok) egyik vagy másik X aktív illetve inaktív, vagyis etekintetben a nőivarú egyedek mozaikosak. A mozaicizmus az X-hez kötött gének heterozigóta genotípusa esetében a fenotípusban is megnyilvánulhat. Erre egy látványos példa a teknőctarka fenotípusú macska. (Vörös-fekete foltos; sokszor fehér bundaszínű szektorok is előfordulnak a testen, de ennek hátterében egyéb ok áll.) Ha vörös-fekete foltos macskát látunk, szinte biztosak lehetünk abban, hogy az nőstény, mely heterozigóta egy X kromoszómához kötött bundaszín gén (O, orange, vörös) alléljaira: O/o genotípus. A vörös és fekete szektorokat az X kromoszóma váltakozó inaktivációja okozza: az XO/(XBarr) szektorok fenotípusa fekete a O allél miatt, az (XBarr)/Xo szektoroké pedig vörös a o allél miatt. 25

38 Egygénes öröklődés 2.7. ábra - Az X kromoszóma inaktiváció mozaikos fenotípust okoz Emberben az X-hez kötött aed génre (az anhydrotic ectodermal dysplasia kifejezésből, mivel recessziv allélja verejtékmirigy hiányt okoz) heterozigóta nőkben (aed/aed+) szintén megfigyelhető a szomatikus mozaicizmus A cikk-cakk öröklésmenet Mendel borsókísérleteiben a reciprok keresztezések mindig azonos eredményt adtak. Az ivari kromoszómákhoz kapcsolt jellegek esetében a keresztezés irányától függően eltérő utódokat látunk. Az XX-XY nemmeghatározáshoz tartozó utód hímek az apjuktól öröklik az Y, az anyjuktól pedig az X kromoszómájukat. Az utód nőstények egyik X kromoszómája az apától, a másik az anyától származik. Nézzük meg egy egyszerű példán, hogyan alakul az utódok fenotípusa attól függően, hogy milyen volt a szülők genotípusa egy X kromoszómán lévő génben (2.8. ábra). A példában bemutatott X kromoszómális gén a white gén (Drosophilában). A vad típusú w+ allél domináns a recesszív w alléllal szemben. A vad allél vad szemszínhez vezet (téglavörös, vagy egyszerűbben mondva piros), a w allél pedig homozigóta (nőstényekben), illetve hemizigóta (hímekben) formában fehér szemszín kialakulását okozza. Ha tiszta vonalú piros szemű nőstényt (X w+/x w+ genotípus) mely a homogamétás nem keresztezzük fehér szemű hímmel (X w/y), akkor az összes utód nemtől függetlenül piros szemű lesz. Ebből következik, hogy a piros szemszín domináns. Ám ha elvégezzük a reciprok keresztezést, tehát fehér szemű nőstényt (X w/x w) keresztezünk piros szemű hímmel (X w+/y), akkor az utódok az ellenkező nemű szülő fenotípusát mutatják: a nőstények piros szeműek (X w+/x w), a hímek pedig fehér szeműek (X w/ Y). Ezt nevezzük cikk-cakk öröklésmenetnek ábra - Cikk-cakk öröklésmenet a muslica X nemi kromoszómáján lévő white gén példáján 26

39 Egygénes öröklődés A ZZ-ZW ivari kromoszómális rendszerben hasonlóképpen öröklődnek a Z kromoszómán lévő gének. Például így öröklődik az Abraxas araszoló lepke sötét-világos színe, vagy a házityúk kendermagos mintázata. Figyeljünk fel arra, hogy ebben a rendszerben a homogamétás nem a hím nem (ZZ), itt tehát akkor látjuk a cikkcakk öröklésmenetet, ha a hím szülő mutatja a recesszív jelleget. Ezek a hímek a heterogamétás (ZW) nőstény utódaiknak kizárólagosan örökítik át a Z kromoszómát, és a rajta lévő recesszív allélt. Törvényszerűség tehát az, hogy a cikk-cakk öröklésmenet akkor tapasztalható, ha a homogamétás szülő recesszív homozigóta, és a heterogamétás szülő hordozza a domináns allélt A kromoszómaelméletet bizonyító kísérlet 27

40 Egygénes öröklődés Most már eleget tudunk ahhoz, hogy megismerjük azt a nagy jelentőségű munkát, melyet Thomas Hunt Morgan és egyik tanítványa, Calvin Bridges végzett, és mellyel kétséget kizáróan bizonyítást nyert a kromoszómaelmélet, azaz, hogy a gének a kromoszómák részei. Megjegyezzük, hogy a Morgan által létrehozott Drosophila-iskola (Columbia University, fly room) a múlt századelőn az egyik legnagyobb genetikai fellegvár volt. Itt tevékenykedett Bridges mellett Alfred Sturtevant, aki a kapcsoltsági térképek szerkesztésében végzett úttörő munkát, valamint Herman J. Müller, aki az indukált mutagenezis területén alkotott nagyot. Morgan a kromoszómák öröklődésben játszott szerepének vizsgálatáért 1933-ban Nobel-díjat kapott. Azt, hogy a géneket a kromoszómák hordozzák, korábban már más kutatók is sejtették. Egy logikus érvelés szerint a petesejtnek és a hímivarsejt kell tartalmazniuk a géneket, mivel ugyanolyan mértékben járulnak hozzá az utódok fenotípusának kialakításához. Morfológiájuk arra enged következtetni, hogy a géneknek a sejtmagban kell lenniük, mert ennek mérete hasonló a kétféle ivarsejtben, egyébként viszont drámaian különbözik egymástól a két sejtféleség. A sejtmagban pedig a kromoszómák találhatók. A bizonyításhoz konkrét kromoszómákhoz kötött konkrét gének generációkon történő nyomonkövetésére volt szükség. A Bridges által végzett kísérletekben az X-kromoszómához kapcsolt white gén töltötte be ezt a genetikai marker szerepet (legalábbis erősen valószínűsíthető módon, melyet az alábbi kísérletsor igazolt is). Bridges a cikk-cakk öröklésmenet kapcsán figyelt fel arra, hogy ha sok fehér szemű nőstényt és piros szemű hímet keresztezett, akkor a nagyszámú piros szemű nőstény és fehér szemű hím utód között 0,1% gyakoriságban megjelentek fehér szemű nőstények és piros szemű hímek is. Ez utóbbiakat elsődleges szokatlan utódok -nak nevezte el. Hogyan magyarázható a szokatlan utódok megjelenése? A szokatlan nőstények olyan fenotípusúak (fehér szeműek), mint az anyjuk. Az apjuktól nem kaphattak w+ allélt, mivel ez domináns, és ezért nem lehetne fehér a szemük. Az sem lehetséges, hogy csak egy X kromoszómájuk (X0) van, mivel akkor nemi jellegük nem női lenne (ez a muslica ivarmeghatározási rendszerére jellemző), hanem hím. Vagyis, mindkét X kromoszómájukat az anyjuktól kellett kapniuk. Bridges úgy okoskodott, hogy az elsődleges szokatlan nőstények abban az esetben kaphatták mindkét X kromoszómájukat az anyjuktól, ha azok a meiózis során osztódási hiba miatt nem szegregáltak, és a petesejtbe egy helyett két X kromoszóma került. Ezt a jelenséget nem-szétválásnak, vagy nondiszjunkciónak nevezik. Ha a meiózis során az egyik meiotikus termékbe két homológ kromoszóma jut (itt XX), akkor a másik termékbe egy sem kerül (itt 0). Ha ezeket a petesejteket szabályos kromoszómakészletű spermiumok termékenyítik meg, akkor XXX, XXY, X0 és Y0 kromoszómájú zigóták keletkeznek. Az XXX és Y0 muslicák nem életképesek. Az XXY és az X0 genotípusúak életképesek. Az XXY termékeny nőstény, az X0 steril hím. Az elsődleges szokatlan hímek valóban sterilnek bizonyultak, és szemszínük piros, mivel X kromoszómájukat a w+ alléllal apjuktól örökölték. Ezek a megfigyelések a nondiszjunkció lehetőségét igazolták. A továbbiakban Bridges azt vizsgálta, hogyan viselkednek az elsődleges kivétel XXY nőstények az öröklésmenetben. Az XXY nőstény négyféle ivarsejtet képezhet. Az XXY szétválhat XX és Y, illetve X és XY kromoszómákra. Ezek a petesejtek a vad típusú hímek X és Y kromoszómát hordozó spermiumaival találkoznak. Punnett tábla segítségével megjósolhatjuk a lehetséges utódok genotípusát, nemét, életképességét és szemszínét. A keresztezés utódai között, a cikk-cakk öröklésmenetnek megfelelően, megjelentek a várt piros szemű nőstények és fehér szemű hímek. Ezenkívül megjelentek másodlagos szokatlan utódok is: a fehér szemű nőstények és a piros szemű hímek. Mindkét nemű másodlagos szokatlan utódok fertilisnek bizonyultak. Az utódok megfeleltek a Punnett táblából jósolt kimeneteleknek. A normális piros szemű nőstények XwXw+ és XwXw+Y, a fehér szemű hímek XwY és XwYY genotípusúak. A másodlagos szokatlan utódok között a fehér szemű nőstény XwXwY, a piros szemű hím Xw+Y genotípusú. Két várt kategória (XXX, YY) nem jelent meg, mivel ezek nem életképesek. Mindez igazolja, hogy az elsődleges kivételes utódok nondiszjunkcióval jöttek létre. Bridges megvizsgálta a másodlagos szokatlan utódok kromoszómáit, és azt találta, hogy azok sejtjeiben valóban XXY és XY kromoszómák vannak. További citológiai vizsgálatok is alátámasztották az elmélet helyességét. A genetikai és a citológiai vizsgálatok eredményei tehát összhangban voltak egymással, és együttesen bizonyították, hogy a white gén az X kromoszómán van. A felfedezés jelentősége abban áll, hogy ha a gének a kromoszómákon vannak, akkor a kromoszómákat alkotó anyagok egyike (DNS vagy fehérjék) a gének anyaga. A témát a DNS mint örökítő anyag tárgyalásakor folytatjuk. 28

41 3. fejezet - Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. Az előző fejezetekben megismerkedtünk egy adott gén öröklődésének szabályszerűségeivel. Mit tapasztalunk, ha két vagy több gén öröklődését vizsgáljuk egyszerre? Két gén öröklődése lehet egymástól független, vagy két gén öröklődhet kapcsoltan ( egymástól függő módon ). Most az első esettel foglalkozunk, és egyúttal megismerkedünk Mendel második törvényével. A kapcsolt öröklődés egy következő fejezet témája lesz. Több gén együttes vizsgálatának legfontosabb alkalmazása a növény- és állatnemesítésben van, de az alapkutatásban a különféle genotípusú laboratóriumi törzsek létrehozásában is elengedhetetlen ezen ismeretek alkalmazása. Nézzünk egy példát a rizs kapcsán! A világ különböző pontjain keletkeztek olyan rizs vonalak, melyek egyenként más-más gén valamilyen előnyös tulajdonságú allélpárjával rendelkeztek, például: sd1 recesszív allél, mely a növénynek alacsony termetet kölcsönöz, így az ellenállóbb lesz az erős szélnek, s a növény relatíve több energiát tud befektetni a termés létrehozásába se1 recesszív allél, mely azt eredményezi, hogy a növény szélesebb spektrumban képes alkalmazkodni a fényviszonyokhoz Xa4 domináns allél, rezisztenciát okoz bakteriális fertőzésekkel szemben bph2 - recesszív allél, rezisztenciát okoz rovarkártevőkkel szemben Snb1 domináns allél, melynek hatására a növény jól tolerálja a nagy esőzések miatti víz alá merülést Felmerülhet az igény arra, hogy a fenti előnyös tulajdonságokat egyesítsék egyetlen vonalban. Ehhez első lépésként be kell szerezni mind az öt tiszta vonalat. ( Emlékezzünk rá, hogy tiszta vonal egy adott tulajdonság tekintetében az az egyed, mely a tulajdonság kialakításában részt vevő gén azonos alléljait hordozza, vagyis homozigóta.) A kívánt allélkombináció eléréséhez először páronként keresztezik a vonalakat. Az F1 generáció már hordozza mindkét allélt, s mindkettőt heterozigóta formában, például P sd1/sd1 se1 + /se1 + sd1 + /sd1 + se1/se1 P gaméták sd1 se1 + és sd1 + se1 F1 mind sd1/sd1 + se1 + /se1 A tisztán tenyésző dupla mutáns vonal (sd1/sd1 se1/se1) létrehozásához az F1 nemzedéket önmegtermékenyítéssel tovább kell szaporítani. Milyen törvényszerűségek érvényesek ekkor? Ez kissé leegyszerűsítve attól függ, hogy a két, a keresztezésben szerepet játszó lókusz azonos vagy különböző kromoszómákon helyezkedik-e el. Ha az utóbbi eset áll fenn, akkor a független öröklődés szabályszerűségei lesznek érvényesek a kétszeresen heterozigóta F1 egyedek ivarsejtképzésekor. Mivel az egyik (sd1) illetve a másik (se1) lókuszt hordozó két homológ kromoszómapár egymástól függetlenül viselkedik a meiózis során, az általuk hordozott lókuszokhoz tartozó allélpárok is egymástól függetlenül szegregálnak az ivarsejtekbe. Ebben a fejezetben láthatjuk, hogyan ismerhetjük fel a független öröklődést, illetve azt, hogy a független öröklődés szabályszerűségeinek ismerete miként hasznosítható törzsek létrehozásában, akár a mezőgazdasági nemesítésben, akár az alapkutatásban. Mielőtt ismertetjük Mendel második, a független öröklődés törvényéhez vezető kísérleteket, ismerkedjünk meg néhány fontos genetikai jelöléssel! Ha egy diploid szervezet genotípusának leírásakor két (vagy több) gént tüntetünk fel, akkor: 29

42 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. Pontosvesszőt teszünk az allélpárok közé, ha a gének különböző kromoszómákon helyezkednek el, például: A/a; B/b Egy allélpárt, mint azt korábban ismertettük, egymástól törtvonallal ( perjellel ) választunk el. A perjel lényegében egy homológ kromoszómapár tagjait választja el egymástól. Ennek az esetnek az értelmezése a kromoszómák szintjén: Ha a szóban forgó két lókuszról tudjuk, hogy azonos kromoszómán helyezkednek el, akkor a gének egyik allélját a perjel egyik oldalára sorba írjuk, a gének másik allélját pedig a perjel másik oldalára, például: A B / a b vagy A b / a B Vegyük észre, hogy bár mindkét fenti genotípus A és B gén tekintetében heterozigóta, a két jelölés mégis megmutat egy lényeges különbséget a két genotípus között: azt, hogy a két gén alléljait milyen kombinációban hordozza az egyik, illetve a másik homológ kromoszóma tag. A fenti két esetet sematikusan, a kromoszómák szintjén az alábbiak szerint ábrázolhatjuk: A továbbiakban fontos lesz, hogy ezt a jelölésmódot értelmezni és alkalmazni tudjuk. Ha a keresztezés felírásakor nem tudjuk, hogy két gén különböző vagy azonos kromoszómán helyezkedik-e el, akkor egy ponttal választjuk el a két allélpárt, például: A/a B/b Ahogy egy génre nézve heterozigóta egyedet (A/a) monohibridnek is nevezhetünk, úgy két génre nézve heterozigóta egyed pedig (A/a B/b) a dihibrid. A dihibrid keresztezés két tulajdonságpárra nézve heterozigóta egyedek keresztezését (vagy dihibrid egyed önmegtermékenyítését) jelenti. 1. Mendel II. törvénye: a független öröklődés törvénye A legtöbb keresztezésben, melyet Mendel a veteményborsóval végzett, két tulajdonságpárban különböző tiszta vonalakból indult ki, vagyis két jelleget vizsgált egyszerre. Szerencsés módon, a Mendel által vizsgált jellegek hátterében álló gének egymástól függetlenül öröklődtek (különböző kromoszómán, vagy egy kromoszómán távol helyezkedtek el a lókuszok, lásd még a Kapcsoltságról szóló fejezetben). Ez tette lehetővé, hogy Mendel felismerje azt a genetikai törvényszerűséget, mely két függetlenül öröklődő génre érvényes. 30

43 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. Az első, Mendel által együtt vizsgált két tulajdonságpár a borsószem színe (sárga vagy zöld) és a borsószem alakja (gömbölyű vagy ráncos) volt. Korábban már láttuk, hogy a sárga és a zöld szemszín esetén a sárga dominál a zöld felett (emlékeztetőül: Y/Y sárga y/y zöld F1 Y/y mind sárga), a monohibrid keresztezés (Y/y Y/y) utódai között pedig 3:1 fenotípusarányban keletkeznek sárga és zöld magok (3 Y/- : 1 y/y). A szem alakjának öröklődését önmagában vizsgálva Mendel hasonló eredményt kapott. A domináns fenotípus a gömbölyű, a recesszív pedig a ráncos, és az F2-ben 3:1 gömbölyű:ráncos arányt kapott. Nézzük, mi történik a két jelleg együttes vizsgálatakor (3.1. ábra)! A keresztezésbe vitt szülői tiszta vonalak geno- és fenotípusa: R/R y/y r/r Y/Y gömbölyű, zöld ráncos, sárga Ezek a szülők R y, illetve r Y gamétákat hoznak létre. A gaméták fúziójából létrejövő F1 nemzedék (az anyai szülőn termő magok) genotípusa egységesen R/r Y/y (dihibrid), fenotípusuk pedig a dominanciáknak megfelelően gömbölyű-sárga. Ezután Mendel beltenyésztette az F1 magokból nevelt egyedeket (F1 inter se, vagyis egymás között ), és megvizsgálta az F2 generációt is. Az F2 magok fenotípusa négyféle volt, a következő arányok szerint: 9/16 gömbölyű-sárga 3/16 gömbölyű-zöld 3/16 ráncos-sárga 1/16 ráncos-zöld 3.1. ábra - Két tulajdonságpár öröklődése Mendel kísérletében 31

44 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. Mendel sok más tulajdonságpárra is elvégezte a fenti keresztezési sémát, és a dihibrid F2 9:3:3:1 fenotípusos számarány általánosnak, törvényszerűnek bizonyult. Az eredmények értelmében ez a számarány egy további öröklődési mintázat, mely mögé Mendel egy máig helytálló elméletet dolgozott ki. Ha az F2 generációt újra átvizsgáljuk, csak az egyik, illetve a másik jellegre, akkor mindkét esetben látjuk a monohibrid F2 3:1 fenotípusos számarányt. Mendel ezt zseniálisan felismerte, és megállapította, hogy a 9:3:3:1 számarány két 3:1 számarány random kombinációja. Ágdiagrammal egyszerűen szemléltethetjük ezt a két random kombinálódó 3:1 számarányt: Ez megfelel egy alapvető statisztikai törvényszerűségnek: két független esemény együttes bekövetkezésének valószínűsége egyenlő a külön-külön vett bekövetkezési valószínűségük szorzatával. Így kapjuk meg a 9/16 : 3/16 : 3/16 : 1/16 arányt. Másképp fogalmazva: ha két esemény együttes bekövetkeztének valószínűsége megegyezik a külön-külön vett bekövetkezési valószínűségek szorzatával, akkor a két esemény egymástól 32

45 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. független. Ez a gondolatmenet vezette Mendelt az öröklődés második alaptörvényének megfogalmazásához: a különböző génpárok tagjai a gamétaképződés során egymástól függetlenül válnak szét (szegregálnak). Mai tudásunk szerint pontosítva a törvényt: a különböző kromoszómapárokon (vagy ugyanazon kromoszómán egymástól távol, lásd erről a kapcsoltság témakörében írtakat) elhelyezkedő gének a meiózis során egymástól függetlenül szegregálnak. A 9:3:3:1 arány a gaméták szintjén is levezethető. Ezt is szemléltethetjük ágdiagrammal: A két génpár tekintetében tehát egy dihibrid egyedben négyféle gaméta keletkezik egyenlő arányban, ha a két gén szegregálása egymástól független: ¼ R;Y ¼ R;y ¼ r;y ¼ r;y Vegyük észre, hogy itt egyszerre alkalmaztuk Mendel első és második törvényét (I. egy génpár tagjai szegregálnak a meiózis során, a gaméták egyik fele a génpár egyik tagját, másik fele a génpár másik tagját kapja; II. két génpár tagjai egymástól függetlenül szegregálnak az ivarsejtképződés során). A négyféle genotípus a női és a hímivarú gamétákra egyaránt jellemző. A gaméták random párosodásából elegendően nagyszámú F2 utód esetén kirajzolódik a dihibrid keresztezésekre jellemző 9:3:3:1 fenotípusos arány. Punnett táblázatban ábrázolva áttekinthető formában tüntethetők fel a négyféle genotípusú hím és női gaméták random fúziójából keletkező utód genotípusok, valamint az egyes genotípusoknak megfelelő fenotípusok (3.2. ábra) ábra - Egy dihibrid öröklésmenet szemléltetése Punnett táblázattal 33

46 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. 34

47 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. A fenti elméletet Mendel tesztelte is. Azt kellett bizonyítani, hogy a dihibrid egyedek valóban 1:1:1:1 arányban hozzák létre a négyféle genotípusú gamétát. Ehhez Mendel tesztelő keresztezést (test cross) végzett, melyben a dihibrid egyedeket ún. tesztelő vonallal (kétszeresen homozigóta recesszív) keresztezte. Mivel a tesztelő szülő minden gamétája recesszív allélkombinációt (r;y) tartalmaz, ezzel nem fedi el a dihibrid által létrehozott gaméták allélkombinációit, tehát az utódok fenotípusa és azok aránya egyenesen tükrözi a dihibrid szülő által létrehozott gaméták allélkombinációit. A tesztelő keresztezés és eredménye genetikai szimbólumokkal (az átláthatóság kedvéért az egyes szülőktől származó allélokat színkód jelzi): P R/r ; Y/y r/r ; y/y dihibrid szülő tesztelő szülő F1 genotípus fenotípus ¼ R/r ; Y/y ¼ R/r ; y/y ¼ r/r ; Y/y ¼ r/r ; y/y ráncos gömbölyű-sárga gömbölyű-zöld ráncos-sárga zöld A tesztelő keresztezésben Mendel megkapta a várt 1:1:1:1 fenotípus arányt, ami igazolta modellje helyességét. Az 1900-as évek elején eukarióta szervezetek széles spektrumán tesztelték és találták általánosan érvényesnek Mendel két törvényét. A 3:1, 1:1, 9:3:3:1, 1:1:1:1 ún. mendeli számarányok, melyek két alapvető öröklődési törvényszerűséget, az egyenlő szegregáció és a független hasadás törvényét igazolják. Ezek a törvények nemcsak diploid, hanem szexuálisan szaporodó eukarióta haploid szervezetekben is érvényesek, az alábbiak szerint (3.3. ábra): 3.3. ábra - Mendel második törvénye szexuálisan szaporodó haploid eukariótákra alkalmazva 35

48 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. 2. A független öröklődés törvényének alkalmazásai 2.1. A független öröklődés törvényének alkalmazásai: geno- és fenotípusok keletkezésének becslése keresztezésekben A klasszikus genetikai analízis kétféle irányban is lehetséges: 1) egy utódnemzedék fenotípusos arányaiból következtetünk a szülők genotípusára (és az öröklődés módjára), 2) ismert genotípusú szülők keresztezéséből származó utódok geno- és fenotípus arányait előre meg tudjuk becsülni. Ez utóbbira nézve kétféle módszer alkalmazását már megismertük: a Punnett tábla és az ágdiagram ( vagy villás elágazás) módszerét. Egy vagy két gén vizsgálata esetén a Punnett tábla jól alkalmazható, de a szerkesztése jóval időigényesebb a villás elágazás módszernél akkor, ha kettőnél több gén öröklődési mintázatát szeretnénk felírni. Gondoljunk bele, hogy dihibrid szülők keresztezésekor a gaméták típusainak száma 4 (azaz 2 2 ), tehát a Punnett tábla 16 (azaz 4 4) cellát tartalmaz. Trihibrid keresztezésnél a gaméta féleségek száma szülőnként 8 (azaz 2 3 ), a Punnett tábla celláinak száma pedig 64 (azaz 8 8). A villás elágazás módszerével egyszerűbben és gyorsabban írhatjuk fel, állapíthatjuk meg a gaméták, illetve az utódok várható geno- és fenotípus arányait. Egy dihibrid keresztezéssel szemléltetve (3.4. ábra): A/a ; B/b A/a ; B/b 3.4. ábra - A villás elágazás módszerének alkalmazása utódok geno- és fenotípusának becslésére 36

49 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. Minden gén esetében háromféle genotípus keletkezik, tehát a lehetséges genotípusok száma dihibrid keresztezésekben 3 2, trihibrid keresztezésekben 3 3 és így tovább. A lehetséges fenotípusok száma pedig mivel egy gén esetén kétféle lehet, 2 2 dihibrid, 2 3 trihibrid stb. keresztezésekben. Ha egy keresztezésben több gént tekintünk egyszerre, és ezek egymástól függetlenül öröklődnek, akkor egy bizonyos genotípussal rendelkező utód keletkezési valószínűségét a teljes utódpopulációban egyszerű statisztikai számítással becsülhetjük. Ekkor a független eseményeket külön-külön tekintjük, és a szorzási szabályt alkalmazzuk. Például a A/a; b/b; C/c; D/d; E/e A/a; B/b; C/c; d/d; E/e keresztezés utódai között a/a; b/b; c/c; d/d; e/e genotípusú utód ¼ ½ ¼ ½ ¼ = 1/256 valószínűséggel keletkezik, mert P (A/a A/a a/a) = ¼ ; P (b/b B/b b/b) = ½ stb. Ez a módszer a geno- és fenotípusok arányainak előrejelzésére egyaránt alkalmazható. Vajon hány utódra van szükség ahhoz, hogy a kívánt geno- vagy fenotípusú egyed legalább egyszer előforduljon? A fenti példánál maradva, a négyszeresen homozigóta recesszív utód keletkezésének a valószínűsége 1/256. Ez azonban nem jelenti azt, hogy 256 utód között biztosan lesz egy megfelelő genotípusú egyed. Gyakorlati szempontból a kérdést úgy célszerű feltenni, hogy mekkora elemszámú mintára van szükség ahhoz, hogy 95%-os biztonsággal megkapjunk legalább egy darab megfelelő genotípusú egyedet (a 95%-os konfidencia-érték általánosan alkalmazott a biológiai tudományterületeken). Először adjuk meg a nem megfelelő genotípusú egyedek keletkezésének valószínűségét, ami 1 (1/256) = 255/256. Ezt a valószínűségi értéket kiterjesztve n darabszámú mintára azt kapjuk, hogy a sikertelenség valószínűsége: (255/256) n. Annak valószínűsége, hogy legalább egy sikeres minta (a megfelelő genotípusú) legyen n darab minta között: 1 (255/256) n. 95%-os konfidencia szintnél: 1 (255/256) n = 0,95. Az egyenlet megoldásával n=765 értéket kapunk, vagyis ekkora utódszámban célszerű gondolkodnunk ahhoz, hogy megkapjuk a négyszeresen homozigóta genotípusú egyedet A független öröklődés törvényének alkalmazásai: tiszta vonalak (pure lines) létrehozása Egy génre nézve homozigóta egyed az adott gén tekintetében tiszta vonalú egyed. A tiszta vonalak az alapkutatásban és a gyakorlatban is kiemelkedően fontosak. A tiszta vonalú egyedek szaporításakor sok-sok generáción keresztül változatlanul fennmarad az adott genotípus (és a hozzá rendelhető fenotípus), tehát a tiszta 37

50 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. vonalak konstans genetikai források. A legfontosabb genetikai modellszervezetekre létrehoztak olyan nemzetközi törzscentrumokat (stock center), melyekben fenntartják, és igény esetén a kutatók rendelkezésre bocsátják az összes már publikált változat bármelyikét. Hasonló törzscentrumok léteznek a mezőgazdaságban hasznosított növény- és állatfajtákra is. A tiszta vonalak több generáción keresztüli önmegtermékenyítéssel hozhatók létre (magasabbrendű állatok esetében önmegtermékenyítés nem jöhet szóba, ehelyett azonos genotípusú egyedek keresztezése történik). Egy egyszerű példát véve, azaz egy gént nézve A/a genotípusú egyed önmegtermékenyítésekor a következő generációban a heterozigóták aránya felére, az azt követő generációban negyedére csökken és így tovább. Nyolc generáció alatt a heterozigóták aránya (½)8 = 1/256, vagyis kb. 0,4% lesz (3.5. ábra): 3.5. ábra - Beltenyésztés során a heterozigóták aránya generációról generációra csökken, a homozigóták aránya pedig nő Ha 256 darab függetlenül öröklődő gén mindegyikére nézve heterozigóta egyedet önmegtermékenyítéssel nyolc generáción keresztül szaporítunk, akkor a nyolcadik generációban átlagosan mindössze egy gén marad heterozigóta formában (1/256) a 256 génből. A módszer tehát eredményesnek tekinthető tiszta vonalak létrehozásához. Nézzünk egy olyan nemesítési sémát, melynek célja egy négyszeresen homozigóta növényvonal létrehozása. A négy gént mindenütt azonos sorrendben írjuk fel. + jel jelöli a vad allélt minden gén esetén, a mutáns allélokat pedig melyeket homozigóta formában egyesíteni kívánunk 1, 2, 3, 4 számokkal jelöljük. Itt négy olyan tiszta vonalból indulunk ki, melyek egy-egy gén különleges (előnyös) alléljait tartalmazzák, és a cél a négy előnyös tulajdonság egyesítése egy vonalban. Egy lehetséges nemesítési séma (3.6. ábra): 3.6. ábra - Egy négyszeresen homozigóta növényvonal nemesítési sémája 38

51 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. Az így létrehozott, több előnyös tulajdonságot hordozó tiszta vonalak (superior pure lines) kényelmesen fenntarthatók, szaporíthatók sok-sok generáción keresztül Hibrid vigor A mezőgazdaságban a tiszta vonalak mellett igen elterjedten alkalmaznak hibrid egyedeket (3.7. ábra). A hibrideket két beltenyésztett vonal keresztezéséből hozzák létre. Az F1 hibrid generáció (lényegében sokszorosan heterozigóta) a szülői vonalakhoz képest lényegesen jobb paraméterekkel rendelkezik (nagyobb a mérete, a terméshozama, az életképessége). A többszörös heterozigótaság eme általános előnyeit nevezik hibrid vigornak. A hibrid vigor hátterében álló molekuláris okok nagyrészt tisztázatlanok. Egy lehetséges magyarázata a következő: A beltenyésztés során nő a homozigótaság (sok gén kerül homozigóta formába), és ez a populációban jelenlévő káros vagy hátrányos recesszív allélokra is érvényes lehet. Két függetlenül beltenyésztett vonalnál a véletlen játéka folytán nem ugyanazoknak a géneknek a káros recesszív alléljai kerülnek homozigóta formába, és keresztezésükkor a legtöbb gén heterozigóta állapotba jut, csökkentve ezáltal az így létrejött hibridben a recesszív előnytelen allélok fenotípusos kifejeződését. A hibrid vetőmag előállítási költsége magas, hiszen évről évre fenn kell tartani a szülői beltenyésztett vonalakat, és mindig újra elő kell állítani a szülői vonalak keresztezésével a hibrid vetőmagot (vagy állatok esetén a hibrid egyedeket). A gazdák szempontjából a hibridek további előnytelen sajátsága, hogy az F1-t követő generációkban mérséklődik, illetve kiegyenlítetlenné válik a hibrid vigor, hiszen az F1 hibrid meiózisa során sokféle allélkombináció jön létre, és az utódoknak csak egy kis hányada rendelkezik a hibridhez hasonló mértékű heterozigótasággal. Például egy tetrahibrid keresztezésben 81-féle (azaz 34) genotípusú utód keletkezik, és e négy gén független öröklődése esetén az F1- gyel megegyező tetrahibrid (A/a; B/b; C/c; D/d) utódok aránya mindössze (½)4 = 1/16 (6%). A A/-; B/-; C/-; D/- genotípus pedig (3/4)4 = 81/256, azaz kb. 30%-ban várható ábra - Hibrid kukorica (középen) a két beltenyésztett szülői vonallal (két szélen) 39

52 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. 40

53 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. 3. A független öröklődés kromoszómális háttere Akárcsak Mendel első törvénye (az allélpárok egyenlő szegregációja), a különböző kromoszómákon lévő gének független hasadása is (Mendel második törvénye) a kromoszómák meiózisbeli viselkedésével magyarázható. Jelöljük a több kromoszómát tartalmazó diploid sejt kromoszómáit 1 (melynek egyik homológ tagja 1, másik homológ tagja 1 ), 2 (2 és 2 homológ pár) stb. számokkal! Miután a meiózis során a homológok párba állnak, és az egyenlítői síkba rendeződnek, a homológ párok egyik tagja (1 ) mehet a sejt egyik pólusa felé (mondjuk úgy, hogy északra ), a másik tagja (1 ) pedig a sejt másik pólusa felé ( délre ), vagy fordítva. Ugyanez érvényes minden homológ kromoszómapárra. Az 1 taggal kerülhet ugyanabba az utódsejtbe a 2 vagy a 2 tag is, és így tovább, ez a független vándorlás a többi kromoszómapárra is igaz. Mikroszkóposan a kromoszómák egymástól független szétválása, szétosztása csak kivételes esetben detektálható, mivel a homológ párok nem különböztethetők meg egymástól ezen a vizsgálati szinten. Az első citológiai bizonyítékot Elinor Carothers szolgáltatta 1913-ban. Ő egy bizonyos szöcskefaj hímjeinek hereszövetében tanulmányozta a meiózist. Carothers ezekben az egyedekben különleges kromoszómákra figyelt fel: egy pár nélküli, illetve egy heteromorf (más kinézetű) homológ párra. Nagyszámú meiózist végignézve Carothers azt tapasztalta, hogy a pár nélküli kromoszóma ugyanolyan gyakorisággal került egy utódsejtbe a heteromorf pár egyik tagjával, mint a másikkal. Általánosságban elmondható, hogy ha az első kromoszómapár helyzetét (vándorlási irányát) rögzítettnek tekintjük, akkor a második kromoszóma tagjai 50 50% eséllyel kerülnek az első kromoszóma adott tagjával ugyanabba az utódsejtbe, azaz a nem homológ kromoszómák egymástól függetlenül szortírozódnak, az egyes homológ párok szétválása nem befolyásolja más homológ párok szétválását. A 3.8. ábra szemlélteti, hogy két kromoszómapár egymástól független meiózisbeli viselkedése miként vezet egy dihibrid sejt (A/a; B/b) meiózisa során 1:1:1:1 genotípus arányú meiótikus termék keletkezéséhez. Az egyik homológ kromoszómapár tagjain feltüntettük a A-a (az A lókuszon), a másik homológ pár tagjain pedig a B-b (a B lókuszon) allélokat. A példában szereplő sejt tehát 2n=4 kromoszómát, azaz két homológ párt tartalmaz. A meiózis során a négyféle allélkombinációjú (A;B, a;b, A;b és a;b) haploid termék egyenlő arányban keletkezik. Ezt írtuk fel a mendeli dihibrid keresztezések szemléltetésekor a Punnett táblában egyik, illetve másik szülő esetén is, és e négyféle allélkombinációjú gaméta random fúziójából kaptuk a 9:3:3:1 fenotípusos számarányt ábra - Két gén független öröklődésének magyarázata a kromoszómák szintjén 41

54 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. 42

55 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. 4. Autoszómális és nemi kromoszómához kötött gének független hasadása A független hasadás a nemi kromoszómákra is érvényes: az autoszómák és a szexkromoszómák egymástól függetlenül viselkednek a meiózis során. A nemi kromoszómák is párba állnak (például X és Y), majd külön utódsejtbe kerülnek. Nézzük, milyen dihibrid arányt kapunk, ha egy X-hez kötött és egy autoszómális gén öröklődését követjük nyomon egyszerre! A példában csökevényes szárnyú (autoszómális recesszív allél okozza, az allél jele: vg, vestigial = csökevényes) /és vad szemszínű/ Drosophila nőstényt keresztezünk fehér szemű (Xhez kötött recesszív allél, jele: w, white = fehér) /és vad szárnyú/ hímmel. A keresztezés genetikai szimbólumokkal felírva: vg/vg ; +/+ +/+ ; w/y Tanulmányozzuk és értelmezzük a genetikai jelöléseket a fenti keresztezésben! A keresztezést szimmetrikusan írjuk fel: minden szóban forgó gén allélpárjait felírunk mindkét szülőnél, azonos sorrendben. A vad allélokat + jel jelzi. Az egyszerűség kedvéért a nőstény szülőnél a w + /w + allélpárt +/+-ként, a hím szülőnél pedig a vg + /vg + allélpárt +/+-ként írtuk fel, de mivel a gének felírásának sorrendje a két szülőnél szabály szerint megegyező, pontosan tudjuk, hogy az egyes + jelek mely gén vad alléljának felelnek meg. Mivel a hímekben az X-hez kötött géneknek csak egy példánya van jelen, a w allél mellé az X kromoszóma párját, vagyis az Y-t írtuk fel. A fenti keresztezést részletesebben az alábbi módon is felírhatjuk: vg/vg ; Xw + /Xw + vg + /vg + ; Xw/Y Itt kiírtunk minden allélt, valamint az X és Y ivari kromoszómákat is, felső indexben az általuk hordozott allélokkal. Nézzük tovább, milyen geno- és fenotípusú utódokat kapunk az F1 és F2 generációkban! A két Mendel törvény ismeretében az utódok genotípusának felírása roppant egyszerű: F1 vg/vg + ; Xw + /Xw minden nőstény vad szárnyú, vad szemű Az F1 inter se keresztezés (egyszerűsített jelölésekkel): vg/vg + ; Xw + /Y minden hím vad szárnyú, vad szemű vg/+ ; +/w vg/+ ; +/Y Az F2 generációban: Az autoszómális vestigial génre nézve ez egy monohibrid keresztezés. Nemtől függetlenül: ¾ +/- (vg + / valami, bármi : a kötőjel azt jelenti, hogy vg + vagy vg is lehet a helyén), szárny fenotípus: vad ¼ vg/vg szárny fenotípus: csökevényes 43

56 Gének független öröklődése. Mendel második törvénye. Az X-hez kötött white gén esetén: ½ +/+ és ½ +/w szemszín fenotípus: vad mind Magyarázat: a nőstény utódok két X kromoszómát kapnak, egyik X-et az apjuktól, mely ebben az F1 inter se keresztezésben w + allélt tartalmaz; az anyától pedig %-ban öröklik a w + illetve a w allélt hordozó X kromoszómát). ½ +/Y (vad szemszín) és ½ w/y (fehér szemszín) Magyarázat: a hímek csak az anyjuktól kapnak X kromoszómát, vagy a w+ vagy a w allélt tartalmazót. A két gént kombinálva és a szorzási szabályt alkalmazva az F2 generációban a nemeknek megfelelő fenotípusos megoszlás: F2 nőstények: ¾ vad típus (mindkét jellegre) ¼ csökevényes szárnyú (és vad szemű) F2 hímek: 3/8 vad típus (3/4 1/2) 3/8 fehér szemű (és vad szárnyú) (3/4 1/2) 1/8 csökevényes szárnyú (és vad szemű) (1/4 ½) 1/8 csökevényes szárnyú és fehér szemű (1/4 ½) 44

57 4. fejezet - Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek Az 1900-as évek elején eukarióta szervezetek széles spektrumán tesztelték és találták általánosan érvényesnek Mendel két az egyenlő szegregáció és a független hasadás törvényét. A független öröklődés azonban sok génpár tekintetében nem érvényesül. Erre a felismerésre jutott több kutató is az 1900-as évek elején a legkülönfélébb rendszerekben (élőlényekben). A nem függetlenül öröklődő génpárokra azt mondjuk, hogy kapcsoltan öröklődnek. A kapcsoltság fizikai oka az, hogy ezen gének lókuszai azonos kromoszómán, egymáshoz közel helyezkednek el, ezért a kromoszómák szegregálása során a két gén együtt mozog. A független kombinálódás a kapcsolt gének alléljaira tehát nem érvényesül: egy dihibrid gamétáiban nem 1:1:1:1 arányban jelennek meg az allélkombinációk. Adódik a kérdés, hogy hogyan módosul ez az arány? A fentiek alapján talán azt gondolhatjuk, hogy ha két gén egy-egy allélja egy kromoszómán, kapcsoltan helyezkedik el, akkor azok mindig is így maradnak, sok-sok sejtosztódás során, generációról generációra együtt mozognak. Ez azonban nem így van. A homológ kromoszómák ugyanis a meiotikus osztódás során darabokat cserélhetnek ki egymással. Ennek következménye az, hogy az egyes kromoszómák allélösszetétele változik. Emlékezzünk vissza, hogy a homológ kromoszómák megegyező morfológiájúak, ugyanazokat a lókuszokat (géneket) tartalmazzák, ugyanolyan elrendeződésben. Különbség köztük az egyes lókuszokon lévő allélekben lehet: a homológ pár egyik tagján egy gén egyik változata (allélja), másikon másik allélja helyezkedhet el. Ha egy kiterjedtebb kromoszómaszakaszt nézünk több lókusszal, akkor a homológ párok az egyes lókuszokon bármilyen kombinációban tartalmazhatják az alléleket (4.1. ábra). Figyeljük meg, hogy a 4.1. ábrán szemléltetett 2., 3,, 4,, esetben a diploid genotípusa a négy génre nézve megegyezik (aa Bb Cc Dd), ha azonban a homológ kromoszómák allélkombinációit nézzük, az mindhárom esetben eltérő (Korábban már megismerkedtünk a perjel szerepével, melyet a homológ kromoszómák tagjainak elválasztására használunk, egyik oldalán az egyik, másik oldalán a másik homológ tag alléljait soroljuk fel.) Az ábra 3. és 4. része szemlélteti a homológ párok közötti adott szakasz (itt a B lókuszt tartalmazó régió) kicserélődésének következményét az allélösszetétel megváltozására ábra - Négy példa allélpárok elrendeződésére egy homológ kromoszómapáron (kék az egyik, piros a másik homológ; A, B, C és D négy lókusz) 1. Kapcsoltság és intrakromoszómális rekombináció kimutatása genetikai eszközökkel A kapcsolt öröklődésre vonatkozó első megfigyeléseket William Bateson és Reginald Crundall Punnett tette (1911) szagos bükköny növényben. A virág színét és a pollen alakját befolyásoló gének öröklődésében nem a várt 9:3:3:1 arányt tapasztalták. P PP LL pp ll 45

58 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek lila virág, hosszúkás pollen piros virág, kerek pollen F1 Pp Ll lila virág, hosszúkás pollen várt (9:3:3:1) tapasztalt (381 utód) F2 P L lila virág, hosszúkás pollen pp L piros virág, hosszúkás pollen P ll lila virág, kerek pollen pp ll piros virág, kerek pollen 215 < > > < 55 Két kategória a vártnál nagyobb, kettő pedig a vártnál kisebb arányban jelent meg. Azt feltételezték, hogy a domináns génváltozat kötődik (coupling) a dominánshoz, a recesszív pedig a recesszívhez. Hogy ez nem egészen így van (nem mindig van így), és hogy miért nem, arra a híres Drosophila-iskola (Columbia University, fly room légyszoba) kutatói világítottak rá (a Kromoszómaelmélet igazolása témakörnél már találkoztunk Morgan és Bridges nevével). A kapcsolt öröklődés alapjainak feltárása és ennek kihasználása genetikai térképek készítésére Thomas Hunt Morgan és Alfred H. Sturtevant nevéhez kapcsolódik (4.2. ábra) ábra - Thomas Hunt Morgan és Alfred H. Sturtevant a légyszobá -ban 46

59 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek Nézzünk meg két, Morgan által elvégzett, Drosophila keresztezést: (a génekről: pr purple lila szem, vg vestigial csökevényes szárny, + jelenti a vad allélt) Első keresztezés: P prpr vgvg pr + pr + vg + vg + lila szem, csökött szárny vad szem, vad szárny F1 prpr + vgvg + (dihibrid) prpr vgvg (test cross) vad szem, vad szárny lila szem, csökött szárny Mivel Morgan a dihibrid nőstényt tesztelő keresztezésbe vitte, az F2 utódok fenotípusa tükrözi a dihibrid szülő által létrehozott gaméták allélösszetételét. A tesztelő keresztezés kulcsfontosságú volt. F2 fenotípusok: vad szem, vad szárny pr + vg vártnál több (1:1:1:1-t várnánk) vad szem, csökött szárny pr + vg 151 vártnál kevesebb lila szem, vad szárny pr vg vártnál kevesebb lila szem, csökött szárny pr vg 1195 vártnál több összesen: 2839 utód Második keresztezés (felcserélt P szülői allélkombinációk): P pr + pr + vgvg prpr vg + vg + vad szem, csökött szárny lila szem, vad szárny F1 prpr + vgvg + (dihibrid) prpr vgvg (test cross) vad szem, vad szárny lila szem, csökött szárny F2 fenotípusok: vad szem, vad szárny pr + vg vártnál kevesebb (1:1:1:1-t várnánk) vad szem, csökött szárny pr + vg 965 vártnál több lila szem, vad szárny pr vg vártnál több lila szem, csökött szárny pr vg 146 vártnál kevesebb összesen: 2335 utód A fenti keresztezések tanulsága szerint nem a domináns vonzza a dominánsat, és a recesszív a recesszívet, hanem mindig az eredeti (szülői P) tulajdonságok kombinációja (azaz allélkombinációk) jelennek meg a vártnál nagyobb arányban az F2 generációban. Morgan felismerte, hogy a két tulajdonság génje azonos kromoszómán helyezkedhet el, ezért a kettős heterozigóta ivarsejtképzése során azok nem válnak el egymástól, és egy ivarsejtbe kerülnek. Ennek 47

60 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek következményeként az eredeti allélkombináció a vártnál nagyobb gyakorisággal lesz jelen az ivarsejtekben (4.3. ábra). Látjuk azonban, hogy nem kizárólag a szülői allélkombinációk jutnak tovább a következő generációba. Hogyan jönnek létre az új kombinációk, vagyis a rekombinánsok? A meiózisok egy részében a homológok szakaszokat cserélnek ki, melynek következményeként új allélkombinációjú kromoszómák keletkeznek. Ilyen rekombináns kromoszómákat tartalmaz a képződő ivarsejtek egy része (4.3. ábra) ábra - A kapcsolt gének alléljai nagy gyakorisággal együtt öröklődnek. Új allélkombinációk a homológok közötti szakaszok kicserélődésével jöhetnek létre. A rekombináció újra kombinálódást jelent: olyan kromoszómák, ivarsejtek kialakulását, melyek a meiotikus diploidot létrehozó haploid sejtektől eltérő allélkombinációt hordoznak. Rekombináció kétféle módon történhet: Interkromoszómális (kromoszómák közötti) rekombináció: a különböző kromoszómákon elhelyezkedő gének a kromoszómák független kombinálódásából adódóan rekombinálódnak (lásd a Gének független öröklődése című fejezetet). Intrakromoszómális (kromoszómán belüli) rekombináció: a homológ kromoszómák tagjain belüli allélkicserélődés vezet új allélkombinációk kialakulásához (ebben a fejezetben ezzel foglalkozunk). Mivel a homológ kromoszómák régióinak újra kombinálódásáról van szó, a rekombinációnak ezt a formáját homológ rekombinációnak is nevezzük. Két gén független öröklődése esetén a szülői és a rekombináns ivarsejtek 50 50%-ban keletkeznek (lásd a Gének független öröklődése című fejezetet). Kapcsolt öröklődésnél a szülői allélkombinációt hordozó ivarsejtek aránya 50%-nál több, a rekombináns ivarsejtek aránya pedig 50%-nál kevesebb. A pontos arányt több tényező befolyásolja, melyek közül az egyik legfontosabb a lókuszok közötti távolság. Mint később látni fogjuk, egy adott élőlény két adott lókuszának viszonylatában statisztikai szempontból megfelelően nagyszámú ivarsejt (tesztelő keresztezésben F2 utód) átvizsgálásával a rekombináns:szülői típusok aránya közel állandó, reprodukálható. Ezt ismerte fel Sturtevant, és használta fel gének viszonylagos távolságának meghatározására (lásd később a Kapcsoltsági térképezés című szakaszban). 48

61 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek 2. Az intrakromoszómális rekombináció citológiai kimutatása A homológ kromoszómák közötti szakaszok kicserélődésének első fizikai bizonyítékát Barbara McClintock és Harriet Creighton (1931) szolgáltatta kukorica növényben. Fenotípusos markerekkel genetikailag, az érintett kromoszóma citológiai vizsgálatával (mikroszkópos kromoszóma vizsgálat) pedig fizikailag mutatták ki a rekombináció tényét. A két markergén: C (colour gén) sötét aleuron, sötét szem cc színtelen aleuron, sárga szem Wx (waxy gén) normál keményítő a magban wx wx abnormális keményítőszerkezet, viaszos megjelenésű mag A két gén kapcsoltan öröklődik, lókuszaik egy kromoszómán helyezkednek el. Ennek a kromoszómának találtak egy olyan különleges formáját, mely citológiailag kimutatható jegyeket hordozott: egyik végén egy buckószerű képletet (jelöljük: ), a másik végén pedig egy extra szakaszt (transzlokálódott szegmens, jelöljük: ~) tartalmazott. Előállítottak egy olyan vonalat, mely adott kromoszómájának egyike a különleges morfológiájú, másika pedig normál szerkezetű volt. A fenti két génre nézve a vonal dihibrid, méghozzá C wx ~ / c Wx allélelrendeződésben (4.4. ábra). Ezt a dihibrid vonalat tesztelő keresztezésbe vitték, majd az utódok között a rekombináns fenotípusúak kromoszómáit citológiailag is megvizsgálták. Kimutatták, hogy a rekombináció együtt jár a kromoszómaszakaszok fizikai kicserélődésével, ami minden bizonnyal töréssel és újraegyesüléssel valósul meg (4.4. ábra) ábra - A homológok közötti szakaszcsere citológiai igazolása kukorica kromoszómán A homológok közötti átkereszteződés mechanizmusára használjuk a crossing over kifejezést, az átkereszteződési helyet pedig kiazmának (chiasma, többes számban chiasmata, eredete: chi = x forma) nevezzük. Az átkereszteződés a meiózis I profázisában történik (lásd a Meiózisról szóló fejezetet). Emlékezzünk vissza, hogy ekkor minden kromoszóma kétkromatidás formában van jelen, tehát a két kétkromatidás homológ négy kromatidája simul össze. Citológiailag akkor láthatók legszebben a kiazmák, amikor a homológok már kezdenek szétválni (4.5. ábra). Ekkortájt történik a keresztszerkezetek feloldása is (lásd a továbbiakban). Átkereszteződés nemcsak a nemtestvér, hanem a testvér kromatidák között is létrejöhet, de ez utóbbi genetikailag nem érhető tetten, hiszen a testvérkromatidák egymás replikái, így ha történik is közöttük szakaszcsere, az az eredeti állapothoz képest nem okoz eltérést ábra - Kiazmák a homológok között 49

62 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek 3. A homológ rekombináció mechanizmusa Ezidáig a homológ rekombinációt úgy emlegettük, mint a meiotikus osztódás fontos mechanizmusát, amely hozzájárul a homológ kromoszómák szakaszainak keveredéséhez. Ez a mechanizmus az ivarosan szaporodó fajok genetikai változatosságának egyik forrása. Tudnunk kell azonban, hogy a homológ rekombináció mint mechanizmus nem csak ebben a vonatkozásban zajlik. Bármely olyan esetben, amikor homológ DNS-szakaszok közötti csere történik, homológ rekombinációról van szó. Ez egy konzervált (élővilágszerte hasonlóképpen zajló) molekuláris mechanizmus, mely homológ szakaszokat tartalmazó vírus, baktérium és eukarióta genomrészek között is lejátszódhat. Fontos szerepe van a prokarióta genomok keveredésében. A DNShibajavításban pro- és eukarióta sejtekben is nagy jelentőségű a homológ rekombináció. Sok szervezetben sokan tanulmányozták a DNS-molekulák átkereszteződésével, majd a keresztszerkezet feloldásával járó folyamat molekuláris hátterét. Ma több modellt is ismerünk, aminek oka az ismeretek folyamatos bővülése, a mechanizmus egyre több aspektusának megismerése. A legismertebb modellek megalkotói: Robin Holliday (1964), M. S. Meselson és C. M. Radding (1975), Jack W. Szostak (1983). A homológ rekombináció a DNS-molekulaszakaszok igen precíz (bázis pontosságú) reciprok cseréje (4.6. ábra). A csere első lépése a két homológ DNS-molekula átkereszteződése, ami a szálak törésével és újraegyesülésével jár. Az átkereszteződést speciális rövid szekvenciarészek (ún. chi-szakaszok), illetve egyes vagy kettős szálú DNS-törések inicializálják. Az átkereszteződésben egy ponton két DNS kettős hélix vesz részt, tehát négy DNSszál. (Meiotikus crossing overnél ez két kromatidának felel meg, de a négy kromatida közül páronként bármelyek átkereszteződhetnek különböző helyeken.) Az átkereszteződést gyakran a kereszteződési pont elcsúszása követi (ún. szálvándorlás), amiből az következik, hogy a kereszt alak megoldódásának helye a DNSmolekulák mentén nem feltétlenül esik egybe az átkereszteződési ponttal. A kereszt alak feloldása történhet úgy, hogy visszaáll az eredeti molekulaszerkezet (leegyszerűsítve mondhatjuk így, mert valójában a kereszt vándorlás miatt egy rövid szakaszon megtörténik a szálcsere, és ún. heteroduplex szakasz keletkezik; a heteroduplex az eredeti átkereszteződési ponttól a kereszt alak feloldódási helyéig tart), vagy úgy, hogy a két DNS-molekula szakaszai kicserélődnek (ebben az esetben beszélhetünk klasszikus értelemben vett rekombinálódásról) (4.6. ábra). A folyamatban számos fehérje vesz részt, melyek nagy része közös a DNSreplikációban és a DNS-hibajavításban működő fehérjékkel (helikáz, DNS-polimeráz, SSB-fehérjék, ligáz, nukleázok stb.) ábra - A homológ rekombináció Holliday-modellje 50

63 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek Rekombináció nem csak nagyobb kiterjedésű homológ DNS-szakaszok között jöhet létre. A fággenomok baktérium kromoszómába integrálódása például rövid, nem teljesen homológ szakaszok által valósul meg, ezt helyspecifikus rekombinációnak nevezik. A homológ szakaszokat nem tartalmazó DNS-molekulák közötti kombinálódást illegitim rekombinációnak nevezik (így épülnek be például mozgó genetikai elemek és plazmidok a kromoszómák valamely részébe). 51

64 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek 4. Kapcsoltsági térképezés (Linkage mapping) Láttuk, hogy ha két gén kapcsoltan öröklődik, a meiózis során nem függetlenül kombinálódnak, hanem leggyakrabban együtt mozognak az őket hordozó kromoszómával. Új allélkombinációjú (rekombináns) kromoszómákat tartalmazó meiotikus termékek akkor jöhetnek létre, ha a meiózis során a két lókusz között átkereszteződés és szakaszcsere történt. Ha egy meiózist tekintünk, melyben két lókusz között rekombináció történt, akkor a meiózis termékeinek átlagosan a fele rekombináns. Ezt a 4.7. ábra szemlélteti ábra - Két lókusz közötti crossing over átlagosan 50% rekombináns terméket eredményez 52

65 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek A fentiek tanúsága szerint két lókusz között nemcsak egy, hanem kettő vagy több átkereszteződés is történhet, és ha ez egy meiózis során bekövetkezik, akkor a termékek fele rekombináns. Az átkereszteződésben bármelyik kromatida részt vehet, egy ponton páronként. A lókuszok közötti távolságtól függ, hogy két lókusz között a meiózisok hány százalékában történik rekombináció. Rekombináció a kromoszóma mentén bárhol létrejöhet, kis távolságon belül kisebb, nagyobb távolságon belül nagyobb valószínűséggel. Ha két lókusz olyan távol helyezkedik el egymáshoz képest a kromoszómán belül, hogy közöttük minden meiózisban történik legalább egy (de akár több) ponton rekombináció, akkor a rekombináns termékek 50%-ban keletkeznek, vagyis pontosan olyan arányban, mintha a két lókusz külön kromoszómán helyezkedne el. Egy kromoszómán belüli távoli lókuszok között tehát kapcsoltság nem mutatható ki genetikai eszközökkel. Kis géntávolságok esetén, melyeknél a kapcsoltság kimutatható (50%-nál kevesebb rekombináns termék), a keletkezett rekombináns termékek aránya a gének közötti viszonylagos távolság jó mérőszáma. Ezt ismerte fel Sturtevant, és használta ki elsőként muslicában gének egymáshoz viszonyított helyzetének meghatározására, azaz géntérképezésre. A módszer általánosan használható. Az 1900-as évek közepétől rengeteg laboratórium dolgozott és dolgozik a mai napig különféle szervezetek kapcsoltsági térképén. A modern molekuláris biológiai eszközök lehetővé teszik, hogy ma már nemcsak fenotípusos markereket (olyan gének, melyek változatai fenotípusos eltéréshez vezetnek, ilyenekkel foglalkozunk folyamatosan ebben a fejezetben), hanem molekuláris markereket is térképezhetünk. Ezek olyan DNS-menti változatok, melyek nem feltétlenül érintenek génfunkciókat, ezért fenotípus alapján nem detektálhatók, de molekuláris biológiai eszközökkel igen, és a kromoszómatérképek mérföldköveiként használhatók. Egy géntérképegység (map unit, rövidítve m.u.) az a génpárok közötti távolság, amikor 100 meiotikus termékből 1 rekombináns. Másképpen: 0,01 (vagy 1%) rekombinációs gyakoriság (recombinant frequency, RF) egyenlő 1 térképegységgel, melyet T. H. Morgan tiszteletére centimorgannak (cm) is neveznek. Az 1% rekombináns gyakoriságot úgy értelmezhetjük, hogy 50 meiózisból egyben történt egy rekombináció a két lókusz között, 50 meiózisnak 4 50 = 200 terméke van, melyek közül 2 rekombináns (egy crossing over reciprok termékei). Meg kell jegyezni, hogy a m.u. nem egy precíz fizikai mértékegység, nem feleltethető meg egyértelműen egy meghatározott bázispárban kifejezett távolsággal. Az egyes biológiai rendszerekben a m.u.- ban és a bázispárban kifejezett távolságok különböznek, akár egy genomon belül is Kétpontos térképezés A legegyszerűbb térképezés során egyszerre két lókusz távolságát határozzuk meg, ezt az eljárást kétpontos térképezésnek nevezzük. A kétpontos térképezés sémája: 1. Tiszta vonalak keresztezése: P pr + pr + vgvg prpr vg + vg + vad szem, csökött szárny lila szem, vad szárny 2. F1 tesztkeresztezése (test cross): F1 prpr + vgvg + (dihibrid) prpr vgvg (test cross) vad szem, vad szárny lila szem, csökött szárny 3. F2 utódok számolása F2 fenotípusok: vad szem, vad szárny pr + vg vártnál kevesebb (1:1:1:1-t várnánk) vad szem, csökött szárny pr+ vg 965 vártnál több lila szem, vad szárny pr vg vártnál több 53

66 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek lila szem, csökött szárny pr vg 146 vártnál kevesebb összesen: 2335 utód 4. RF számolás: RF = rekombináns utód / összes utód ebben a példában a rekombinánsok száma: = 303 RF = 303 / 2335 = 0,129 0, = 12,9 % = 12,9 cm (vagy m.u.) Ugyanez rajzban szemléltetve (4.8. ábra): 4.8. ábra - Kétpontos térképezés kísérleti sémája 54

67 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek 55

68 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek Minél nagyobb utódszámmal dolgozunk (minél több meiózis végkimenetelét nézzük egyszerre), annál pontosabb távolságértéket kapunk. Egy kísérlet természetesen nem egy-egy, hanem több azonos genotípusú egyed populációjának keresztezésével történik. A térképtávolsággal ténylegesen a lókuszok közötti crossing overek átlagos száma arányos. A gyakorlatban ezt nem közvetlenül mérjük, hanem a végkimenetel, a rekombináns utódok arányának megállapítása által. Távol lévő lókuszok esetén genetikai eszközökkel nem feltétlenül tudjuk detektálni az összes közöttük lezajlott crossing over-t. Például, ha ugyanazon két nem-testvér kromatida között két (vagy bármely páros számú) átkereszteződés történik, akkor a széli markerek (a két térképezett gén alléljai) a szülői kombinációban jelennek meg. Ez a szülői kategória arányát növeli meg a számításainkban, tévesen. Közeli lókuszok esetén a többszörös crossing over keletkezésének esélye elhanyagolható, ezért kis távolságoknál a rekombináns F2 utódok aránya hűen tükrözi a meiózisokban lezajlott crossing overek arányát. Nagy géntávolságoknál a kísérletesen meghatározott rekombináns frekvencia a többszörös crossing overek torzító hatása miatt a valós távolság alulbecsüléséhez vezet. A kísérletesen meghatározható géntávolság felső határa 50 m.u. (50%-os rekombináns frekvencia már a nem kapcsolt génekre jellemző). Minél közelebbi adatot kapunk a felső határhoz, annál nagyobb a pontatlanság. Léteznek matematikai számítások a mért térképtávolságok pontosítására. A kísérleti kivitelezés szempontjából két dolgot tehetünk annak érdekében, hogy minél precízebb géntérképet készíthessünk: 1) minél több markerrel, minél kisebb távolságokon térképezünk, 2) hárompontos térképezést végzünk Hárompontos térképezés Egyszerre három markerrel végzett térképezési eljárás a hárompontos térképezés. A térképtávolságok additívak, ezért hárompontos térképezéskor a térképezett három lókusz egymáshoz viszonyított sorrendje is kiderül (a relatív távolságok mellett) (4.9. ábra) ábra - Hárompontos térképezéssel egyszerre három gén egymáshoz viszonyított távolságát és sorrendjét lehet meghatározni Az eljárás további előnye a kétpontos térképezéssel szemben, hogy több crossing overt tehetünk láthatóvá az utódokban. A két szélső lókusz közötti kettős crossing overre a közbülső marker rávilágíthat. Ez a két szélső lókusz távolságának pontosabb meghatározását teszi lehetővé. Hárompontos térképezésnél az a gén van középen, amelyik a legritkább rekombinációs osztályban a szülői genotípushoz képest eltérést mutat. Nézzünk egy sémát a hárompontos térképezési kísérlet kivitelezésére! Kukoricában térképezünk három gént: L, G, S A gének nevének és jelölésének eredete: ll (lazy) lassú növekedés gg (glossy leaves) fényes levél ss (sugary endosperm) cukros endospermium 56

69 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek A hárompontos térképezés kivitelezése a kétpontos térképezéshez hasonlóan történik, a kiértékelésben van eltérés. A kísérlet kivitelezése: 1. Tiszta vonalak keresztezése: P L G S / L G S l g s / l g s vad növény lassú, fényes, cukros 2. F1 tesztkeresztezése (test cross): F1 L G S / l g s (trihibrid) l g s / l g s (test cross) vad növény lassú, fényes, cukros 3. F2 utódok számolása: F2 fenotípusok F2 genotípusok Darabszám vad L G S / l g s 286 (szülői) lassú l G S / l g s 33 fényes L g S / l g s 59 cukros L G s / l g s 4 lassú, fényes l g S / l g s 2 lassú, cukros l G s / l g s 44 fényes, cukros L g s / l g s 40 lassú, fényes, cukros l g s / l g s 272 (szülői) 4. Kiértékelés: Összesen: 740 A két leggyakoribb osztály a szülői: LGS és lgs. Az összes többi rekombináns kategória. A két legritkább osztály kettős crossing overre utal. Ezek a LGs és a lgs. Említettük már, hogy a ritka kettős rekombináns osztályban a szülőitől eltérő allél arra utal, hogy annak lókusza van középen, tehát a génsorrend gyaníthatóan: L S G. A két legritkább genotípus az L S és az S G között is lejátszódó kettős crossing overrel keletkezhetett. Ennek következménye, hogy a két szélső marker kombinációja a szülőivel egyezik, de a középső attól eltér: L s G, valamint a reciprok termék l S g. Ezt a génsorrendre vonatkozó feltételezést a kiszámított távolságoknak alá kell támasztaniuk. Az RF értékeket génpáronként számoljuk. L S esetén (rekombinánsok a Ls és ls kategóriák): RF=( )/740 10,7 m.u. S G esetén (rekombinánsok a Sg és gs kategóriák): 57

70 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek RF=( )/740 14,8 m.u. L G esetén (rekombinánsok a Lg és lg kategóriák): RF=( )/740 23,8 m.u. A géntávolságok alapján valószínűsíthető génsorrend (megegyezik azzal, amit a ritka rekombináns osztályok sugalltak: 10,7 m.u. 14,8 m.u. L S G 23,8 m.u. (?) A két szélső lókusz távolságát a fenti számításban alulbecsültük. Ennek oka, hogy nem vettük figyelembe a ritka rekombináns osztályokat, mivel ha csak az L G viszonyát nézzük, akkor az ebben a két ritka osztályban szülőinek mutatkozik. Valójában azonban történt crossing over az L és a G lókuszok között, mégpedig kettő is, amit a közbülső marker (s) jelez. Így tehát akkor járunk el helyesen, ha L G esetén a ritka rekombináns osztályokat kétszeres szorzóval vesszük számításba. Ekkor L G esetén (rekombinánsok a Lg és lg kategóriák + a két ritka rekombináns osztály 2 ): RF=( )/ m.u. A 25 m.u. érték közel megegyezik a 10,7 + 14,8 = 25,5 m.u. additív távolsággal A kapcsoltsági és a fizikai térképek összeegyeztetése A kapcsoltsági térképek a kromoszómákat ábrázolják a térképezett lókuszokkal. A lókuszok közötti távolságokat m.u. (cm) egységekben adják meg. Egy kromoszóma rendszerint hosszabb 50 cm-nál. Bár a kísérletesen meghatározható térképtávolság maximum 50 cm lehet, a közeli lókuszok távolságának összeadásából kaphatunk nagyobb térképtávolságokat. A ábra a muslica korai kapcsoltsági térképét mutatja be. Egy kromoszómát egy vonal reprezentál, I (X) jelöli az X ivari kromoszómát. Egy kromoszómát egy kapcsoltsági csoportnak is szoktak nevezni. (Megkereshetjük a térképen a már megismert, és később a későbbi fejezetek példáiban előforduló lókuszokat: white, vestigial, purple, Bar, brown, cinnabar.) ábra - A Drosophila melanogaster kapcsoltsági géntérképe 58

71 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek Ha ma látunk egy kapcsoltsági térképet, az kevés (vagy semennyi) morfológiai markert és nagyságrendekkel több molekuláris markert tartalmaz. A sűrűn elhelyezkedő molekuláris markerek segítik a génazonosítást. Ha egy érdekes fenotípust okozó gént keresünk (például növényben egy patogén rezisztencia gént), akkor minél szorosabban kapcsolt molekuláris markert találunk hozzá, annál közelebb juthatunk fizikailag magához a génhez. A ábrán árpa növény kapcsoltsági térképe látható néhány morfológiai, és számos molekuláris markerrel ábra - Árpa kapcsoltsági térképe (hét kromoszóma, bal oldalon a térképtávolság cm egységekben megadva, sárgával kiemelve a morfológiai markerek, a többi molekuláris marker) 59

72 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek A ábra az egér 16-os kromoszómájának egy kevesebb, mint 1 cm-nyi szakaszát (9,5 10,37 cm) mutatja. Adódik a kérdés, hogy mi az összefüggés a klasszikus térképegység és a valós fizikai (bázispárokban kifejezett) távolság között. A klasszikus kapcsoltsági adatok és a DNS-szekvencia ismeretének tükrében egérben ebben a régióban 1 cm 3000 kbp-nak felel meg. A gének mérete átlagosan kbp közé esik (intronokkal együtt), a maradék távolságokat az intergénikus (gének közötti) régiók teszik ki ábra ábra: Az egér 16-os kromoszómájának egy kevesebb, mint 1 cm-nyi szakasza. A régióban számos gén és molekuláris marker található (kék színnel jelölve). Az eredeti tárhelyen az egyes gének részletes adatait is megtaláljuk ( Jobb oldalon fekete betűkkel a humán ortológok és azok kromoszómális lokalizációja van feltüntetve. 60

73 Kapcsoltság. Homológ rekombináció. Kapcsoltsági térképek 61

74 5. fejezet - A mendeli genetika kiterjesztése A korábbi fejezetekben már találkoztunk olyan öröklődési mintázatokkal (lásd a Nemhez kötött öröklődés és a Kapcsoltság témákat), melyek a klasszikus mendeli szabályszerűségekhez képest valamilyen eltérést mutattak. Ebben a fejezetben további, a mendeli genetikát kiegészítő öröklődési formákkal ismerkedünk meg. A mendeli számarányok fenotípus szintjén való megnyilvánulása szigorú feltételekhez kötött. Mendel a róla elnevezett számarányok és törvények felfedezését a következő véletlen tényezőknek köszönhette: minden mendeli allélpár egyszerű domináns recesszív viszonyt mutatott az összes genotípus életképessége azonos volt minden vizsgált fenotípus jól azonosítható volt (nem függött a környezeti hatásoktól és a genetikai háttértől) minden vizsgált gén csak egyetlen fenotípust befolyásolt (két allélpár esetén mindegyik allélpár csak az egyik fenotípust befolyásolta, a másikat nem) minden mendeli fenotípus génje különböző kromoszómán helyezkedett el Mendel a kísérleteiben egy fenotípus követésével valójában egy kromoszóma átörökítését modellezte. A mendeli törvények tökéletesen leírják a kromoszómák meiózisbeli viselkedését, ami az élővilág nagy részére általánosan érvényes. Számos olyan mechanizmust ismerünk, melyek hatására nem a mendeli számarányok jelennek meg a fenotípus szintjén. A mendeli számarányokat módosító mechanizmusok nem érvénytelenítik, hanem kiegészítik a klasszikus mendeli genetikát. Ezek a mechanizmusok az alábbiak: különböző dominanciaviszonyok többszörös allélizmus letális allélok pleiotrópia (egy gén egyszerre több tulajdonságot befolyásol) a környezet fenotípusra gyakorolt hatása penetrancia (egy tulajdonság megjelenésének gyakorisága) expresszivitás (egy tulajdonság kifejeződésének változó mértéke) több gén hatása ugyanarra a jellegre egy útvonalban ható gének, episztázis extranukleáris öröklődés kapcsoltság nemhez kötött öröklődés imprinting Meg kell jegyezni, hogy a fenti felsorolás nem klasszikus tudományos felosztás, inkább csak ízelítő és felvezetés a további témákhoz. Ebben a fejezetben megismerkedünk ezen mechanizmusok egy részével, más részüket külön fejezetekben tárgyaljuk. Látni fogjuk ezen mechanizmusok összefüggését, a gének működésének összetett formáit. 62

75 A mendeli genetika kiterjesztése 1. A dominanciaviszonyok különböző változatai 1.1. Inkomplett dominancia Az inkomplett (nem teljes) dominancia jelenségének leírása Carl Correns (a Mendel-törvények egyik újrafelfedezője) nevéhez köthető. Az 1900-as évek legelején csodatölcsér (Mirabilis jalapa) növények keresztezésekor figyelt fel arra, hogy ha piros virágú növényeket keresztez fehér virágú növényekkel, akkor az utódok mindegyike köztes fenotípust (rózsaszín virág) mutat. Az F1 rózsaszín virágú növények önmegtermékenyítéséből származó F2 generáció tagjai 1:2:1 arányban piros:rózsaszín:fehér virágúak (5.1. ábra). Az F2 nemzedék 1:2:1 aránya azt igazolja, hogy a három fenotípust egy allélpár határozza meg (ez az egygénes öröklődés genotípusaránya). A példában az R1 és az R2 jelölés tehát egy gén, az R (red, piros) két alléljára vonatkozik. A jelenség oka a szülők fenotípusának nem tiszta domináns recesszív viszonya. A háttérben a jó géntermék dupla, szimpla vagy nulla dózisa áll, ennek megfelelően alakul ki a piros, rózsaszín, vagy fehér virágszín. A nem teljes dominancia eme formája sok növénynél felfedezhető (oroszlánszáj, nebáncsvirág, szegfű stb.) 5.1. ábra - Inkomplett dominancia 63

76 A mendeli genetika kiterjesztése 1.2. Kodominancia Kodominancia esetén a heterozigóta egyed a gén mindkét alléljának fenotípusát mutatja. A fenotípus tehát pontosan tükrözi a genotípust. Tipikus példa kodominanciára az M N vércsoportrendszer öröklődése az emberben. A háromféle vércsoportot a vörösvértestek felszíni antigénjének minősége okozza (5.1. táblázat) táblázat - Kodominancia az M N vércsoportrendszer kialakításában Szülői fenotípusok F1 F2 F2 fenotípus 64

77 A mendeli genetika kiterjesztése arány 1. sárga zöld szem mind sárga 6022 sárga; 2001 zöld 3,01 : 1 2. sima ráncos szem mind sima 5474 sima; 1850 ráncos 2,96 : 1 3. zöld sárga hüvely mind zöld 428 zöld; 152 sárga 2,82 : 1 4. felfújt becsípett hüvely mind felfújt 882 felfújt; 299 becsípett 2,95 : 1 5. lila fehér sziromlevél mind lila 705 lila; 224 fehér 3,15 : 1 6. magas alacsony szár mind magas 787 magas; 277 alacsony 2,84 : 1 7. axiális terminális virágos hajtás mind axiális 651 axiális; 207 terminális 3,14 : 1 Ki kell emelni, hogy a fenotípus vizsgálati szintjétől függően (molekula, sejt, szövet, egyed) kaphatunk különböző dominanciaviszonyokat. Példaként nézzük a sarlósejtes vérszegénység betegséget, melynek hátterében a vad típustól eltérő hemoglobin mutáció áll. A normális változatot a Hb A allél, a mutáns változatot a Hb S allél határozza meg. A következő három szinten vizsgáljuk a fenotípust: 1. VÉRSZEGÉNYSÉG (csökkent vörösvértest szám) 2. VÖRÖSVÉRTESTEK SARLÓS ALAKJA 3. HEMOGLOBIN FEHÉRJE (elektroforetikus mobilitás) A lehetséges háromféle genotípushoz a vizsgálati szinttől függően az alábbi fenotípusok, illetve heterozigótában az alábbi dominanciaviszonyok rendelhetők: HbA/HbA HbA/HbS normál 1. nem vérszegény > HbA domináns 2. normál/enyhén sarlós/sarlós > inkomplett dominancia 3. kétféle hemoglobin fehérje > kodominancia HbS/HbS 1. vérszegény, mert a sarlósejtes vörösvértestek könnyebben degradálódnak 1.3. A dominanciaviszonyok magyarázata 2. a kizárólagos abnormális hemoglobin miatt a vörösvértestek sarló alakúak 3. egyféle (kóros) hemoglobin fehérje Egy gén két alléljának dominanciaviszonyait az allélokra nézve heterozigóta egyed fenotípusa mutatja meg. Ha a heterozigóta fenotípusa megegyezik az egyik allélra homozigóta egyed fenotípusával, akkor az az allél teljes dominanciát mutat a másik felett. Leggyakrabban a vad allél domináns a funkcióvesztéses allélek felett. Ez esetben haploelégségről (haploszufficiencia) beszélhetünk, azaz a jó géntermék egy dózisa (lényegében haploid felállás) elég a dupla géndózisnak megfelelő fenotípus kialakításához. A funkcióvesztéses allél ez esetben recesszívként viselkedik. Ha a jó gén egyszeres dózisa a vad fenotípus kialakításához szükséges 65

78 A mendeli genetika kiterjesztése küszöbérték alatt van, akkor haploid elégtelenség (haploinszufficiencia) esete áll fenn. Ekkor a funkcióvesztéses allél dominánsként viselkedik, mert a heterozigóta fenotípusa a funkcióvesztéses homozigóta fenotípusával egyezik meg. Hasonló helyzet áll elő az ún. domináns negatív mutációt hordozó allélek hatására. Ilyenkor heterozigótában a rossz géntermék gátolja a jó géntermék működését. Nem teljes dominanciánál az allélek dupla, szimpla és nulla dózisa más-más fenotípust okoz. Kodominanciánál az allélok egymással egyenértékűek, hatásuk a másik allél jelenlététől függetlenül megnyilvánul. 2. Többszörös allélizmus Egy populációban a génváltozatok, vagyis az allélféleségek száma több is lehet (természetesen egy diploid egyedben minden génnek két allélja van csak jelen). Egy gén alléljainak összességét allélsornak nevezzük. Egy allélsor tagjai változatos dominanciaviszonyokat mutathatnak. Nézzük példaként az AB0 vércsoportrendszert az embernél! Egy gén három allélja alakítja ki a lehetséges négyféle vércsoportot a humán populációkban, az alábbiak szerint (5.2. táblázat): 5.2. táblázat - Többszörös allélizmus (i, IA, IB) az AB0 vércsoportrendszernél Genotípus Fenotípus Antigén ii 0 vércsoport nincs A vércsoport csak A I A I A vagy I A i I B I B vagyi B i IAIB B vércsoport AB vércsoport csak B A és B Akárcsak az M N vércsoportrendszernél, itt is vörösvértest-felszíni antigének térnek el az egyes vércsoportok esetén. A dominanciaviszonyok alakulása: i allél recesszív, vele szemben az I A és I B allélek dominánsak I A és I B allélek kodominánsak További szemléletes példa többszörös allélizmusra az emlősök bundaszínét befolyásoló C (colour) gén. Leggyakoribb alléljai: C sötét egyszínű, c ch csincsilla, c h himalája, c albínó (5.2. ábra). Az allélok egymáshoz képest dominánsak C, c ch, c h, c sorban, ennek megfelelően a genotípus fenotípus viszonyok az alábbiak szerint alakulnak: szőrszín fenotípus sötét, egyszínű csincsilla himalája albínó genotípus CC vagy Cc ch vagy Cc h vagy Cc c ch c ch vagy c ch c h vagy c ch c c h c h vagy c h c cc 66

79 A mendeli genetika kiterjesztése 5.2. ábra - A C génnel összefüggő szőrszín fenotípusok A himalája fenotípus kialakításáért felelős ch allél, pontosabban a fehérjeterméke hőmérséklet érzékeny: a hidegebb testrészeken funkcióképes (a C allél termékével egyenértékű), a melegebb részeken funkcióképtelen (a c allél termékével egyenértékű). A hőmérséklet érzékeny mutációkat a képződő fehérje szerkezetének hőmérséklet érzékenysége magyarázza. A mutáció hatására a fehérje elsődleges szerkezetében bekövetkező változás (legtöbbször egyetlen aminosav cseréje) alacsony (megengedő permisszív) hőmérsékleten nem okoz jelentős változást a fehérje szerkezetében és funkciójában, míg magasabb (korlátozó, restriktív) hőmérsékleten az aminosavcsere következtében a fehérje olyan szerkezetben stabilizálódik, amely a működését lehetetlenné teszi. Fontos kiemelni, hogy a C génen kívül még számos gén terméke befolyásolja az emlősök szőrszínét, ezért a C allélsor fenti fenotípusai függenek más gének allélösszetételétől is Az allélizmus megállapítása vagy elvetése. A komplementáció Ugyanazon jelleg (például szőrszín) különböző változatait okozhatják egyetlen gén allélváltozatai vagy különböző gének változatai. Hogyan állapíthatjuk meg az allélizmust, vagyis azt, hogy egy jelleget érintő két fenotípust (például csincsilla és himalája szőrszín) ugyanazon gén változatai okozzák-e? Ha a kétféle fenotípust mutató tiszta vonalú egyedek keresztezésekor a mendeli egyfaktoros öröklődés szabályszerűségeivel találkozunk, akkor az allélizmus esete áll fenn. Az F1 generációban teljes dominancia esetén csak az egyik fenotípus jelenik meg, (hogy melyik, az elárulja az allélek közötti dominanciaviszonyt is), az F2 generációban pedig a 3:1 (vagy 1:2:1) arányokat kapjuk. Például: P F1 F2 sötét himalája mind sötét ¾ sötét, ¼ himalája himalája csincsilla mind csincsilla ¾ csincsilla, ¼ himalája albínó himalája mind himalája ű Vezessünk le egy esetet, például a sötét himalája keresztezést genetikai szimbólumokkal: P CC c h c h sötét himalája F1 67

80 A mendeli genetika kiterjesztése Cc h sötét F2 3 C (vagyis CC és Cc h ) sötét 1 c h c h himalája Nézzünk egy másik példát! A muslica téglavörös (vad), fehér és barack szemszínű tiszta vonalak egyedeinek keresztezésekor szintén igazolható egy gén többszörös allélizmusa, és a w + > w > w a dominanciasor. P F1 F2 téglavörös fehér mind téglavörös ¾ téglavörös, ¼ fehér téglavörös barack mind téglavörös ¾ téglavörös, ¼ barack fehér barack mind barack ¾ barack, ¼ fehér Nézzük ez utóbbit genetikai szimbólumokkal felírva: P ww w a w a fehér szem barack szem F1 ww a barack szem F2 3 w a (vagyis w a w a és ww a ) barack szem 1 ww fehér szem Mint látjuk, egy gén alléljait rendszerint felső indexek által különböztetjük meg. A vad allél jelölési módja fajonként változó lehet, leggyakrabban + jellel vagy nagy betűvel jelöljük. Polimorf alléloknál, ahol több allél is vad típusnak tekinthető, az egyenértékűségre utaló jelölést célszerű alkalmazni. Meg kell jegyezni, hogy a különféle élőlények genetikai szimbólumrendszerének egységesítésére bár jó ideje vannak már törekvések erre tudománytörténeti vagy más okokból nem mindig van lehetőség. Néhány szervezet jelölésrendszeréről az alábbi elérhetőségeken találunk részletes leírást: (ember) (egér) (élesztő) (muslica) (laboratóriumi fonalféreg) A white gén elnevezése abból adódik, hogy elsőként leírt változata fehér szemszín fenotípust okozott (ww). A w a allél indexének elnevezése az apricot (barack) kifejezésből származik. 68

81 A mendeli genetika kiterjesztése A fenti példában szereplő white gén ww genotípusán kívül más genotípus is vezethet fehér szemszínhez. Erről a bevezető fejezetben már volt szó: az stst bwbw kétszeres homozigóta egyedek nem képesek sem a skarlát, sem a barna pigment termelésére. Itt tehát két további, szemszínt befolyásoló génről van szó. Hogyan igazolhatjuk, hogy a fehér szemszínt a két vonalban nem egy gén alléljai okozzák? Beltenyésztve mindkét fehér szemszínű vonal fehér szemszínű utódokat hoz (tiszta vonalak). Egymással keresztezve azonban azt kapjuk, hogy az utódok mindegyike téglavörös szemű, azaz vad fenotípusú. A jelenséget, amikor azonos jelleget érintő azonos vagy hasonló fenotípusú tiszta vonalak keresztezésekor vad típusú utódokat kapunk, komplementációnak nevezzük. A komplementáció kiegészítést jelent: a két genotípus egészíti ki egymást úgy, hogy a hibridben előáll a vad fenotípus. Ha ezt tapasztaljuk, akkor az allélizmust el kell vetnünk. A komplementáció jelenségének fennállása igazolja, hogy a két vonalban ugyanazt a fenotípust nem ugyanazon gének alléljai okozták. A fehér szemszínű muslica vonalak példáján szemléltetve: P ww st + st + bw + bw + w + w + stst bwbw fehér szem fehér szem F1 ww + stst + bwbw + komplementáció vad, téglavörös szem A két szülői vonalban aláhúztuk a fehér szemszín hátterében álló genetikai okot. Mint azt korábban bemutattuk, minden keresztezést szimmetrikusan írunk fel, s az ismert mutáns allélokon kívül a többi gén alléljainak vad típusát is feltüntejük. Az F1 generáció minden egyede trihibrid, mindhárom szóban forgó gén vad allélját tartalmazza, genotípusa kiegészült, fenotípusa vad. Itt érdemes kitérni a skarlát és barna szemszín mutánsok genetikai analízisére is, melyről a bevezető fejezetben az ennek megértéséhez szükséges tudnivalók ismertetése előtt csak érintőlegesen szólhattunk. Hogyan lehet megállapítani, hogy a két (skarlát és barna) szemszín mutáció allélikus-e vagy sem? Egész egyszerűen, kereszteznünk kell a skarlát és barna tiszta vonal egyedeit, és megvizsgálni az utódokat: Ha az F1 minden tagja kizárólag skarlát vagy kizárólag barna szemszínű, és az F2-ben 3:1 fenotípusarányt kapunk, akkor ez egygénes mendeli örökletességnek felel meg, az allélizmus igazolt, tehát egy gén két allélja okozza a szülői vonalakban a skarlát, illetve barna fenotípust. Ha az F1 utódok mindegyike vad típusú, azaz a komplementáció jelenség fennáll, és az F2-ben a mendeli dihibrid fenotípusos számarányokat kapjuk (négyféle fenotípus, 9:3:3:1 arányban), akkor megállapíthatjuk, hogy két gén változatai okozzák a skarlát és barna szemszín fenotípusokat. A valóságban ez utóbbi eset bizonyul igaznak. Levezetése genetikai szimbólumokkal: P stst bw + bw + st + st + bwbw skarlát szem barna szem F1 stst + bwbw + komplementáció vad, téglavörös szem F2 9 st + bw + vad szem 3 stst bw + skarlát szem (mert nem képződik a barna pigment) 69

82 A mendeli genetika kiterjesztése 3. Letális allélok 3 st + bwbw barna szem (mert nem képződik a skarlát pigment) 1 stst bwbw fehér szem (mert nem képződik egyik pigment sem) Letálisnak azokat az allélokat nevezzük, melyek a hordozójuk pusztulását okozzák (diploidokban a legtöbbször csak homozigóta formában okoznak letalitást). Minden olyan gén, melynek terméke az illető élőlény életfenntartásához vagy egyedfejlődéséhez nélkülözhetetlen, potenciális letális gén. Ezen génfunkciók kiesése ugyanis az életműködés megszűnését, vagy a fejlődés megszakadását eredményezik. Az, hogy mikor letális az allél az egyedfejlődés során, fontos információt nyújt arra vonatkozóan, hogy mikor, hol van szükség az adott gén termékére. Például embernél az achondropláziás törpeségért felelős allél homozigóta formában embrió letális, amiből az következik, hogy a gén terméke az embrionális fejlődés során fontos funkcióval bír. A letalitás sokszor függ a környezettől: ilyenek például a cisztás fibrózis vagy a sarlósejtes anémia monogénes betegségek, melyek kezelés hiányában letalitáshoz vezetnek. A hőmérséklet-érzékeny letális allélok hatása szintén függ a környezettől. A letális allélok egyik iskolapéldája a sárga bundaszínű egerek esete (5.3. ábra). Az emlősökben előforduló aguti (agouti) nevű gén rendelkezik egy letális alléllal, jelöljük ezt A Y -nal, a vad allélt pedig A-val. A kutatók először arra figyeltek fel, hogy a sárga bundaszínű egerek nem tenyésznek tisztán. Beltenyésztve 2:1 arányban jönnek létre sárga:vad színű utódok. Sárga és vad egerek keresztezésekor pedig 1:1 arányban keletkeznek sárga és vad utódok. Ez utóbbi arra utal, hogy a sárga egerek heterozigóták. Beltenyésztve azért kapunk 2:1 arányt, mert az egyik genotípus-kategória hordozói, az A Y A Y homozigóták, embrionális korban elpusztulnak. Az A Y allél ezek szerint kétszeres dózisban letalitást, egyszeres dózisban sárga szőrszínt okoz, és etekintetben domináns a vad allél felett (A Y A heterozigóta sárga) ábra - Sárga (A Y A) és vad típusú (AA) egerek Ebben a példában láthatjuk a pleiotrópia érvényesülését. A pleiotrópia az a jelenség, amikor egy gén több jelleget is befolyásol, jelen esetben a letalitást és a bundaszín kialakulását, valamint további, eddig nem említett életműködést is: elhízást, inzulin rezisztenciát, tumorgenezisre való megemelkedett hajlamot. Ezek látszólag igen távoli jellegek, és talán nehéz elképzelni, milyen molekuláris szintű mechanizmus teremt kapcsolatot a jelenségek között. A gén termékének molekuláris-funkcionális elemzéséről szóló első publikáció 1994-ben jelent meg a Nature című rangos folyóiratban ( Az aguti gén terméke egy parakrin szignalizációs peptid, a melanokortikoid receptorok endogén antagonistája. Kifejeződése normálisan csak meghatározott szövetekben tapasztalható. A melanocortin rendszer számos élettani funkcióban vesz részt, mint például a pigmentáció, szteroidszintézis, energia homeosztázis, gyulladás, hőszabályozás, szexuális funkciók. A gén ektopikus (nem normális helyeken történő) expressziója, valamint epigenetikai szabályozásának megváltozása (DNS-metiláció csökkenése a gén területén, lásd a génkifejeződés szabályozásáról szóló fejezetet) a fenti funkciókat érintő változásokhoz vezet. A gén ortológja emberben is megtalálható. Az utóbbi években a humán aguti ortológ bizonyos alléljait összefüggésbe hozták az elhízásra, illetve bőrrákra való hajlammal. További példa a Man szigetről származó manx macska, mely egy gén mutációja miatt farkatlan (5.4. ábra). A mutáns allél domináns a vad allél felett, a heterozigóták tehát farkatlanok, homozigóta formában a mutáns allél letalitást okoz: M L M a gerinc fejlődése nem megfelelő, következménye a farkatlanság 70

83 A mendeli genetika kiterjesztése M L M L életképtelen genotípus ábra - Farkatlan manx macska 4. Penetrancia és expresszivitás A penetrancia azt mutatja meg, hogy azonos genotípusú egyedek csoportjában az egyedek hány százaléka mutatja a genotípusra jellemző fenotípust. Ha a megegyező genotípusú egyedek mindegyikében megjelenik az adott fenotípus, akkor a gén teljes penetranciájú (penetrancia 100%), ha csak az egyedek egy részén látszik a fenotípus, akkor a gén penetranciája nem teljes. Az expresszivitás a fenotípus kifejeződésének mértékét mutatja. Az expresszivitás egy fenotípusos skálán a magastól az alacsonyig bármekkora lehet. A fenotípust nem mutató egyed (0% expresszivitás) a penetrancia értéket csökkenti az azonos genotípusúak csoportjában (5.5 és 5.6 ábrák) ábra - 100% penetrancia (minden egyed foltos) és változó expresszivitás (a foltosság mértéke egyedenként változó) kutyákon 71

84 A mendeli genetika kiterjesztése 5.6. ábra - Nem teljes penetrancia és változó expresszivitás szemléltetése. Minden ovális egy egyedet képvisel, és minden egyed azonos genotípusú. A nem teljes penetranciát és a változó expresszivitást két körülmény okozhatja: a genom többi génje (melyek egy része ugyanazon fenotípust befolyásolja) egyedenként különbözik az egyes egyedeket eltérő környezeti hatások érik az egyedfejlődés során. 5. Több gén hatása ugyanarra a jellegre 72

85 A mendeli genetika kiterjesztése A gének nem magukban, hanem más génekkel együttműködve, azokkal kölcsönhatásban alakítják ki a fenotípust. Úgy is fogalmazhatunk, hogy az egyes jellegeket a legtöbbször nem egy, hanem több gén terméke alakítja ki. Ebből az következik, hogy a korábban megismert mendeli örökletesség a fenotípus szintjén sokszor módosul. Most olyan eseteket veszünk sorra, melyekben ugyanazt a jelleget befolyásoló géneket vizsgálunk dihibrid keresztezésekben. A fenotípus szintjén megfigyelhető módosult számarányok a génpárok közötti kölcsönhatás viszonyára utalhatnak. A kölcsönhatás típusának megállapítása nagyon hasznos információt szolgáltat. Egy jelleget érintő sok gén viszonyának szisztematikus feltárása elvezethet komplett biokémiai vagy genetikai útvonalak feltérképezéséhez Két gén hatása ugyanarra a jellegre független útvonalon Egy példával A komplementáció című szakaszban már találkoztunk. Muslicában a szemszín egy jellegnek tekinthető. Több gént ismerünk, amely részt vesz e jelleg kialakításában, ilyenek a korábbiakban bemutatott white (w), scarlet (st) és brown (bw) gének. Ha a hivatkozott szakaszban ismertetett dihibrid keresztezést (P: stst bw + bw + st + st + bwbw) megvizsgáljuk, és párhuzamba állítjuk a mendeli dihibrid keresztezésekkel, akkor a megfeleltethetőség nyilvánvaló. Függetlenül hasadó génpárról van szó, mert F2-ben megkapjuk az erre jellemző 9:3:3:1 fenotípusarányt. Mi a különbség a mendeli borsó kísérlettől? Az, hogy itt a két függetlenül öröklődő gén ugyanazt a fenotípus-jelleget (szemszín) érinti (szemben a borsószem színére és alakjára vonatkozó sárga zöld/ráncos sima jellegpárral), ezért abban az egy jellegben, a szemszínben tükröződik vissza mindkét gén allélösszetételének hatása. A következő iskolapélda az ugyanarra a jellegre független útvonalon ható két génre a csirke tarajforma öröklődése. Hosszú múltra tekint vissza ez a terület, Bateson és Punnett már 1902-ben publikált a tarajforma öröklődés kapcsán két gén interakciójáról. Rózsa és borsó tarajú csirkék keresztezésekor az utódok egy új fenotípust, dió tarajat növesztettek (5.7. ábra). Az F1 inter se keresztezés utódai között 9:3:3:1 arányban jelent meg a dió:rózsa:borsó:egyszerű tarajforma. Sematikusan: P RR pp rr PP rózsa borsó F1 Rr Pp dió F2 9 R P dió A gének jelölésének eredete: R rose, rózsa; P pea, borsó. 3 rr P borsó 3 R pp rózsa 1 rr pp egyszerű A háttérben álló molekuláris mechanizmusról sokáig nem tudtak semmit. Egy néhány éve megjelent publikáció számol be arról, hogy a borsó tarajformát egy fejlődéstanilag fontos gén (a SOX5 transzkripciós faktor gén) intronjában bekövetkező duplikáció okozza. Ez egy olyan domináns mutáció, mely a gén kifejeződésének szabályozását változtatja meg (ektópikus expressziót okoz). A SOX5 gén megfelel a fenti példában szereplő P génnek, domináns mutáns allélja a P-nek, recesszív vad allélja a p-nek. A cikk megtalálható a webhelyen ábra - Csirke tarajformák 73

86 A mendeli genetika kiterjesztése A házi tyúk őse, az ázsiai esőerdőkben honos bankivatyúk (Gallus gallus) egyszerű tarajjal rendelkezik. A SOX5 mutáció minden bizonnyal a háziasítás kezdetén jöhetett létre, mert a borsó taraj elterjedtnek számít a tenyésztett fajtáknál világszerte. A kutatók ezt előnyös spontán mutációnak gondolják, mert a borsó tarajforma hidegebb éghajlatokon előnyösebb az egyszerű tarajjal szemben, a kisebb hűtési felület miatt. A rózsa tarajformát szintén egy, a vad típussal szemben domináns allél okozhatja. Emberben húsz SOX gént ismerünk. Ezek számos fejlődésbiológiai folyamat (ivarmeghatározás, neuronális fejlődés, sejtdifferenciáció) irányításában vesznek részt. A kutatók úgy vélik, hogy néhány SOX gén alkalmas lehet a gyermekkori agytumor kialakulásának korai diagnosztizálására, ezért ez intenzív kutatási terület napjainkban. A modellszervezeteken végzett génazonosítás és funkcionális jellemzés jelentőségét ez a példa is bizonyítja Komplementer öröklésmenet Két fehér virágú borsó törzs keresztezésének utódai lehetnek bíbor virágúak, ami komplementációra utal. F2- ben 9:7 arányban kapunk bíbor:fehér virágú növényeket. Ez módosult dihibrid F2 számarány: a 7 a 3:3:1 genotípusok egymással megegyező fenotípusából adódik. A virágszín csak akkor bíbor, ha a genotípusban mindkét szóban forgó génnek legalább egy domináns allélja jelen van. Egyszerű jelölésekkel levezetve: P AA bb aa BB fehér fehér F1 Aa Bb komplementáció bíbor (vad) F2 9 A B bíbor komplementáció 74

87 A mendeli genetika kiterjesztése 3 aa B fehér 3 A bb fehér 1 aa bb fehér A genotípusok szintjén tehát nem, csak a fenotípus szintjén érvényesül a módosult számarány. A komplementer génhatás jelenség magyarázata az, hogy egy festék termeléséért két enzimre van szükség, és azok lineáris sorban egymás után fejtik ki hatásukat. Csak akkor keletkezik festék, ha mindkét enzim jelen van. Az A enzim hiánya is (aa funkcióvesztéses allélpár), akár a B enzim hiánya is (bb funkcióvesztéses allélpár), s mindkettő hiánya is (aa bb genotípus) megakadályozza a pigmentképződést, fehér virágszínt okoz (5.8. ábra) ábra - Komplementer génhatás egy reakciósor két tagjánál 5.3. Duplikált gének öröklésmenete Nem ritka, hogy egy biokémiai lépést két vagy több gén terméke is képes végrehajtani. Az ilyen géneket redundáns géneknek nevezzük. Redundáns gének génduplikációval keletkeznek. A duplikált gének az evolúciós folyamatok kiváló nyersanyagai, mivel az egyik géntaggal az evolúció szabadon bánhat, ami új, az élőlény számára előnyös funkció kialakulásához is vezethet. A megegyező funkciójú redundáns gének bármelyikének terméke elegendő a fenotípus kialakításához, például egy pigment termelődéséhez (5.9. ábra). Minden genotípus, amelyben A vagy B gén domináns allélja előfordul, színes fenotípusú, és csak a aa bb genotípusban nem termelődik aktív enzim, ezért nem keletkezik festékanyag. A fenotípus szintjén módosult F2 dihibrid számarány 15:1. P AA bb aa BB színes színes F1 Aa Bb színes F2 9 A B színes 3 aa B színes 3 A bb színes 1 aa bb fehér 5.9. ábra - A redundáns gének termékei azonos funkcióval rendelkeznek 75

88 A mendeli genetika kiterjesztése 5.4. Recesszív episztázis Az episztázis jelentése: felette álló. A genetikában gének egymás feletti hatására használt kifejezés. Az egymás felett állás természetesen nem fizikai értelemben, hanem génfunkcióban értendő. Gyakorlatias megfogalmazásban: az A gén episztatikus B gén felett, ha a B gén allélösszetételétől függetlenül az A gén allélkombinációjának megfelelő fenotípus érvényesül. Úgy is mondhatjuk, hogy az episztatikus gén bizonyos allélösszetétele meggátolja egy másik gén fenotípusos kifejeződését. Az előző mondatban a bizonyos allélösszetétel arra utal, hogy megkülönböztetünk recesszív episztázist (ha az episztatikus gén recesszív allélja fejt ki episztatikus hatást) és domináns episztázist (ha az episztatikus gén domináns allélja fejt ki episztatikus hatást). Nézzünk egy példát recesszív episztázisra! Az emlősök szőrszínével korábban már foglalkoztunk. A C gén allélsora példát mutatott a többszörös allélizmusra, az A aguti gén A Y allélja pedig a letális allélra). Most egy harmadik gént is bemutatunk: ez a brown (B) gén, melynek domináns allélja fekete pigment, recesszív allélja pedig barna pigment termelődéséhez vezet. B gén alléljai: B fekete bb barna C gén alléljai: C intenzív szín c ch csincsilla c h himalája c c albínó A C és B bundaszín gének recesszív episztázisa: 76

89 A mendeli genetika kiterjesztése P CC bb cc BB barna albínó F1 Cc Bb (komplementáció, mert barna és albínó nem allélikusak) fekete F2 9 C B fekete 3 cc B albínó 3 C bb barna 1 cc bb albínó (A fenti eset a többi szőrszín gén meghatározott genotípusa mellett érvényesül). A recesszív episztázisra a 9:3:4 módosult F2 fenotípusos számarány jellemző. Ez úgy jön létre, hogy az egyik 3 és az 1 genotípusok fenotípusa megegyezik, jelen esetben albínó. A 4 arányban megjelenő fenotípus oka az, hogy ha az egyik gén recesszív homozigóta formában van jelen (itt cc), akkor a fenotípus a másik gén alléljaitól függetlenül (B vagy bb) ugyanaz (itt albínó). A biokémiai hátteret szemlélteti az ábra: ábra - Recesszív episztázis egy reakciósor tagjai között C gén recesszív allélja episztatikus B gén felett, ezért recesszív episztázisról beszélünk. B géntermék hatása szubsztrát hiányában nem érvényesül Domináns episztázis A domináns episztázisban két gén között olyan episztatikus viszony áll fenn, melyben az episztatikus gén domináns allélja akadályozza meg a másik gén alléljainak fenotípusos kifejeződését. Példaként a gyűszűvirág (Digitalis purpurea) pártaszínének alakulását tekintjük át. 77

90 A mendeli genetika kiterjesztése Az egyik gén a D gén, melynek domináns allélja sötét lila, recesszív allélja homozigóta formában (dd) világos lila virágszínt eredményez. Egy másik gén, a W gén, befolyásolja a képződött pigment lerakódását: W domináns allélja megakadályozza a pigmentlerakódást, kivéve a virágtorokban, így a párta fehér w allél nem gátolja a pigment lerakódását (így a D gén genotípusának megfelelő színű a virág). Ebben a példában a W gén domináns W allélja episztatikus D gén felett. A D gén alléljainak hatása csak ww genotípus mellett érvényesül (5.11. ábra). A két génre nézve dihibrid önmegtermékenyítésekor az utódokban a domináns episztázisra utaló 12:3:1 számarányt kapjuk: Ww Dd inter se 9 W D fehér 3 ww D sötétlila 3 W dd fehér 1 ww dd világoslila ábra - W allél domináns episztázisa D gén felett ábra: 5.6. Egy biokémiai útvonal genetikai analízise Egy tudománytörténeti szempontból is nagy jelentőségű kísérletsor bemutatásával szemléltetjük a genetikai és biokémiai analízis ötvözésének erejét. Biokémiai útvonalon olyan több lépésből álló reakciósort értünk, melynek egyes lépéseit különböző gének termékei (különböző enzimek) katalizálják. A példánkban szereplő kísérletsort George Wells Beadle és Edward Lawrie Tatum végezte még az 1940-es években. Ebben az időszakban még ismeretlen volt a gének mint a tulajdonságok átörökítéséért felelős faktorok molekuláris természete. A két kutató a gének és fehérjék közötti kapcsolat felderítését tűzte ki célul. Ha van 78

91 A mendeli genetika kiterjesztése direkt kapcsolat a gének és az enzimek között, akkor lehet olyan mutánsokat (öröklődő változásokat hordozó, tehát génjükben megváltozott) izolálni, amelyek specifikus enzimreakciókban hibásak. Eredményeik alapján ez a feltevésük be is igazolódott. Megalkották az ún. egy gén egy enzim hipotézist. Munkájukért 1958-ban Nobel-díjat kaptak. A kérdés tanulmányozására a Neurospora crassa mikroszkopikus gombát választották. Előnyös választás volt ez a modellszervezet, mert kis helyen, egyszerű eszközökkel nagy számban fenntartható, és aszexuális és szexuális szaporodási ciklusa is van. Aszexuálisan a haploid hifák által termelt spórákkal (vagy mikrokonídiumokkal) szaporodik. Szexuális ciklusában két párosodási típus hifái kétmagvú (dikarióta) hifává egyesülnek, s ezt magfúzió (kariogámia) követi. A sejtmagok fúziójából kialakulnak a diploid magok. Ezekből a sejtekből alakulnak ki az aszkuszok (tömlők). Az aszkusz olyan zsákszerű képződmény, melyben nyolc haploid aszkospóra jön létre. Az aszkospórák a kiindulási diploid sejt egy meiotikus osztódásával, majd azt követő egy mitotikus osztódásával keletkeznek. A faj jellemzője, hogy az aszkuszban a spórák nem keverednek, lineáris sorrendben helyezkednek el, mely elrendeződés tükrözi a megelőző osztódások és rekombinációs események térbeli viszonyait. Ennek Beadle és Tatum munkájában nincs jelentősége, de a térképezéssel és rekombinációval kapcsolatos vizsgálatoknál a szabályos elrendeződés meghatározó jelentőségű volt (erre itt nem térünk ki). A kísérlet célja nagyszámú arginin auxotróf (arginin aminosavat előállítani nem képes) mutáns izolálása és jellemzése, ami elvezetett az arginin bioszintézis lépéseinek feltárásához. A mutánsok képződését röntgen mutagenezissel indukálták, ami megemelte a spontán mutációs rátát (lásd a Mutációk című fejezetet). Körülbelül darab röntgensugárzásnak alávetett mikrokonídiumot teszteltek a továbbiakban. Azért volt szükség ilyen nagy számú egyed átvizsgálására, mert a mutációképződés esélye még indukált esetben is kicsi. Ha keletkezik is mutáció egy mikrokonídiumban, akkor az a genom bármelyik részét érintheti, s az csekély valószínűségű, hogy a mutáció éppen az arginin bioszintézisben részt vevő valamely génben következzen be. Több lépésben keresték a besugárzott mikrokonídiumok között az arginin auxotróf mutánsokat. Első lépésben kiválogatták az auxotrófokat: ezek azok a mikrokonídiumok, melyek csak komplett (a növekedéshez szükséges minden szerves és szervetlen vegyületet tartalmazó) táptalajon nőnek, minimál (csak alapvető szervetlen forrásokat tartalmazó) táptalajon nem (5.12. ábra) ábra - Auxotrófok kiválogatása Az auxotrófokat tovább szűrték: arra a csoportra volt szükségük, melyek az összes aminosavval kiegészített minimál táptalajon növekedni tudtak, mert ezek mindegyike valamelyik aminosav előállításában hibás (5.13. ábra) ábra - Aminosav auxotrófok kiválogatása 79

92 A mendeli genetika kiterjesztése Végül már csak az aminosav auxotrófokat kellett egyenként tesztelni arra, hogy közülük melyik arginin auxotróf, vagyis melyik képes kizárólag argininnel kiegészített tápközegben növekedni (5.14. ábra) ábra - Arginin auxotrófok kiválogatása Miután találtak néhány arginin auxotrófot, két alapvető genetikai teszt elvégzése következett, melyek semmilyen klasszikus genetikai analízisből nem hagyhatók ki. Ezek célja: igazolni, hogy az adott vonalban csak egy mutáció van jelen Csakis olyan mutánssal érdemes dolgozni, melyben az adott fenotípus egyetlen mutációnak a következménye. A kikeresztezést (outcrossing) általában alkalmazzák indukált mutagenezissel induló mutánspark előállításakor. Ez azt jelenti, hogy ha kezünkben van az érdekes fenotípusú mutáns, akkor néhány generáción keresztül a vad típussal keresztezzük, minden generációban az érdekes fenotípusú egyedekkel megyünk tovább. Ezzel elérhető, hogy az érdekes fenotípust okozó mutáción kívül a genomból eltűnjenek az indukált mutagenezis során esetlegesen létrejött más mutációk. Neurospora crassa esetében a mutáns és a vad vonal párosításából származó utódok 1:1 arányú hasadása igazolja, hogy a mutánsban egy gént érint a mutáció (5.15. ábra) ábra - Az 1:1 arányú hasadás igazolja, hogy egyetlen gén mutációja okozza az arginin auxotrófiát 80

93 A mendeli genetika kiterjesztése a mutánsokat (pontosabban az általuk hordozott mutációkat) komplementációs csoportokba sorolni A kopmlementációs csoportba sorolás célja annak megállapítása, hogy az izolált, azonos fenotípusú (itt arginin auxotróf) mutánsok közül melyek azok, amelyek ugyanabban a génben hordoznak mutációt, azaz allélikusak, és melyek azok, melyek különböző gének mutációi hatására lettek arginin auxotrófok. A komplementációs analízissel végeredményben azt állapítjuk meg, hogy a kezünkben lévő mutánsok által hány darab, az adott fenotípust befolyásoló gént azonosítottunk. Leegyszerűsítve, az egymást komplementáló mutációk különböző géneket érintenek, más kifejezéssel: különböző komplementációs csoportba tartoznak. Ha két mutáció esetén a komplementáció elmarad, akkor azok ugyanazt a gént érintik, azaz egy komplementációs csoportba tartoznak. Egy genetikai analízis során minél több komplementációs csoport, azaz a folyamatot érintő minél több gén azonosítása kívánatos, mert így tárható fel minél részletesebben a folyamat genetikai-biokémiai háttere. Páronként keresztezve példánkban az arginin auxotrófokat, az alábbi séma szerint végezhető el a komplementációs analízis (5.16. ábra): ábra - Az arginin auxotrófok komplementációs csoportokba sorolásának kísérleti vázlata 81

94 A mendeli genetika kiterjesztése Beadle és Tatum három olyan mutánst találtak, melyek különböző komplementációs csoportba tartoztak. A három komplementációs csoport egy-egy tagja által tehát három arginin bioszintézisben részt vevő gént sikerült fülön csípni. (Ezek az arg-1, arg-2, arg-3 gének, a mutánsokat jelöljük arg-1-, arg-2-, arg-3- jelöléssel, utalva arra, hogy három különböző génben hibásak.) A mutánsok izolálása és jellemzése után következhetett a biokémiai munka. Az argininen kívül annak rokonvegyületeire nézve is tesztelték, hogy a három arginin auxotróf mutáns vajon menekíthető-e az argininen kívül más, hasonló szerkezetű vegyülettel is, például ornitinnal vagy citrullinnal (5.17. ábra) ábra - Az arginin és két rokonvegyület, az ornitin és citrullin szerkezeti képlete 82

95 A mendeli genetika kiterjesztése A menekítési kísérlet eredményeit foglalja össze az 5.3. táblázat táblázat - A menekítési kísérlet eredményeinek összefoglalása (+ van növekedés, - nincs növekedés) arg-1- arg-2 arg-3 ornitin citrullin arginin Ez a menekítési mintázat egy bioszintézis útvonalra utal. Egy adott mutáns csak annak a vegyületnek a bioszintézisére képtelen, mely a prekurzorok sorában először képes minimál táptalajon a mutánst menekíteni. A bioszintézis útvonal elemeit az ábrán látjuk sorbarendezve ábra - Az arginin bioszintézis útvonal elemeinek sorbarendezése 83

96 A mendeli genetika kiterjesztése A bioszintetikus út minden egyes lépését egy-egy specifikus enzim végzi. Minden enzimet külön-külön egy-egy gén határoz meg. A modell az egy gén egy enzim hipotézis néven vonult be a tudományág szóhasználatába. Más kutatók más rendszerekkel hasonló eredményeket kaptak. Az arginin bioszintetikus út helyességét is részletekbe menően igazolták, s a működésképtelen enzimeket is kimutatták. A bemutatott kísérleti séma általánosan alkalmazható bioszintetikus utak felderítésére Egy genetikai útvonal episztázis analízise Genetikai útvonalaknak tekintjük azokat a sejten belüli és sejtek közötti jeltovábbító rendszereket, melyek gének működésének megváltoztatását eredményezik. A biokémiai szintézis útvonalakhoz hasonlóan a jelátviteli rendszerek több elemből állnak, és az elemek szekvenciálisan működnek. (A valóságban ennél komplexebb a működésük a különféle visszacsatolási hurkok és a különféle jelátviteli útvonalak közötti kereszthatások miatt.) A genetikai útvonal elemei olyan jeltovábbító fehérjék, melyek a következő elem aktivitását befolyásolják annak függvényében, hogy ők maguk aktív vagy inaktív állapotban vannak-e. Ezt pedig az előző elem aktivitása határozza meg, és így tovább. Az útvonal utolsó tagja meghatározott gén vagy gének kifejeződését befolyásoló szabályozó fehérje (transzkripciós faktor, lásd a génkifejeződésről szóló fejezeteket). A génszabályozás célirányos megváltoztatásával érhető el egy szignál által kiváltott sejtválasz (például ilyen szignál a sejtet érő növekedési faktor, melynek hatására a sejt osztódik). Ahhoz, hogy megértsük, hogyan lehet azonosítani egy genetikai útvonal elemeit, és hogyan lehet felderíteni a klasszikus genetika eszköztárával az elemek közötti gátlási-aktiválási viszonyokat, a Caenorhabditis elegans modellszervezetet vesszük példának. A Caenorhabditis elegans modellszervezet bemutatása A C. elegans körülbelül egy milliméter hosszú, a talajban élő fonálféreg. Minden szárazföldön elterjedt. Laboratóriumi fenntartásuk agar lemezen történik, a lemezre oltott E. coli baktériumokkal táplálkoznak. Óriási előny, hogy -80 C-on is tárolhatók a törzsek. Hermafrodita alakjai (XX ivari kromoszómákkal) és hím (X0, vagyis egy X ivari kromoszómával rendelkező) alakjai vannak. A hímek csak 0,1 0,2 %-ban jelennek meg a természetes populációkban (ivari kromoszóma nondiszjunkció következtében). A kromoszómák szétválását érintő bizonyos mutáns törzseiben körülbelül 30% a hímek aránya. Ezek a törzsek szükségesek a genetikai munkában alkalmazott keresztmegtermékenyítéshez. A hermafroditák petéket raknak, ezekből lárva bújik ki. A lárva növekszik, többször vedlik, míg kifejlett állattá (adult) válik. A C. elegans esetében a szokásos laboratóriumi feltételek között egy életciklus mindössze körülbelül három napig tart, ami rövidnek számít, és igen előnyös a rajta végzett kísérletes munka szempontjából. A kifejlett állat élettartama rövid, ezért viszonylag könnyű megnövekedett, illetve csökkent élethosszú (ún. age) mutánsokat izolálni. Emiatt az öregedéskutatás területén kedvelt modell. A kifejlett egyedek morfológiája nagyon leegyszerűsített. A hermafroditák testüregének nagy részét a gonádok teszik ki. Az ivarnyílást (vulva) a két gonádkarral az uterusz kapcsolja össze. A gonádok teljes hosszuk felénél visszahajlanak, disztális (az uterusztól távoli) és proximális (az uteruszhoz közeli) kart alkotnak. A proximális karokon az uterusz fele haladva petevezetéket és spermatékát találunk. A gonádok petesejteket és spermiumot egyaránt termelnek. A petevezetéket az uterusz felé növekvő méretű petesejtek töltik ki. A spermatékában tárolt spermiumok által történik a hermafroditák önmegtermékenyítése. Ha hermafrodita egyedet hímmel pároztatnak, akkor a hím spermiumai abszolút előnyt élveznek a hermafrodita saját spermiumaival szemben. A felnőtt egyed testében csak nemosztódó sejtek vannak: hermafroditáknál 939 darab, hímeknél 1031 darab. A sejtek leszármazási sorsa invariáns, azaz szigorúan determinált, hogy melyik sejtből milyen szövetféleség lesz. Ezek a sejtvonalak teljes pontossággal reprodukálódnak. A sejtek leszármazása az alábbi technikákkal vizsgálható: az embriót kiveszik az uterusból, blasztomerjeit megjelölik (riportergénnel, fluoreszcens jelöléssel), osztódások során az utódsejtek is jelölődnek lézeres sejtléziókat hoznak létre az embrióban, és vizsgálják, mi történik hatására, mi nem fejlődik ki Nomarski mikroszkópiával Az egyedfejlődés során bizonyos sejtek (105 darab) egyértelmű sorsa, hogy programozott módon elhalnak. Emiatt a C. elegans a programozott sejthalál (apoptózis, jelentése lombhullás) kutatás kiváló modellje. 84

97 A mendeli genetika kiterjesztése A C. elegans genomszekvenciája volt az első megismert szövetes eukarióta genomszekvencia (1998-ban határozták meg). A genom 97 Mbp méretű és gént tartalmaz. Egy génre átlagosan 5 kbp DNS esik. Az emberi gének körülbelül 70%-a rendelkezik C. elegans ortológgal. Genomjában a redundáns gének száma alacsony. A közelmúltban három Nobel-díjat is kiérdemeltek az e modellszervezettel végzett kutatások: 2002 (orvosi) Sydney Brenner a féreggel végzett úttörő munkájáért John Sulston a sejtleszármazások feltérképezéséért Robert Horvitz a programozott sejthalál vizsgálatáért 2006 (orvosi) Andrew Fire és Craig Mello az RNS interferencia felfedezéséért (lásd az eukarióta génkifejeződés szabályozásáról szóló fejezetet) 2008 (kémiai) Osamu Shimomura, Martin Chalfie és Roger Y. Tsien a GFP (green fluorescent protein, zöld fluoreszcens protein) felfedezéséért és genetikai markerként való alkalmazásáért a féregben A vulva (a hermafroditák ivarnyílása) A genetikai útvonal, melynek analízisét bemutatjuk, a hermafrodita egyedek ivarnyílásának (vulvájának) fejlődését szabályozza. Normálisan egy vulva található a kifejlett féreg hasi oldalán, s kétféle, a vulvafejlődésben hibás mutánstípus bizonyult izolálhatónak (5.19. ábra): vulvaless (Vul fenotípus) vulva nélküli (az ivarnyílás hiánya miatt a hermafrodita nem tud lepetézni, a lárvák a testen belül fejlődnek ki, ami az anya pusztulásához vezet) multivulva (Muv fenotípus) egynél több vulvaszerű képződmény fejlődik a hasi oldalon ábra - C. elegans vulvaless, vad típusú és multivulva egyedei (fentről le) A vulva néhány sejtből kialakított csőszerű képződmény, mely az uteruszt köti össze a külvilággal. Kialakulása az L3 lárvastádiumban zajlik. Bizonyos sejtek (ún. vulva prekurzor sejtek) a környező sejtektől érkező 85

98 A mendeli genetika kiterjesztése molekuláris jelek hatására meghatározott sejtsorsot vesznek fel (ezt 1, 2, 3 jelölik), ami azt jelenti, hogy a jelnek megfelelő módon differenciálódnak. Normál esetben meghatározott sejtek veszik fel ezeket a sejtsorsokat. A szerv kialakulása, leegyszerűsítetten szólva, az adott sejtek meghatározott számú osztódásával történik (5.20. ábra) ábra - A C. elegans vulvájának kialakulása A vulva egyszerű szerv, de a kialakulásában több jelátviteli útvonal játszik közre. Ha a jeltovábbító rendszerek valamely eleme(i) hibás(ak), akkor a sejtek nem a megfelelő módon differenciálódnak. E hibák következménye lehet, hogy egyáltalán nem fejlődik vulva, vagy az, hogy egynél több vulva fejlődik. 86

99 A mendeli genetika kiterjesztése A továbbiakban bemutatjuk a genetikai analízis menetét lépésről lépésre. Vulvafejlődésben érintett mutánsok izolálása, s azt követő komplementációs analízis Tegyük fel, hogy izolálunk 10 vulva nélküli és 10 multivulva mutánst. Ezek a vonalak alkotják a kiindulási mutánsparkot. Mint azt már korábban többször láttuk, első lépésként a mutánspark tagjait komplementációs csoportokba kell sorolni. Ehhez páronként keresztezzük az azonos fenotípust mutató vonalak egyedeit. Az egymást nem komplementáló vonalakban egyazon gén tartalmazza a fenotípust kialakító mutációt (azonos komplementációs csoportba tartoznak). Az egymást komplementáló vonalak tagjaiban különböző gének mutációja vezet ugyanazon fenotípus kialakulásához. Az alábbi példában konkrét kísérleti eredményeket mutatunk be. A komplementációs analízis eredményeként a vulvaless mutánsok két, a multivulva mutánsok pedig három komplementációs csoportba sorolhatók. Ez azt jelenti, hogy öt vulvafejlődésben részt vevő gén érintett a mutánsok által. Minden komplementációs csoportból kiválasztottak egy képviselőt a további analízishez, ezek: Vul (vulvaless) mutánsok: lin-45, let-23 Muv (multivulva) mutánsok: lin-1, let-60, lin-15 (a fenti jelölések a törzseket jelentik, a megfelelő géneket hasonlóképpen, de dőlt betűvel írjuk, a vad allél +, a mutáns allél - jelzést kap) A kettős mutánsok fenotípusának megállapítása A fenti öt gén termékéről tehát tudjuk, hogy mutációjuk milyen fenotípushoz vezet. Az episztatikus viszonyok megállapításához ismerni kell a kettős mutánsok fenotípusát. Ennek megállapítása az alábbiak szerint történik a lin-45 és a lin-1 példáján (5.21. ábra): ábra - Kettős mutánsok fenotípusának megállapítása A két csoport tagjaival minden páros kombinációban el kell végezni a fenti séma szerinti kettős mutáns fenotípus-analízist. Az eredményeket az 5.4 táblázat foglalja össze táblázat - A kettős mutánsok fenotípusának összefoglalása lin-1 Muv let-60 Muv lin-15 Muv lin-45 Vul Muv Vul Vul 87

100 A mendeli genetika kiterjesztése let-23 Vul Muv Muv Vul Az episztatikus viszonyok megállapítása Az 5.4. táblázatba foglalt eredmények szerint a kettős mutáns fenotípusok valamely egyes mutáns fenotípusával egyeznek meg. Páronként vizsgálva a géneket, az a gén episztatikus a másik gén felett, amelynek mutáns fenotípusával megegyezik a kettős mutáns fenotípusa. Például: lin-45-/lin-45- lin-1-/lin-1- lin-45-/lin-45- ; lin-1-/lin-1- egyes mutáns Vul egyes mutáns Muv kettős mutáns Muv A fentiekből az következik, hogy a lin-1 gén episztatikus a lin-45 gén felett, mert lin-1-/lin-1- genotípus (a lin- 45 gén allélösszetételétől függetlenül) ugyanazon (Muv) fenotípus kialakulásához vezet. A genetikai útvonalaknál az episztatikus viszonyokat másképp értelmezzük, mint ahogyan egy biokémiai reakciósor esetén láttuk (lásd a fejezet előző szakaszában). Genetikai útvonalaknál a downstream elem episztatikus az upstream elemhez képest. A downstream irányon a folyamatsor végéhez mutató irányt értjük, a legutolsó (the most downstream) elem a gének kifejeződését befolyásoló transzkripciós faktor. Ha például a transzkripciós faktor mutáns, akkor ahhoz kapcsolódik egy bizonyos fenotípus. Ha a transzkripciós faktor mutációján kívül egy a folyamatsorban előbb lévő, more upstream elem is hibás (kettős mutáns), akkor is a transzkripciós faktor mutációjának megfelelő fenotípus jelenik meg, vagyis a downstream elem episztatikus az upstream elem felett. Ez a logika a jelátviteli útvonal bármely két tagjára alkalmazható, és ennek alapján az elemek sorrendje meghatározható (5.22. ábra) ábra - Egy jelátviteli útvonal elemeinek sorbarendezése a mutáns fenotípusok alapján Az elemek közötti aktiválási és gátlási viszonyok megállapítása Miután a szignáltól (upstream) a génkifejeződésig (downstream) sorba rendeztük a jelátviteli útvonal elemeit, az elemek közötti aktiválási, illetve gátlási viszonyokat is megállapíthatjuk. Ehhez célszerű a the most 88

101 A mendeli genetika kiterjesztése downstream elemtől felfele haladni, és az elem mutáns fenotípusából következtetni annak normális funkciójára. Példánkhoz az ábra nyújt magyarázatot ábra - A jelátviteli útvonal elemek közötti aktiválási és gátlási viszonyok megállapítása Végül hangsúlyozzuk, hogy a vulvafejlődés példáján azonosított jelátviteli útvonal elemei konzervált, sejtosztódást szabályozó útvonal elemeinek (a Ras-Raf-MAPK) felelnek meg. A lin-3 gén terméke az anchor sejt által kibocsátott epidermális növekedési faktor, ez az a jel, melyet a növekedési faktor receptor (példánkban a let-23 gén terméke) érzékel, és továbbít a sejtbe. A let-60 kódolja a Ras, a lin-45 pedig a Raf fehérjéket, melyek a jelátvitel fontos citoplazmatikus komponensei. A the most downstream elem, a lin-1 gén terméke, transzkripciós faktor, melynek aktivitása vagy inaktivitása meghatározza a sejtsorsot, ebben az esetben azt, hogy a sejt osztódjon-e vagy sem (5.24. ábra). Rákos sejtekben gyakori a tárgyalt jelátviteli útvonal elemeinek abnormális működése ábra - A vulvafejlődést konzervált jelátviteli útvonal szabályozza 89

102 A mendeli genetika kiterjesztése 6. Extranukleáris öröklődés Az extranukleáris (vagy citoplazmatikus) öröklődés a nem sejtmagi génekre jellemző. Eukarióta sejtekben a mitokondrium és a kloroplaszt organellumok rendelkeznek saját DNS-sel, melyeket mitokondriális (mtdns) és kloroplaszt genomnak (cpdns), együttesen pedig extranukleáris genomnak nevezünk. Az organellumok genomja cirkuláris, a nukleáris genomtól és a sejtciklustól függetlenül replikálódik (a sejtmagban kódolt, de organellum specifikus DNS-polimeráz által). A sejtekben ezek a sejtorganellumok több példányban vannak jelen, és organellumonként az mtdns és a cpdns kópiaszáma is több egynél (számuk változó). Fajok között széles mérettartománybeli eltéréseket találunk (akár néhányszázszoros különbséget is). Az mtdns állati szervezetekben kisebb, mint növényekben. A humán mtdns mérete bp körüli; rrns-géneket, trnsgéneket és tizennégy, az oxidatív foszforilációban részt vevő, fehérjét kódoló gént tartalmaz. A mitokondriális fehérjék nagy része a sejtmagban kódolt, a citoplazmában szintetizálódik, majd importálódik a mitokondriumba (ez a kloroplaszt fehérjék zömére is igaz). A cpdns többnyire egy-két nagyságrenddel nagyobb a mtdns-nél. A dohány cpdns-mérete például bp körüli; rrns-, trns-géneket és számos, a fotoszintézisben részt vevő fehérjekódoló gént tartalmaz. Az extranukleáris öröklődés felismeréséhez vezető első megfigyeléseket Carl Correns (a mendeli törvények egyik újrafelfedezője) tette 1909-ben. Csodatölcsér (Mirabilis jalapa) növénynél figyelt fel arra, hogy a szár és levél színét ami lehet teljesen zöld, teljesen fehér, vagy zöld-fehér variegált kizárólag az anyai szülő határozza meg. El is nevezte ezt az öröklődési formát anyai öröklődésnek. 90

103 A mendeli genetika kiterjesztése Hangsúlyozni kell, hogy az anyai öröklődés és az anyai hatás nem ugyanazt jelenti. Ez utóbbi kifejezést azon anyai hatású gének öröklődésével kapcsolatban használjuk, melyek a nukleáris genomban kódoltak, és melynek termékei a petesejtbe kerülve a korai embrionális fejlődést irányítják. Az anyai hatású génekre jellemző a mendeli öröklődés, azzal a kiegészítéssel, hogy a fenotípusos hasadás egy generációval megkésik: az anya genotípusa az utódok fenotípusában tükröződik ezekre a sajátságokra nézve. Az anyai öröklődés a csodatölcsér esetén a kloroplaszt gének öröklődésével magyarázható: csak az anya kloroplasztiszai kerülnek a petesejten keresztül a zigótába, a pollenszemcsék nem tartalmaznak kloroplasztot. A levelek fenotípusa attól függ, hogy a zöld színtest keletkezik-e bennük (vad típusú cpdns), vagy sem (mutáns cpdns). A csak vad típusú DNS-sel rendelkező kloroplasztokat tartalmazó sejtek osztódásával zöld szövet keletkezik, a mutációt hordozó cpdns-t tartalmazó sejtek pedig fehér szövetet hoznak létre. Ha egy sejtben mindkét féle cpdns jelen van, akkor is zöld fenotípus alakul ki. Az egy sejten belül különféle organelláris DNS jelenlétét (a kloroplaszt és a mitokondrium vonatkozásában is) heteroplazmia jelenségnek hívják. Milyen utódokat képez egy heteroplazmiás petesejt a fenti példában? Mitotikus sejtosztódás során a sejtorganellumok random jutnak az utódsejtekbe (5.25. ábra). Ennek következménye, hogy az utód fejlődése során létrejöhetnek olyan sejtek, melyek kizárólag mutáns cpdns-t hordoznak, ezen sejtek osztódásával kialakulnak mutáns cpdns-t tartalmazó sejtklónok, azaz fehér színű szektorok a növényben. A csak vad vagy mindkétféle cpdnssel rendelkező sejtek alkotta szövetek zöld szektorként jelennek meg. A variegált fenotípusú növény tehát heteroplazmiás petesejtből alakulhat ki (5.25. és ábra). A sejtek mitotikus osztódása során különváló fenotípusok kialakulását citoplazmás szegregációnak is nevezik ábra - Kloroplaszt gének citoplazmatikus öröklődése ábra - Variegált fenotípusú csodatölcsér növény 91

104 A mendeli genetika kiterjesztése Nem növényi rendszerben hasonló megfigyelést először 1952-ben publikált Mary Mitchell és Herschel Mitchell. Neurospora crassa gombában írták le a poky mutáció anyai öröklődését. A poky (lassan növő) fenotípust egy mtdns-mutáció miatti oxidatív foszforiláció hiba okozta. Meg kell jegyezni, hogy bár az mtdns és a cpdns a legtöbb esetben anyai uniparentális öröklődést mutat, a természetben ismerünk példákat uniparentális apai (csak az apai organelláris DNS kerül az utódba) és biparentális (mindkét szülőből átjut organelláris genom az utódba) citoplazmatikus öröklődésre is. Ezek a mechanizmusok fajonként változók lehetnek. A szakirodalomban a humán mtdns apai öröklődésének ritka eseteivel is találkozhatunk. Egérben kimutatták, hogy az utódokba került apai:anyai mitokondriumok aránya 1 4: A humán mtdns néhány ritka esettől eltekintve anyai öröklődésű. Számos mtdns-mutáció vezet súlyos kórképek kialakulásához. A mutációk a respirációs lánc alulműködését, ezáltal ATP-depléciót okoznak, ami komplex, krónikus degeneratív megbetegedésekhez vezet. A tünetek tipikusan az agy, a szív, az izmok, a vesék, az endokrin szövetek működését érintik. 92

105 6. fejezet - A DNS szerkezete és replikációja Foglaljuk össze, milyen kulcsfunkciókkal kell rendelkeznie a genetikai anyagnak: A többsejtű szervezetek minden sejtjének ugyanazzal az öröklődő információval kell rendelkeznie, tehát a sejtek osztódása során a genetikai anyag hű másolására van szükség. Az élővilág nagy részében az ivarsejtek által kerül átadásra az élőlények genetikai anyaga generációról-generációra, és ezáltal a szülőkhöz hasonló élőlények jönnek létre, tehát a pontos másolás az ivarsejtek kialakulásához is elengedhetetlen. A genetikai anyag információt hordoz. Az információ alapján épülnek fel a sejteket kialakító és működtető molekulák, ami a sejtek által felépített szövet, szervezet felépítését és működését meghatározza. Az öröklődő változások, vagyis a mutációk szolgáltatják az evolúció (biológiai változás) nyersanyagát, tehát a genetikai anyagnak képesnek kell lennie a változékonyságra. (A mutációkkal részletesebben foglalkozunk egy későbbi fejezetben). A tudományos társadalom nagy része sokáig kételkedve fogadta a DNS örökítőanyag mivoltára utaló eredményeket, hiszen a DNS viszonylag egyszerű felépítésű polimer, monotonnak tűnő szerkezettel. Meg kellett érteni, hogy ez az egyszerűnek tűnő molekula hogyan képes betölteni az örökítőanyag szerepét, hogyan lehet alkalmas arra, hogy a Földön élő szervezetek óriási diverzitásának alapját biztosítsa, és hogyan képes a tulajdonságok generációról-generációra történő átadására. A kérdések megválaszolásához a szerkezeti modell lefektetése hozta meg az áttörést. A DNS helyes szerkezeti modelljét James Watson mikrobiális genetikus és Francis Crick fizikus állították fel 1953-ban. A 20. század első felében számos kísérleti eredmény mutatott abba az irányba, hogy az örökítőanyag a DNS, és nem egyéb biomolekula (szénhidrát, fehérje, lipid). A Watson Crick modell számos kutató megelőző eredményeire épült. Felhasználták a DNS kémiai összetételéről, a bázisok arányairól felhalmozódott ismeretanyagot, valamint a DNS-ről készült röntgendiffrakciós felvételek adatait. Mielőtt a DNS szerkezetének tárgyalására térünk, tekintsük át, mit lehetett tudni a génekről és a DNS-ről akkor, amikor Watson és Crick megkezdte történelmi jelentőségű munkáját. A legfontosabb ismereteket az alábbi pontok foglalják össze: A gének a Mendel által leírt öröklődési faktorok specifikus tulajdonságokhoz köthetők, de fizikai természetük ismeretlen. A mutációk megváltozatják a gének funkcióját, de a mutációk molekuláris természete tisztázatlan (lásd a mendeli genetika témakört). Az egy-gén-egy-protein hipotézis szerint a gének határozzák meg a fehérjék szerkezetét (lásd a génkifejeződés témakört). A géneket a kromoszómák hordozzák (lásd a nemhez kötött öröklődés és a kromoszómaelmélet témaköröket). Az es években egy sor kísérlet utalt arra, hogy a DNS a genetikai anyag. Az alábbiakban két ide vonatkozó, nagy jelentőségű kísérletet mutatunk be. 1. A DNS mint genetikai anyag 1.1. A transzformáció felfedezése 1928-ban Frederick GriffithStreptococcus pneumoniae baktériumokon érdekes és tudományos szempontból igen fontos megfigyelést tett. A baktérium emberben tüdőgyulladást okoz, laboratóriumi egereket megfertőzve az állatok pusztulásához vezet. Léteznek kevésbé virulens törzsek is. Griffith egy virulens és egy avirulens törzzsel kísérletezett. Laboratóriumi körülmények között, agaros táptalajon tenyésztve a két törzs az általuk képzett telepek alapján egymástól megkülönböztethető volt: 93

106 A DNS szerkezete és replikációja a virulens törzs sejtjei vastag poliszacharid tokot termeltek, mely sima megjelenést kölcsönzött a sejtek millióiból álló telepeknek (az angol smooth = sima kifejezésből azt a törzset Griffith S törzsnek nevezte). az avirulens törzs sejtjei nem termeltek tokot, a sejtek által képzett telepek kompaktabbak, durva megjelenésűek voltak (az angol rough = durva kifejezésből ez a törzs az R jelet kapta). A forralással elpusztított S-sejtekkel beoltott egerek életben maradtak. Ha azonban a felforralt S-sejteket R- sejtekkel keverte össze, akkor az egerek elpusztultak, és a tetemekből Griffith S-sejteket tudott izolálni, melyek teljesen fertőzőképesnek bizonyultak. Az elölt S-sejtek maradványa tehát valamilyen módon átalakította (transzformálta) az avirulens R-sejteket. Úgy is mondhatjuk, hogy az S-sejtekből származó molekula átadódott az R-sejteknek, felruházva azokat egy új tulajdonsággal, a virulencia képességével, és ez a tulajdonság átörökíthető volt. Leegyszerűsítve: az S-törzs örökítőanyaga, de legalábbis a virulencia génje átjutott az R- törzsbe. Azt a jelenséget, amikor örökítőanyag jut át egyik szervezetből a másikba, általánosságban genetikai transzformációnak nevezzük. Az elölt S-sejtek azon kémiai komponensét kellett megkeresni, amelyik az R-sejtek transzformációját okozta, mivel nyilvánvalónak tűnt, hogy a transzformáló anyag a baktérium örökítőanyaga ben Griffith kísérletének továbbvitelével Oswald Avery, Colin MacLeod és Maclyn McCarty találta meg ezt a komponenst. Kísérleteikben külön-külön szelektíven degradálták a felforralt S-sejtek maradványában az egyes biomolekula típusokat: poliszacharidokat, lipideket, fehérjéket, RNS-t, DNS-t. Az egyes mintákkal aztán tesztelték, hogy megmaradt-e azok transzformáló képessége vagy sem. Csak a DNS-bontó enzimmel (DNázzal) kezelt mintáknak tűnt el a transzformáló sajátsága, és ez azt jelentette, hogy a genetikai információ molekuláris hordozója a DNS. Ma már tudjuk, hogy a virulenciát okozó transzformáló DNS-szakasz beépült az R-sejtek kromoszómájába úgy, hogy közben helyet cserélt a megfelelő, de virulenciát okozni nem képes DNSszakasszal (a DNS-szakaszok kicserélődése rekombináció útján megy végbe) A Hershey Chase kísérlet A bemutatott transzformációs kísérletek erős bízonyítékul szolgáltak a DNS őrőkítőanyag mivoltára vonatkozóan, de sok kutató továbbra is vonakodott az eredményeket elfogadni. Hogyan képes egy ilyen alacsony komplexitású molekula betölteni az örökítőanyag funkcióit? A fehérjék sokkal változatosabbak, és szintén részei a kromoszómáknak, így egyes tudósok továbbra is úgy gondolták, hogy ezek a molekulák felelősek az öröklődő sajátságok kialakításáért ben Alfred Hershey és Martha Chase újabb bizonyítékot szolgáltatott. A legegyszerűbb biológiai rendszerek, a vírusok közül választottak alanyt a kísérleteikhez, s ez az Escherichia coli baktériumot fertőző T2 elnevezésű fág volt. Úgy gondolták, hogy ha meg tudják állapítani, hogy a fág mely molekulafélesége jut be a baktériumsejtekbe a fertőzéskor, akkor ezzel azonosítani tudják a fág genetikai anyagát, hiszen a baktériumba az a molekulatípus kerül be a fágból, amely képes újabb fágrészecskék kialakításának irányítására. A fágok csak kétféle molekulaféleséget tartalmaznak: a feji rész DNS-ből és az azt körülölelő fehérjeburokból áll, a farokstruktúra pedig kizárólag fehérjékből épül fel. DNS-molekulák nyomonkövetésére olyan fágkultúrát hoztak létre, mely radioaktív foszfort tartalmazott. ( 32 P-t tartalmazó tápfolyadékban növesztett fágrészecskék a radioaktív foszfort beépítik a DNS-ükbe, de a fehérjékbe nem, mert azok nem tartalmaznak foszfort.) Egy másik fágkultúrát pedig radioaktív kén ( 35 S) tartalmú tápfolyadékban hoztak létre, megjelölve ezáltal kizárólagosan a fehérjéket, hiszen a DNS nem tartalmaz ként. A kétféleképpen jelölt fágkultúrával megfertőzték az E. coli sejteket: összekeverték a fágokat a baktériumokkal folyadékkultúrában, és néhány perc kitapadási időt követően erős rázásnak vetették alá az elegyet (konyhai turmixgéppel), ami által a baktériumok felszínéhez tapadt, de a sejtekbe be nem jutott fágrészek leváltak, és centrifugálás hatására a felülúszóba kerültek, míg a baktériumsejtek (a beinjektált fág genetikai anyaggal együtt) lesüllyedtek az üledékbe. Ezután az egyes frakciókban vizsgálták a radioaktivitást: a 32 P-jelölt kultúra esetében a radioaktivitás az üledékben (a baktériumsejtekben), a 35 S-jelölt fágoknál pedig a radioktivitás csak a felülúszóban (a baktériumsejteken kívül) volt kimutatható. A konklúzió egyértelmű: a fág örökítőanyaga a DNS; a fehérjék csak csomagoló, szállítóanyagként funkcionálnak, és fertőzéskor nem jutnak be a baktériumokba. 2. A DNS szerkezete 2.1. Mit tudtak a DNS-ről a Watson Crick modell előtt? A DNS építőkövei A Watson Crick modell megszületése előtt már ismeretes volt, hogy a DNS (dezoxiribonukleinsav) háromféle alkotóelemből áll: foszfátcsoportból, cukor (dezoxiribóz) részből és négyféle nitrogéntartalmú heterociklusos 94

107 A DNS szerkezete és replikációja vegyületből vagy bázisból (ezek az adenin, guanin, citozin és timin). A bázisok és a cukor rész C-atomjait arab számokkal jelölik (bázisoknál 1, 2, 3 stb., a cukornál 1, 2, 3 stb.). A dezoxiribóz 2 C-atomjához a ribózzal ellentétben nem kapcsolódik OH csoport. Az adenin és a guanin kettős gyűrűt alkotó purinvázas bázisok, a citozin és a timin pedig egyetlen gyűrűt képező pirimidinvázas vegyületek. Egy foszfátcsoport, egy dezoxiribóz és a négyféle bázis egyike alkot egy nukleotidnak nevezett egységet (6.2. ábra). A nukleotidok kémiai elnevezése: dezoxiadenozin 5 -monofoszfát (damp), dezoxiguanozin 5 -monofoszfát (dgmp), dezoxicitidin 5 - monofoszfát (dcmp), dezoxitimidin 5 -monofoszfát (dtmp). A négyféle nukleotidot az egyes bázisok kezdőbetűivel jelöljük (A, G, C, T). A DNS-t alkotó nukleotidok (bázisok) aránya A DNS-t alkotó nukleotidok aránya meghatározott. Erre a felismerésre Erwin Chargaff jutott az es években, amikor különféle élőlényekből kivont DNS-mintákban meghatározta a négyféle bázis arányát. A purin nukleotidok mennyisége egyenlő a pirimidin nukleotidok mennyiségével: A+G = C+T Az A nukleotidok száma megegyezik a T nukleotidok számával, és a G nukleotidok száma megegyezik a C nukleotidok számával: A=T és G=C A különböző élőlényekben az A+T nem szükségszerűen egyenlő a G+C mennyiséggel, de arányuk egy fajon belül állandó. Ismerünk kifejezetten A+T-gazdag genomokat (például egy tengeri sün faj, Paracentrotus lividus (A+T) / (G+C) = 1,85), illetve G+C-gazdag genomokat is (például Mycobacterium tuberculosis (A+T) / (G+C) = 0,42). Egy genomon belül is váltakozhat a G+C és az A+T tartalom. A G+C-gazdag DNSszakaszok az A+T-gazdag DNS-hez képest stabilabbak. Ez megnyilvánul abban, hogy a kettős hélix hődenaturációja (ún. olvadása) megegyező bp-hosszúság esetén magasabb hőmérsékleten megy végbe G+Cgazdag fragmentumok esetén. A DNS röntgendiffrakciós analízise A DNS röntgendiffrakciós elemzésével Rosalind Franklin és Maurice Wilkins foglalkozott szintén az es években. Az adatok alapján úgy tűnt, hogy a DNS hosszú, vékony, egyenletes átmérőjű molekula, amely a teljes hosszán végigfutó két párhuzamos részből áll. A felvételek a molekula spirális szerkezetére is utaltak. A DNS-ről készült legjobb felvétel Franklin tudta nélkül került Watson és Crick kezébe, és ez kiemelkedő fontosságú volt a DNS háromdimenziós modelljének megalkotásához A DNS szerkezetének Watson Crick modellje Mint láttuk, a DNS összetételéről sok információ gyűlt össze az 1950-es évekre, de az még nem volt világos, hogy miként kapcsolódnak egymáshoz az egyes részek. Watson és Crick a DNS háromdimenziós szerkezetét leíró modelljét 1953-ban, egyoldalas cikk formájában publikálta a Nature című rangos tudományos szaklapban. A modellben merészen összeillesztették a röntgendiffrakciós adatokat, a Chargaff-szabályokat és a DNS alkotórészeiről felhalmozódott kémiai ismereteket oly módon, hogy a modell eleget tegyen az örökítőanyaggal szemben támasztott követelményeknek (pontos másolás, információhordozás, változékonyság). Akkortájt több publikáció is megjelent a DNS szerkezetéről (lásd a Watson-Crick cikkben és a cikk hivatkozásai között), de kémiai és/vagy biológiai okokból egyik sem volt helytálló ábra - Watson és Crick a fizikai modell építése közben 95

108 A DNS szerkezete és replikációja Az alábbiakban áttekintjük a DNS szerkezetére vonatkozó mai ismereteket: A DNS elsődleges szerkezete: foszfodiészter kötés A nukleotid egységek 3-5 -foszfodiészter-kötéssel összekapcsolódva alkotják a polinukleotid láncokat Két polinukleotid lánc fut egymással párhuzamosan, de ellentétes (antiparallel) irányultságban. A szálak polaritását a cukor 5 és 3 C-atomjaihoz viszonyítjuk: a szálvégi nukleotidok egyike szabad foszfátcsoportot tartalmaz a cukor 5 C-atomjához kapcsoltan (ezt nevezzük a lánc 5 végének); a szál másik végén lévő nukleotid cukor egységén a 3 C-atomon szabad OH-csoport van (ezt tekintjük a lánc 3 végének). Minden polinukleotid szál egyik végén tehát 5 foszfát-csoport, másik végén pedig 3 hidroxil-csoport található. Az antiparallelitást a két párhuzamos szál ellentétes 5 3 irányú lefutása adja (6.2. ábra). A két szál között a bázisok teremtenek kapcsolatot H-kötések révén. A hidrofil cukor és a foszfát-csoportok a molekula külső felületén helyezkednek el. A szemközti bázisokat bázispároknak (rövidítése: bp; 1000 bp = 1 kbp, azaz kilo-bázispár) nevezzük. Minden bázispár egy purint és egy pirimidint tartalmaz, így biztosított a DNS-molekula egyenletes átmérője (2 nm). A bázisok közül az adenin timinnel, a citozin pedig guaninnal alkot párt (ez megfelel a Chargaff-szabálynak). A párokat kialakító bázisokat egymást kiegészítő vagy komplementer bázisoknak nevezzük. Az A-T párt 2, a G- C párt 3 hidrogénhíd stabilizálja. Ezektől eltérő bázispárok csak igen ritkán alakulhatnak ki (lásd a replikációról és a mutációkról szóló fejezeteket). 96

109 A DNS szerkezete és replikációja A DNS-szálak egyediségét az adott szakaszon egymást követő bázisok milyensége adja. Egy DNS-szakaszt tehát a bázisok sorrendje (szekvenciája) azonosít. A szálak szekvenciáját megegyezés szerint 5 3 irányban írjuk fel. A 6.2. ábra példáján az egyik szál szekvenciája (bázissorendje) 5 - ATCG -3, a másik, komplementer szálé pedig 5 - CGAT-3. A szakirodalomban (cikkekben, adatbázisokban stb.) egy DNSszakasz szekvenciájának megadásakor elegendő csak az egyik (bármelyik) szál bázissorendjét felírni, de ezt mindig következetesen balról 5 jobbra 3 irányban teszik (a legtöbbször a polaritást külön nem is jelölik, mert a balról-jobbra olvasási irány ezt is megadja). Az egyik szál 5 3 irányú bázissorendjének fordított irányú (reverz) komplementere adja a másik szál 5 3 irányú olvasatát ábra - A DNS elsődleges (jobbra) és másodlagos (balra) szerkezete A DNS másodlagos szerkezete: kettős spirál A két párhuzamosan futó DNS-szál egy közös tengely mentén spirálszerűen csavarodik, s ezt kettős spirál (double helix) szerkezetnek nevezzük. A kettős hélixet szalag, létra vagy térkitöltő formában szokták ábrázolni (6.2. és 6.3. ábrák). A szalag és a létra ábrázolási formában a szalagok a két antiparallel lánc cukorfoszfát gerincét, a pálcák vagy sokszögek pedig a bázisokat képviselik. A bázispárok létrafokként helyezkednek el a szerkezet belsejében. A cukorgyűrű síkja majdnem merőleges a bázisok síkjára. A víztaszító bázisok szoros egymásra fekvése a víz kiszorítása által erősen stabilizálja a szerkezetet (két bázispár közötti távolság 0,34 nm). A hidrofil cukor foszfát gerinc kölcsönhatásban áll a sejt vízmolekuláival. A spirál 10 bázisonként fordul csaknem pontosan 360o-ot, egy csavarulat hossza 3,4 nm. A háromdimenziós szerkezet jól szemlélteti az ellentétes oldalakon futó kis és a nagy árkot. A DNS-kötő fehérjék ezeknél az árkoknál kapcsolódnak a bázisokhoz. A DNS többféle másodlagos szerkezetet vehet fel (6.3. ábra). Az élőlényekben és vizes oldatban a B forma a leggyakoribb, melyre jobb menetes csavarulat jellemző, a bázisok síkja majdnem merőleges a cukor foszfát gerincre. Dehidrált körülmények között egy tömörebb A forma jön létre, melyben a bázisok síkja megdől. Hosszú ismétlődések (például GCGCGC...) a Z formát vehetik fel, amely balmenetes, zegzugos lefutású és megnyúlt. 97

110 A DNS szerkezete és replikációja 6.3. ábra - A DNS térkitöltő modellje 3. A DNS szintézise A DNS szintézise (replikáció) rendkívül gyors és pontos folyamat. Egyetlen ember egyedfejlődése több millió sejtosztódást igényel, és minden sejtosztódást megelőzi a teljes genom megkettőződése (a sejtciklus S szintézis fázisában). A replikáció sebessége 1000 nukleotid/másodperc. A genom másolásánál csupán 1/ (10-8 ) replikációs hiba történik, melynek 99%-át a javító rendszerek (repair mechanizmusok) utólagosan kijavítják. Az átlagos mutációs ráta a replikáció végeztével 10-10, vagyis a 10 9 bp genomméretű emberi sejt egy osztódása során 0 1 új mutáció keletkezik a replikáció hibája folytán A DNS replikáció jóslata A DNS kettős spirál szerkezetéből közvetlenül adódik a megkettőződés mikéntje, amire Watson és Crick már a modell publikálásakor utalt: "It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material." (Nem kerülte el a figyelmünket az, hogy az általunk lefektetett specifikus bázispárosodásból közvetlenül adódik a genetikai anyag másolásának lehetséges mechanizmusa.) A bázispárosodás szigorú törvényéből az következik, hogy ha a kettős spirál két szála cipzárként kettéválik, 98

111 A DNS szerkezete és replikációja mindkét szál mintaként (templátként) szolgálhat egy új szál szintéziséhez, aminek során az eredetivel és egymással megegyező molekulaszerkezetek jönnek létre. Ezzel magyarázatot nyer az örökítőanyag pontos átadódása a sejtosztódások során. A genetikai kódot a nukleotid sorrend adhatja A szemikonzervatív replikáció bizonyítása A DNS másolása szemikonzervatív (félig konzervatív) módon történik. Ez azt jelenti, hogy a kettős szálú molekula másolásakor az egyik és a másik régi (szülői) szál mellé is szintetizálódik egy-egy új szál, így a létrejövő két kópia egyik szála régi, a másik pedig új lesz. Ezt Matthew Meselson és Franklin Stahl igazolta 1958-ban baktériumok örökítőanyagán. A céziumklorid (CsCl) sűrűséggradiens ultracentrifugálás során a DNS a fajsúlyának megfelelő sávban gyűlik össze. Ezt a jelenséget használták ki kísérleteikben. A több generáción keresztül 15 N táptalajon tartott baktériumokból származó DNS nehéz sávot, a normál ( 14 N) táptalajon nevelt baktériumok DNS-e pedig könnyű sávot ad céziumklorid-gradiens centrifugálással. Ha a 15 N-en tartott sejteket átteszik könnyű táptalajra, az első nemzedékben köztes, a másodikban könnyű és köztes sáv figyelhető meg a gradiensben (6.4. ábra). A Meselson Stahl kísérletben kapott eredmények csak szemikonzervatív DNSreplikációval értelmezhetők (6.4. ábra) ábra - A szemikonzervatív replikáció bizonyítása baktériumban A DNS-replikáció magasabbrendűekben is szemikonzervatív 1958-ban Herbert Taylor bab gyökércsúcs sejteken bizonyította, hogy a DNS replikációja a baktériumok DNS-éhez hasonlóan szemikonzervatív módon zajlik. Egy sejtgeneráció hosszan triciált ( 3 H timidint tartalmazó) tápoldatban tartott sejtjei a radioaktív nukleotidot beépítik az új DNS-szálba, amit a kromoszómák autoradiogramja jelez. Emlékezzünk vissza, hogy minden kromatida egy DNS kettős hélixnek felel meg. Egy szintézisfázist követően minden kromatida jelölődik, mert minden DNS-molekula hibrid a radioaktivitás 99

112 A DNS szerkezete és replikációja tekintetében. Ezután nem-radioaktív timidint tartalmazó tápoldatba áttéve a sejteket, egy újabb replikáció után az autoradiogramon csak az egyik testvér-kromatida jelölődik (a kiindulási DNS hibrid volt, a jelölt szülői szál és a nem jelölt szülői szál mellé is egy-egy jelöletlen szál szintetizálódik) Replikációs villa E.coli sejtek táptalajához 3 H timidint adva a DNS-be beépült radioaktivitás a hibrid szálak autoradiogramján kimutatható. A sejtekből szelíd feltárással John Cairns ki tudta nyerni a baktérium cirkuláris DNS-ét, mely radioaktív jelet adott (6.5.a ábra). A következő replikációs ciklus során a képződő egyik dupla hélix most szintetizálódó szála lesz csak jelölt, míg a másik dupla hélix ( a kör belsejében ) mindkét szála jelölt lesz. A jelölésbeli különbséget az autoradiogramon a jel intenzitása tükrözte (6.5.b ábra). A felvételen látott szerkezet a görög théta (θ) betűre emlékeztet, ezért a szaknyelvben a bakteriális cirkuláris DNS replikációja théta-replikáció kifejezéssel él a mai napig. A szülői kettős spirál szétnyílásával két a szintézis során egymástól távolodó replikációs villa jön létre (6.5.b ábra) ábra - E. coli cirkuláris kromoszóma θ replikációja 3.4. A DNS-polimerázok Az első DNS-polimeráz enzimet 1959-ben izolálta Arthur KornbergE. coli baktériumból. Az enzim polimeráz aktivitását in vitro igazolta. Az enzim szubsztrátjai a dezoxiribonukleotidok trifoszfát formái (dntp-k: datp, dgtp, dctp és dttp). A DNS-polimeráz az egyes szálú DNS-templátra (minta) azt kiegészítő (komplementer) szálat szintetizál a rendelkezésre álló nukleotid trifoszfátokból. A Kornberg által izolált enzim volt az első, ezért 100

113 A DNS szerkezete és replikációja ezt DNS-polimeráz I-nek (pol I, Kornberg-enzim) nevezzük. Az E. coli pol I akárcsak a többi eddig ismert DNS polimeráz polimeráz aktivitása 5 3 irányú szálnövekedést katalizál. Az új szál tehát mindig az 5 vég felől a 3 vég irányába növekszik: az újonnan beépülő nukleotid a szál előző nukleotid cukor egységének 3 - OH csoportjához kapcsolódik észterkötéssel, pirofoszfát felszabadulás közben (6.6. ábra). Később (1969, John Cairns és Paula DeLucia) igazolták, hogy a pol I génben hibás baktériumok normálisan növekednek, tehát nem a pol I a baktérium DNS-szintézisének fő katalizálója. Erre utaltak további adatok is: a pol I túl lassú (körülbelül 20 nt/perc), túl abundáns a sejtekben (400 molekula/sejt), túl gyakran disszociál a DNS-ről (20 50 nukleotid beépítése után leválik). Mai ismereteink szerint az E. coli-ban öt DNS-polimeráz működik, és a replikációs villákban a pol III a fő polimeráz ábra - A DNS-szál szintézise 5 3 irányban történik 101

114 A DNS szerkezete és replikációja 3.5. A replikációs kezdőpont (origó) A replikációnak kitüntetett kezdőpontja (origója) van. Az E. coli cirkuláris kromoszómájának egyetlen replikációs origója, az oric 245 nukleotidpár hosszú, meghatározott szekvencia részletekkel. Innen indul a cirkuláris kromoszóma replikációja két ellentétes irányba, amíg a villák össze nem érnek. Az oric egyik szakaszán 13 bp hosszú speciális szekvenciarész többször ismétlődik (ún. DnaA box). Ehhez a részhez kötődnek a DnaA fehérjék, és ezzel elkezdődik a replikációs gépezet, az ún. repliszóma összeépülése. A DnaA-kötődés hatására az oric másik, A+T-gazdag szakaszán a kettős hélix szálai szétválnak. A szétvált szálakhoz további 102

115 A DNS szerkezete és replikációja DnaA fehérjék kötődnek, majd helikázaktivitással rendelkező DnaB fehérjék folytatják a szálak szétválasztását a kialakuló replikációs villákban. Fehérje fehérje kölcsönhatással bekötődik a replikációhoz szükséges többi fehérje: a primáz (lásd később) és a pol III. A replikációs gépezetnek nem része a DnaA fehérje, funkciója a replikáció kezdőpontjának kijelölése és a repliszóma összeszerelődésének segítése. A baktériumok replikációs osztódási ciklusa általában 60 percnél kevesebb (az E. coli esetén perc). Az eukarióta kromoszóma sok replikációs origót tartalmaz Az eukarióta sejtek sejtcilusa 1 2 órától (élesztő: 1,4 óra) több óráig tarthat (állati eredetű laboratóriumi sejttenyészeteknél 24 óra körüli). A szintézisfázisban nemcsak a DNS, hanem a kromatin teljes szerkezetének meg kell duplázódnia. Az eukarióta kromoszómák a replikációs hatékonyság növelése végett több replikációs origót tartalmaznak (néhány százat vagy néhány ezret), és ennek megfelelően több replikonból állnak. Replikonnak az egy origóból kiinduló replikációs egységet nevezzük. A replikonok a replikáció végére összeolvadnak (6.7. ábra) ábra - Az eukarióta kromoszómák replikációja több origóból indul balra: sematikus ábrázolás, jobbra: elektronmikroszkópos felvétel 3.6. Szemidiszkontinuus replikáció A replikáció az origótól mindkét irányban halad. Autoradiográfiás (3H-timidin pulzusjelöléses) kísérletekkel kimutatták, hogy a legtöbb eukarióta és prokarióta DNS replikációja kétirányú. Az origótól két irányba haladó DNS-replikáció két replikációs villát és négy újonnan szintetizálódó szálat jelent. Mivel a szálak szintézise csak egyik irányba (5 3 ) haladhat (lásd fent), minden egyes replikációs villában az egyik új szál a replikációs villa irányában folyamatosan növekszik ezt az új szálat vezető szálnak (leading strand) nevezzük, a másik új szál pedig csakis szakaszosan, a replikációs villával ellentétes irányban polimerizálódhat ez az új szál a lemaradó, vagy követő szál (lagging strand) (6.8. ábra). A követő szál kezdetben különálló (később összekapcsolódó, lásd alább) darabjait leírójuk után Okazaki-fragmentumoknak nevezzük. Az Okazakifragmentumok hossza nts (nukleotidok, nucleotids) ábra - A replikációs villában az egyik szál szintézise folyamatos, a másik szálé szakaszos 103

116 A DNS szerkezete és replikációja 3.7. A replikáció további enzimei A DNS-polimerázok a szálszintézist elkezdeni nem tudják, csak folytatni. A kezdéshez egy rövid kezdő (primer) szakaszra van szükségük. A primer körülbelül 8 12 nts hosszú RNS-szakasz, melyet a primáznak nevezett RNS-polimeráz szintetizál (6.9. ábra). Minden DNS-szál tehát egy rövid RNS-szakasszal indul (az 5 vég felől). A vezető szál szintéziséhez egyetlen kezdő primerre van szükség, a követő szál esetén pedig minden Okazaki-fragmentum egy-egy RNS-primerrel kezdődik. A primáz enzim a repliszómával együtt egy nagyobb fehérjekomplex, a primoszóma részeként halad előre a replikációs villában (6.10. ábra). A DNS-polimeráz III az RNS-primer folytatásaként szintetizálja a DNS-t addig, amíg a templát rendelkezésre áll, illetve az Okazakifragmentumok esetén addig, amíg az előző primert el nem éri. Az Okazaki-fragmentumokat indító RNSprimereket a DNS-polimeráz I távolítja el 5 3 exonukleáz-aktivitása révén, és helyére DNS-t szintetizál 5 3 polimeráz-aktivitásának köszönhetően. A követő szál DNS-szakaszait végül a ligáz enzim kapcsolja össze: ATP felhasználásával hozza létre a hiányzó észterkötést az egyik fragmentum 5 foszfát és a másik fragmentum 3 OH csoportjai között ábra - Primáz, primer, ligáz szerepe a replikációban 104

117 A DNS szerkezete és replikációja A kettős hélix széttekerését a helikázok végzik a hidrogénhidak bontásával. Amint a replikációs villában szétválnak a szülői szálak, a villa túloldalán lévő DNS-szakasz pozitív irányban túltekeredik. A topoizomeráz oldja fel a feszültséget oly módon, hogy az egyik szálat elvágja, azt a másik szál körül kipörgeti, majd a szálat folytonossá teszi. A replikációnál működő DNS-topoizomeráz neve giráz. A széttekert templát-szálak visszacsavarodását a hozzájuk kötődő ún. SSB fehérjék (egyes szálat kötő, single strand binding) akadályozzák meg (6.10. ábra) ábra - A replikáció áttekintése 105

118 A DNS szerkezete és replikációja 3.8. A két új szál szintézisét egyetlen pol III dimer végzi Az elmaradó szál templátjának kihurkolódása lehetővé teszi, hogy a replikációs villához kapcsolódó pol III mindkét utódszálat a villa irányában szintetizálhassa (6.11. ábra). A pol III így két leolvasófejjel rendelkező dimerként működik. A hurokban a templát szál időnként ahogy a villában a szálak válnak szét továbbcsúszik. Ez a mechanizmus gyorsítja a folyamatot, mivel a követő szál szintéziséhez sem szükséges a polimeráz leválása, majd újbóli bekapcsolódása (ez lényegesen lelassítaná a szintézist) ábra - A két új szál szintézise egyetlen pol III dimer által, az elmaradó szál templátjának kihurkolódásával valósul meg 106

119 A DNS szerkezete és replikációja 3.9. A replikáció pontossága. Proof-reading repair. A szintézis során nukleotidonként történik egy hibás beépülés. Ez igen magas mutációs rátát eredményezne. A pol III és a pol I enzim is rendelkezik saját hibajavító rendszerrel, és a hibás beépülések 99%- át azonnal kijavítják, így csak 10 8 nukleotidonként marad egy hiba. A pol III ε (epszilon) alegysége végzi annak ellenőrzését, hogy nem történt-e hiba a szintézis során. A hibásan beépített nukleotidokat az alegység azonnal kivágja, majd folytatja a szintézist (6.12. ábra). A kivágás visszalépést jelent, ezért annak iránya 3 5, és nukleotid-eltávolítást, azaz exonukleáz aktivitást igényel. A DNS-polimerázok saját hibajavítását proofreading repair-nek ( visszaolvasó javításnak) nevezzük. A primáz nem rendelkezik ezzel a hibajavító képességgel, és ezért az RNS-primerekben nagyobb eséllyel fordul elő hiba. A replikáció hűségét (fidelitás, fidelity) azonban ez nem befolyásolja, hiszen a primerek a replikáció végére lebomlanak. A replikáció utáni javítórendszerek a megmaradt hiba 99%-át kijavítják. Így adódik a végső pontosság, ami nukleotidonként egy hiba. Ez az emberi genom esetén átlagosan egyetlen hibát jelent egy replikáció során ábra - A replikáció alatt azonnali hibajavítás működik (proof-reading repair) Vírus genomok gördülő gyűrű replikációja Egy különleges replikációs mechanizmus a gördülő gyűrű (rolling circle) replikáció, ami főleg cirkularizált vírusgenomokra jellemző. A cirkuláris DNS egyik szála pontszerűen bevágódik (keletkezik egy rés, nick). A polimeráz az ép szálat templátként használva a törött szál 3 végéhez új nukleotidokat épít körbe-körbe, miközben leszorítja az előtte lévő régi szálat. A leszoruló egyes szál kettős szállá egészül ki. A lineáris kettős szálú molekula az eredeti cirkuláris DNS-nek megfelelő szakaszokat egymás után többszörösen tartalmazza. Ezt a hosszú, az eredeti DNS sok kópiáját tartalmazó molekulát konkatemernek nevezzük. A konkatemer végül egységnyi méretűre darabolódik, és az egységek gyűrűkké zárulnak Telomerek. Telomeráz. Cirkuláris DNS esetén nem, de a lineáris DNS-molekulák replikációjánál találkozhatunk az ún. végreplikációs problémával. Minden újonnan szintetizálódott szál 5 végén marad egy RNS-primer (6.13. ábra) ábra - Lineáris DNS-molekulák végreplikációs problémája 107

120 A DNS szerkezete és replikációja Nem ismert, hogy kizárólag a primerek eltávolítása miatt történik-e így, de tény, hogy a legtöbb eukarióta sejtféleségben minden DNS-replikáció során bp szakasz elvész a DNS-molekulák végeiből (tehát minden kromatida két végéből), azaz fogy a DNS. Az orvosi Nobel-díjat 2009-benhárom olyan kutatónak (Elizabeth H. Blackburn, Carol W. Greider és Jack W. Szostak) ítélték oda, aki e problémakörben jelentős felfedezéseket tett. A legfontosabb ide vonatkozó ismereteket az alábbiakban foglaljuk össze. A kromoszómák végeit a telomerek védik. A telomerek fenntartását a telomeráz enzim végzi. A telomer kifejezés a görög telosz (vég) és merosz (rész) szavakból keletkezett. A telomerek feladata kettős: a szabad DNS-vég védelme a lebomlástól, valamint a replikációs rövidülés megakadályozása. A telomerekkel kapcsolatos első eredmények a Tetrahymena thermophila egysejtű protozoa és élesztőgomba sejteken születtek. Azt találták, hogy a Tetrahymena kromoszómavégi DNS-szakasza (azaz telomere) megakadályozza a mesterséges kromoszómák lebomlását élesztő sejtekben. A telomer szakaszt több szervezetben szekvencia szinten ismerjük. Ezek olyan kromoszómavégi DNS-részek, melyekben egy rövid szekvencia ismétlődik sokszorosan. Emberben -TTAGGG- szekvencia ismétlődik körülbelül 2500-szor (az ismétlések száma sejt-, illetve szövetfüggő). A telomer szakaszon a DNS visszahurkolódik, a hurokszerkezetet telomer kötő fehérjék stabilizálják. Egy átlagos testi sejtben a telomer minden sejtosztódás során rövidül. Kivételt képeznek az ivarsejtek, az őssejtek, és a rákos sejtek többsége. Ha a telomer szakasz túl rövid, akkor a telomerkötő fehérjék nem tudnak hozzákapcsolódni, a visszahajlás (loop) nem tud kialakulni, a kromoszómák végei ragadóssá válnak, és mindez kromoszóma-átrendeződésekhez vezet. Végül leáll a sejtosztódás, és beindul a programozott sejthalál mechanizmus, az apoptózis. Mindebből az következik, hogy a telomervesztésnek ha az nem kerül pótlásra köszönhetően a sejtek meghatározott számú (50 60) osztódás után elpusztulnak. Igazolt, hogy az ember testi 108

121 A DNS szerkezete és replikációja sejtjeiben a telomer a kor előrehaladtával rövidül. Mai tudásunk szerint ezt a mechanizmust a biológiai óránk egyik mozgatórugójának tekinthetjük. Azt is kimutatták, hogy oxidatív stressz hatására a telomervesztés ötszöröse lehet a normálisnak. Mint említettük, bizonyos sejttípusok (ivarsejtek, őssejtek) képesek a telomer szakaszaik megújítására. Ennek szükségessége érthető is. A telomerek hosszúságát a telomeráz enzim tartja fenn. A telomeráz egy ribonukleoprotein. A humán telomeráz felépülése (6.14. ábra): Katalitikus alegység (htert, humán telomeráz reverz transzkriptáz): ez a fehérje egység, mely az RNS részt saját templátként használva DNS-t szintetizál, vagyis reverz transzkripciót végez. A testi sejtekben a htert fehérje génje transzkripcionálisan represszált állapotban van (róla mrns és fehérje nem keletkezik). RNS-alegység (hterc, humán telomeráz RNS komponens): ez az RNS-molekula a telomer ismétlések szintézisének a templátja. Másodlagos szerkezetét fajok közti erős konzerváltság jellemzi ábra - A telomer szerkezete, és újjáépülése a telomeráz komplex által A rákos sejtek korlátlan számú osztódásra képesek, halhatatlanok. A kutatásokban használt sejtvonalak jelentős része éppen ezért rákos szövetből származik. (Például a HeLa egy méhnyakrák sejtvonal, melyet ben izolálták egy bizonyos Henrietta Lacks nevű páciensből, s azóta világszerte fenntartanak kutatási célokra.) A rákos sejtek zömére jellemző a telomeráz enzimaktivitás. Az orvoslásban felvetődött a telomeráz-gátlás daganatterápiás alkalmazásának lehetősége. Ez olyan szempontból szelektív, hogy a normális szövetekben telomerázaktivitás alig van, de az őssejtekre gyakorolt hatásuk elbizonytalanító. A kutatók feltételeznek egy ún. ALT-mechanizmust (a telomerek hosszabbításának alternatív útja), mivel a rákos sejtek egy része fenn tudja tartani a telomerei hosszúságát, miközben telomeráz enzimaktivitást nem mutatnak. Áttérve erre az útvonalra, a daganatsejtek rezisztensekké válhatnak a telomeráz gátlószerekkel szemben. 109

122 A DNS szerkezete és replikációja A telomereknek fontos szerepük van néhány örökletes betegség kialakulásában is. A Werner-szindróma egy korai öregedést mutató kórkép, mely autoszómális recesszív módon öröklődik. A betegek WRN génjének mindkét kópiája mutáns. Ez a gén egy helikázaktivitású fehérjét kódol, melynek szerepe lehet a telomerstruktúra létrehozásában. A betegek sejtjeire fokozott telomer vesztés jellemző ábra - Kromoszóma a fodrásznál 110

123 7. fejezet - A génkifejeződés molekuláris alapjai Azokat a lépéseket, melyeken keresztül a génekről a fenotípust befolyásoló molekulák (fehérjék és funkcionális RNS-ek) képződnek, génkifejeződésnek (génexpresszió) nevezzük. Az 1990-es évek közepétől kezdődően meghatározták egy sor élőlény teljes genomjának DNS-szekvenciáját. Ezek az eredmények óriási előrelépést jelentenek, hiszen a szekvenciaadatokból a korábban felhalmozódott ismeretek alapján rengeteg információ kiolvasható. Lehetővé válik a gének számának és milyenségének előrejelzése, sőt a gének kifejeződésének szabályozására utaló információk kiolvasása is. Az információk értelmezését a DNS-ben kódolt jelrendszer teszi lehetővé. Ezekről a jelekről a továbbiakban folyamatosan tárgyalunk. A teljes genomok szekvenciájának analízise informatikai eszközökkel lehetséges. Az elsőként megismert teljes genomszekvenciák nem hoztak meglepetést a gének számának tekintetében: az Escherichia coli baktérium kb génnel, a Saccharomyces cerevisiae egysejtű eukarióta élesztő kb génnel, a többsejtű muslica (Drosophila melanogaster) kb génnel rendelkezik. A növekvő komplexitás tehát a gének számának növekedésével jár. Ennek alapján a kutatók korábban úgy becsülték, hogy az ember kb génnel rendelkezik. A humán genom felderítése előtti években az érdekelt kutatók fogadást kötöttek egymással a humán gének számára vonatkozóan. A tippek között mozogtak tavaszára jutott el a humán genom analízise abba a stádiumba, hogy a gének számát jó közelítéssel meg tudták állapítani. Igen meglepő eredmény született: a fehérjekódoló génjeink száma mindössze körüli. A fogadásban a legkisebb számra (25947) tippelő kutató nyert. Hogyan lehetséges, hogy a fejlett aggyal, kifinomult immunrendszerrel rendelkező Homo sapiens csak kétszer annyi génnel rendelkezik, mint egy fonalféreg, és nagyjából ugyanannyi génje van, mint a növényi modellszervezet Arabidopsis thaliana-nak? A válasz az alternatív splicing mechanizmus létében keresendő (erről később szólunk részletesen), melynek köszönhetően a gén nél több fajta proteint kódol. 1. RNS intermedier létére utaló korai kísérletek 1957-ben Elliot Volkin és Lawrence Astrachan kutatók igen jelentős megfigyelést tettek. Azt a meglepőnek tűnő jelenséget találták, hogy az Escherichia coli baktérium T2 fággal történő fertőzését követően jelentős mennyiségű RNS szintetizálódik a baktériumban. Ez a gyors fág-indukálta RNS-szintézis hamar, perceken belül lecseng. Az RNS-molekulák gyors megjelenése, majd eltűnése arra utalt, hogy a képződő RNS-eknek szerepük lehet a T2 fággenom kifejeződésében, szükségesek lehetnek ahhoz, hogy az új fágrészecskéket felépítő fehérjék szintetizálódjanak. Eukarióta sejteknél a DNS a sejtmagban található, míg a fehérjeszintézis a citoplazmában történik. Az RNS közvetítő szerepét a DNS és fehérjék közötti információ átvitelben ún. pulse-chase (impulzus és üldözés) kísérlettel vizsgálták. A sejtekhez rövid időre (impulzusszerűen) radioaktívan jelölt uracilt adtak (az uracil az RNS egyik alkotóeleme), majd a médiumot lecserélték nem jelölt uracil tartalmúra. A médiumcsere előtt a sejtek a sejtmagban tartalmazták a jelölt RNS-eket, a médiumcserét követően pedig a radioaktivitás a citoplazmában volt kimutatható. A kísérlet azt mutatta, hogy eukarióta sejtekben az RNS a sejtmagban szintetizálódik, majd kijut a citoplazmába, a fehérjeszintézis helyszínére. A kísérlet alapján az RNS-molekula alkalmas jelöltnek tűnt arra, hogy információt továbbítson a DNS és a fehérjék között. 2. Az RNS-molekulák sajátságai A DNS és az RNS is nukleinsavak, felépítésük, tulajdonságaik sok közös vonást mutat, azonban fontos különbségek is vannak közöttük: Az RNS általában egyszálú nukleotidlánc (nem kettős hélix szerkezetű, mint a DNS). Egy RNS-molekulán belüli bizonyos szakaszok bázispárosodással egymáshoz közel hozhatják a molekula adott szakaszait (intramolekuláris bázispárosodás), így az egyes RNS-molekulák igen változatos háromdimenziós szerkezeteket képeznek. Az RNS-t felépítő nukleotidok cukor része ribóz (nem dezoxiribóz, mint a DNS-ben). A cukormolekula 2 szénatomján hidroxilcsoport (-OH) található a ribóz esetében. Később látni fogjuk, hogy ez a hidroxilcsoport 111

124 A génkifejeződés molekuláris alapjai kitüntetett szerepet játszik több fontos folyamatban. Az RNS cukorfoszfát gerince a DNS-hez hasonlóan 5 3 polaritást kölcsönöz a nukleotidláncnak. Az RNS-t felépítő nukleotidok (ribonukleotidok) adenin, guanin, citozin és uracil (timin nukleotid helyett) bázisokat tartalmaznak. Az uracil a timinhez hasonlóan adeninnel képez bázispárt. Ismerünk olyan RNS-molekulákat, melyek a fehérjékhez hasonlóan, de a DNS-sel ellentétben katalizálni képesek biokémiai reakciókat. A ribozimek katalitikus sajátsággal rendelkező RNS-ek. (Nevük az RNSenzim összeolvadásából alakult ki.) 3. RNS-típusok mrns (messenger, információs RNS): A gének többségéről képződő RNS-transzkriptum köztes, információszállító termék, amely szükséges a gén által kódolt fehérjetermék szintéziséhez. Funkcionális RNS-ek: Ezek az RNS-típusok nem szolgálnak alapul fehérjék szintéziséhez, hanem önmagukban végeznek egy bizonyos funkciót trns (transzfer, szállító RNS): Aminosavat szállítanak a fehérjeszintézishez. rrns (riboszómális RNS): A riboszómák felépítésében és működésében vesznek részt. A riboszómák RNSből és fehérjéből felépülő makromolekuláris gépezetek, melyek az aminosavláncok szintézisét végzik. A t-rns-t és az rrns-t kódoló gének száma egy adott genomban kevés (néhány tucat). A sejtben lévő RNS-ek között az rrns-ek vannak fölényes mennyiségben jelen. Ez az r-rns-ek nagy stabilitásának köszönhető, valamint annak, hogy folyamatosan sok kópiában íródnak át a génjeikről. snrns (small nuclear, kis nukleáris RNS): Csak az eukariótákra jellemző csoport. Az elsődlegesen képződött RNS-transzkriptum érésében vesznek részt. Egy részük fehérjékkel komplexet alkotva alakítja ki a spliceoszómát (lásd a fejezet későbbi részében), mely az intronok eltávolítását végzi. A következő két csoport szintén az eukarióta szervezetekre jellemző RNS-féleségeket tartalmaz. Az eukarióta genomok jelentős része íródik át olyan funkcionális RNS-sé, melyek a gének kifejeződésének szabályozásában vesznek részt különböző szinteken. Ezek közül a legismertebbek: mirns (micro RNS): Nemrégiben fedezték fel ezt az RNS-típust, és egyre több gén esetén igazolják, hogy ezek nagyon sok gén expressziójának szabályozásában vesznek részt. A képződött fehérjetermék mennyiségét különféle szinteken befolyásolhatják. sirns (small interfering, kis interferáló RNS): A növényi és állati genomok integritásának megőrzésében fontosak. Gátolják a vírusrészecskék képződését, megelőzik a mozgó genetikai elemek genomon belüli áthelyeződését. 4. RNS-szintézis Az RNS-szintézis (transzkripció, átírás) báziskomplementaritás szerint DNS-mintáról (templát) történik. A szintézist RNS-polimeráz végzi. Az enzim a DNS kettős spirálhoz kapcsolódik az átírandó gén elején, és miközben halad előre, építi a ribonukleotid-láncot a DNS-templát alapján, rntp-k (ribonukleotid-trifoszfátok) felhasználásával. Az RNS-szintézis a DNS-szintézishez hasonlóan 5 3 irányban történik, azaz az újabb rntp a készülő RNS-lánc előző nukleotidján a ribóz egység 3 OH csoportjához kapcsolódik észterkötéssel. Egy RNS-molekula szintéziséhez mindig csak a DNS kettős hélix egyik lánca szolgál templátként. A másik szál az RNS-szintézis tekintetében a nem-templát szál, melynek nukelotidsorrendjével és polaritásával a képződő RNS nukleotid sorrendje és polaritása megegyezik, vagyis az RNS a nem-templát szál másolata (kivéve, hogy az RNS-ben timin helyett uracil található). Ez a nem-templát szál a kódoló szál, mivel a benne rejlő nukleotidsorrend adja a funkcionális RNS-ek és a fehérjék szerkezetére vonatkozó információt, a kódot. Ha egy nagyobb kromoszómaszakaszt tekintünk, több génnel (kódoló szekvenciával), akkor az egyes gének esetén a DNS kettős hélix egyik vagy másik szála lehet a kódoló szál, tehát bizonyos gének esetében az egyik, míg más gének esetében a másik DNS-szál szolgál genetikai kódként (7.1 ábra). Kompakt genomoknál, amelyekben a génsűrűség nagy, előfordulhat, hogy a DNS kettős spirál egy adott szakaszán mindkét szál kódoló. Ebben az esetben az egyik és a másik szálról is képződik RNS-másolat, tehát egy DNS-szakaszon két gén is elhelyezkedhet (gén a génben, Gén 3 és Gén 4 a 7.1. ábrán). Ez két teljesen különböző RNS-nukleotidsorrendet 112

125 A génkifejeződés molekuláris alapjai eredményez (7.2. ábra). A két kódoló szakasz átfedése sokszor csak részleges. Az RNS-szálat akárcsak a DNS-t balról jobbra 5 3 irányban írjuk fel. Később látni fogjuk, hogy ennek a polaritásnak az RNS-érése és későbbi élete során is jelentősége van (például mrns-eknél a fehérjeszintézis irányának meghatározásában) ábra - A DNS mindkét szála szolgálhat genetikai kódként 7.2. ábra - Egy szakaszon a DNS egyik és másik szála eltérő kódot jelent, eltérő RNSszekvenciát határoz meg 4.1. A transzkripció lépései Egy átírásra kerülő DNS-szakasz egy jóval nagyobb DNS-molekulának, a kromoszómának egy kis szegmense. Mivel a kromoszómát alkotó DNS kettős hélix egyetlen molekula, egyetlen folytonos egység, a transzkripciót végző molekuláris gépezetnek nukleotid pontossággal biztosítania kell, hogy a megfelelő szakaszok a megfelelő irányban és megfelelő hosszan íródjanak át. Ez három részfolyamatban történik: 1) a gén elejének megtalálása, a transzkripció pontos starthelyének és irányának kijelölése iniciáció, kezdés, 2) az átírás végzése a gén hossza mentén elongáció, lánchosszabbítás, 3) az átírás leállítása a gén végén termináció, befejezés (7.3. ábra). A teljes folyamatot a fenti három részfolyamat szerint tárgyaljuk. A transzkripció alapjaiban igen hasonlóan zajlik pro- és eukariótákban, de vannak lényeges eltérések is ábra - A transzkripció áttekintése 113

126 A génkifejeződés molekuláris alapjai 4.2. Transzkripció iniciáció prokariótákban Hogyan találja meg az RNS-polimeráz a transzkripció korrekt starthelyét? Ehhez egy speciális DNS-szekvencia segíti hozzá, melyet promóternek (promoter, elősegítő) nevezünk. A promóter a transzkripció starthelyének közelében, attól 5 irányban (vagy upstream) helyezkedik el (7.3. ábra). Emlékezzünk vissza, hogy a gén kódoló szakaszát 5 3 irányban írjuk fel, és a transzkripció iránya megegyezik a kódoló szál 5 3 irányultságával. A kódoló szálon az első átírásra kerülő nukleotidot +1 pozíciónak nevezzük. Ez a fontos koordináta a transzkripció starthelye (7.4. ábra). Ettől 5 irányban (a kódoló szakasz előtt vagy upstream) lévő nukleotidokat -1, -2 stb. számozással, a +1 helytől 3 irányban (downstream) elhelyezkedőket pedig +2, +3 stb. számozással jelöljük. A promóter tehát a +1 helytől upstream elhelyezkedő DNS-szekvenciarész, mely a transzkripció strathelyének közelébe irányítja az RNS-polimerázt. Mitől speciális ez a DNS-szakasz? Egy DNSszakasz egyediségét nem adhatja más, mint annak nukleotidsorrendje. A promótert is meghatározott nukleotidok meghatározott pozíciókban és sorrendben való elhelyezkedése teszi funkcionális szakasszá. Egy genomon belül az egyes promóterek szekvenciája hasonló. Ha összehasonlítjuk például E. coli gének +1 helytől upstream lévő DNS-szakaszait, akkor két olyan, egyenként néhány nukleotidból álló részt figyelhetünk meg, melyek az egyes gének promóter régióiban igen hasonlóak. (A promóterszekvenciát általában csak az egyik szál, a kódoló szakasznak megfelelő DNS-szál szerinti szekvenciával adjuk meg.) Ezekből a hasonló de nem mindig tökéletesen egyező szekvenciájú régiókból leképezett leggyakoribb bázissorrendet konszenzus (megegyező) szekvenciáknak nevezzük. Az E. coli promóterek konszenzusszekvenciái a -10 és a -35 pozíciók környezetében vannak (7.4. ábra). Más prokarióta promóterekre is jellemző ez a szerkezet. Bár e két konzervált régió helye prokariótáknál általános, a konkrét bázissorendben egy genomon belül is többféle variáció lehetséges. Ez befolyásolja az adott promóter erősségét, és lehetőséget biztosít meghatározott géncsoportok együttes transzkripcionális szabályozására (lásd később). A 7.4. ábrán az E. coli RNS-polimeráz σ 70 alegysége által felismert konszenzusszekvencia látható. A konszenzusszekvenciától akár csak egy bázisban is eltérő promótereknél az RNS-polimeráz kötődése (és ezzel a transzkripció) gyengül vagy akadályozott. Más típusú promóterfelismerő RNS-polimeráz alegységekhez más konszenzusszekvenciák tartoznak. 114

127 A génkifejeződés molekuláris alapjai 7.4. ábra - Az E. coli RNS-polimeráz σ70 alegysége által felismert promóterek konszenzusszakaszai A promóter után pásztázva, az RNS-polimeráz holoenzim (több alegységből álló enzimkomplex) felismeri azt a speciális szekvenciája alapján, hozzáköt, megkezdi a DNS kettős hélix lokális széttekerését (ezzel létrejön a transzkripciós buborék), és pontosan a +1 pozícióban lévő nukleotidnál elkezdi az RNS-lánc felépítését. A promóterben a konzervált szekvenciaszakaszok megfelelő pozícióban való jelenléte elengedhetetlen ahhoz, hogy a transzkripció mindig pontosan meghatározott nukleotidnál indulhasson el. A bakteriális RNS-polimeráz alegységei: α, α, β, β, ω. Ez az öt alegység alkotja az ún. core enzimet (core mag). A promótert közvetlenül egy további alegység, a σ-faktor ismeri fel, ez irányítja a promóterhez a core enzimet. A σ-faktor elnevezése a specifitás (specificity) kifejezés kezdőbetűjével áll összhangban, ugyanis ez az alegység felel a DNS specifikus szakaszainak felismeréséért. A σ alegység a DNS-szálak szétválasztásában is részt vesz a -10 hely környezetében. A transzkripció elindulásával a σ alegység leválik a DNS-ről és a core enzimről. Az E. coli akárcsak más baktériumok többféle σ-faktorral is rendelkezik. A gének zömének átírásában a σ 70 nevű (70 kda) fehérje vesz részt. Más σ-faktorok másféle promóterszekvenciákat ismernek fel, vagyis a σ- faktorok promóterspecifitásban különböznek egymástól. Ez lehetővé teszi, hogy ugyanaz az RNS-polimeráz holoenzim a sejtben jelenlévő σ-faktorok függvényében többféle, különböző promóterszerkezetű gének csoportjait írhassa át. Prokariótáknál a gének kifejeződésének a σ-faktorok sejten belüli hozzáférhetőségéből (jelenlétéből, hiányából, mennyiségéből) fakadó szabályozása elterjedt (lásd A génkifejeződés szabályozása prokariótákban című fejezetet). A transzkripció starthelye (+1) nem esik egybe a transzlációs starthellyel. (Itt mrns-ekről beszélünk; más RNS-féleségek nem templátjai a transzlációnak.) A transzláció a START kodonnál (ez általában AUG az mrns-en, tehát ATG a kódoló DNS-szálon) indul. A DNS-szekvenciában ez az ATG triplet (bázishármas) a +1 helytől távol, downstream helyezkedik el, és a transzkripciós apparátus számára semmilyen jelzésértékkel nem bír. Ez azt jelenti, hogy a képződő RNS-transzkriptumnak van egy olyan 5 végi szakasza (a transzkriptum eleje), mely nem kerül transzlációra. Ezt az RNS-szakaszt 5 UTR-nek (untranslated region, nem transzlálódó régió) nevezzük. Az 5 UTR-nek a transzlációnál a riboszóma kötésében fontos szerepe van (lásd erről később) Transzkripció elongáció prokariótákban Az RNS-polimeráz haladása közben maga előtt kitekeri, maga mögött pedig visszatekeri a DNS kettős hélixet. A lokálisan széttekert DNS kettős hélix (transzkripciós buborék) lehetővé teszi, hogy a templát szál leolvashatóvá váljon az enzim számára. A transzkripciós buborék így az RNS-polimerázzal együtt halad (7.5. ábra). Az RNS-polimeráz kb. 30 nukleotid hosszan kötődik a DNS-hez (a DNS dupla hélix egy teljes csavarulata 10 nts), a kitekert szakasz hossza nukleotidnyi. A nukleotidok beépülése a templát szállal komplementer bázispárosodás alapján történik. A beépüléshez szükséges energiát a szintézis monomereiben, a ribonukleozid-trifoszfátokban (NTP-k) lévő foszfoanhidrid-kötések felszakadása szolgáltatja, pirofoszfát felszabadulása közben. Az RNS-szintézist az alábbi egyszerű képlettel írhatjuk le: NTP + (NMP) n (NMP) n+1 + PP i DNS Mg 2+ RNS-polimeráz 115

128 A génkifejeződés molekuláris alapjai 7.5. ábra - RNS-szintézisnél a DNS kettős hélix lokálisan felnyílik (transzkripciós buborék) Az RNS-láncba utoljára beépült 8 9 nukleotid hidrogénhidakkal kapcsolódik össze a DNS-templátszállal (ez RNS-DNS hibrid régió, 7.5. ábra), az ezt megelőző RNS szakasz pedig leválik a templátról Transzkripció termináció prokariótákban Az elongáció mindaddig tart, míg az RNS-polimeráz nem érzékel terminációra utaló jelet. E. coli-ban (és más baktériumokban) két fő mechanizmust ismerünk a transzkripció terminációjára: intrinsic (belső, vagy másik nevén ρ-független) termináció és ρ-függő termináció. Az intrinsic terminációs mechanizmus direkt út, külső faktor nem szükséges hozzá. A terminációs szignál ahogy a mechanizmus neve is utal rá a DNS-ben kódolt. Ez egy kb. 40 nukleotid hosszú szekvencia, mely rendelkezik két egymással komplementer, GC-gazdag szakasszal, melyet minimum hat A nukleotid követ (7.6. ábra). Ez a DNS-templátra jellemző szekvencia a róla átíródó mrns-ben, az ellentétes irányultságú komplementer szakaszoknak köszönhetően, ún. hajtű szerkezet kialakulását idézi elő (7.6. ábra). Ezt követi egy A-U hibrid szakasz, mely laza DNS-RNS párosodást okoz. A mechanizmus részletei nem világosak. Feltételezhető, hogy a transzkripció során az RNS-polimeráz érzékeli, ha túl laza a mögötte hagyott DNS- RNS hibrid szakasz, ekkor visszalép, és megpróbálja stabilizálni azt. A terminációs szakaszon kialakuló laza A- U kapcsolódás ezért leállásra és visszalépésre késztetheti az RNS-polimerázt, a stabil, GC-párok által összetartott hajtű struktúra pedig útját állja, melynek hatására a polimeráz és az RNS leválik a DNS-ről. Az E. coli genomban ezrnél több ilyen szekvencia található, ami azt jelenti, hogy a gének közel fele ilyen terminátorral rendelkezik ábra - Intrinsic (ρ-független) transzkripció termináció 116

129 A génkifejeződés molekuláris alapjai A másik terminációs mechanizmusban egy fehérje, a ρ-faktor működik közre. Ez egy homohexamer fehérje. A ρ-függő terminációs szignált is egy speciális DNS-szakasz szolgáltatja, melyre jellemző, hogy nukleotid hosszúságú, C-ben gazdag (de G-ben szegény), és tartalmaz egy ún. rut (rhoutilization site, ρ által felismert hely) szekvenciarészt. Amint a rut hely átíródik és hozzáférhetővé válik, a ρ-fehérje hozzáköt, ezzel leállásra kényszeríti az RNS-polimerázt, és elősegíti az RNS leválását. mrns-ek esetén a transzkripció terminációs helyet mindig megelőzi a majdani transzláció terminációs hely (ez a STOP kodon, lásd később). Az mrns 3 végén tehát az 5 véghez hasonlóan van egy nem transzlálódó szakasz (UTR, untranslated region, nem transzlálódó régió). A 3 UTR tehát az mrns-nek a STOP kodontól a 3 végig tartó szakasza, mely tartalmazza a transzkripció terminációs szignált Transzkripció eukariótákban áttekintés Az eukarióta transzkripció az alapmechanizmusok tekintetében a prokarióta mechanizmusokhoz hasonlít, de annál jóval komplikáltabb. Ennek legfőbb okait az alábbi három pontban foglaljuk össze: Eukariótákban a gének száma nagyobb (jellemzően tízezres nagyságrendű a prokarióta genomok néhány ezres génszámával szemben). Ehhez a nem kódoló DNS-szakaszok magas aránya társul, ami jelentősen csökkenti a gének sűrűségét. Néhány példa a génsűrűségre: E. coli 1 gén/1400 bp, Drosophila 1 gén/9000 bp, ember 1 gén/ bp. Egy gén megtalálása a transzkripciós apparátus számára olyan lehet, mintha tűt keresnénk a szénakazalban. Érthető, hogy eukarióta sejtekben komplexebb transzkripció iniciációs rendszer felelhet csak meg ennek az óriási kihívásnak. Az egyik kiemelendő eltérés a prokariótákkal szemben az, hogy eukariótákban nem egy, hanem három különböző RNS-polimeráz enzim működik. Az RNS-polimerázok más-más géncsoportok transzkripcióját végzik: 117

130 A génkifejeződés molekuláris alapjai RNS-polimeráz I rrns-gének átírása (kivéve az 5S RNS-t) RNS-polimeráz II fehérjekódoló gének (melyek termékei a mrns-ek), továbbá néhány snrns gén átírása RNS-polimeráz III kis funkcionális RNS-ek (trns-gének, snrns-gének és az 5S rrns-gének) A mitokondrium és a kloroplaszt saját RNS-polimerázzal rendelkezik. Ebben a fejezetben elsősorban az RNS-polimeráz II-vel foglalkozunk. Az eukarióta génátírás másik fontos jellemzője, hogy az iniciációs lépésben az RNS-polimerázon kívül számos fehérje vesz részt. Ezeket a fehérjéket összefoglaló néven általános transzkripciós faktoroknak (GTFs, general transcription factors) nevezzük. Hiányukban az RNS-polimeráz nem képes elindítani az átírást. Eukariótákban a transzkripció és a transzláció térben és időben elkülönül egymástól: a transzkripció a sejtmagban, a transzláció a citoplazmában zajlik. Míg prokariótákban már a transzkripció elongáció során elkezdődik az 5 RNS vég transzlációja, eukarióta sejtekben az mrns-nek előbb ki kell jutnia a sejtmagból. Ezt megelőzően számos módosuláson megy keresztül az elsődleges transzkriptum (vagy pre-mrns), mely folyamatokat összefoglaló néven RNS-érésnek nevezünk (ennek részleteit lásd a továbbiakban). Eukariótákban a kromatin szerkezete befolyásolja a génátírást, ami jelentős szereppel bír a gének kifejeződésének szabályozásában Transzkripció iniciáció eukariótákban Az RNS-polimeráz II nem képes arra, hogy a gének promóter régióit felismerje. Ehhez más fehérjék, az általános vagy alap transzkripciós faktorok (GTFs, general vagy BTFs, basal transcription factors) szükségesek. A TFIIA, TFIIB stb. (transcription factor of RNA polymerase II) elnevezésű általános transzkripciós faktorok egyenként is több fehérjéből felépülő komplexek. Maga az RNS-polimeráz II szintén több (egy tucat körüli) alegységből áll. Az RNS polimeráz II több alegysége konzervált (hasonló szerkezetű) az élesztőtől a humánig. Ezt igazolja, hogy ha az élesztő RNS-polimeráz bizonyos alegységeit a humán megfelelőire kicserélik, akkor az az élesztősejtekben funkcionáló kiméra (a kiméra szó jelentése: különböző eredetű részeket magába foglaló) RNS-polimerázt alkot. A promóter régió eukarióta géneknél is a transzkripciós starthelytől 5 irányban helyezkedik el. Az eukarióta promóterek kiterjedtebb szekvenciaszakaszok, mint a prokarióta promóterek, és funkcionális szempontból két részre oszthatók: magpromóter és szabályozó promóter. E fejezetben a magpromóterrel foglalkozunk, a szabályozó promóterekről a génexpresszió szabályozás témakörnél lesz szó. Az RNS polimeráz-ii által átírt gének promótereinek összehasonlításából kirajzolódik a -30 pozíció környezetében elhelyezkedő TA-gazdag, ún. TATA-box konszenzus szekvencia. Ennél a pozíciónál kezdődik el a preiniciációs komplex összeépülése, mely hat GTF-t és magát az RNS-polimeráz II enzimkomplexet tartalmazza (7.7. ábra). A TATA-boxot a TFIID komplex TBP (TATA-binding protein, TATA-kötő fehérje) alegysége ismeri fel. A TBP a promóter környezetébe vonzza a többi GTF-t (TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH) és az RNS-polimerázt (7.7. ábra). A preiniciációs komplex összeszerelődésével az RNS polimeráz II-komplex a megfelelő helyre irányítódik, és elkezdheti az átírást. Az elongációs szakasz kezdetéről azt tudjuk, hogy az RNS polimeráz II egyik alegységének a C-terminális doménje (CTD) foszforilálódik, feltehetőleg valamelyik GTF által. Ez a kémiai módosulás lazíthatja a polimeráz kötődését a preiniciációs komplex többi tagjához, és elősegítheti a leválását (7.7. ábra). Ezzel kezdetét veszi az RNS-lánc szintézis (elongációs) szakasz. A GTF-ek egy része a DNS-hez kötötten marad, és hozzájuk újabb RNS-polimeráz kapcsolódhat. Ily módon egy génről egymást követően több polimeráz folytathat átírást ábra - Transzkripció iniciáció eukariótákban 118

131 A génkifejeződés molekuláris alapjai 119

132 A génkifejeződés molekuláris alapjai 4.7. Transzkripció elongáció, termináció és pre-mrns-érés eukariótákban Az elongáció a transzkripciós buborékban a prokarióta RNS-szintézishez hasonlóan zajlik. A lényegi különbség, hogy míg prokariótáknál a még polimerizálódó RNS-szál már elkészült 5 végéhez riboszóma kapcsolódik, és elindul a transzláció, addig az eukarióta pre-mrns-ek nem transzlálódnak, hanem ebben a fázisban esnek át három fontos érési folyamaton: 1) az 5 vég egy sapkát (cap) kap, 2) meghatározott szakaszai, az intronok kivágásra kerülnek, ez a splicing nevű folyamat, 3) a 3 végre adenin tartalmú nukleotidokból álló szakasz (polia) kapcsolódik a poliadenilációnak nevezett folyamat során. Korábban azt gondolták, hogy ez a három érési folyamat a transzkripció végeztével zajlik (azaz poszt-transzkripcionálisan), de a kísérleti eredmények azt igazolják, hogy már a transzkripció közben (ko-transzkripcionálisan) végbemegy a pre-mrns-ek érése. Úgy tűnik, hogy az RNS-polimeráz már említett alegységének C-terminális doménje (CTD, amely az elongációs fázis elején foszforilálódik) fontos szerepet kap az érési folyamatok összehangolásában, irányításában is. A CTD jellegzetes aminosavsorrenddel rendelkezik (hét aminosavból álló szakasz többször ismétlődik), és térben a készülő RNS-lánc RNS-polimeráztól leváló részének közelében helyezkedik el. Az érés egyes fázisaiban a CTD aminosavai reverzibilis módosításokon mennek keresztül (leggyakoribb a foszforiláció defoszforiláció), ami meghatározza, hogy az érésben részt vevő fehérjék közül melyek kapcsolódnak hozzá, és kerülnek ezáltal az RNS-lánchoz közel. Az 5 és a 3 végek módosítása Amint az RNS-lánc 5 vége ( eleje ) leválik a polimerázról, egy speciális struktúrát, 7-metilguanozin sapkát (transzlálódnak, hanem ebben a fázisban esnek át három ) kap, mely három foszfátcsoporton keresztül kapcsolódik a transzkriptumhoz (7.8. ábra). A módosítást az ún. capping enzimkomplex végzi. A cap szerepe kettős: 1) védi az RNS-t a degradálódástól, ami azért fontos, mert hosszú utat kell megtennie, míg a transzlációra sor kerül, 2) jelenléte szükséges a transzlációhoz (erről lásd később) ábra - Capping: az RNS 5 végi módosítása 120

133 A génkifejeződés molekuláris alapjai Az elongáció addig folytatódik, míg egy AAUAAA vagy AUUAAA konzervált szekvencia keletkezik az RNSszálon. Ezt egy enzim felismeri, és tőle nukleotiddal downstream elvágja a transzkriptumot. Az elvágott 3 véghez egy adenint tartalmazó nukleotidfüzér (polia farok) szintetizálódik (7.9. ábra). A konzervált szekvenciaszakaszt ezért poliadenilációs szignálnak nevezzük. A 3 vég módosítását végző enzim a poli(a) polimeráz. Ez az RNS-lánchosszabbítás nem igényel templátot, a polia farok nem a DNS-ben kódolt! Megjegyezzük, hogy más RNS-féleségekhez (normálisan) nem kapcsolódik polia farok, ami lehetőséget teremt arra, hogy a kutatók az mrns-eket szelektíven preparálhassák a sejtekből (például kromatográfiás oszloptölteten rögzített szintetikus oligot szekvenciákhoz az mrns-ek a polia szekvenciájukkal a komplementer bázispárosodás alapján kikötődnek). 121

134 A génkifejeződés molekuláris alapjai 7.9. ábra - Poliadeniláció: az RNS 3 végi módosítása Az intronok eltávolítása: RNS-splicing 1977-ben a Cell című folyóiratban jelent meg egy tudományos publikáció a következő címmel: An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA, azaz Elképesztő szekvenciaelrendeződés az adenovírus 2 mrns 5 végén. Az elképesztő kifejezés nem volt túlzó. Két kutatócsoport (Richard Roberts és Phillip Sharp laboratóriuma) egymástól függetlenül fedezte fel, hogy az eukarióta gének kétféle darabokból állnak, exonokból és intronokból. Az exon szakaszok (expressed region, kifejeződő régió) tartalmazzák mrnsekben a fehérjék aminosavsorrendjére vonatkozó kódsort, az intron részek (intervening region, közbeeső régió) pedig az exonok közé ékelődnek, genetikai kódként nem funkcionálnak, mivel a primer transzkriptum érése során kivágódnak (7.10. ábra). Az intronok funkciója máig nem világos. Intronok nemcsak a proteinkódoló génekben vannak, hanem néhány rrns- és trns-génben is. Az intronok száma, mérete egy genomban génenként változik, illetve fajok között is vannak felismerhető különbségek. Például az élesztő 6300 génjéből csak kb. 200-ban van intron, emberben pedig a legtöbb génben van néhány intron. Emberben az intronok átlagos mérete 2000 nukleotid, az exonoké pedig 200 nukleotid. Egy extrém példa: egy humán izombetegség, a Dushenne-féle izomdisztrófia génje 79 exont és 78 intront tartalmaz, együttesen 2,5 millió bp hosszúságú, s ebből az exonok mindössze bp-t tesznek ki ábra - Az exonok közé ékelődő intron szakaszok az érés során kivágódnak 122

135 A génkifejeződés molekuláris alapjai Az intronok láthatóvá tehetők elektronmikroszkóppal, ha az érett mrns-t a megfelelő genomiális DNSszakasszal hibridizáltatják (párosítják). Ekkor az intronszakaszok mivel az RNS-ben nincs homológ szekvenciájuk kihurkolódnak (7.11. ábra). Kísérletesen bázispontossággal megállapíthatók az exon intron határok úgy, hogy az ismert genomiális szekvenciát és az érett mrns-ről készített cdns (komplementer DNS, melyet in vitro rendszerben rutinszerűen szintetizálnak reverz transzkriptáz enzim segítségével) szekvenciáját összevetik egymással ábra - A gén és a róla képződött érett mrns hibridizációjakor a DNS-molekula intron szakaszai kihurkolódnak, mert az érett mrns-ben nincs homológ szakaszuk 123

136 A génkifejeződés molekuláris alapjai 124

137 A génkifejeződés molekuláris alapjai A splicing mechanizmusa. A spliceoszóma és a kis nukleáris RNS-ek (snrns-ek) Miután az intronok léte nyilvánvalóvá vált, a következő kérdés az volt, hogy milyen mechanizmussal vágódnak ki nukleotidpontossággal az intronok. A kutatók első megközelítésképpen pre-mrns szekvenciákat hasonlítottak össze (melyekben az exon intron határokat már ismerték). Az illesztésekből kirajzolódott a konzervált bázisok helye és milyensége: az intronok 5 végén GU, a 3 végén AG, és ez utóbbitól nukleotiddal upstream konzervált A nukleotid mindig jelen van (7.13. és ábra). E három hely környezetében lévő más nukleotidok konzerváltsága is megfigyelhető (de nem ennyire erős). A konzervált bázisok jelenléte az exon intron határokon arra utalt, hogy léteznie kell olyan celluláris gépezetnek, mely információként használja ezeket a jeleket, és az exonok splicingját (összekapcsolását) véghezviszi. Mint a tudományban sok más esetben is, a splicing elemek első megfigyelése is a véletlennek köszönhető. Joan Steitz autoimmun betegségben szenvedő páciensek vérének vizsgálata közben olyan antitestet talált, mely egy nagy molekuláris komplexhez kapcsolódott. Ez a nagyméretű molekuláris komplex kisméretű RNS-eket és fehérjéket tartalmazott. Mivel ezt a riboprotein komplexet sejtmagból izolálták, az RNS-komponenseket kis nukleáris RNS-knek (snrnas, umall nuclear RNAs) nevezték el. Később kiderült, hogy az snrns-ek komplementer szakaszokat hordoznak az exon intron határok környezetével, és így összefüggésbe hozták ezeket a splicinggal. Mai tudásunk szerint a transzkriptum konzervált szakaszait öt snrnp (snrns+proteins) komplex ismeri fel, melyek fehérjéket és az öt snrns (U1, U2, U4, U5, U6) egyikét tartalmazzák. Száznál több további fehérje vesz még részt a folyamatban. Ezek az elemek együttesen alkotják az intronok eltávolítását végző molekuláris gépezetet, a spliceoszómát (7.12. ábra). A spliceoszóma komponensei kölcsönhatásban állnak az RNSpolimeráz CTD-részével, és így kerülnek közel a készülő RNS lánchoz már a transzkripció befejezése előtt (7.12. ábra). A splicing tehát ko-transzkripcionálisan megy végbe (ily módon a ábra nem teljesen hűen tükrözi a valóságot, mert a polia farok létrejötte előtt már kivágódhatnak az intronok). Ez mikroszkóposan is megfigyelhető (7.12. ábra) ábra - Egy génről egyszerre több RNS-transzkriptum képződik, ez mikroszkóposan fenyőfára emlékeztető struktúraként jelenik meg (a fa teteje a gén elejének, alja a gén végének felel meg, egyre hosszabb ágakkal, vagyis leváló transzkriptumokkal). A splicing ko-transzkripcionálisan zajlik, ez a bal oldali felvételen megfigyelhető. A splicing kémiailag két transzészterifikálási reakciót jelent. Az első reakcióhoz az elágazási ponton (branch point) lévő konzervált A nukleotid ribózegységének 2 OH csoportja szükséges. Az első transzészterifikálás következtében az intron lasszóra emlékeztető szerkezetet alkot. Az intron lasszóstruktúra a második transzészterifikálást követően kivágódik, majd lebomlik (7.13. és ábrák) ábra - A splicing folyamatának áttekintése 125

138 A génkifejeződés molekuláris alapjai ábra - A splicing két egymást követő transzészterifikálási reakcióval valósul meg 126

139 A génkifejeződés molekuláris alapjai Self-splicing intronok és RNS-világ Átütő felfedezés született 1981-ben Tom Cech és munkatársai jóvoltából. Leírták, hogy a Tetrahymena állati egysejtű (melyet a telomerkutatás kapcsán már említettünk) egyik rrns-ének elsődleges transzkriptumából egy 413 nukleotid hosszúságú intron szakasz kémcsőben, fehérjék nélkül, önkatalizált módon képes kivágódni. Ma már több, hasonló tulajdonsággal rendelkező, ún. self-splicing intront ismerünk. Ezek az ismeretek az snrns-k splicingban betöltött szerepének felülvizsgálatára késztették a kutatókat. A legfrissebb kísérleti eredmények arra utalnak, hogy a spliceoszómában az intronok eltávolítását nem a fehérjekomponensek katalizálják, hanem az snrns-ek. Később látni fogjuk, hogy mai tudásunk szerint egy másik RNS fehérje gépezet, a riboszómák működésében is igen fontos katalitikus szerepük van a riboszóma RNS komponenseinek a fehérjeszintézis során. A katalitikus funkcióval rendelkező RNS-eket ribozimeknek nevezzük. Létük hívta életre az RNSvilág teóriát, mely szerint a földi élet kialakulása során az első sejtek genetikai anyaga RNS lehetett, mivel ez a molekula képes genetikai információ tárolására és egyúttal biokémiai reakciók katalizálására is. 127

140 A génkifejeződés molekuláris alapjai Alternatív splicing A humán genom körülbelül fehérjekódoló gént tartalmaz (ami csak körülbelül kétszerese egy hengeresféreg génjei számának), a humán fehérjék összesége, a proteom viszont százezres nagyságrendben tartalmaz fehérjéket. Ez csak úgy lehetséges, ha egy génben kódolt információ egynél több fehérje szerkezetét is képes meghatározni. Ez többek között az alternatív splicing segítségével valósul meg, melynek során egy elsődleges transzkriptumból több különböző mrns és ennek megfelelően több különböző fehérje képződik. Míg az alternatív splicing igen ritka a növények körében, addig a humán gének több mint 70%-áról képződik alternatív splice termék. Hangsúlyozni kell, hogy az alternatív splicing során képződő fehérjetermékek egymáshoz hasonlóak, hiszen ugyanazon elsődleges transzkriptum alapján készülnek. Ezek az alternatív szerkezetű fehérjék általában különböző sejttípusokban vagy eltérő fejlődési stádiumokban keletkeznek. A lehetséges alternatív splicing mechanizmusokat szemlélteti a ábra ábra - Alternatív splicing formák 4.8. Az eukarióta trns-ek érése A trns-ek is átesnek érési folyamatokon (7.16. ábra). Ezek leggyakrabban az alábbiak: Az 5 végi szekvencia eltávolítása A 3 végi két nukleotid cseréje CCA szekvenciára (ez minden trns-molekulára jellemző, ehhez a részhez kapcsolódik a trns által a fehérjeszintézis helyére szállított aminosav). Meghatározott bázisok kémiai módosítása Intronok eltávolítása 128

141 A génkifejeződés molekuláris alapjai Az érett trns-t síkban ábrázolva lóhere levélre emlékeztető szerkezetet látunk (7.16. ábra). Ez a jellegzetes másodlagos szerkezet intramolekuláris bázispárosodások következtében alakul ki ábra - Egy trns-prekurzor és érett formája 4.9. Az eukarióta rrns-ek érése A riboszómális RNS-gének egy része (18S, 5,8S és 28S) egy transzkripciós egységet alkot, és a genomban ezek az egységek egymás mellett többször ismétlődnek (ún. tandem ismétlődés, lásd a Sejtbiológiai tanulmányokban a nucleolust). Az rrns-gének átírását az RNS-polimeráz I enzim végzi. Egy transzkripciós egységről egy olyan primer transzkriptum képződik (45S), mely a három rrns-szekvenciát tartalmazza TS (transcribed spacer, átíródó elválasztó) szakaszokkal elválasztva egymástól. Az érés során a TS-szakaszok kivágódnak és előáll a háromféle rrns-molekula (7.17. ábra) ábra - Eukarióta rrns-ek érése 129

142 A génkifejeződés molekuláris alapjai 5. A gének és a fehérjék kolinearitása Az 1900-as évek első felében már ismert volt, hogy a gének kromoszómákon lokalizálódnak (lásd a kromoszómaelméletet). A gének egymáshoz viszonyított helyzetét genetikai eszközökkel (lásd a rekombinációs térképezést) meg tudták határozni még mielőtt bizonyítást nyert volna, hogy a gének anyaga a DNS, és mielőtt a DNS szerkezetét megismerték volna. Egy ideig külön fejlődött a genetika a maga eszköztárával, és tőle viszonylag független tudományág volt a hosszabb múltra visszatekintő biokémia. A két terület azonban a múlt század közepétől fokozatosan közelített egymáshoz. A gének és a fehérjék kapcsolatára vonatkozó fontos feljegyzést tett Archibald Garrod az 1920-as években. Alkaptonúriás betegeket vizsgálva azt tapasztalta, hogy a betegek vizeletében a homogentizinsav felhalmozódik. (Egészséges embereknél ez a vegyület normálisan továbbalakul.) Garrod azt is tudta, hogy ez recesszíven öröklődő betegség, s feltételezte, hogy öröklődő metabolikus hiba, enzimhiba. Garrod felvetette annak lehetőségét, hogy a sejtekben lejátszódó kémiai reakciók gének irányítása alatt állhatnak. Nagy jelentőségű kísérletsort végzett ezen a területen George Wells Beadle és Edward Lawrie Tatum ben. (Munkájukért 1958-ban Nobel-díjat kaptak.) Egy biokémiai útvonal genetikai analízisét végezték el Neurospora crassa gombán (lásd az Egy biokémiai útvonal genetikai analízise című fejezetben). Munkájuk hidat vert a genetika és a biokémia kutatási módszertana között. Eredményeik alapján megalkották az egy gén egy enzim hipotézist, mely szerint a gének felelősek az enzimek funkciójának kialakításáért. A szakmában a molekuláris biológia fogantatását kötik ehhez a munkához. Ne feledjük, hogy a gének anyagi természete (lásd Griffith és Hershey-Chase munkái), és a gének anyagának szerkezete (lásd a DNS Watson Crick-féle modelljét) csak ezt követően vált ismertté. Nagy áttörést jelentett a fehérjék szekvenálási módszerének kidolgozása. Frederick Sangernek hat évébe telt a szarvasmarha viszonylag kisméretű (51 aminosavból álló) inzulin aminosavsorrendjének meghatározása. Ez volt az első publikált fehérje szekvencia (1955-ben, jóval megelőzve a DNS-szekvenálást). A módszer 130

143 A génkifejeződés molekuláris alapjai kidolgozásáért Sanger 1958-ban megkapta a kémiai Nobel-díjat. (Második Nobel-díját 1980-ban kapta a DNSszekvenálás módszerének kidolgozásáért, Paul Berggel és Walter Gilberttel megosztva.) A Sanger-féle fehérjeszekvánálás módszerét felhasználva Vernon Ingram 1957-ben egészséges emberek és sarlósejtes vérszegénységben szenvedő betegek véréből származó (mutáns) hemoglobin β-alegység szekvenciáit hasonlította össze. A hemoglobin β-láncában egyetlenegy aminosav különbséget talált (a hatodik pozícióban glutaminsav helyett valin található a mutáns változatban). Munkájával a korábban genetikailag azonosított betegség új értelmezést nyert a fehérjeszerkezet szintjén. Később további öröklődő hemoglobinváltozatokban más-más aminosavcseréket találtak. Nyilvánvalóvá vált, hogy a génváltozatok fehérjeváltozatokat határoznak meg. Minden ismeret arra utalt, hogy a DNS nukleotidsorrendje és a fehérjék aminosavsorrendje között lineáris megfeleltethetőség (kolinearitás) áll fenn. A kolinearitás kísérletes igazolására 1963-ban került sor. Charles Yanofsky egy könnyen kezelhető modellszervezetet, az E. coli baktériumot használta a kérdés tisztázására. 16 triptofán szintetáz mutánst izolált. A mutációk egymáshoz viszonyított helyét a trpa génben térképezte (rekombinációs térképezéssel). Az egyes mutánsokból izolált TrpA fehérje aminosavsorrendjét is meghatározta. Minden esetben egyetlen aminosavcserét talált. Bár a gén nukleotidsorrendjét akkor még nem tudta meghatározni, a mutációk sorrendjét és relatív távolságukat a klasszikus genetikai térképezéssel meglehetősen precízen meg tudta állapítani. Amikor a mutációk térképhelyzetével összevetette az egyes génváltozatok által kódolt fehérjeváltozatok adatait, akkor azt tapasztalta, hogy a trpa génben a mutációk sorrendje és relativ távolságuk megegyezik a fehérjék megfelelő aminosavváltozásainak sorrendjével és viszonylagos távolságával (7.18. ábra). Ezzel a gének és a fehérjék kolinearitása bizonyítást nyert ábra - A gén és a fehérje közötti kolinearitás igazolása Yanofsky kísérletében 6. A genetikai kód A genetikai kód az a fordítási kulcs, amely meghatározza, hogy milyen nukleotidcsoportok felelnek meg az egyes aminosavaknak ban a Nobel-bizottság a genetikai kód megfejtéséért és a fehérjeszintézisben játszott szerepének tisztázásáért három kutatónak Robert William Holley, Har Gobind Khorana és Marshall Warren Nirenberg ítélte oda a rangos kitüntetést. Holley nevéhez fűződik a fehérjeszintézisben részt vevő trns-ek szétválasztására szolgáló módszerek kidolgozása. Ő határozta meg az első RNS, az alaninspecifikus trns nukleotidsorrendjét (1964). Khorana módszereket dolgozott ki meghatározott szekvenciájú, szintetikus polinukleotidok előállítására. A kémiai és enzimatikus módszerek szellemes kombinációjával szintetizált poliribonukleotidokat, melyeket messengerként használt sejtmentes rendszerben folyó fehérjeszintézis programozására. Nirenberg 1961-ben munkatársaival együtt leírta egy E. coli-ból készített sejtmentes fehérjeszintetizáló rendszer előállításának és működésének körülményeit. A fenti technikai előrelépések teremtették meg a genetikai kód megfejtésének lehetőségét. Lássuk, mit tudtak a genetikai kódról a genetikai kódrendszer megfejtése előtt: A kód három betűs 131

144 A génkifejeződés molekuláris alapjai Elvi megfontolás: A 20 aminosav kódolásához csak 4 különböző nukleotid áll rendelkezésre, ezért egy-egy aminosav meghatározásához több nukleotid kombinációja szükséges. Ha egy aminosavat két nukleotid kódol, akkor 4 4=16 féle (azaz kevés), ha három, akkor 4 4 4=64 féle (több, mint elég) aminosavat képes kódolni. Kísérletes igazolás: A kód három betűs (triplet) voltát kísérletesen Watson Crick és Seymour Benzer igazolta 1961-ben klasszikus genetikai eszközökkel az E. coli T4 fágjának rii lókusza segítségével (a részletekre itt nem térünk ki). A kód nem átfedő Elvi megfontolás: Ha a kód átfedő lenne, akkor egy nukleotid változás egynél több (kettő vagy három) aminosavat érintene. Kísérletes igazolás: A vizsgálatok egyértelműen azt mutatták, hogy egy nukleotid csere csak egyetlen aminosav cseréjét eredményezi. Tehát a kód nem átfedő. A kódszótárt in vitro fehérjeszintetizáló rendszer segítségével fejtették meg. Templátként szintetikus RNS-eket használtak. Elsőként monoton polimerekkel sikerült megállapítani, hogy a poliu fenilalanin, a polic prolin, a polia lizin, a polig pedig glicin beépüléséhez vezet. Két nukleotidot tartalmazó polimerekkel (például AGAGAGAGAGA) további kodonok váltak ismertté. Végül szintetikus RNS-tripletekkel sikerült az összes kód megfejtése, teljessé vált a kódszótár (7.19. ábra) ábra - A kódszótár 132

145 A génkifejeződés molekuláris alapjai A genetikai kódrendszer további sajátságai: A kódolás redundáns, egy aminosavat több kodon is meghatározhat. Vannak azonban aminosavak, melyekhez csak egy kodon rendelhető. A kód kialakulására vonatkozóan egyelőre nincs minden szempontból kielégítő tudományos magyarázat. START és STOP kodonok: Három kodon nem határoz meg aminosavat (nincs vele komplementer antikodonnal rendelkező trns), ezek a STOP kodonok. A STOP kodon a transzláció terminációját okozza (lásd később). A STOP kodonok külön nevet is kaptak: UAG amber (borostyánkő) kodon, UAA ochre (okker) kodon, UGA opal (opál) kodon. 133

146 A génkifejeződés molekuláris alapjai A transzláció kezdőhelyét jelző START kodon leggyakrabban az AUG (vannak kivételek, főleg prokariótákban). Ennek megfelelően az első beépülésre kerülő (N-terminális végi első) aminosav minden peptidláncnál metionin. (Prokariótáknál formil-metionin akkor is, ha más a START kodon, mely utólagosan eltávolításra kerül.) A kód univerzális, élővilágszerte kevés kivételtől eltekintve ugyanaz. 7. A genetikai információáramlás utolsó állomása: transzláció A transzláció témakörével csak érintőlegesen foglalkozunk, mivel a genetikát hallgatók más tantárgyak keretein belül már részleteiben megismerkedtek a fehérjeszintézis mechanizmusával rrns-ek és trns-ek a transzlációban A fehérjék szintézisében két együttesen a sejtek teljes RNS-tartalmának 80 95%-át kitevő funkcionális RNS-csoport, a trns-ek és az rrns-ek vesznek részt. Úgy becsülik, hogy e két RNS-féleség egy aktív eukarióta sejtben a teljes nukleáris transzkripció több mint felét lefedi. Abundanciájuk ezen kívül nagy stabilitásukból is ered. A rrns-ek a riboszómák alkotóelemei. A riboszómák felépítése pro- és eukarióta sejtekben hasonló, azzal a különbséggel, hogy az eukarióták riboszómái nagyobb méretűek. A prokarióta riboszóma tömegének 2/3-a RNS, 1/3-a fehérje. Egy nagy (50S) és egy kis (30S) alegységből épül fel (7.20. ábra). Háromféle rrns (23S és 5S a nagy alegységben, 16S a kis alegységben) és mintegy ötvenféle fehérje alkotja. Az eukarióta riboszóma nagy alegysége 60S, a kis alegység 40S ülepedési állandójú. Négyféle rrns-ből (28S, 5,8S és 5S a nagy alegységben, valamint 18S a kis alegységben) és több mint 80 fehérjéből áll. A mrns-t tartalmazó riboszómán három trns-kötőhely található: a töltött trns (A acilált vagy aminoacil), a peptid-trns (P peptid vagy peptidil) és a deacilált üres trns (E exit) helye (7.20. ábra). A riboszóma 5 3 irányban halad az mrns mentén ábra - Prokarióta riboszóma sematikus ábrázolása a kötött mrns-sel és a növekvő peptidlánccal A riboszómák szerkezetéről egyre finomabb képünk van (7.21. ábra). Az első nagyfelbontású modelleket ben publikálták. A riboszómák szerkezetének és működésének felderítéséért ítélték oda a kémiai Nobeldíjat 2009-ben Ada E. Yonath, Thomas A. Steitz és Venkatraman Ramakrishnan kutatóknak. A részletes 134

147 A génkifejeződés molekuláris alapjai szerkezeti modellek nagyban hozzájárulnak a racionális, szerkezet alapú antibiotikum-tervezéshez (a ma forgalomban lévő antibiotikumok körülbelül felének targetje a bakteriális riboszóma) ábra - Prokarióta riboszóma nagyfelbontású szerkezeti modellje (fent). Antibiotikumok, melyek a peptidlánc kivezető csatornánál blokkolnak (lent). 135

148 A génkifejeződés molekuláris alapjai A trns-ek töltik be az adapter (feldolgozó) szerepet a transzláció során. Az mrns kodonja összekapcsolódik a trns antikodonjával báziskomplementaritás alapján. A trns-ek a kódnak megfelelő aminosavakat szállítják a riboszómákhoz, így értelmezik az mrns-ekben lévő kódokat. A trns-ek nukleotid hosszú, jellegzetes lóhere alakú szerkezetet felvevő RNS-ek (7.22. ábra). Sejtenként különböző trns található. Az antikodon hurok sorrendje szabja meg a trns kapcsolódását az mrns-el ábra - trns másodlagos és harmadlagos szerkezete 136

149 A génkifejeződés molekuláris alapjai Az aminosav a trns 3 CCA sorrendjéhez kapcsolódik kovalensen aminoacil-trns szintetáz enzimek által. Ezek az enzimek specifikus kötőhelyet tartalmaznak az adott aminosav és a meghatározott antikodonnal rendelkező trns számára (7.23. ábra) ábra - Aminoacil-tRNS szintézise 137

150 A génkifejeződés molekuláris alapjai 138

151 A génkifejeződés molekuláris alapjai A kodon antikodon párosodás nem csak Watson Crick párosodással valósulhat meg. A kodon harmadik pozíciójában G-U párosodás is előfordulhat, amit lötyögésnek (wobble) nevezünk (7.24. ábra). A trns antikodon részén inozin is előfordulhat, mely U, C és A bázisokkal is képes párosodni. Ha egy aminosavat több kodon is meghatároz, akkor ezek a kodonok gyakran a harmadik pozícióban lévő bázisban különböznek. A lötyögés lehetővé teszi, hogy ugyanaz a trns több kodont is felismerhessen. Ezért nincs szükség minden (64 mínusz a 3 STOP kodon) kodonhoz külön trns-re ábra - A kodon antikodon kapcsolódásban lötyögés is előfordul 139

152 A génkifejeződés molekuláris alapjai 7.2. mrns-ek a transzlációban Az mrns-ek szolgáltatják a génekből származó, a fehérjék aminosavsorrendjére vonatkozó kódsort. Egy sejt mrns-ei méretüket tekintve igen heterogének, és a sejt összes RNS-ének csak néhány százalékát teszik ki. Gélelektroforézis során az mrns-ek ezért halvány maszatként (smear) látszanak az abundáns rrns-ek erős sávjaihoz képest. A ténylegesen aminosavsorrenddé fordítódó szakasz a START kodon és a STOP kodon közötti rész (7.25. ábra). Mind a pro-, mind az eukarióta mrns-ek rendelkeznek 5 UTR és 3 UTR (untranslated, nem transzlálódó) régiókkal. Ezek, ahogy a nevük is jelzi, nem kerülnek transzlációra. Az 5 UTR fontos szerepet tölt be a riboszóma mrns-hez kötődésében. Prokariótáknál a riboszómakötőhely (RBS, ribosome binding site, vagy más nevén Shine Dalgarno-szekvencia) a START kodontól körülbelül 10 nukleotiddal 5 irányban elhelyezkedő 6 8 nukleotid hosszúságú GA-gazdag konszenzus szekvencia. Ide kötődik a riboszóma 30S kis alegysége a 16S rrns 3 végével, komplementer bázispárosodással. Ezáltal az AUG START kodon a riboszóma P-helyére kerül. Prokariótáknál gyakori az ún. policisztronos mrns, amely egymás után több polipeptidlánc kódoló szekvenciáját tartalmazza (lásd operonok). Ebben az esetben minden egyes kódoló szakasz START kodonnal kezdődik és STOP kodonnal végződik, és minden START kodont megelőz egy riboszómakötő hely. Eukarióta mrns-eknél a transzláció kezdőpontját a START kodont is magába foglaló és az azt körülvevő konszenzus szekvencia (az ún. Kozak-szekvencia: ACCAUGG, az aláhúzott rész a START kodon) alapján ismeri fel a riboszóma. A transzláció iniciációjához, a riboszóma kötődéshez az eukarióta mrns-ek 5 végi cap része és 3 végi polia farka is szükséges ábra - Prokarióta (monocisztronos) és érett eukarióta mrns-ek szerkezete 7.3. A transzláció mechanizmusa A transzláció pro- és eukariótákban igen hasonlóan zajlik (7.26. ábra) ábra - A transzláció lépéseinek áttekintése 140

153 A génkifejeződés molekuláris alapjai A transzlációban segítő fehérjék is részt vesznek: az iniciációhoz iniciációs faktorok (IF), az elongációhoz elongációs faktorok (EF), a terminációhoz pedig release faktorok (RF) szükségesek (7.27, 7.28 és ábra). A peptidkötés a 23S rrns katalízise által jön létre ábra - Transzláció iniciáció (prokarióta) 141

154 A génkifejeződés molekuláris alapjai ábra - Transzláció elongáció 142

155 A génkifejeződés molekuláris alapjai ábra - Transzláció termináció 143

156 A génkifejeződés molekuláris alapjai 144

157 8. fejezet - Mutációk A genetikai változatosságot alapvetően két mechanizmus biztosítja: a mutációk képződése és a rekombináció. Mutációk szolgáltatják a nyersanyagot az evolúcióhoz. A rekombináció hatása magasabb szintű, lehetővé teszi, hogy a különböző gének alléljei új kombinációkban jelenjenek meg (lásd A homológ rekombináció mechanizmusa című fejezetben). A mutációk, illetve az azokat hordozó mutáns sejtek vagy egyedek a genetikai analízis nyersanyagai: a genetikai boncolás mutánsok gyűjtésével vagy előállításával kezdődik. Ebben a fejezetben a mutációk típusaival, keletkezésével foglalkozunk. A mutációk öröklődő változások. (Az öröklődést itt tágabb értelemben, a változás sejtről sejtre történő átadásaként értelmezzük.) A változások a vad típushoz képest jelentenek változást. A vad típus olyan genetikai tulajdonságot takar, melyet közmegegyezéssel alaptípusnak tekintünk. Egy gén vad típusú változatának vagy a természetben előforduló leggyakoribb allélt, vagy a laboratóriumban tenyésztett törzs allélját tekintjük. A mutáns kifejezést különböző szinteken használhatjuk: mutáns allél, mutáns fehérje, mutáns sejt, mutáns egyed. A mutációk létrejöhetnek spontán módon vagy kémiai (mutagén anyagok), illetve fizikai (sugárzás) hatások következtében. 1. A mutációk csoportosítása A mutációkat különféle szempontok szerint csoportosíthatjuk: az érintett régió nagysága, a változás iránya, szövettípus, fenotípus és a génműködés megváltozása szerint Pont- és kromoszóma-mutációk A mutáció által érintett régió nagysága szerint két mutációformát különböztünk meg: Pontmutációknak nevezzük azokat a mutációkat, amelyeket nem lehet kimutatni hagyományos citogenetikai eszközökkel. Ezek általában egy gént érintenek (ez esetben a génmutáció kifejezés is használatos). A kromoszóma-mutációk több gént, akár teljes kromoszómákat érintenek. Legtöbbször a kromoszómák szintjén kimutathatók Forward és reverz mutációk A változás iránya szerint a mutáció kétféle lehet: Előremutató (forward) mutáció, ekkor az eredetitől (vad típustól) eltérő változat keletkezik. Visszamutató (reverse vagy back) mutáció, ez az eredeti (vad) genotípus vagy fenotípus visszaállását eredményezi. A visszaállás többféle módon történhet: pontos reverzióval, amikor az eredeti nukleotidsorrend helyreáll, egyenértékű reverzióval, amikor az új nukleotid az eredetitől különbözik, de hatására az eredeti funkció helyreáll, génen belüli szupresszor mutációval, amikor ugyanabban a génben egy második mutáció kompenzálja az első mutáció hatását, génen kívüli szupresszor mutációval, amikor egy másik génben megjelenő új mutáció kompenzálja az első mutáció hatását Szomatikus és csíravonal mutációk Szövetes szerveződésű élőlényekben a mutáció által érintett szövettípus szerint szomatikus mutációkat és csíravonal mutációkat különítünk el. A szomatikus mutációk a testi sejtekben keletkező mutációk. A mutáns sejt osztódásával a mutáció az utódsejteknek is átadódik, mutáns szektort (sejtcsoportot) képezve az egyedben. Ezt mozaikosságnak is nevezik, 145

158 Mutációk mert az egyed eltérő genotípusú sejtcsoportokat tartalmaz. Ha a szomatikus mutáció az egyedfejlődés korai szakaszában keletkezik egy sejtben, akkor a mutáns szektor mérete nagyobb lesz, mert sok osztódással a mutáns sejtből nagy sejtpopuláció képződik. Az egyedfejlődés során később bekövetkező szomatikus mutáció kevesebb utódsejtbe adódik át, így a mutáns szektor mérete kisebb lesz. A szektorok száma megegyezik a mutáció kialakulásának esetszámával. Egy látványos példát mutat be erre a 8.1. ábra. A Golden retriever és a Labrador retriever kutyafajták között ritkán előfordulnak sárga-fekete mozaikos egyedek ábra - Sárga-fekete mozaikos Labrador retriever (lent) és szülei (fent) A 8.1. ábrán látható foltos egyed fekete és sárga szülők keresztezéséből származik, testvérei vagy tiszta feketék, vagy tiszta sárgák. A sárga labradorokra jellemző ee allélpár B genotípus mellett gátolja a fekete pigment termelődését. Genetikai jelölésekkel: Ee (BB) ee (BB) fekete szülő sárga szülő utódok: Ee (BB) feketék ee (BB) sárgák A foltos különc örökölt genotípusa ee (BB), a fekete szektorok szomatikus mutáció miatt (e E, ez back mutáció) alakultak ki a testen. A csíravonalat nem érinti mutáció, az ivarsejtek genotípusa e (B), ezért a foltos egyed az utódaira csak e allélt örökít át. A természetben megfigyelhető változatosságot a csíravonal mutációk hozzák létre. A növények csírasejtjei az egyedfejlődés végén szomatikus sejtekből jönnek létre, ilyenformán a növények szomatikus mutációi ivaros szaporodás során átöröklődhetnek (a vegetatív szaporítással pedig egyébként is). Az állatok csíravonala korán 146

159 Mutációk elkülönül a szomatikus sejtektől az egyedfejlődés során. A csírasejtekben keletkező mutáció abban az esetben adódhat át a következő nemzedéknek, ha a mutáns csírasejt részt vesz a megtermékenyítésben A mutációk fenotípus szerinti csoportosítása A mutáció által érintett fenotípus szerint a mutációk többfélék lehetnek: Morfológiai (alaktani) mutációk Ide sorolunk minden olyan mutációt, amely az egyed morfológiáját (kinézetét) befolyásolja. A tananyag példáiban a leggyakrabban ilyen mutációtípusokkal találkozunk. Letális (halálos) mutációk A letális allélokkal A mendeli genetika kiterjesztése című fejezetben már foglalkoztunk. Diploid élőlényekben ezek a mutációk a leggyakrabban homozigóta formában vezetnek letalitáshoz. Anyagcsere-mutációk A mikrobák anyagcsere-mutációt hordozó törzseit auxotrófoknak nevezzük. Az auxotróf mutánsok laboratóriumi körülmények között táptalaj-kiegészítést igényelnek szaporodásukhoz. A prototrófok ásványi sókat és energia forrást tartalmazó minimál táptalajon nőnek. Az ember veleszületett anyagcsere rendellenességei is (például fenilketonúria, galaktozémia) anyagcserét érintő mutációk következményei. Viselkedési mutációk Az állatok (és az ember) viselkedése jelentős részben genetikailag meghatározott, ezért azt mutációk megváltoztathatják. A muslica udvarlási viselkedése például megváltozhat akár a szárnyizmokat, akár azok beidegzését, akár az idegközpont szerkezetét befolyásoló mutációkkal. Kondicionális (feltételes) mutációk A kondicionális mutáció csak bizonyos környezeti feltételek, restriktív, azaz korlátozó körülmények között eredményez mutáns fenotípust. Más, permisszív, megengedő körülmények között vad fenotípus jön létre. A kutatók leggyakrabban a tenyésztési hőmérsékletet használják mint restriktív, illetve permisszív körülményt, ilyenkor a mutánsokat hőérzékenyeknek nevezzük. A hőérzékeny mutánsok esetén az egyedfejlődés különböző szakaszaiban változtatva a hőmérsékletet meghatározható az érzékeny életszakasz. Az érzékeny szakasz azt jelzi, hogy az érintett gén működésére mikor van szükség Funkcióvesztéses és funkciónyeréses mutációk A génműködés megváltozása szerint a mutációk lehetnek: Funkcióvesztéses mutációk (loss of function, LoF) A DNS véletlenszerű változásának leggyakoribb következménye a génműködés sérülése. Ekkor a kódolt fehérje eredeti működése gátlódik vagy elvész. Ezek a funkcióvesztéses, vagy loss of function (LoF) mutációk. Amennyiben a génműködés teljesen kiesik, nulla allél jön létre. Ha a vad típusú funkcióból valamennyi megmarad, azt homozigóta formában leaky (magyarul sántának nevezett) fenotípus jelezheti. A funkcióvesztéses mutációk általában recesszívek. A gén egyetlen sértetlen példánya ugyanis legtöbbször a vad fenotípus kialakításához elegendő terméket termel. Azon ritka esetekben, amikor egyetlen ép génpéldány nem elegendő a vad fenotípus kialakításához, a funkcióvesztéses allél domináns fenotípust okoz (haplo-elégtelenség, haplo insufficiency). Léteznek ún. domináns negatív mutációk is. Ezek olyan funkcióvesztéses mutációk, amelyeknél a vad alléllal szemben mutatott dominancia oka az, hogy a funkcióvesztett géntermék gátolja az ép géntermék működését. Funkciónyeréses mutációk (gain of function, GoF) A mutáció a sejtben megváltozott működésű génterméket is eredményezhet. Megemelkedhet például a fehérje eredeti aktivitása, vagy teljesen új reakciókban is részt vehet. A megváltozott működés a heterozigótákban is megjelenik, és általában domináns fenotípust okoz. 147

160 Mutációk 2. A mutációk kialakulása A mutációk kialakulhatnak spontán módon vagy valamilyen környezeti hatás következtében. A spontán mutációk a sejtek természetes környezetében következnek be, míg az indukált mutációk kialakulásához valamilyen mutagén ágens szükséges, amely megnöveli a mutációk kialakulásának gyakoriságát Mutációs ráta és mutációs gyakoriság Mutációs rátán az időegység alatt bekövetkező mutációk számát értjük. Biológiai időegységként általában egy élőlény generációs idejét használjuk, vagy sejtosztódásokra normalizáljuk az újonnan létrejött mutációk számát. A 8.2. ábra példáján a mutációs ráta 1/7 (egy mutáció keletkezett hét sejtosztódás alatt). A mutációs gyakoriság az az arány, amivel egy bizonyos mutáció a sejtek vagy egyedek egy vizsgált populációjában előfordul. A 8.2. ábra példáján a mutációs gyakoriság az utolsó sejtgenerációban 2/8 = 0, ábra - Mutációs ráta (1/7) és mutációs gyakoriság (1/4) szemléltetése A nagyobb mutációs ráta nagyobb mutációs gyakoriságot eredményez. A genom egyes régióinak mutációs hajlama nem egyforma. A spontán mutációs ráta ezért lókuszonként eltérő lehet, nagyságrendben mozoghat A Luria Delbrück-féle fluktuációs teszt A mutációk kialakulásának mikéntje számos kutatót foglalkoztatott. Az alapvető kérdés az volt, hogy a mutációk spontán, véletlenszerűen keletkeznek-e, és a természetes populációkban kis gyakorisággal ugyan, de jelen vannak, vagy külső hatás befolyásolja a kialakulásukat. A kérdés megválaszolásához nagymértékben hozzájárult Salvador Luria és Max Delbrück 1943-as kísérlete. Ha egy E. coli baktérium populációt T1 bakteriofágokkal fertőzünk meg, akkor a fágok a baktériumok többségét elpusztítják. Néhány baktérium azonban ellenáll a fágfertőzésnek, és túléli, tehát szaporodik, agar lemezen telepet képez. A fágrezisztencia sejtről sejtre átörökítődik, tehát ez genetikai változás, azaz mutáció 148

161 Mutációk következménye. Luria és Delbrück azt a kérdést tette fel, hogy ezek a fágrezisztens mutáns baktériumok a fágfertőzést követően, annak hatására alakulnak-e ki, vagy a mutáns baktériumok még a fágfertőzés előtt kialakultak és jelen voltak a populációban, de csak a fágfertőzéses szelekció hatására váltak láthatóvá. E kérdés eldöntéséhez tervezték meg a fluktuációs tesztet. 20 baktériumtenyészetet képeztek kevés sejtből kiindulva: 10 8 sejt/ml sűrűségű baktérium tenyészeteket növesztettek fel. Emellett készítettek egy 10 8 sejt/ml sűrűségű nagyobb kulturát is. A 20 egymástól függetlenül növesztett kultúrát és a nagy kultúrából származó mintát fágok jelenlétében agar lemezekre szélesztették, és megvizsgálták a rezisztens telepek számát az egyes lemezeken (8.3. ábra) ábra - A fluktuációs teszt kivitelezése Azt találták, hogy a független kultúrákban a rezisztens telepek (azaz baktériumsejtek, hiszen egy telep egy baktériumsejt klónja) száma lemezről lemezre nagy varianciát mutat (0 107 telep/lemez), vagyis fluktuál (8.1. táblázat). Ugyanakkor az együtt növesztett baktérium kultúrából származó 20 mintában az ellenálló telepek száma kevésbé fluktuált (11 32 telep/lemez), és minden egyes lemezen találtak telepeket (8.1. táblázat) táblázat - A fluktuációs teszt eredménye Egyedi kultúrák lemezek sorszáma és fágrezisztens telepek száma Nagy kultúra lemezek sorszáma és fágrezisztens telepek száma A kísérlet eredménye alapján arra a következetetésre jutottak, hogy a fágrezisztens mutációk létrejöttét nem a fágok jelenléte indukálta, hanem a baktérium tenyészetekben a növesztés folyamán véletlenszerűen keletkeztek. Ha ugyanis a rezisztenciát a fágok váltják ki, akkor minden baktérium csekély, de azonos valószínűséggel rezisztenssé válhat a fág hatására, és a rezisztens sejtek száma csakis a baktériumsejtek és a fágok számától 149

162 Mutációk függ. A kísérlet tanúsága szerint azonban azonos baktériumszám és fágszám mellett az egyes tenyészetekben eltérő számú rezisztens sejt keletkezett, vagyis a rezisztensek száma tenyészetenként változott, fluktuált. A fluktuációt azzal magyarázták, hogy az egyes tenyészetekben a mutációk véletlenszerűen, nem egy időben keletkeznek. Azokban a tenyészetekben, ahol a mutációk korábban kialakulnak, több rezisztens sejt lesz a szélesztés időpontjában. Lesznek továbbá olyan populációk is, amelyekben a rezisztenciáért felelős génmutáció nem alakult ki a szélesztés időpontjáig (8.4. ábra). Luria és Delbrück ezért a felfedezésért, valamint a bakteriofágok kutatásában elért további eredményeiért ben megkapta a Nobel-díjat ábra - A fluktuációs teszt eredményének magyarázata A fluktuációs teszt által sugallt megállapításokat 1952-ben Joshua felesége, Esther Miriam Zimmer és felesége, Esther Miriam Zimmer Lederberg kísérlete is alátámasztotta. Az általuk kidolgozott replika módszer (8.5. ábra) segítségével a fágfertőzést megelőzően sikerült kimutatniuk a mutáns baktériumok jelenlétét a tenyészetben. Ha a lemezen lévő telepekhez steril bársony darabot érintünk, akkor ahhoz minden egyes telepből néhány sejt hozzátapad. Ha ezt a bársonydarabot egy másik lemezhez érintjük, akkor a leszakadó sejtek létrehozzák az eredeti lemez (master plate) telepmintázatát, replikáját. Lederbergék a fluktuációs tesztet úgy módosították, hogy a baktériumtenyészeteket először fágmentes táplemezre szélesztették, majd a kinőtt telepeket a replika módszerrel számos, fággal fertőzött lemezre vitték át. Ha a mutációk a fágokkal való kölcsönhatás miatt alakulnak ki, akkor a replika lemezeken bármely baktérium véletlenszerűen mutálódhat, és ez az egyes replika lemezek telepmintázatában is megnyilvánul. Ezzel szemben azt tapasztalták, hogy minden egyes replika lemezen ugyanolyan mintázatban és számban jelentek meg rezisztens baktérium telepek (8.5. ábra). Joshua Lederberg a mikrobiális genetika területen végzett munkásságáért Edward L. Tatum és George Beadle kutatókkal megosztva orvosi Nobel díjat kapott 1958-ban ábra - Replikázással igazolható, hogy a fágrezisztenciát okozó mutáció spontán, a fággal való találkozás előtt létrejön a baktériumokban 150

163 Mutációk 2.3. Spontán mutációk A spontán mutációk a sejtek természetes környezetében következnek be. Gyakran nem állapítható meg, hogy a mutációt belső vagy külső tényező hozta-e létre. Ilyenkor általában spontán mutációnak tekintjük a mutációt. A spontán mutációk képződésének oka lehet a tautomerizáció és a bázisok egyéb szerkezeti változásai, valamint replikációs szálcsúszás. A bázisok alternatív formái (keto/enol, amino/imino tautomerek) megváltoztatják a bázisok párosodási sajátságait. A normál (Watson Crick modell szerinti) bázispárosodásban a bázisok keto és amino formái vesznek részt (8.6. ábra). A tautomerek párosodásában pedig: guanin enol forma timinnel, adenin imino forma citozinnal, citozin imino forma adeninnel, timin enol forma guaninnal képez párt (8.6. ábra). A párosodási hiba a replikáció során jön létre az újonnan szintetizált szálban. Ha a hiba nem kerül kijavításra, akkor a következő replikáció során az inkorrekt módon beépült bázis szolgál alapul az egyik szál szintéziséhez, így a hiba állandósul: például: eredeti bázispár G C G(enol) T egyik molekulában G C, másikban A T (a nyilak egy replikációs ciklust jelképeznek; az eredeti G C pár a második replikációt követően A T párra módosult) ábra - A bázisok normál és ritka tautomer formáinak párosodása 151

164 Mutációk A DNS szerkezeti változásai szintén a bázisok párosodási tulajdonságait változtatják meg. Deaminációval a citozin uracillá alakul, s ez a replikációkor adeninnel párosodik, G C A T tranzíciót okozva. Az uracil-dnsglikoziláz repair enzim felismeri az uracilt és kivágja azt. (A bázismentes hely a fejezet későbbi részében leírt módon vezethet mutációhoz.) A metilált citozin (5-metilcitozin) a DNS-molekulában mutációs forrópontként viselkedik (azaz gyakran vezet mutáció kialakulásához). Ennek oka, hogy az 5-metilcitozin deaminálása timint (5-metiluracilt) eredményez, melyet az uracil-dns-glikoziláz nem ismer fel. Ez m C G T A tranzícióhoz vezet. A glikozidos kötés hasadása bázismentes (apurin vagy apirimidin) hely kialakulásához vezet. A replikáció során a templáton lévő apurin illetve apirimidin helyen az új szálba random épül be egy bázis. Ez a véletlenszerű beépülés mutációt okozhat. A replikáció során a szálak elcsúszása következtében kisméretű inszerciók és deléciók keletkezhetnek (8.7. ábra). A hiba kialakulásának esélye ismétlődő DNS-szekvenciáknál nagyobb. Az ismétlődéseket tartalmazó DNS-szakaszok ezért mutációs forrópontként viselkednek, mert ezeken a részeken a mutáció képződés gyakorisága magas. A következő replikáció során az inszerció, illetve a deléció fixálódik ábra - Ismétlődéseket tartalmazó szekvenciák replikációjánál a szálak elcsúszása inszercióhoz vagy delécióhoz vezethet 152

165 Mutációk Emberben több öröklődő betegség molekuláris hátterében három nukleotid ismétlődés kiterjedése áll. A különböző betegségekben az ismétlődés érinthet kódoló és nem kódoló szakaszokat egyaránt. A törékeny (fragilis) X kromoszóma szindróma (a név abból ered, hogy in vitro cytológiai képen az X kromoszóma az adott ponton gyakran törik) az egyik leggyakoribb öröklődő szellemi visszamaradottság (előfordulása férfiakban 1/1500, nőkben 1/2500). A betegség hátterében álló FMR-1 (fragile X mental retardation 1) gén normálisan 60-nál kevesebb egymást követő CGG-ismétlődést tartalmaz az 5 UTR régióban szoros ismétlődés a legtöbbször nem okoz súlyos tüneteket (az esetek csak 20%-a súlyos), e feletti ismétlődésszámnál azonban kialakul a kórkép (súlyos esetekben az ismétlődések száma a betegben több ezer is lehet). Az FMR-1 fehérje a szinaptikus plaszticitás kulcseleme, ezáltal elengedhetetlen a tanulás, memória folyamatokban. Az ismétlődések kiterjedésének mechanizmusa nem ismert. Valószínűsíthető, hogy 50 ismétlődés felett pontatlan az ember replikációs rendszere. Az ismétlődések génfunkcióra gyakorolt hatása sem ismert. Elképzelhető, hogy az ismétlődést tartalmazó szakaszon a kromatin magasabb metiláltsága transzkripciót gátló hatású, vagy a túl hosszú 5 UTR gátolja a transzlációt. A Huntington-kórban számfeletti CAG ismétlődés jellemző a Huntingtin gén kódoló régiójában. Ez, a máig ismeretlen funkciójú Huntingtin fehérjében poliglutamin extra szakasz megjelenéséhez vezet Indukált mutációk A spontán mutációs ráta mesterséges módon jelentősen megemelhető. Ez mutációt okozó vegyszerekkel (mutagén anyagokkal) vagy ionizáló sugárzással történhet. Az így keletkezett mutációkat nevezzük indukált mutációknak. A genetikai munkához szükséges nagyszámú mutáns vonal előállítása leggyakrabban indukált mutagenezissel, valamilyen mutagén ágens alkalmazásával történik. Fontos hangsúlyozni, hogy a mutagén hatások a genom egészében növelik a mutációk képződésének gyakoriságát. A mutációképződés ez esetben is random, a mutagén ágens a folyamat irányára (mely génekben következzen be mutáció) nincs befolyással. A mutagenizált populációban a számunkra érdekes fenotípusú mutánsokat szűréssel (mutáns screen) kell kiválogatni. Ionizáló sugárzás hatására a molekulák ionizált és gerjesztett állapotba kerülnek, és ilyen formában reagálhatnak a sejt komponenseivel, többek között a DNS-sel is. Az ionizáló sugárzás felbonthatja az N- glikozidos kötést, mely apurinált, illetve apirimidinált helyet eredményez, s kétszálú törések is létrejöhetnek. Mindkét jelenség mutációk kialakulását indukálja, az előbbi pontmutációkhoz, az utóbbi kromoszóma átrendeződésekhez vezethet. Vegyszerek számos módon okozhatnak mutációkat: a bázisanalógok a DNS-be beépülnek, de nem a megfelelő bázissal párosodnak, 153

166 Mutációk az alkiláló, deamináló szerek, oxidáló anyagok a DNS bázisainak szerkezetét és párosodási tulajdonságait változtatják meg, az interkaláló szerek a bázisok közé ékelődnek, és nukleotid inszerciót vagy deléciót okoznak. A bázisanalógok a természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS-polimeráz a bázisanalógokat a kettős spirálba beépíti. Például: Az 5-brómuracil (5BU) timin analóg, mely adeninnel és guaninnal is képes párosodni, s az alábbi utakon okozhat tranzíciót: T A 5BU A 5BU G C G C G 5BU G 5BU A T A A 2-aminopurin (2AP) adenin analóg, mely a timinen kívül citozinnal is képes párosodni, s az alábbi utakon okozhat tranzíciót: T A T 2AP C 2AP C G C G C 2AP T 2AP T A Az alkilálószerek alkil ( CH 3, CH 2-CH 3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira, így módosítják azok kémiai tulajdonságait. Például az etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja. A 6-etilguanin (G e ) timinnel párosodik, ami C G e T A tranzíciót eredményez. A 4-etil-timin (T e ) guaninnal párosodik, melynek következményeként T e A C G tranzíció jön létre. A deamináló szerek (például salétromossav) hatására a citozin uracillá, az adenin hipoxantinná (A =O ) alakul. Az uracil (ha nem kerül kijavításra) a következő replikáció során adeninnel párosodik, majd az azt követő replikációban timin épül be az adeninnel szemben, ezáltal C G U G T A tranzícióhoz vezet. A hipoxantin nem timinnel (az adenin eredeti párja), hanem citozinnal párosodva T A C A =O C G tranzíciót eredményez. A hidroxilálószerek (például hidroxilamin, NH 2OH) hidroxilálják a citozin C4 pozícióban levő aminonitrogénjét, mely így adeninnel fog párosodni. Ezzel C G C NOH G T A tranzíciót indukál. Az interkaláló szerek olyan gyűrűs vegyületek, melyek térkitöltése a bázispárokhoz hasonlít. A DNS kettős spirálban egymás mellett lévő bázispár közé képesek beépülni (8.8. ábra). A beépülés a kettős spirál alakját torzítja, ami a replikáció során egy nukleotid kiesését vagy beépülését okozza. Az interkaláló vegyületek ezért frameshift mutációt (lásd később) okoznak. Előfordul, hogy keresztkötik a DNS két szálát, ezáltal megakadályozzák a replikációt. Interkaláló tulajdonságú molekulák például a proflavin, akridin sárga, etídiumbromid, aktinomicin-d, dioxin-származékok ábra - Két szomszédos bázispár közé ékelődő etídium-bromid torzítja a kettős spirál szerkezetét 154

167 Mutációk 3. Pontmutációk 3.1. A pontmutációk típusai A pontmutációk mindössze egy vagy néhány nukleotidot érintenek. Pontmutációk három úton jöhetnek létre: szubsztitúció, inszerció vagy deléció révén. Szubsztitúció esetén egy bázis egy másik bázisra cserélődik ki. A szubsztitúcióknak két altípusa van: Tranzícióról beszélünk, ha egy bázis hozzá hasonló kémiai tulajdonságú bázisra cserélődik. Ez esetben egy purinvázas bázis purinvázas bázisra (A G vagy G A), vagy egy pirimidin vázas bázis pirimidin vázas bázisra cserélődik ki (T C vagy C T). sítja. A 6-etilguanin esetén egy purin bázis változik pirimidinre (A C, A T, G C, G T), vagy egy pirimidin purinra (C A, C G, T A, T G). Inszerció esetén egy vagy több bázis ékelődik be az eredeti DNS-szekvenciába. A deléció egy vagy több bázis kieesését jelenti az eredeti DNS-szekvenciából A pontmutációk hatása a géntermékre A kódoló régiót érintő pontmutációk A mutációk érinthetik a DNS kódoló, illetve nem kódoló szakaszát. A kódoló szakaszban létrejött mutációk következménye általában könnyen megjósolható, legtöbbször az adott fehérje aminosavsorrendjének és térszerkezetének megváltozását eredményezi. Ezzel szemben a nem kódoló régiókban bekövetkező mutációk gyakran nem, vagy kevéssé előrelátható módon változtatják meg a génműködést. Befolyásolhatják a kódolt fehérje aminosavszekvenciáját (lásd alább az mrns érését befolyásoló mutációkat), hatással lehetnek a gén kifejeződésének helyére, illetve mértékére is. Szinoním vagy csendes mutációk A kódoló szakaszt érintő pontmutációk legtöbbször a kód és így a kódolt aminosav megváltozásához vezetnek, azonban bekövetkezhetnek olyan mutációk is, amelyek nem okoznak változást a kódolt polipeptid aminosavsorrendjében. Ezek az úgynevezett szinoním (synonymous) vagy más néven csendes (silent) mutációk. A genetikai kód degenerált, vagyis a legtöbb aminosavat több kodon is kódolja. Ezért, ha az adott pontmutáció következtében az eredeti kodon egy szinoním (ugyanazt az aminosavat kódoló) kodonra változik, akkor ez a mutáció csendes, mivel nem okoz változást a kód alapján képződő polipeptid aminosavsorrendjében (8.9. ábra). Misszensz (missense, megváltozott értelmű) mutációk 155

168 Mutációk Ha egy pontmutáció eredményeképpen a kódolt aminosav minősége megváltozik, akkor misszensz mutációról beszélünk. Az aminosavcserét eredményező mutáció konzervatív, ha az eredeti aminosav hasonló kémiai struktúrájú aminosavra cserélődik. Két hasonló szerkezetű aminosav kicserélődése általában kevésbé befolyásolja az adott fehérje térszerkezetét, illetve funkcióját. Ha a misszensz mutáció következtében az eredetitől eltérő kémiai szerkezetű aminosav épül be a fehérjébe, akkor az aminosavcsere nem konzervatív. Az ilyen mutációk gyakran járnak az adott fehérje szerkezetének és működésének megváltozásával (8.9. ábra). Nonszensz (nonsense, értelmetlen) mutációk Előfordul, hogy egy aminosavat kódoló kodon a transzlációt termináló, úgynevezett STOP kodonra változik, ezáltal a fehérje transzlációja idő előtt befejeződik. Az ilyen mutációkat nevezzük nonszensz (nonsense, értelmetlen) mutációknak. A nonszensz mutációk súlyosan befolyásolják a fehérjék funkcióját, mivel hatásukra az eredeti fehérjénél akár jelentősen rövidebb, működésképtelen fehérjék keletkezhetnek (8.9. ábra). A nonszensz mutációkat a három STOP kodon hagyományos neve alapján szokták amber (UAG), ochre (UAA), illetve opal (UGA) mutációknak is nevezni. Frameshift (kereteltolódási) mutációk Egy vagy néhány bázispár kiesése (deléció) vagy beékelődése (inszerció) az örökítőanyag kódoló régiójába drámai változásokat okozhat a kódolt fehérje szerkezetében. Amennyiben az inszercióban, illetve a delécióban résztvevő bázisok száma hárommal nem osztható, a DNS-ről átíródó mrns leolvasási kerete elcsúszik, ezáltal a mutációt követő kodonok az eredetitől eltérő aminosavakat fognak kódolni. A leolvasási keret elcsúszása következtében sokszor nonszensz mutáció is kialakul. Abban az esetben is jelentős mértékben megváltozhat a fehérje szerkezete, ha az inszerció, illetve a deléció nem jár a leolvasási keret megváltozásával. (Három és többszöröse számú bázis beépülése vagy kiesése extra aminosavak beépüléséhez vagy kieséséhez vezet.) (8.9. ábra) ábra - Fehérjekódoló gének kódoló régióját érintő pontmutációk típusai Nem kódoló régiókat érintő pontmutációk 156

169 Mutációk A DNS azon részében, amely közvetlenül nem vesz részt a fehérjék kódolásában, számos olyan régió található, amely elengedhetetlen a normális génműködéshez. Ilyen régiók például a DNS transzkripcióját, az mrns érését, valamint transzlációját szabályozó fehérjék kötőhelyei. Az itt bekövetkező mutációk hatása nehezebben jósolható meg, mint a kódoló régiót érintőké. A nem kódoló régiókban bekövetkező mutációk egyes esetekben nincsenek kimutatható hatással a gén kifejeződésére, máskor azonban akár a gén teljes funkcióvesztéséhez is vezethetnek. Az mrns érését befolyásoló mutációk Az mrns érése során a nem kódoló intronok kivágódnak. Az intron határait jellegzetes szekvenciák, az 5 és a 3 splice helyek jelzik. Ha egy génmutáció a splice helyeket érinti, akkor az éretlen mrns-ből az intronok hibásan vágódnak ki. A splice helyek mutáció hatására eltűnhetnek, illetve megjelenhetnek. Előbbi esetben intronok maradhatnak az érett mrns-ben (intron retenció), utóbbi esetben exon régiók vágódhatnak ki belőle. Mindkét esetben jelentős változást okoz a mutáció a polipeptid-szekvenciában (8.10. ábra) ábra - A pontmutációk megváltoztathatják a gén exon intron szerkezetét A promótert és az 5 szabályozó régiót érintő mutációk A gének kifejeződése nagyban függ a transzkripciós faktorok kötődésétől. A kötődésben részt vevő szabályozó elemek mutációi elronthatnak vagy létrehozhatnak transzkripciós faktor kötőhelyeket, ezáltal drasztikusan változhat a gén transzkripciójának mértéke. Mutációk érinthetik azokat a nem kódoló szakaszokat, melyek átíródnak, és az RNS-ben a transzlációhoz szükségesek (például riboszóma kötőhely). Ezek a mutációk ugyancsak befolyásolják a gén kifejeződésének mértékét. 4. A DNS hibáit javító (repair) mechanizmusok A DNS hibái többféle mechanizmussal javítódnak. Néhány általános szabály érvényesül. A javítás a DNS kettős spirál szerkezetén alapszik. A javítási mechanizmusok redundánsak, azaz egy hibát több mechanizmus is képes kijavítani, ami többszörös biztonságot jelent. Ha egy hibát az egyik mechanizmus nem javítja ki, jó esély van rá, hogy egy másik mechanizmus felismeri és kijavítja. A DNS-polimeráz proof-reading javító tulajdonságáról a replikáció tárgyalásakor már volt szó. A mismatch (hibás bázispárosodát javító) repair pro- és eukariótákban is előforduló konzervált mechanizmus. A MutL-MutS fehérjék felismerik a téves párosodást. A MutH exonukleáz a legközelebbi GATC helynél elvágja az új szálat. A javítandó új szálat úgy ismeri fel, hogy annak GATC helyein lévő adenin még nem metilált az adeninmetiláz (Dam metiláz) lassúsága miatt. A helikáz szétválasztja a szálakat, exonukleázok visszabontják, egyesszálú DNS-kötő (SSB) fehérjék stabilizálják az egyszálú templátot, melyen a polimeráz újra szintetizálja a kivágott darabot. 157

170 Mutációk Baktériumokban és néhány alacsonyabb rendű eukariótában fordul elő a fotoreaktivációs repair. Az UV fény által létrehozott timidin fotodimert a kék zöld tartományban működő fotoreaktiváló enzim (fotoliáz) széthasítja az eredeti bázisokra (fényt igénylő repair). Ez direkt hibajavítási mechanizmus. Direkt hibajavítást végezhetnek alkiltranszferázok, melyek az O-6-os pozícióban metilezett guaninról a metilcsoportot egy ciszteinjükre viszik át, miközben az enzim inaktiválódik. Így ez a repair rendszer kimeríthető. A bázis kivágáson alapuló (bázis excíziós repair, BER) esetében DNS-glikozilázok hasítják a sérült nukleotid bázis cukor kötését, AP (apurin vagy apirimidin) helyet eredményezve. Az AP-helyen a foszfodiészter kötést az AP-endonukleáz elhasítja, a dezoxiribofoszfodiészteráz enzim eltávolítja a cukorfoszfát lánc egy szakaszát. A DNS-polimeráz ezután kipótolja a hiányt, amit a ligáz azután beforraszt, és ezzel helyreáll az eredeti sorrend. Sokféle glikoziláz ismert. Például az uracil-dns-glikoziláz eltávolítja az uracilt a DNS-ből, mely a citozin spontán deaminálásakor keletkezik (vagy eleve uracil épülhet be). A rendszer felismeri a hipoxantint, xantint, 3- metiladenint, a 7-metilguanint és más módosított bázisokat. A sejtek életben maradásához nélkülözhetetlen javító mechanizmus, mert az AP-helyek keletkezése nagyon gyakori. Humán sejtben napi AP-hely keletkezik. A nukleotid excíziós repair (NER) nagyméretű DNS-hibákat (fotodimereket, nagyméretű bázismódosításokat) javító repair mechanizmus. A javító rendszer a sérülés környékén szétválasztja a szálakat, azokat SSB fehérjék stabilizálják. Két bemetszéssel eltávolításra kerül a sérülést hordozó szál egy nagyobb, több nukleotidnyi szakasza. A maradék egyszálú szakasz alapján a polimeráz a komplementer szálat feltölti, és a ligáz folytonossá teszi a szálat. Prokariótákban nukleotidnyi a kivágás, és három fehérje (UvrA, B és C) vesz részt a javításban. Eukariótáknál nukleotid vágódik ki, és legalább 17 fehérje működik közre a javításban. Hibajavítás rekombináció útján is történhet. Ha a replikációs komplex működése fennakad egy hibán, a komplex esetenként átugorja azt, és egy egyszálú rést hagy maga után. A rést a reca gén terméke a másik templát szálról pótolja, majd az ott keletkezett rést a másik új szálat használva fel templátként kitölti. A fentieken kívül még sokféle mechanizmus ismert, melyekre itt nem térünk ki. Ha a hibajavító fehérjéket kódoló génekben mutáció következik be, a DNS-hibák javítása szenved kárt, így több hiba halmozódik fel a DNS-ben. Ennek következménye egysejtűekben nagyságrendekkel magasabb mutációs ráta, többsejtűekben rákbetegség kialakulása. Ezért ezeket a géneket mutátor géneknek is nevezik. 5. Mutagén hatást (genotoxicitást) mérő rendszerek Felmérések szerint a halálozások oka a civilizált világban 40%-ban rákos daganat. A rákos megbetegedések közel 90%-át a környezetünket szennyező mutagének okozzák. A mutagén vegyületek egyben rákkeltők (karcinogének) is, hiszen a rákos sejtek mutációk sorozatával alakulnak ki. Évente néhány ezer olyan vegyületet állítanak elő, amelyek korábban nem léteztek a Földön (gyógyszer-alapanyagok, növény- és faanyagvédő szerek, élelmiszer-adalékok, kozmetikumok komponensei, háztartási vegyszerek stb.). A mutagének és a karcinogének közötti szoros kapcsolat szükségessé teszi a környezetünkben lévő mutagén vegyületek kimutatását. A mutációt okozó anyagok kimutatására olyan tesztrendszer szükséges, amely hatékonyan láthatóvá tesz sok különböző lókuszban bekövetkező új funkcióvesztéses recesszív mutációt is. Soksejtű eukariótákban ez nehezebb, az első ilyen rendszert mégis muslicában dolgozta ki Herman J. Müller 1928-ban (Drosophila ClBteszt). Ma többféle, nemzetközileg elfogadott tesztrendszer használatos a genotoxicitás mérésére: bakteriális tesztek (Salmonella typhimurium, Escherichia coli) mikroszkopikus gombák (például Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) rovarok (ecetmuslica Drosophila melanogaster) növények (lóbab, árpa, vöröshagyma) gerincessejt-vonalak (humán és egyéb emlős sejtvonalak) in vivo emlős (egér, hörcsög, patkány) 158

171 Mutációk Az egyik legegyszerűbben kivitelezhető teszt a bakteriális reverz mutagenitási teszt. Kidolgozója, Bruce Ames után Ames-tesztnek is hívják. Validált teszt (OECD Guideline 471), világszerte alkalmazzák új anyagok mutagén tulajdonságának vizsgálatára első szűrőként. A teszt pontmutációk észlelésére alkalmas, s nagy populációban bekövetkező ritka mutációs esemény detektálását teszi lehetővé. A teszt Salmonella typhimurium apatogén, mutáns törzseinek használatán alapul. A tesztet több teszttörzsön is el kell végezni. A teszttörzsek mindegyike hisztidin auxotróf. A hisztidin bioszintézisben részt vevő több gén közül bármelyiket érintheti a mutáció (hisg, hisc, hisd) az egyes törzsekben. A teszt a potenciálisan mutagén vegyület hatására bekövetkező his - his + reverzió gyakoriságát méri a spontán reverziós gyakorisághoz képest (8.11. ábra) ábra - Az Ames-féle mutagenitási teszt alapja A tesztelő törzsek a fentieken túl hibásak az LPS kialakításában (rfa -, sejtfelszíni lipopoliszacharid bioszintézisben), ezáltal a vizsgálandó anyag könnyebben jut be a sejtbe a sejtfalon át. Továbbá, hibásak a teszttörzsek az excíziós repairben (uvr - ), ami érzékenyebb kimutatást tesz lehetővé. A törzsek különböző típusú his mutációkat tartalmaznak (báziscserét vagy frameshift mutációt), ezért a mutáció reverziója történhet bázispár szubsztitúcióval vagy frameshift mutáció segítségével. Ez azért előnyös, mert különböző hatásmechanizmusú mutagén vegyületek mutathatók ki, azaz a teszt információt nyújt a genotoxikus anyagok által előidézett mutációk típusáról is. A tesztelendő vegyülethez patkány májából készült mikroszóma frakciót (ún. S9 frakciót, mely tartalmazza az endoplazmás retikulumot a drogmetabolizmusban részt vevő enzimrendszerekkel) is adagolnak. Ennek célja, hogy modellezzék az emlősökben lezajló enzimatikus reakciókat, így a bakteriális genotoxikológiai tesztből precízebben következtethetünk a vizsgált anyag magasabb rendű szervezetekre gyakorolt hatására. Egy vegyületre akkor mondjuk, hogy Ames-tesztben nem mutagén, ha legalább négy törzsön TA98, TA100, TA1535, TA97 és/vagy TA1537 bizonyította önmagában vagy S9-es aktiválás után a hatástalanságát. Egyetlen törzsön mért pozitív teszt esetén is mutagén a minősítés. Az Ames-teszt továbbfejlesztett változatában nem Petri-csészéken képzett telepek számát mérik, hanem 96 zsebes mikrotitráló lemezen, zsebenként 6 törzzsel (TAMix) egyszerre végzik a kimutatást. A lemez zsebeiben hisztidinmentes tápközegben szaporodó (revertált) baktériumok savasítják a tápközeget, amit a tápközegbe helyezett ph-indikátor festék (brómkrezol lila sárgulása) jelez (8.12. ábra) ábra - Az Ames-teszt továbbfejlesztett változata 159

172 Mutációk 160

173 9. fejezet - A génkifejeződés szabályozása prokariótákban A gének kifejeződése (génexpresszió) az a teljes folyamatsor, melynek során a génekről funkcionális termék (fehérje vagy funkcionális RNS) képződik. Vannak gének, melyek termékeire állandóan szüksége van az élőlénynek, ezért expressziójuk állandó (konstitutív). Ezeket háztartási (housekeeping) géneknek nevezzük. A regulált, nem mindig expresszálódó gének kifejeződése a teljes folyamatsor több pontján szabályozható. Az első szabályozási pont a transzkripcionális szabályozás, mely lehetőséget ad arra, hogy a sejtek génjeiknek csak egy részéről készítsenek RNS-másolatot, méghozzá azokról, amelyek termékére az adott pillanatban szükségük van. Ez igen hatékony, energetikailag gazdaságos megoldás. Baktériumokban a génkifejeződés szabályozása elsősorban transzkripciós szinten valósul meg. Ez azt jelenti, hogy egy időpillanatban a sejtben a géneknek csak egy részéről történik átírás. Ahhoz, hogy sejtek a környezeti feltételekhez igazodva képesek legyenek génjeik ki-be kapcsolására, rendelkezniük kell a környezeti változásokat érzékelő rendszerrel, valamint a gének ki-be kapcsolását lehetővé tevő mechanizmusokkal. Azon gének, melyek termékeire az adott körülmények között nincs szüksége a sejtnek, nem (vagy csak gyengén) íródnak át. Általánosságban mondhatjuk, hogy a lebontó folyamatokért felelős gének alapállapotban nem íródnak át, csak akkor kapcsolnak be, ha a lebontandó molekula rendelkezésre áll (például speciális cukrok hasznosításában részt vevő operonok: lac, ara stb.). Ellenben, a felépítő folyamatokat irányító gének alapállapotban mindaddig működnek, amíg a termék szintézisére a sejtnek szüksége van (például aminosavak bioszintézisében részt vevő operonok: trp, his stb.). A transzkripcionális szabályozás leggyakrabban a transzkripció iniciációjának befolyásolásával valósul meg, de ismerünk transzkripció terminációval kapcsolatos regulációs mechanizmusokat is. 1. A transzkripció iniciációjának szabályozása regulátor fehérjék által A transzkripció iniciáció szabályozásának gyakori esete, amikor az RNS-polimeráz promóterhez kapcsolódása áll kontroll alatt. A szabályozásban a promóter környezetében elhelyezkedő specifikus DNS-szakaszok és a hozzájuk kapcsolódó regulátor fehérjék vesznek részt. A regulátor fehérjék lehetnek aktivátorok, melyek kötődése fokozza a transzkripciót (ez pozitív szabályozás), vagy lehetnek represszorok, melyek a promóter környezetébe kapcsolódva gátolják az átírást (ez negatív szabályozás). A represszorok kötőhelyeit baktériumokban operátor régiónak nevezik. A regulációban részt vevő fehérjék és kötőhelyeik a gének ki-be kapcsolásáért felelős genetikai kapcsolók. Mind az aktivátor, mind a represszor fehérjéknek képesnek kell lenniük arra, hogy a sejt fiziológiás állapotának, illetve a környezeti feltételeknek megfelelően kétféle állapotba kerülhessenek: az egyik állapotukban kötődjenek, a másikban leváljanak a target DNS-szekvenciáikról. Ez leggyakrabban allosztérikus konformációváltozással valósul meg. Az allosztérikus domén a regulátor fehérje szenzor funkciót betöltő része, melyhez kismolekulájú molekula (ún. allosztérikus effektor) kapcsolódhat. Az effektor kötődése befolyásolja a fehérje DNS-kötő doménjének konformációját, és ily módon befolyásolja a génátírásra kifejtett aktivitását. A transzkripció bekapcsolása, fokozása történhet aktiválással, vagy gátlás megszüntetésével. A transzkripció kikapcsolása, mérséklése pedig az aktiválás felfüggesztésével vagy gátlással valósulhat meg. 2. A transzkripció iniciációjának szabályozása speciális szigma (σ) faktorok által E. coli-ban az RpoD (σ 70 ) az alap szigma faktor, amely jellegzetes konszenzus promóter szekvenciát ismer fel (9.1. táblázat). Vannak más szigma faktorok, amelyek különböző környezeti tényezők hatására vagy regulációs kaszkádok aktiválódásakor jelennek meg, és speciális, eltérő promóterszerkezettel rendelkező gének átíródását biztosítják a core RNS-polimerázhoz kapcsolódva. Az alternatív szigma faktorok tehát maguk is génexpressziós szabályozás alatt állnak. Nézzünk néhány példát az E. coli alternatív szigma faktoraira! Az RpoH (σ 32 ) hőstressz fehérje gének átírását irányítja. A hőmérséklet emelkedésére jelennek meg a sejtben hőstressz (heat shock) fehérjék, amelyek között számos ún. dajkafehérje (chaperone) található. Ezek segítenek a fehérjék szerkezetének stabilizálásában, a helyes térszerkezet kialakításában. E. coli-ban 17 olyan hőstressz fehérje található, amelynek expressziója az RpoH irányítása alatt áll. A denaturált fehérjék felszaporodása a jel 161

174 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban az RpoH megjelenésére. Ahogy nő az RpoH aránya a sejtben, úgy szorítja ki az alap szigma faktort az RNSpolimeráz komplexből, és segíti elő a hőstressz gének átírását. Mivel az RpoH gyorsan degradálódik, a stressz elmúltával a hőstressz-gének átírása is gyorsan leáll. Az RpoE (σ E ) szintén hőstressz hatására jelenik meg. A periplazmikus térben és a külső membránban felszaporodó denaturált fehérjék hatására aktiválódik egy jelátviteli út, és jelenik meg az RpoE fehérje. Az RpoS (σ S ) a logaritmikus növekedés leállása (a stacionárius fázis kialakulása) közben kezd megjelenni a sejtekben. Az alacsony hőmérséklet vagy a magas ozmolaritás stressz szintén aktiválja. Az RpoN (σ 54 ) nitrogénéhezés esetében jelenik meg, amikor az ammónia szintje csökken. Ekkor olyan gének kapcsolódnak be, amelyek más nitrogénforrás felhasználását segítik elő. A FliA (σ F ) a kemotaxissal és a flagelláris apparátussal kapcsolatos gének átírását segíti elő. A különböző szigma faktorokat tartalmazó RNS-polimerázok más és más konzerválódott promóter szerkezetet ismernek fel. Ezek legtöbbje a -10 és -35 régiókban tartalmaz az alap promoterétől eltérő jellegzetes DNSszekvenciákat (9.1. táblázat) táblázat - Különféle szigma faktorok és az általuk felismert promóter szekvenciák jellemzői Gén Szigma faktor -35 konszenzus szekvencia közbülső (bp) távolság -10 konszenzus szekvencia rpod RpoD (σ 70 ) TTGACA TATAAT rpoh RpoH (σ 32 ) CCCTTGAA CCCGATNT rpon RpoN (σ 54 ) CTGGNA 6 TTGCA flia FliA (σ F ) CTAAA 15 GCCGATAA sigh SigH (σh) AGGANPuPu GCTGAATCA A szigma faktorok alkothatnak regulációs kaszkádot. Jellegzetes példa erre a Bacillus subtilis sporulációjának szabályozása, ahol az egyes differenciálódási (spóra kialakulásához vezető) lépéseket irányító gének bekapcsolásának sorrendjét különböző szigma faktorok megjelenése határozza meg (ezt most nem tárgyaljuk). Ehhez hasonló a Bacillus subtilis SPO1 bakteriofág fertőzésénél működő kaszkád. A fág korai génjeinek promóterét még a baktérium alap szigma faktora ismeri fel. A korai gének között van egy speciális szigma faktort meghatározó gén is (gp28). A korai fázisban nagy mennyiségű gp28 fehérje készül, amely lecseréli az alap szigma faktort a baktériumban. A gp28-tartalmú polimeráz már nem írja át a bakteriális géneket, de intenzíven expresszálódnak a fág középső fázis génjei. Ezek között szintén van két gén, amelyek egy dimérből álló speciális szigma faktort kódolnak (gp33 és gp34). Ezek felszaporodása teszi lehetővé a fág késői fázis génjeinek átíródását. Tehát minden egyes cserénél az RNS-polimeráz más és más promóterrel rendelkező gének átírását végzi, és abbamarad az ezektől eltérő promóterszerkezettel rendelkező gének átírása. 3. A transzkripció terminációjának szabályozása Ismerünk transzkripció terminációval kapcsolatos szabályozást is. Ilyen mechanizmusok az attenuáció (lásd később, trp, phe, his operonok) és az antitermináció. Ez utóbbinál a terminációs szignál ellenére is tovább folyik a transzkripció akkor, ha egy antiterminátornak nevezett fehérje kötődik a transzkripció terminációs szignálhoz. Az antiterminációval megvalósuló transzkripcionális szabályozásra jó példát szolgáltat az E. coli lambda fág lizogén-lítikus fejlődésének szabályozása (erre itt nem térünk ki). 4. Operonok és regulonok 162

175 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban Baktériumokban az egy folyamatsorban részt vevő fehérjék génjei általában csoportokba rendeződnek a kromoszómán, ún. operonokat alkotnak. Ez a szerveződés gazdaságos, közös transzkripcionális szabályozásnak a lehetőségét teremti meg. Az operon tehát olyan gének csoportja, melyek fizikailag egymáshoz közel helyezkednek el a kromoszómán, és egy promóter irányítása alatt állnak. A gének egy transzkripciós egységet alkotnak, vagyis róluk egy közös RNS-transzkriptum keletkezik, melyet policisztronos RNS-nek ( több génes, a cisztron ritkán használt kifejezés, mai értelmezésben a génnek felel meg) nevezünk. A policisztronos RNS-ről több peptidlánc képződik. Az operon részének tekintjük annak szabályozó elemeit is: a promóter környéki szabályozó szekvenciákat (szabályozó fehérjék kötőhelyeit) és a struktúrgének közelében elhelyezkedő de saját promóterrel rendelkező, önálló transzkripciós egységként viselkedő szabályozó fehérjék génjeit. Az operonok prokariótáknál elterjedtek, eukarióta szervezetekben ritkák, de akad rá példa. A továbbiakban néhány operon szabályozási mechanizmusát tekintjük át. A regulon több, együtt szabályozott géncsoportot jelent, lényegében együtt szabályozott operonok összessége, mely operonok a genomban elszórtan helyezkedhetnek el. Példa erre a CAP-regulon, mely az összes, camp- CAP által szabályozott operont magába foglalja (lac, ara, gal, mal és egyéb cukorhasznosításban részt vevő operonok, lásd a fejezet későbbi részében). 5. A lac operon szabályozása Az elsőként felderített génszabályozási rendszer az E. coli laktóz-metabolizmusban részt vevő operon (röviden lac operon) szabályozása volt. Az operon működésének alapjait Francois Jacob, Jacques Monod és André Lwoff tárta fel az 1950-es években. Őket az operonmodell megalkotóiként tartjuk számon. Jacob és Monod 1965-ben Nobel-díjat kapott. Munkájukat nagyrészt genetikai kísérletes eszköztár segítségével végezték, s ezek a kísérletek a klasszikus baktériumgenetikai kísérletek iskolapéldái. A továbbiakban először áttekintjük az operon szabályozásának kulcselemeit, majd az olvasó genetikai szemléletének csiszolása céljából érintőlegesen foglalkozunk a modell megalapozásához vezető kísérletekkel Negatív szabályozás és indukció a lac operonban A lac operon termékei a laktóz hasznosításban vesznek részt. Három struktúrgénje és a megfelelő fehérjetermékek, valamint azok funkciói az alábbiak: lacz gén β-galaktozidáz laktóz hidrolízisét katalizáló enzim (9.1. ábra) lacy gén galaktozid permeáz a sejtmembránban elhelyezkedő transzport fehérje laca gén transzacetiláz funkciója a laktóz-metabolizmusban nem ismert 9.1. ábra - A β-galaktozidáz enzim a laktózt galaktózra és glükózra hidrolizálja 163

176 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban A három struktúrgénről, egy szabályozható promóter irányítása alatt egy policisztronos RNS keletkezik, így a három fehérjetermék mindig egyenlő mennyiségben képződik. Az operonhoz tartozik a promótertól upstream elhelyezkedő szabályozó represszor fehérje génje, a laci. A laci gén saját promóterrel rendelkezik, expressziója konstitutív. Az operon része továbbá a LacI represszor fehérje kötőhelye, az operátor szakasz, mely a struktúrgének szabályozható promóterével és a transzkripciós starthellyel fed át (9.2. ábra) ábra - A lac operon felépítése és negatív szabályozása 164

177 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban Az operonon alapállapotban (ha nincs felvehető laktóz a tápközegben) negatív szabályozás érvényesül: a sejtben mindig jelen lévő LacI represszor fehérje az operátor szakaszhoz köt, és ezzel megakadályozza az RNSpolimeráz promóter felismerését. Az operon bekapcsolása a gátlás feloldásával valósul meg: a laktóz (illetve egyéb galaktozid-származékok) allosztérikus effektorként módosítják a LacI szerkezetét úgy, hogy az leválik az operátor szakaszról (9.2. ábra). Ezt a folyamatot mivel a génátírás fokozásáról van szó génindukciónak is nevezzük. Felmerülhet a kérdés, hogy ha az operon represszált, akkor nincs jelen a sejtekben a laktózt importáló permeáz, tehát nem juthat be laktóz a sejtekbe, és nem végezhet effektor funkciót. Valójában a represszió, mint ahogyan a prokarióta génszabályozásban általában igaz, nem száz százalékos, az operon ereszt, gyengén, de átíródnak a struktúrgének. Az indukcióval ez a gyenge átírás többszázszoros mértékben megemelkedik. Az operon szabályozható promóter környezetének szerkezetét DNS-szekvencia szinten mutatja be a 9.3. ábra. Az operátor régió egy tükörszimmetrikus szekvenciarész (akárcsak a később tárgyalandó camp CRP kötőhely). Az operátorhoz a LacI represszor tetramerként kötődik (9.4. ábra) ábra - A szabályozható lac promóter és környezetének szerkezete szekvencia szinten 165

178 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban 9.4. ábra - A LacI represszor tetramerként kötődik a tükörszimmetrikus szekvenciájú operátor régióhoz 5.2. Pozitív szabályozás a lac operonban A lac operonon érvényesül egy pozitív szabályozás is. A szabályozó a CAP (vagy CRP) fehérje, melynek allosztérikus effektora a camp (ciklikus AMP). Ez a pozitív szabályozás nemcsak a lac, hanem más cukorhasznosításban részt vevő operonon is érvényesül (CAP regulon). Ez a szabályozási rendszer lehetővé teszi, hogy több cukorforrás együttes jelenléte esetén a baktérium előnyben részesítse a számára legkedvezőbbet, a legkönnyebben hasznosítható glükózt (9.5. ábra). Amíg glükóz hozzáférhető a sejt számára, a lac, ara, ma, gal operonokról a laktóz, arabinóz, maltóz, galaktóz indukció ellenére is csak gyengén folyik az átírás ábra - A sejtek két cukorforrás közül előbb a glükózt fogyasztják 166

179 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban Kezdetben azt feltételezték, hogy a glükóz valamelyik bomlásterméke, katabolitja gátolja a többi cukoroperon működését, ezért a jelenséget elnevezték katabolit repressziónak, a szabályozó fehérjét pedig CAP, azaz katabolit aktivátor proteinnek. Ma már tudjuk, hogy egészen más mechanizmusról van szó, ennek ellenére a fenti kifejezés megmaradt a szaknyelvben. Néhol már találkozhatunk a CAP helyett a CRP (camp receptor protein) elnevezéssel, mely a valóságot jobban tükröző név. A továbbiakban mi is ezt használjuk. Mi az összefüggés a CRP-t aktiváló camp szint és a glükóz között? A camp ATP-ből keletkezik adenilátcikláz (AC) hatására. Alapvetően a szintézis sebessége határozza meg az intracelluláris camp-koncentrációt. Az adenilát-cikláz membránkötött enzim, amelynek aktivitását egy másik membránkötött enzim, a IIAGlc befolyásolja. A IIAGlc fehérje a foszfotranszferáz transzport rendszer egyik eleme, ami a glükóz transzportjában játszik szerepet. A IIAGlc működése közben reverzibilisen foszforileződik, és glükóz jelenléte esetén foszfátját nagy sebességgel a glükóznak adja, az pedig glükóz-6-foszfáttá alakul. Az adenilát-cikláz aktivitásához foszforileződésére van szükség, ami szintén a IIAGlc felől történik. Glükóz jelenlétében ez a folyamat lassú, mert a glükóz foszforilálódik elsődlegesen a IIAGlc által, ezért az AC inaktív, és alacsony a camp szint. Az alacsony camp szint miatt a CRP nem aktív, pozitív regulátorként nem tud hatni a CAP-regulon tagjain. Glükóz hiány esetén azonban a IIAGlc foszforilezett formájának koncentrációja megnő, gyorsan foszforilezi és aktíválja az AC-t, aminek következményeként megnő a camp szintje. A camp CRP komplex erősíti a promótert. A komplex kétféleképpen segítheti az iniciációt, annak függvényében, hogy milyen a promóter és a camp CRP kötőhely viszonya (9.6. ábra): zárt komplex szerkezet: camp CRP kötőhely a -60 pozícióban az RNS-polimeráz kötődését segíti (például lac operon) nyitott komplex szerkezet: camp CRP kötőhely a -40 pozícióban stimulálja a DNS-szálak szétválását, azaz a transzkripciós buborék kialakulását (például gal operon) 9.6. ábra - A camp CRP komplex a kötőhelyének és a promóter távolságának függvényében kétféleképpen segítheti a transzkripció iniciációt 167

180 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban A camp CRP kötőhely a lac operonban egy rövid, tükörszimmetrikus DNS-szekvencia (9.7. ábra). A komplex kötődése megváltoztatja a DNS görbületét ábra - A camp CRP komplex tükörszimmetrikus szekvenciához kötődik 168

181 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban Összefoglalva: a lac operonon kettős egy negatív és egy pozitív szabályozás érvényesül. A struktúrgének átírása: laktóz hiányában és glükóz jelenlétében csak szivárgó (negatív szabályozás megléte, és pozitív szabályozás hiánya) laktóz és glükóz együttes jelenlétében gyenge (negatív szabályozás feloldása, de a pozitív szabályozás hiánya) laktóz jelenlétében és glükóz hiányában erős (negatív szabályozás feloldása, és a pozitív szabályozás megléte) Ha egy gépjárműhöz hasonlítjuk a rendszert, akkor a negatív szabályozás analóg a fékkel, illetve annak kioldásával, a pozitív szabályozás pedig a gázadással. Ahhoz, hogy az autó maximálisan működjön, nem elég a féket kioldani (a repressziót megszüntetni), gázt is kell adni (pozitív szabályozás is szükséges) A lac operon működésének felderítése Jacob, Monod és Lwoff az enzimadaptáció jelenségével kezdett foglalkozni az 1950-es években. Felfigyeltek arra, hogy az E. coli baktérium laktóz-metabolizmusban részt vevő enzime, a β-galaktozidáz nem mindig van jelen a sejtekben, csak akkor termelődik, ha laktóz kerül a táptalajba. Ezt nevezték el adaptáció jelenségnek, melyben az enzim megjelenését a szubsztrát váltja ki. Izotóppal jelzett aminosavak segítségével bizonyították, hogy az enzim a laktóz adást követően újonnan szintetizálódik. A kérdés, melynek megválaszolása elvezetett egy génszabályozási modell megalkotásához, és a Nobel-díj elnyeréséhez, szinte magától adódott: vajon miből érzékeli a sejt, hogy mikor kell termelni a megfelelő enzimeket? A β-galaktozidáz aktivitás kimutatására, és az indukció kiváltására mesterséges galaktozid származékokat is kipróbáltak. A β-galaktozidáz enzimaktivitás vizsgálatára két kromogén származékot (ONPG és X-gal) is találtak (9.8. ábra). E kromogén szubsztrátok esetén színes termék is keletkezik a bomlási reakció során, így az enzimaktivitás nyomonkövetése egyszerű. Az ONPG (O-nitrofenil-β-D-galaktopiranozid) pontos enzimaktivitás méréseknél használatos, a reakció sárga terméket eredményez. Az X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-Dtiogalaktopiranozid) festéket a szilárd táptalajba téve a β-galaktozidáz aktivitással rendelkező baktériumkolóniák megkékülnek. Ez a módszer az enzim jelenlétének vagy hiányának gyors kimutatását teszi lehetővé. A két kromogén szubsztrátot a mai napig elterjedten használják a lac operon alapú kutatási technikákban. 169

182 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban Egyes vegyületek az alapszinthez viszonyítva akár ezerszer több enzim megjelenését indukálták. Az inducer eltávolítása leállította az enzim szintézisét. A legjobb indukálószernek az IPTG (izopropil-β-dtiogalaktopiranozid) bizonyult (9.8. ábra), mely nem szubsztrátja az enzimnek. Az indukáló tulajdonság és az enzimhez való kötődés tehát elkülönül, úgy is mondhatjuk, hogy más az érzékelő és más a végrehajtó rendszer. Az IPTG alkalmazásának előnye, hogy nem fogy az indukció előrehaladásával, mint az eredeti indukálószer, a laktóz. Ezért máig ezt a vegyületet alkalmazzák a lac promóterrel működő biotechnológiai rendszerekben ábra - A β-galaktozidáz enzim két kromogén szubsztrátja (X-gal, ONPG) és a lac promóter kiváló indukálószere (IPTG) Az operon struktúrgénjeinek azonosítása A β-galaktozidáz enzim mennyiségi meghatározását eleinte specifikus ellenanyaggal végezték. A kromogén szubsztátok alkalmazása megkönnyítette a genetikai analízist. β-galaktozidáz aktivitást nem mutató, illetve az enzimet túltermelő baktériumtörzsek könnyen azonosíthatók voltak a színreakciókkal. Izoláltak olyan mutánsokat, melyek indukált állapotban is fehér telepeket képeztek (nem indukálható mutánsok, Lacfenotípus). A mutációkat két komplementációs csoportba tudták besorolni. A mutációk által izolált két gént (melyek neve lacz és lacy) térképezték, és megállapították, hogy ezek egymáshoz igen közel helyezkednek el a kromoszómán. Funkciójukat tekintve megállapítható, hogy mivel ezen gének elrontása megakadályozza a laktózbontó enzimaktivitás megjelenését, a gének termékei nélkülözhetetlenek az aktivitáshoz (beleértve az enzimet kódoló gént is). Szabályozásban hibás mutánsok Az alapvető gének (laczy) megismerése, térképezése után lehetőség nyílt különleges fenotípusú mutációk felismerésére, izolálására is. Néhány mutáció konstitutív (folyamatos) expressziót eredményezett, azaz a mutáns baktériumokban a β-galaktozidáz állandóan termelődött. Ez a mutáns tehát nem Lac-, felismerni például úgy lehet, hogy X-gal tartalmú táptalajon inducer hiányában kék telepet ad. Azon gének, melyek elrontása az enzim konstitutív termelését eredményezi, ép állapotban gátolják az enzim termelését. Az új mutációk a laczy génekhez közel térképeződtek, és a későbbi kísérletekben további két csoportra voltak bonthatók: laco operátorgén (későbbi pontos elnevezése operátor régió) mutációk és laci indukálhatóságot befolyásoló mutációk. A két kategória között komplementációs kísérletekkel lehetett különbséget tenni. A laci volt az első gén, melyről feltételezhető volt, hogy nem enzimet kódol, hanem valamilyen regulátor funkciót tölt be. A vad (laci + ) baktériumokban β-galaktozidáz teljes termelődés csak inducer jelenlétében történik. A laci mutánsokban a β-galaktozidáz szint az indukált állapotra jellemző az inducer hiányában is. Tehát a laci mutációja megakadályozza a gátlást, azaz a LacI represszor fehérje, mely gátolja a laczy gének működését. A szabályozás elemeinek felderítését és a működés megértését tovább segítette egy technikai előrelépés: létre tudtak hozni a lac operonra nézve részlegesen diploid (ún. parciális diploid) törzseket. Ehhez elsőként olyan plazmid származékokat izoláltak, melyek tartalmazták a baktériumkromoszóma bizonyos részeit (az alap plazmid az E. coli természetesen előforduló F plazmidja, melynek F jelölt származékait rekombináció segítségével izolálták). A lac régió egyes részeit, különféle mutációk kombinációjával, hordozó F' plazmidokat különféle lac genotípussal rendelkező sejtekbe juttaták be. A parciális diploid állapotok létrehozása megteremtette a lehetőséget az allélek dominanciaviszonyainak megállapítására, valamint további fontos részlet tisztázására (9.2. táblázat) táblázat - A lac operon működésének genetikai analízise I. 170

183 Genotípus A génkifejeződés szabályozása prokariótákban β-galaktozidáz enzimaktivitás indukálás nélkül β-galaktozidáz enzimaktivitás indukálással Fenotípus, következtetés I + Z + (vad) + ha I +, indukálható I - Z ha I -, konstitutív I + Z - ha Z-, nem indukálható I+Z- / F I-Z+ + indukálható, I + domináns I - felett, I + transz módon hat A táblázatban foglalt eredmények alapján, a laci + (az indukálhatóság megléte) domináns a null mutációt (indukálhatóság hiánya, konstitutív expresszió) okozó laci - allélok felett, függetlenül attól, hogy az allél a többi génhez képest cisz (ugyanazon a DNS-molekulán) vagy transz (másik DNS-molekulán a kromoszóma, illetve F jelenti a két DNS-molekulát) helyzetben van-e. A laci gén terméke ezért egy diffúzibilis represszor fehérje. Hogyan működik a represszor? Komplexet kell alkotnia egy DNS-szakasszal, amely a szabályozott gének előtt helyezkedik el. Ez a kitüntetett hely az operátor nevet kapta. Ha ez létezik, kell találni olyan mutációt, amely aktív represszor jelenlétében is (cisz) dominánsan megengedi az expressziót (a termék nem diffúzibilis). Sikerült ilyen mutációt izolálni, s ezt O c (operátor konstitutív) mutációnak nevezték el. A mutáció az I és Z gének közé térképeződött, és csak azon gének megnyilvánulására volt hatása, amelyek vele fizikai kapcsolatban (tehát ugyanazon a DNS-molekulán, cisz helyzetben) voltak (9.3. táblázat) táblázat - A lac operon működésének genetikai analízise II. Genotípus β-galaktozidáz enzimaktivitás indukálás nélkül β-galaktozidáz enzimaktivitás indukálással Fenotípus, következtetés O + Z + (vad) - + ha O +, indukálható O C Z ha O C, konstitutív O C Z - és O + Z ha Z-, nem indukálható O + Z - / F O C Z konstitutív, O C cisz domináns módon hat Az O + (az indukálhatóság megléte) és az O c (indukálhatóság hiánya, konstitutív expresszió) alléleknek csak a velük cisz helyzetben lévő gének expressziójára van hatása. A feltételezett laco gén terméke tehát nem diffúzibilis (nem transz módon ható), hanem egy cisz szabályozó elem, azaz egy DNS-szakasz, mai nevén az operátor régió. Így állt össze a kép: a szabályozás elemei a regulátor gén, az operátor régió és a struktúrgének, amelyek az operátor után rendeződve egy szabályozható egységként alkotják az operont. (Megjegyzés: a modell kidolgozásának lépéseit nem teljes körűen mutattuk be.) 5.4. A lac operonon szerzett tudás hasznosítása napjainkban. A lacz mint riporter gén A riporter gén, valamint terméke, a riporter fehérje könnyen detektálható módon tudósít, közöl információt egy biológiai rendszer állapotáról, működéséről. A lacz volt az elsőként alkalmazott, és máig igen népszerű riporter gén. Az ismertetett kromogén szubsztrátoknak (X-gal, ONPG) köszönhetően a β-galaktozidáz enzimaktivitás könnyen nyomonkövethető nemcsak in vitro (sejtmentes rendszerben), hanem in situ (eredeti környezetben) is. Modellszervezetek széles spektrumán (baktérium, C. elegans, Drosophila, egér) alkalmazható. 171

184 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban Az egyik legelterjedtebb alkalmazása az alapkutatásban a génexpressziós vizsgálatokban van. A géntechnika eszköztárának segítségével a lacz kódoló szekvenciáját beépítik az adott modellszervezet valamelyik saját, vizsgálandó promótere mögé. Ezt a konstrukciót a kérdéses modellszervezetben működtetik, és különböző körülmények, eltérő fejlődési állapotok, különböző szövetek stb. esetén mérik a β-galaktozidáz enzimativitást, mely az őt irányító promóter mindenkori állapotáról nyújt információt. Magát a szabályozható (ki-be kapcsolható) lac promótert (és származékait) is elterjedten alkalmazzák a biotechnológiában. Heterológ fehérjék (idegen fehérjék E. coli-ban történő) termeltetésére alkalmazott rendszerekben az egyik leggyakrabban használt promóter. Segítségével az irányítása alatt álló idegen fehérjét kódoló génről csakis indukció esetén (általában IPTG-vel) történik átírás és fehérjetermelés. Ez azért fontos, mert ezáltal kivitelezhető, hogy a terméket gyártó sejtpopulációt a legmegfelelőbb állapotában késztessük termelésre. A lac rendszer a génklónozás eszköztárának is alapeleme évtizedek óta. A kék fehér tesztet más kurzusok keretein belül (Mikrobiális genetika, Molekuláris biológiai technikák) részletesen tárgyaljuk, ahogyan a fenti pontban érintőlegesen bemutatott alkalmazásokat is. 6. Az ara operon szabályozása Az operon az arabinóz cukor lebontásához szükséges enzimek génjeit és szabályozó elemeiket tartalmazza. Struktúrgénjei: arab, araa, arad, melyekről policisztronos RNS keletkezik. A struktúrgéneket irányító promótert pbad-nak nevezik (p promóter, valamint a gének nevei sorrendben). Az operonon kettős pozitív és negatív szabályozás érvényesül. A szabályozó fehérje az AraC, mely a LacI-hez hasonlóan konstitutív módon termelődik. Az AraC a promóter környezetében lévő két DNS-régióhoz (I és O) egyszerre kötődve a DNS hurokképződése által gátolja az RNS-polimeráz működését, tehát represszorként működik, és felelős a negatív szabályozásért. Az indukálószer itt is a szubsztrát, az arabinóz. Az arabinóz AraC komplex azonban nem válik le mindkét kötőhelyről: az O régiót kötésben tartja, és aktivátorként működik. Ez az egyik pozitív szabályozás. A másik pozitív szabályozás a lac operonnál már megismert camp CRP által valósul meg itt is. Az arabinózzal indukálható pbad promóter-t szintén előszeretettel alkalmazzák heterológ fehérjetermeltetéskor. A lac promóterhez képest gyengébb promóterről van szó, ami mérsékeltebb termelésre ad lehetőséget. Sok esetben a lassabb termelés előnyös. 7. A trp operon szabályozása Az E. coli triptofán (trp) operonjának géntermékei, a sejt szükségleteinek megfelelően, triptofán aminosavat állítanak elő. Érdekes módon az operonban a gének sorrendje megegyezik a géntermékek reakcióútban elfoglalt sorrendjével is (9.9. ábra). A triptofán operonon negatív szabályozás érvényesül: alapállapotban a működő operont a végtermék magas szintje kikapcsolja, azaz ha a sejtben megnő a szabad triptofán szintje, akkor az transzkripciós szinten negatívan visszahat a triptofán szintézisét végző enzimek expressziójára. A negatív szabályozás úgy valósul meg, hogy a triptofán az operon represszor fehérjéjéhez kapcsolódik mint korepresszor, elősegítve ezáltal annak operátor régióhoz kötődését, így gátolva az RNS-polimeráz működését (9.9. ábra) ábra - A trp operon negatív szabályozása a represszor fehérje és a triptofán mint korepresszor által 172

185 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban Az operon genetikai analízise során felfigyeltek arra, hogy a represszor mutánsok továbbra is képesek szabályozni az enzimek képződését a triptofán szint függvényében. Ez a felismerés egy második, az előzőt kiegészítő negatív finomszabályozás felderítéséhez vezetett, melyet attenuációnak (csillapítás) neveztek el. Ez a finomszabályozás a represszor génen kívül térképeződő deléciós mutáció által szűnt meg. A deletált (kiesett) szakasz a policisztronos mrns elejét meghatározó génrégiót érintette. Az általa meghatározott mrns-részt leader (vezető) szakasznak nevezték el. A leader mrns-szakasz szekvenciája speciális, kulcsfontosságú a finomszabályozás mechanizmusában. A leader mrns-résznek négy kitüntetett szakasza van (1, 2, 3, 4, lásd ábra), melyek által a molekularész kétféle másodlagos szerkezetet vehet fel: az 1+2 és a 3+4 szakaszok kapcsolódnak komplementer bázisok által a 2+3 szakaszok kapcsolódnak komplementer bázisok által. A leader szakaszról egy rövid, 14 aminosavból álló peptid képződik. A peptid szintézisének végeit kijelölő START és a STOP kodon közé esik a leader mrns 1-es szakasza. Ez az 1-es szakasz két egymást követő triptofán kodont tartalmaz. Emlékezzünk arra, hogy prokarióta szervezetről lévén szó, a transzkripció és a transzláció szorosan kapcsolt: az RNS-polimeráz által hátrahagyott mrns elejéhez azonnal riboszóma kapcsolódik, és az RNS-polimerázt követve elkezdi a még szintetizálódó mrns-ről a transzlációt. Amikor a riboszóma az 1-es szakaszhoz ér, felbomlanak az mrns 1-es és 2-es szakaszai közötti másodlagos kötések. A transzláció sebességét az 1-es szakaszon lévő két trp kodonnál a triptofánt szállító trp-trns (mely arányos a sejtben lévő triptofán szinttel) hozzáférhetősége befolyásolja. Az 1-es szakasz területén a riboszóma gyorsan áthalad, vagy stagnál az alábbiaknak megfelelően: Ha sok a triptofán (van elég trp-trns), a riboszóma fennakadás nélkül beépíti a két egymást követő triptofánt a leader peptidbe, tehát gyorsan végighalad az mrns 1-es szakaszán, és eléri a 2-es szakaszt. Emiatt a szintetizálandó mrns 2-es szakasza fizikailag nem képes a 3-as szakasszal komplementer párosodást kialakítani. A 3-as szakasz így a legutóbb képződő 4-es szakasszal alakít ki bázispárosodással egy hurok (hajtű, hairpin) szerkezetet, amelyet U-füzér követ. Ezzel kialakul egy transzkripció terminációs szignál -független termináció). Ennek hatására az RNS-polimeráz leválik, nem viszi végbe a mrns további 173

186 A génkifejeződés szabályozása prokariótákban szintézisét, tehát az enzimek kódoló szakaszait már nem írja át. Leáll a triptofán bioszintézis enzimeinek termelése. Ha kevés a triptofán (nincs elég trp-trns), a riboszóma a mrns 1-es szakaszánál stagnál, vár az érkező trptrns-re. Ekkor a 2-es és 3-as szakaszok párosodnak, és nem alakul ki a 3+4-es szakaszok általi transzkripció terminációs jel. Az RNS-polimeráz tovább halad, átírja a struktúrgéneket egy policisztronos mrns-be, melyről a triptofán bioszintézis enzimei képződnek. Az attenuáció tehát egy transzkripció termináció általi szabályozási forma. A triptofán operonon kívül több más, aminosavszintézisben részt vevő operonon is érvényesül hasonló regulációs mechanizmus ábra - A trp operon szabályozása attenuációval a) a leader mrns szerkezete b) és c) a leader mrns szekvenciája és a transzkripció terminációs szabályozás szemléltetése 174

187 10. fejezet - A génkifejeződés szabályozása eukariótákban 1996-ban az első klónozott emlős, Dolly birka híre végigfutott a világon. Dollyt szomatikus sejt (emlőszövet sejt) magjának enukleált (magjától megfosztott) petesejtbe ültetésével hozták létre. A korai stádiumú embriót álvemhes (hormonálisan felkészített) nőstény uterusába ültették. Azóta hallhattunk hasonló technikával klónozott szarvasmarháról, galambról, egérről és más állatokról. A tudományos társadalom is nagy megdöbbenéssel fogadta Dolly hírét, hiszen a tudomány akkori álláspontja szerint nehezen volt elképzelhető, hogy differenciált szomatikus sejt diploid magja alkalmas lehet egy új egyed kialakításához szükséges genetikai információ biztosítására. Dolly klónozásának sikeressége arra mutatott rá, hogy a többsejtű szervezetek differenciált sejtjeinek genetikai anyaga nem szenved olyan irreverzibilis változást, mely megakadályozná egy új egyed fejlődésére vonatkozó program végbemenetelét. Néhány kivételtől eltekintve, általánosnak mondható, hogy egy többsejtű élőlény sejtjei ugyanazt a genomot hordozzák, azaz jellemző rájuk a genomi ekvivalencia (genomi megegyezőség), mégis különböző fehérjéket tartalmaznak, ebből fakadóan eltérő a felépítésük és a működésük. Az egyedfejlődés és a sejtek, szövetek differenciált állapotának fenntartása a genom génjeinek differenciális expresszióján (eltérő kifejeződésén) alapul ábra - Dolly, az első klónozott emlős az egyik anyjával Egy taxonómiai csoport komplexitásának mértékét a szervezet sejtféleségeinek száma sokkal inkább kifejezi, mint pusztán az élőlény összes génjeinek száma. Az igazán izgalmas kérdés az, hogyan képes egy élőlény a genomját használni, milyen szabályozási mechanizmusokkal valósítja meg egyes sejttípusainak génkifejeződési mintázatát, ezáltal egyediségét ábra - Az eukarióta gének transzkripcionális szabályozása az egyszerűbb mechanizmusoktól a komplex szabályozási rendszerekig valósulhat meg a) Egy eukarióta sejt egyszerű transzkripcionális génszabályozási rendszere b) Egy többsejtű eukarióta szervezet génszabályozási elemei (részletek később a szövegben) 175

188 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban A fehérjekódoló gének szerepe hosszú évtizedekig kiemelt figyelmet élvezett a tudományban. Ez érthető, hiszen fehérjék határozzák meg a biológiai tulajdonságokat (szerkezet, enzimaktivitások stb.). A genomika ágazat, valamint a molekuláris genetikai kísérletes eszköztár fejlődése gyökeresen változtatta és változtatja meg a genomok működésével kapcsolatos elképzeléseinket. A humán genom körülbelül 98%-a nem kódol fehérjét. Mi tehát a funkciója? Valószínűtlen, hogy hulladékként maradt volna fenn, és értelmetlenül adódna át a sejtosztódások során. A gének kifejeződésének szabályozásával kapcsolatos mechanizmusok egyre jobb megértése közelebb visz minket a fenti kérdés megválaszolásához. A bioinformatikai eszközök fejlődése, a rendszerbiológiai szemlélet további érdekességekre világít rá. Például a sejtekben fellépő fehérje interakciók száma, minősége (az ún. interaktóm) alapvetően meghatározza a sejtek működését. Az interaktóm hálózatok feltérképezése napjaink egyik nagy kutatási kihívása. 1. A génkifejeződés szabályozásának szintjei Eukarióta sejtekben a gének kifejeződésének szabályozása több szinten valósulhat meg. A génkifejeződés szabályozható a DNS mrns fehérje útvonal bármely lépésénél: Transzkripcionális szabályozás: milyen gének, mikor és hol íródjanak át RNS-sé. Szelektív RNS-érés és alternatív splicing: mely elsődleges transzkriptumok válnak mrns-é, valamint milyen mrns-ek alakulnak ki az elsődleges transzkriptumból. RNS-transzport szabályozás: mely érett mrns-ek jutnak ki a sejtmagból a citoplazmába. Transzlációs szabályozás: mely mrns-ek fordítódnak le a citoplazmában fehérjévé. mrns degradációs szabályozás: bizonyos mrns-molekulák szelektív módon lebontásra kerülhetnek. Fehérjeaktivitás szabályozása: fehérjemolekulák poszttranszlációs szabályozása (aktiváció, inaktiváció, kompartmentalizáció, degradáció). 2. Transzkripcionális szabályozás Az eukarióta génszabályozás sokban hasonlít a bakteriális mechanizmusokhoz. Mindkét sejtféleségben kiemelt fontosságú a transzkripcionális szabályozás, melynek alapja, hogy a DNS-molekula specifikus szekvenciáihoz regulátor fehérjék kötődnek. A szabályozó elemeket szokás az alábbiak szerint felosztani: 176

189 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban cisz módon ható szabályozó elemek: ide tartoznak a szabályozásban részt vevő DNS-szakaszok, melyek csak a velük megegyező DNS-molekula génjeit képesek szabályozni transz módon ható szabályozó elemek: ide soroljuk a transzkripciót szabályozó fehérjéket, melyek diffúzibilis molekulák, minden jelen lévő DNS-molekulán képesek hatni. Az eukarióta sejtekben sokkal nagyobb a gének száma, mint a prokariótákban (néhány ezer helyett akár néhányszor tízezer), ráadásul az eukarióták génjei nagyobbak és bonyolultabbak. Bizonyos szabályozó szekvenciák a transzkripció starthelyétől akár több tízezer bázispárnyira is lehetnek, és reguláló faktorok egész sorára lehet szükség a gének megfelelő szabályozásához. Eukariótákban a gének kifejeződésének transzkripcionális szabályozása két tényező összjátékával valósul meg: strukturális sajátságok: a DNS csomagoltságának mértéke transzkripcionális faktorok (transzkripciót szabályozó fehérjék) hatása Foglaljuk össze újra az eukarióta transzkripció jellemzőit: a transzkripció és a transzláció külön térben, egymástól jól elválasztva zajlik háromféle RNS-polimeráz: pol-i, pol-ii, pol-iii van jelen a transzkripció szabályozása jelentős részben aktiváló jellegű: a promóter és az RNS-polimeráz önmagában nem elég a transzkripció elindításához a kromatinszerkezet gátolja a transzkripciót transzkripciós egységenként egy fehérjekódoló szakasz jellemző (monocisztronos mrns), az operonok igen ritkák az mrns érési folyamatokon megy keresztül, mielőtt kijutna a sejtmagból 2.1. Cisz regulátor elemek: a promóter Az eukarióta gének promóterei összetettek, több konzervált DNS-szekvenciát tartalmaznak. A core (alap, minimál, mag) promóterről és az alap transzkripciós faktorokról a transzkripció témakörnél már esett szó. Kiemeljük újra, hogy az RNS-polimeráz önmagában nem tud kötődni a DNS-hez. Az iniciáció számos fehérje fehérje kölcsönhatás által valósul meg. A magpromóter több konszenzus szekvenciát tartalmaz. A TATA-bokszon kívül jellemző a transzkripciós starthely (+1 hely) körüli ún InR (iniciátor régió), valamint a strathelytől nukleotiddal 3 irányban elhelyezkedő DPE (downstream promóter elem) konzervált régiók is. Az InR minden promóternél jelen van, a másik két elem (TATA-boksz, illetve DPE) közül elegendő csak az egyik jelenléte egy alap promóter működéshez. A minimál eukarióta promóter önmagában nagyon gyenge. További cisz aktivátor elemek (DNS-szekvenciák) szükségesek a jobb működéshez, melyeket szokás szabályozó promóternek vagy aktivátor szekvenciáknak vagy promóter proximális elemeknek is nevezni. Ezek a konzervált szakaszok különböző aktivátor fehérjék kötődését segítik elő. Az aktivátor szekvenciák a magpromótertől upstream (5 irányban) körülbelül 500 bp-on belül találhatók. A CAAT-boksz az első megismert aktivátor szekvencia, mely a promóter hatásfokát növeli. A másik gyakori elem a GC-boksz (GGGCGG szekvencia, sokszor több kópiában). További szabályozó promóter elemek is ismertek. A különböző gének szabályozó promóterei e konzervált szekvenciák egyedi kombinációit tartalmazzák ábra - Egy eukarióta gén szerkezete a magpromóterrel és promóter proximális elemekkel 177

190 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban 2.2. Távolból ható cisz regulátor elemek: enhancerek, silencerek Az enhancerek olyan DNS-szakaszok (tipikusan néhány száz bp hosszúságúak), melyek távolról képesek a transzkripció mértékét fokozni, s a gén maximális aktivitásához járulnak hozzá. A távoli hatás akár több kilobázispárt is jelenthet, például a T-sejt receptor alfa alegységét kódoló gén enhancere 9 kbp távolságra helyezkedik el a promótertől. A legelfogadottabb modell szerint az enhancer hatása úgy valósul meg, hogy a hozzá kötődő aktivátor fehérjék a DNS kihurkolódása révén kerülnek kapcsolatba az alap transzkripciós apparátussal, vagy a szabályzó promóterhez kötődő fehérjékkel. Az enhancerhez kötődő aktivátor fehérjék magukhoz vonzhatnak kromatin szerkezetet befolyásoló (átépítő, fellazító) koaktivátor fehérjéket is (10.4. ábra). Élesztőben az enhancer sajátságú szekvenciákat UAS (upstream activator sequences) elemeknek nevezik, melyek a promótertől csak 5 irányban elhelyezkedve működnek. Magasabbrendű eukariótákban az enhancer elemek változatos pozíciókat foglalhatnak el: a géntől (promótertől) 5 irányban, a génen belül, vagy akár a gén után 3 irányban. További jellegzetesség, hogy bár az enhancerek meghatározott szekvenciájú szakaszok, hatásuk orientációtól független. Egy gén transzkripcióját több enhancer is szabályozhatja. Az enhancerek a környezetük minden promóterére képesek hatni, hatásukat azonban inzulátor szakaszok (határoló DNS-elemek) korlátozzák. Az enhancer és a promóter közé helyezett inzulátor megakadályozza, hogy az enhancer hasson a promóterre. Bizonyos inzulátorok a kromatin konformáció változás továbbterjedését akadályozzák meg. Ismerünk transzkripciót gátló távoli cisz elemeket is, ezeket silencereknek nevezzük. A silenceren keresztül ható szabályozó fehérjék gátolják a transzkripciót ábra - Az enhancerhez kötődő aktivátor fehérjék távolba hatása a DNS meghajlása révén valósul meg 178

191 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban Egy stimulus egyszerre több gén működését is képes szabályozni, például hőstressz, nehézfémstressz, hormonhatás következtében összehangolt génexpresszió változás tapasztalható. A közösen szabályozott gének közös cisz szabályozó elemekkel rendelkeznek. Ezeket a jól definiált cisz szabályozó szekvenciákat válasz elemeknek (response elements, RE) nevezik, és a szabályozó promóter vagy az enhancer régiókban helyezkednek el. Néhány példa: hősokk válasz elem HRE, ösztrogén válasz elem ERE, glükokortikoid válasz elem GRE, fém válasz elem MRE. A konzervált kötőhelyek ismerete és a bioinformatikai eszközök alkalmazása kellő alapot szolgáltathat új szabályozási utak felderítéséhez Transz regulátor elemek: a transzkripciós faktorok Eukariótákban transzkripciós faktoroknak (TF) nevezzük azokat a transzkripcióban részt vevő szabályozó fehérjéket, melyek a bemutatott cisz szabályozó elemekhez kapcsolódva befolyásolják a génátírást. A TF-ek a transzkripciót pozitívan vagy negatívan befolyásolhatják. A TF-ek száma élesztőben körülbelül 300, emberben körülbelül Ez azt jelenti, hogy élesztőben kb. 20, emberben kb. 10 génre jut egy TF. Egy gén szabályozásában a TF-ek különféle kombinációi vesznek részt, ami a genetikai válaszreakciók számát óriásira növeli már a transzkripcionális szabályozás szintjén. A transzkripció hatásfokát a génen ható összes TF együttes hatása szabja meg. Mivel a TF-ek kulcsfontosságúak egy szervezet fejlődése során, egy TF-gén deléciója gyakran súlyos fejlődési rendellenességekhez vezet. Például a Drosophila egyik mutánsánál (ún. Antennapedia) egy transzkripciós faktor hibája folytán az antenna imaginális korongból láb fejlődik csáp helyett (10.5. ábra) ábra - A Drosophila Antennapedia mutánsa 179

192 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban A TF-ek által felismert DNS-szekvencia motívumok rövid, 6 10 bp hosszúságú szakaszok. A DNS egy szakaszának 3D szerkezete a TF-ek számára hasznosítható információt rejt: a bázisok szélei a DNS nagy árkában felismerhetők. A TF-ek kapcsolatba lépnek egymással és az RNS-polimerázzal. Gyakoriak a homovagy heterodimerként funkcionáló TF-ek. A TF-ek moduláris szerkezetű fehérjék, s az alábbi domének kombinációit hordozhatják: DNS-kötő domén, mely által a DNS specifikus szakaszaihoz kötődnek fehérjekötő domén, mely által kapcsolatot teremtenek más TF-ekkel, vagy az RNS-polimerázzal a kromatinszerkezetet befolyásoló domén a különféle fiziológiai hatásokat érzékelő domén (például hormonkötő domén a nukleáris hormonreceptoroknál, melyek valamely hormon kötésével aktív transzkripciós faktorként működnek) A transzkripciós faktorokat a DNS-kötő domén szerkezete alapján négy fő csoportba, funkcionális szempontok szerint pedig számos családba sorolják. A DNS-hez kötődő motívumok szerkezetileg az alábbiak lehetnek (10.6. ábra): hélix-fordulat-hélix (helix-turn-helix) cink-ujj (zink-finger) leucin cipzár (leucine zipper) hélix-hurok-hélix (helix-loop-helix) Ez a sajátság teremti meg az alapját a TF-ek egyféle csoportosításának. Csoporton belül a fehérjék DNS-kötő régiójának szerkezete hasonló ugyan, de a régiók aminosavsorrendje közötti kisebb-nagyobb különbségek miatt, illetve más faktorokkal való kölcsönhatásuk eredményeképpen más-más DNS-szekvenciákhoz kötődnek. Megjegyezzük, hogy a fenti négy csoportba nem sorolható be minden TF, a finomabb csoportosítás érdekében további típusokkal is találkozhatunk a szakirodalomban. Nem minden TF rendelkezik DNS-kötő doménnel, például a koaktivátorok fehérje fehérje kölcsönhatással kapcsolódnak a transzkripciót szabályozó komplexhez ábra - Transzkripciós faktorok DNS-kötő doménjeinek szerkezete 180

193 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban Funkcionális szempontok, doménszerkezet, szekvencia hasonlóság alapján a TF-eket számos családba sorolják. Internetes adatbázisok is rendelkezésre állnak, melyekben összegyűjtik az ismert, illetve a genomszekvenálások adataiból feltételezhető TF-ek adatait. Az adatbázisokban különféle szempontok szerint (például faj, TF-család) lehet keresni. Ezen adatbázisok előnye, hogy hivatkozásokat tartalmaznak számos más adatbázishoz, így némi keresgélés során rengeteg információhoz juthatunk. A jegyzet írásakor elérhető két legnagyobb TF-adatbázis: (Ezeken kívül egy-egy modellszervezetre specifikus TF-adatbázisok is léteznek.) AnimalTFDB, Animal Transcription Factor Database állati szervezetek TF-adatbázisa Az adatbázis jelenlegi tartalma: 72 család, körülbelül tag (10.7. ábra) PlnTFDB, Plant Transcription Factor Database növényi szervezetek TF-adatbázisa Az adatbázis jelenlegi tartalma: 84 család, körülbelül tag (10.8. ábra) ábra - Állati szervezetek transzkripciós faktor adatbázisában jelenleg fellelhető transzkripciós faktorok (TFs), kofaktorok (CoFs) és kromatin remodeling faktorok (CRFs) száma taxonómiai egységenként 181

194 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban ábra - Növényi szervezetek transzkripciós faktor adatbázisában jelenleg fellelhető transzkripciós faktor és más transzkripcionális regulátor (kofaktorok, kromatin remodeling faktorok) családok 182

195 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban A TF-ek a transzkripciót pozitívan vagy negatívan befolyásolhatják. Az enhancerekhez kötődő aktivátor hatású transzkripciós faktorok közvetlenül vagy koaktivátor, illetve mediátor fehérjéken keresztül kapcsolódnak az alap transzkripciós komplexhez (10.4. ábra). A kapcsolat elősegíti a komplex összeszerelődését, és/vagy stabilizálja, aktiválja azt. A koaktivátor fehérjék egy részének a kormatinszerkezetet módosító aktivitása van (lásd később). Ezeket a TF-típusokat a csoportosítás során szokás elkülöníteni, és kromatin módosító faktoroknak nevezni. Eukariótákban a prokariótáknál megismert típusú kifejezett represszorok nincsenek, ezért gyakran nem is represszoroknak, hanem silencer (csillapító) fehérjéknek nevezik őket. Ezek a fehérjék gátolják az aktivátor fehérjék hatását, miközben maguk is specifikusan kötnek a DNS-hez, de sohasem az RNSpolimeráz működését akadályozzák közvetlenül, mint prokariótákban. A silencer fehérjék hatása megvalósulhat úgy, hogy versenyeznek az aktivátor fehérjékkel a kötődésben, de maguk nem aktiválnak, vagy úgy, hogy destabilizálják az alap transzkripciós komplexet. A szabályozó promóter elemekhez, valamint az enhancerekhez és silencerekhez kötődő transzkripciós faktorok sejten belüli jelenléte meghatározó a gének transzkripcionális szabályozásában. Egy gén a cisz szabályozó szekvenciáival együtt (többsejtű szervezetben) minden sejtféleségben jelen van, de a szabályozó transz elemek nélkül a génről nem történik, vagy csak igen alacsony szintű (ún. bazális) átírás történik. A génspecifikus transzkripciós faktorok több tíz- vagy százszorosra fokozzák a gén átírásának mértékét. Ahogy már említettük, vannak olyan gének, melyek termékére minden sejtféleségben szükség van, ezeket háztartási (housekeeping) géneknek nevezzük. A háztartási gének azonos promóter proximális elemekkel rendelkeznek, amelyekre specifikus aktivátor fehérjék minden sejttípusban jelen vannak. Ez biztosítja, hogy ezek a gének minden sejtben folyamatosan átíródjanak. Más gének termékére viszont csak bizonyos sejtféleségekben, vagy a sejt életének meghatározott szakaszában, vagy a sejtet érő különféle hatások esetében van szükség. Ez utóbbiak lehetnek a sejt szempontjából külső, illetve belső fiziológiás hatások. (Külső hatások például: sejtfelszíni receptor felől szignáltranszdukciós útvonal által közvetített hatás, stresszhatások; belső hatás például: hibák felhalmozódása a DNS-ben.) Ezek a nem állandóan expresszálódó gének egyedi szabályozó cisz elemekkel rendelkeznek. A specifikus szabályozó 183

196 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban transzkripciós faktorok egyedfejlődési szakasztól, sejttől, szövettől, időtől és más tényezőktől függő jelenléte, illetve aktivitása teszi lehetővé, hogy csak a meghatározott helyen és időben íródjon át magas szinten az adott gén. A ábra a szérum albumin példáján szemlélteti a gén májszövet-specifikus expressziójának szabályozó transzkripciós faktoroktól való függését ábra - Egy gén szövetspecifikus transzkripciója a szabályozó transzkripciós faktorok jelenlététől és aktivitásától függ Mi befolyásolja az adott sejt aktív transzkripciós faktor populációját? Sok transzkripciós faktor kizárólag specifikus szövetekben képződik. Transzkripcionális szabályozásukért ahogyan más géneknél is specifikus cisz regulátor szekvenciák és az ezekhez kötődő transzkripciós faktorok felelősek. A transzkripciós faktorok tehát nemcsak szabályozzák más gének kifejeződését, hanem azok kifejeződése is szabályozódik. Ennek megfelelően génszabályozási hierarchiák alakulnak ki, amelyeknek csúcsán a mestergén áll. Ha a mestergén szabályozó szakaszában van olyan elem, melyen keresztül a saját átíródását serkenti, kialakulhat egy egyszerű sejtmemória mechanizmus. A sejtmemória alapja már az egyedfejlődés igen korai szakaszában tetten érhető a zigótát létrehozó petesejt citoplazmájában lévő ún. morfogének (ezek a formát kialakító molekulák, zömében transzkripciós faktorok vagy azok mrns-ei) gradiensszerű megoszlása által. A morfogének koncentrációja már a korai, néhány sejtes embrionális fejlődési szakaszban különböző lesz az egyes sejtekben (ennek oka az eleve gradiensszerű megoszlásuk a zigótában), tehát a sejtek egyedi, egymástól eltérő transzkripciós faktor populációval fognak rendelkezni. Ezek a génszabályozási kaszkád csúcsán álló TF-ek megteremtik a differenciálódás alapját. A transzkripciós faktorok kifejeződése nemcsak transzkripcionális szinten, hanem az azt követő génexpressziós lépések valamelyike (lásd fent) által is szabályozható. Gyakori a foszforiláció defoszforiláció általi 184

197 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban poszttranszlációs aktivitás szabályozás. A tiol-diszulfid redox átalakulás számos stresszválaszban fontos transzkripciós faktor aktivitását befolyásoló poszttranszlációs módosítás. Az alternatív splicing is vezethet aktív vagy inaktív TF formákhoz (lásd a Drosophila ivarmeghatározási rendszere). A hormon-receptor komplex kialakulása egy további aktiválási lehetőség (például az intracelluláris szteroid receptoroknál). 3. Epigenetikai szabályozás Az epigenetika a genetika dinamikusan fejlődő, napjainkban igen népszerű kutatási ágazata. Az epigenetika tárgykörébe tartoznak azok a genomot érintő jelenségek, melyek a DNS-szekvencia felett, kívül állnak. A genom olyan sajátságai tartoznak ide, melyek nem a DNS nukleotidsorrendjét érintik, de mitotikusan, vagy akár meiotikusan is átörökíthetőek. Epigenetikai szabályozáson az epigenetikai tulajdonságok megváltozásával járó génexpressziós szabályozást értjük. A mai tudásunk szerinti epigenetikai jelenségek a kromatin szerkezetét meghatározó hisztonmódosulások és a DNS-metilációs mintázatok. Mindkét jelenség alapvetően kihat a gének transzkripcionális szintű kifejeződésére. Ma már életünk szinte minden területét összefüggésbe hozzák többé vagy kevésbé megalapozott módon epigenetikai jelenségekkel. Habár mindent nem magyarázhatunk általa, tény, hogy a terület fejlődése jelentősen hozzájárul a genom működésének egyre jobb megértéséhez. A genetika epigenetika nevezéktan mintájára a genom genetikai kód genetikai térkép kifejezésekkel párhuzamosan használjuk az epigenom epigenetikai kód epigenetikai térkép kifejezéseket a teljes genomra vagy egy genomszakaszra jellemző hisztonmódosulások és DNS-metilációs mintázatok leírására A dinamikus kromatin Elevenítsük fel a kromatin szerkezetére vonatkozó ismereteinket: a DNS bázikus oldalláncokkal rendelkező hiszton és nem-hiszton fehérjékkel összekapcsolódva tömörül, ez a fehérje DNS szerkezet a kromatin a kromatinszerveződés több szinten valósul meg a kromatintömörülés mértéke a sejtciklus során és DNS-régiónként változik (interfázisban laza, mitózis és meiózis során tömör; a heterokromatin régiók, az eukromatinnal szemben, az interfázisban is erősen kondenzált részek). Ebben a fejezetben látni fogjuk, hogy a kromatin szerepe nemcsak a DNS kondenzációjának biztosítása, hanem a DNS működésének szabályozása is. Leegyszerűsítve azt mondhatjuk, hogy az eukarióták DNS-ének kromatinszerkezetbe szerveződése a gének működésére (a transzkripcióra) negatív hatással van. Az eukarióta gének alapértelmezett állapota ezért a kikapcsolt állapot. Annak érdekében, hogy a gének átírását kijelölő szabályozó szakaszok a transzkripciós apparátus számára hozzáférhetővé váljanak, szükség van a kromatin szerkezet meghatározott területeken történő fellazítására. A kromatinszerkezetet befolyásoló számos fehérjekomplexet és mechanizmust azonosítottak a közelmúltban. A legismertebb epigenetikai módosulások: 1) hisztonváltozatok beépülése a nukleoszómákba, 2) a hisztonok kovalens módosítása acetiláció, metiláció, foszforiláció által, 3) a nukleoszómák átépítése ( ábra) és 4) a DNS metilációja. A kromatinmódosulások lehetnek stabilak egy élőlény teljes élete során, így járulva hozzá egy állandó génkifejeződési mintázat kialakulásához. A jelenség azonban nem irreverzibilis. Rákos sejtekben például gyakoriak a kromatinszerkezeti változások. Az ivarsejtek kialakulása során az epigenom szintén jelentős változásokon esik át ábra - A kromatin szerkezetét befolyásoló epigenetikai jelenségek 185

198 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban Hisztonvariánsok A nukleoszómák magját kialakító hisztonfehérjékből álló oktamer kanonikus tagjai: 2-2 darab H2A, H2B, H3, H4. A nukleoszómák szerkezete a DNS-replikáció során alakul ki, ez a szerkezet azonban változhat. Az alap hiszton fehérjék kicserélődhetnek hiszton változatokra, valamint kovalens módosulásokon eshetnek át. Ezek a mechanizmusok hatással vannak a lokális kromatinszerkezetre, így jelentős szerepük van a génátírás szabályozásában. A H2A.Z fehérje a H2A hiszton egyik változata, mely inaktív gének promóter régiójában fordul elő. Érdekes módon a H2A.Z hisztonváltozat nem a replikációkor épül be, hanem később egy kromatin remodeling komplex (SWR1) ATP-függő módon katalizálja a H2A hiszton kicserélését H2A.Z-re. Egy másik hisztonvariáns a CENP-A ( ábra), melyet immunfluoreszcens festés alapján a centromer környékéhez kapcsolódó fehérjeként azonosítottak. A CENP-A egy H3 hisztonváltozat. A hiszton változatok egyedi, nukleoszómából kinyúló farkai lehetővé teszik egyedi regulátor fehérjék kötését ( ábra). Hisztonok kovalens módosítása A kanonikus hisztonfehérjék poszttranszlációs kovalens módosítása befolyásolja a DNS-kötést. A módosulások reverzibilisek, s meghatározott aminosav oldalláncokon történnek, melyek közül leggyakoribbak: acetiláció és metiláció lizin amino-csoportján, foszforiláció szerin hidroxil-csoportján ( ábra). Egy genomi régió működéséhez a hisztonmódosulások mintázata rengeteg információt rejt, ezért ezekre a mintázatokra használjuk a hiszton-kód elnevezést. A hisztonacetiláció elősegíti a transzkripciót, legalább kétféle mechanizmus által: 1) lazítja a hiszton DNS kapcsolatot, mert csökkenti a hisztonfarok pozitív töltését, 2) befolyásolja a szabályozó fehérjék kötődését. Az acetilációért felelős hiszton-acetiltranszferáz (HAT) aktivitású fehérjék fokozzák, a hiszton-deacetilázok (HDAT) pedig mérséklik a transzkripciót ábra - A hisztonok kovalens módosítása (metiláció, acetiláció, foszforiláció) és hiszton változatok (például CENP-A) beépülése a nukleoszómába befolyásolja a kromatin szerkezeti és funkcionális sajátságait 186

199 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban A legújabb kísérleti eredmények szerint (Drosophilá-ban) DNS-replikációkor a szülői módosított hisztonok nem jutnak át a leány DNS-be. Ehelyett a DNS replikáció után új nukleoszómák szerelődnek össze a frissen szintetizált, módosítatlan hisztonokból. Úgy tűnik, hogy a hiszton módosító fehérjék képesek ellenállni a DNSreplikációs szerkezeten való áthaladásnak. Ott maradnak a kötőhelyükön megülve, és minden valószínűséggel később újra elvégzik a hisztonok módosítását, így véglegesítve a kromatin struktúrát, amely később a gének aktivációját vagy represszióját határozza meg. Nukleoszóma-átépítés (remodeling) Ismerünk olyan multiprotein komplexeket, melyek ATP hidrolíziséből származó energia felhasználásával képesek a nukleoszómák mobilizálására, átstrukturálására. Az átépítés pontos mechanizmusa nem ismert, feltételezhető, hogy a DNS és a hisztonok közötti kapcsolat felbontásával képesek a DNS irányított elcsúsztatására a hiszton-oktamer körül, vagy adott nukleoszóma hisztonjainak eltávolítására. Mindkét modell szerint a nukleoszómába csomagolt target DNS-szakasz hozzáférhetősége nő. Ma öt családba sorolják a remodeling fehérjéket. Legismertebb az SWI/SNF komplex, melynek első képviselőjét élesztőben írták le, majd sok más szervezetben is. A komplex tagjai interakcióba lépnek transzkripciós faktorokkal, nukleáris mátrix fehérjékkel, centromer komponensekkel; fontos szerepük van a sejtciklus szabályozásában (a sejtciklus szabályozásában részt vevő gének transzkripcionális szabályozásában) és a kromoszóma-szerveződésben. A komplex humán ortológjai tumor-szupresszor gének, hibájuk a sejtosztódás kontrolljának felborulásához vezet. 187

200 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban 3.2. DNS-metiláció A DNS metilációs mintázata szintén epigenetikai jelenség (nem tévesztendő össze a hisztonok metilációjával). A metiláció a citozinbázisokon történik, 5-metil-citozin kialakulását eredményezve. Ez az epigenetikai jelenség gerinces állatokban és növényekben fordul elő. A citozinmetiláció a transzkripcionálisan nem aktív gének szabályozó régióira jellemző. Ebből következik, hogy a DNS-metiláció valószínűsíthetően gátolja a transzkripciót. A citozinmetiláció az egymás melletti CG nukleotidoknál történik (a komplementer szálon is CG található 5 3 irányban olvasva). Ez megmagyarázza a metilációs mintázat átörökítését a sejtosztódások során: ha a szülői DNS-szál metilált egy CG helyen, akkor az újonnan szintetizált DNS-szál citozinja is metilálódik az adott nukleotid párnál, DNS-metiltranszferáz (DNMT) enzimek által ( ábra). Közismert, hogy az 5-metil-citozinok mutációs forrópontként viselkednek (lásd Mutációk fejezet), hiszen spontán dezaminációjuk timin kialakulásához vezet. Feltételezhető, hogy emiatt a CG szekvenciarészek nagy része az evolúció során kikopott a genomokból. Megmaradtak viszont azokon a részeken, melyeken regulációs szereppel bírtak, és emiatt szelekciós nyomás alá estek. Ma ezzel magyarázzák a gének szabályozó régióiban fennmaradt CpG-szigeteket (több CG szekvencia rövid szakaszon, a p a cukorfoszfát gerincet jelzi, utalva a C és G nukleotidok egymás melletti, egy szálon való elhelyezkedésére). A DNS metilációja és a hisztonok módosulása gyakran együtt jár, s ma úgy látszik, hogy ezek egymást kiegészítő szabályozási formák. A metilezett DNS-szakaszokhoz jellegzetes fehérjék kötődnek. Ezekhez hiszton deacatilázok is kapcsolódhatnak, melyek tovább stabilizálják a gén inaktív állapotát ( ábra). A metilcsoportok eltávolítása során rendszerint acetiltranszferázok is megjelennek, és segítik a nyitott kromatinszerkezet kialakítását. Az ivarsejtek kialakulásakor a genomon végigfut egy demetilációs hullám, és az embrionális fejlődés során kialakul a de novo (újonnan képződő) metilációs mintázat a sejtekben, ami aztán a sejtosztódások során ún. fenntartó metilációval többnyire stabilan fennmarad ( ábra). Ezen a területen még igen sok a megválaszolatlan kérdés, főként az embrionális epigenetikai újraprogramozás hátteréről tudunk keveset ábra - A DNS-metiláció egy epigenetikai jelenség, mely befolyásolja a kromatin szerkezetét és a gének kifejeződésének mértékét 188

201 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban A DNS-metiláció szerepet játszik a szülői imprintingben, az emlősök X-kromoszóma inaktivációjában, a centromer körüli kromatinrégiók kondenzált szerkezetének kialakításában. Szabálytalan metilációs mintázat rákos sejtekben is gyakori, például alapvetően kifejeződő tumorszupresszor gének promóterének de novo hipermetilációja a gén csendesítéséhez vezet, ami ekvivalens az adott gén funkcióvesztéses mutációjával. A centromer régió DNS-ének hipometilációját is leírták bizonyos rákos sejtekben; ekkor a centromer szerkezetének megbomlása a genom instabilitásához vezet. A mozgó genetikai elemek (helyüket változatni képes DNS-szakaszok) mozgásának visszaszorításában is igazolták a DNS-metiláció szerepét, tehát ezáltal ez a mechanizmus hozzájárul a genomi átrendeződések megakadályozásához Szülői imprinting Az epigenetikai öröklődés különleges példája a szülői imprinting, ekkor adott gén aktivitása függ annak leszármazásától. Bizonyos autoszomális gének az általánostól eltérő öröklődési mintázatot mutatnak. Az Igf2 gén például csak akkor fejeződik ki egérben, ha azt az egyed apjától örökölte. Erre az esetre az anyai imprintinget szenvedett (maternally imprinted) kifejezés használatos, mivel az anyától származó génpéldány inaktív. Az egér H19 génje ezzel szemben apai imprintinget szenvedett. A jelenség következménye az, hogy noha fizikailag jelen van két példánya a kérdéses génnek, az imprintinget szenvedő génekre nézve az egyed hemizigótaként viselkedik. Az imprintingben érintett gének molekuláris szintű vizsgálata megmutatta, hogy bizonyos citozinbázisaikon metilcsoportok vannak, és egyébként a gén szekvenciája nem változott. Mivel az egyik szülőtől örökölt allél inaktív, a másik szülőtől származó allél mutációja dominánsnak tűnik, holott az egyed funkcionális értelemben hemizigóta a génre nézve. Mai ismereteink szerint az imprintinget szenvedő gének száma az emberi genomban száz körüli. Néhány humán genetikai betegség hátterében is imprintinget szenvedő gének vannak. Az Angelman-szindróma (leírója Harry Angelman után, 1965) világszerte előfordul körülbelül 1: gyakorisággal. A betegség leírója boldog babáknak nevezte az érintett gyerekeket (jellemző tünetek a nevetés, szaggatott járás) ben írták le a betegséggel kapcsolatban a 15. kromoszóma egy kb. 4 Mbp-os szakaszának delécióját. Mára ismert, hogy ezen a szakaszon lévő, az ubikvitin-útvonalban részt vevő, UBE3A gén érintett a betegségben. A gén apai imprintinget mutat. Az Angelman-szindróma kialakulása az anyai allél deléciójának (az esetek 70%-a) vagy más mutációjának (az esetek 30%-ban) következménye. Egy másik betegség, a Prader Willi-szindróma szintén a 15. kromoszómán elhelyezkedő egyik gén (SNRPN) funkcióvesztésének eredménye. A betegek alacsonyak, enyhén szellemi fogyatékosak, izomtónusuk gyenge és kényszeres evők. Az SNRPN gén terméke az mrns-splicingban vesz részt, anyai imprinting jellemzi. A szindróma tehát az apai génpéldány hiányának vagy hibájának következménye Az emlősök X kromoszóma inaktivációja Emlősöknél az X kromoszóma dóziskompenzációja (lásd még az Egygénes öröklődés című fejezetben) azt jelenti, hogy az X két példányán lévő gének kifejeződése kiegyenlítődik a hímek egyetlen X kromoszómáján lévő gének dózisával. A dóziskompenzáció emlősökben a nőstények egyik X kromoszómájának inaktivációjával valósul meg. Minden egyes sejtben a fejlődés egy korai szakaszán az egyik X kromoszóma inaktiválódik, és ezt az állapotát minden utódsejtbe továbbörökíti. Az X kromoszóma az ovogenezis alatt aztán reaktiválódik. Az X-inaktiváció két tekintetben is hasonlít az imprintingre: Az X-inaktiváció nem mindig random. Az erszényeseknél mindig az apai X inaktiválódik. Bizonyos sejttípusokban a méhlepényesekben sem véletlenszerű az inaktiváció: az amnion, a korion és a placenta, azaz az extraembrionális membránok sejtjeiben is az apai X inaktiválódik, és csak magában a kb. 64 sejtes, szűk értelemben vett embrióban random az inaktiváció. A korai sejtek minden utódja emlékszik a döntésre. A klonális természetű öröklődés miatt nagy, folyamatos szöveti szektorokban ugyanaz az X kromoszóma inaktív. A memória alapja lehet a metiláció: az inaktív kromoszóma jóval metiláltabb. Továbbá az inaktív X hisztonjai kevésbé acetiláltak. Egy speciális RNS, amit Xist-nek neveznek, nem kódol fehérjét, és az inaktív X-en szintetizálódik, egy inaktivációs centrumból kiindulva burkolja be az inaktív X-et. Hogy mennyiben járul hozzá a metiláció, hisztonacetiláció és a Xist- RNS-lokalizáció az X-inaktivációhoz, egyelőre kérdéses. 189

202 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban Megjegyezzük, hogy nem az egész X kromoszóma inaktiválódik, az ún. pszeudoautoszómális régió (az Y kromoszómával homológ szakasz) génjei mindkét X kromoszómán aktívak maradnak, és az inaktív blokkban is vannak aktív gének Pozíciófüggő variegáció A jelenséget Hermann Müller írta le Drosophilá-ban még 1938-ban. (Müller volt az, aki elsőként végzett röntgen mutagenezis screen vizsgálatokat.) Felfigyelt olyan különleges mutánsokra, melyek összetett szemében fehér és piros szektorok váltakoztak. Kiderült, hogy a foltos szemű legyekben egy X kromoszóma szerkezeti változás van jelen: az X kromoszóma végi régió transzlokációval átkerült a centromer közelébe ( ábra). Az átkerült szakasz tartalmazta a white gént (emlékezzünk vissza, hogy a gén mutációja fehér szemszínhez vezet). A fehér szektorok kialakulásának oka az, hogy bizonyos sejtekben a centromert alkotó heterokromatin szerkezet kiterjed a szomszédos régiókra, így a white gént tartalmazó transzlokálódott szakaszra, mely kromatinstruktúra a white gén inaktiválódásához vezet. A gén kifejeződése tehát nem mutáció hatására, hanem a kromoszómán elfoglalt pozíciójával változik meg (Erre utal a jelenség neve: pozíciófüggő variegáció, angol kifejezéssel position-effect variegation, rövidítve PEV). A heterokromatinizáció nem minden sejtcsoportban történik meg, ezért lesznek piros szektorok is a szemben ( ábra). A felfedezés jelentőségét az adja, hogy PEV-fokozó és PEV-szupresszáló mutánsok segítségével egy sor olyan gént azonosítottak a Drosophilá-ban, melyek a heterokromatin kialakulását elősegítik vagy gátolják. Később kiderült, hogy a Drosophilá-ban azonosított fehérjék homológjai az eukarióta szervezetekben általánosan elterjedtek. A HP1 (heterokromatin protein 1) például egy H3 hiszton-specifikus metiltranszferáz, mely fontos a centromer és telomer régiók heterokromatin szerkezetének kialakításában. Mutációja Drosophilá-ban szupresszálta a heterokromatin kiterjedését, azaz csökkentette a fehér szektorok mennyiségét a szemben ( ábra) ábra - A pozíciófüggő variegáció (PEV) egy gén helyének megváltozásával járó génkifejeződés megváltozásából adódik 190

203 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban 4. Általánosan és nagy mennyiségben előforduló RNS és fehérje molekulák termelődésének szabályozása Sok molekulaosztály fehérjéi és RNS-ei nagy mennyiségben fordulnak elő minden eukarióta sejtben. Ide tartoznak például a hisztonok, a transzlációs apparátus molekulái, membrán komponensek. Ezen molekulák megfelelő számának fenntartására többféle stratégia ismeretes: folyamatos átíródás, gének ismétlődése (genetikai redundancia), gének extrakromoszómális amplifikációja. A genetikai redundancia szép példái eukarióta sejtekben az rrns-gének. Az emberi genom öt klaszterben (a 13, 14, 15, 21, 22 kromoszómákon) tartalmazza összesen példányban azt a transzkripciós egységet, melyről a 18S, 28S és 5,8S rrns keletkezik (lásd még A génkifejeződés molekuláris alapjai című fejezetet). Az 5S rrns-gének nem a NO (nucleolus organizátor) régió részei, de szintén klaszterekben helyezkednek el a genomban. Az 5S rrns gének száma emberben 2000 körüli. A hisztongének redundanciája ugyancsak megfigyelhető a legtöbb genomban. A Xenopus laevis (Afrikai karmosbéka, fejlődésbiológiai modellszervezet) esetében és más kétéltűeknél a 40S rrns transzkripciós egységéből az oocyta a testi sejteknél ezerszer többet tartalmaz. Az oocyta magjában a kromoszómákból elszabadult extrakromoszomális sejtmagvacskák százai vannak, melyek a riboszomális gének gyűrűszerű elrendeződéseiből állnak ( ábra). Az amplifikáció részletei nem ismertek ábra - Xenopus laevis oocyta sejtmagjának elektronmikroszkópos felvétele. A fekete pöttyök az extrakromoszómális nukleóluszok (nukleolin antitest festés). 191

204 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban Bár nem tartozik szorosan a témához, itt említjük meg a géncsaládok létét. Számos példát ismerünk olyan géntöbbszöröződésre, amikor a másolat is működőképes marad, de mutációk következtében valamilyen mértékben megváltozik. Amennyiben a változások száma kicsi, és jellegük nem érinti alapvetően a fehérje szerkezetét, a gén eredeti funkciója egyáltalán nem vagy csak kis mértékben módosul. Több olyan enzimet ismerünk (például laktát dehidrogenáz, aldoláz, kreatin kináz), amelynek génjei több változatban vannak jelen a genomban. Az egyes enzimváltozatok ugyanazt a reakciót katalizálják, de biokémiai tulajdonságaikban, szövetspecifitásukban lehet eltérés. Ezeket izoenzimeknek is nevezik. A véralvadásban szerepet játszó thrombin és a tripszin emésztő enzim génjének szekvenciája hasonló, és bizonyítható, hogy egyetlen gén az idők folyamán módosult másolatairól van szó. Az azonos eredetű, szekvenciájukban nagyon hasonló gének összessége a géncsalád. A géncsalád tagjai többnyire egymás közelében helyezkednek el a kromoszómán. A génmásolatok az idők során olyan nagy mértékben is megváltozhatnak, hogy bár közös eredetük kimutatható, mégsem célszerű egyetlen család tagjaiként jelölni őket. Ha a homológ fehérjék aminosav szekvenciája 50%-nál nagyobb eltérést mutat, megegyezés szerint szupercsaládról (gene superfamily) beszélünk -globulinok aminosavszekvenciája 50% globulinok közötti különbség azonban már meghaladja az 50%-ot, így e két család (a mioglobinokkal) együtt egy szupercsaládot alkot. 5. Poszttranszkripcionális szabályozás 5.1. Differenciális mrns-érés 192

205 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban Emlékezzünk vissza, hogy az eukarióta mrns érik, azaz processzálódik: 5' végére cap, 3' végére polia farok kerül, és a transzkriptum splicingon megy át. A differenciális (eltérő helyen történő) polia farok hozzáadás különféle mrns-eket eredményezhet ugyanabból a primér transzkriptumból. A splicing alternatív útjai szintén befolyásolják a géntermék funkcióját (lásd még A génkifejeződés molekuláris alapjai című fejezetet). Az alternatív splicing szabályozás jól ismert példája a muslica ivarmeghatározása ( ábra). Igazán érdekes alternatív splicing kaszkád határozza meg, hogy a zigóta X kromoszóma:autoszóma arányának függvényében miként fejlődik ki a hím vagy női egyed. A szabályozás első eleme egy olyan transzkripciós faktor, mely dimert alkot az X kromoszómán kódolt és egy autoszómán kódolt alegységekből véletlenszerűen. A kombinációkat az egyszerűség kedvéért jelöljük a következőkkel: XX, AA és XA. Csak az XX dimer aktív transzkripciós faktor (az XA és az AA inaktív), mely az Sxl (sex lethal) gén promóterét bekapcsolja. Ez akkor következik be, ha a muslicaembrió sejtjeiben az X:autoszóma arány 1 (két X kromoszóma van jelen). Az XX genotípusú embriókban a képződő Sxl fehérje egy másik gén, a tra (transformer) pre-mrns-ének splice faktora. Az Sxl fehérje hatására a tra gén termékéről aktív, hiányában inaktív Tra fehérje képződik. A Tra fehérje maga is splice faktor, egy harmadik, a dsx (doublesex) gén termékének splicingját szabályozza. A Tra egy további gén (tra-2) termékével nőstényspecifikus Dsx fehérjét, Tra hiánya hím specifikus Dsx fehérje keletkezését eredményezi ábra - A Drosophila ivarmeghatározási rendszerében az alternatív splicing jelentős szerepet játszik 6. Az mrns degradációjának szabályozása Egy adott mrns koncentrációja a citoplazmában nemcsak szintézisének rátájától, hanem stabilitásától is függ. A polia farkak nélkül az mrns-ek gyorsan degradálódnak. A polia farokhoz kapcsolódó PABP (polia binding protein) a cap-hez horgonyozza a polia farkat, és ezzel védi az mrns 5 végét. Az mrns gyakori 5 3 lebontását a polia rövidítése, majd a cap eltávolítása előzi meg. Az mrns-ek 3 UTR-ének szekvenciája befolyásolhatja annak féléletidejét. Egy rövid féléletidejű mrns-osztály például az AUUUA szekvencia több példányát tartalmazza a 3' végén. A szekvencia átültetése stabilabb mrns-ekbe azok féléletidejét lecsökkenti ( ábra) ábra - mrns-ek féléletidejének függése a 3 UTR-ben jelen lévő AUUUA motívum számától 193

206 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban 7. A gének kifejeződésének szabályozása kis RNS-ek által Az utóbbi, körülbelül másfél évtized felismerése, hogy nem transzlálódó kis RNS-molekulák fontos génexpresszió-szabályozó szerepet töltenek be, szinte élővilágszerte. Legtöbb ismeretünk jelenleg az sirns (small interfering, kis interferáló) és a mirns (mikro) típusokról van. A kis RNS-ek köre az utóbbi évek felfedezései alapján tovább bővült (például pirns Piwi-interacting, rasirns repeat-associated small interfering), és minden bizonnyal a sor nem szakad meg itt. Ez az izgalmas kutatási terület forradalmasította a génkifejeződés szabályozásáról szóló ismereteinket. Jelenlegi tudásunk szerint ezek a szabályozó kis RNS-ek a gének kifejeződését az alábbi pontokon befolyásolhatják: transzláció gátlása mrns-ek degradációja transzkripció befolyásolása A Science folyóirat decemberi számának címlapján ez áll: New roles for RNAs. Breakthrough of the year, vagyis RNS-ek új funkciója. Az év áttörése ( ábra). Az RNS-féleségeket, melyekre a címlap utal, az es években fedezték fel két különböző kutatási területen, állati, illetve növényi rendszerben. Tekintsük át röviden ezeket a felfedezéseket! ábra ben a Science magazin a szabályozó RNS-eket tekintette az év tudományos áttörésének 194

207 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban Andrew Fire és Craig Mello 1998-ban publikálták azt az eredményüket, hogy találtak egy olyan mechanizmust C. elegans féregben, amellyel szelektíven ki lehet kapcsolni meghatározott géneket. A géncsendesítésnek (gene silencing) nevezett mechanizmust az embrióba injektált dupla szálú RNS-sel (dsrns) érték el. A dupla szálú RNS-t in vitro szintetizálták, a vizsgált unc-22 gén kódoló szálát (sense) és a komplementer (antisense) szálat is tartalmazta. A vad típusú féregembriókba injektált unc-22 dsrns az unc-22 null mutánsokkal megegyező fenotípust (konkrétan izomdefektet) okozott. Vagyis egy gén szekvenciájának megfelelő dupla szálú RNS az adott gén kifejeződését meggátolja. A kérdés, hogy hogyan történik mindez, nyitva maradt. A két kutató ban felfedezésükért Nobel-díjat kapott. David Baulcombe és csoportja leírta, hogy egy általuk létrehozott, vírus gént kifejező transzgénikus dohány növény rezisztens lett az adott vírussal szemben. Azt találták, hogy ezek a növények rövid, 25 nukleotid hosszúságú RNS-molekulákat termelnek, amelyek komplementerek a vírus genommal. A rövid RNS-ek termelődését egy másik növényi kísérletben is kimutatták. Richard Jorgenson lila virágú petúnia növénybe vitte be egy saját gén extra kópiáját, a lila pigment termeléséért felelős enzim génjét. Meglepő módon, a transzgén (az extra kópia, melyet bejuttatott a növénybe) gátolta a lila pigment termelődését. Tehát a jelek arra utaltak, hogy a transzgén gátolta a saját és a vele megegyező endogén (a növényben eleve meglévő) gén kifejeződését. Később kiderült, hogy a bemutatott növényi kísérletekben is dupla szálú RNS váltotta ki a géncsendesítést. A dsrns úgy keletkezhetett, hogy a transzgének a növényi genomba random épültek be (ez a módszer sajátsága), és a beépülés környezetében lévő belső promóter(ek)-nek köszönhetően a transzgén mindkét szála átíródott. A keletkező két, egymással komplementer RNS-szál létrehozta a dsrns-t. A fenti eredmények közlése után hamarosan kiderült, hogy egy közös, evolúciós értelemben ősi szabályozási mechanizmus áll a háttérben. Arra is fény derült, hogy ezt a mechanizmust nem csupán exogén (a sejtbe kívülről bejuttatott) nukleinsavak képesek aktiválni, ugyanis a sejtben képződő (endogén) kis RNS-ek is léteznek, melyek a génkifejeződés szabályozásának fontos szereplői. Ma úgy tartják, hogy a humán gének 60%-a áll mirns-ek szabályozása alatt. Az érett sirns-ek és mirns-ek keletkezési módjában és hatásmechanizmusában sok a közös elem, de eltérés is mutatkozik több ponton. Szerkezeti jellegzetességük, hogy érett formájuk körülbelül nukleotidból áll. Prekurzor alakjaik kettős szálat alkotnak. A mirns-ek transzkripciójában az RNS-polimeráz II vesz részt. Először egy hajtűre emlékeztető, önmagában visszahajló prekurzor, a primer-mikro-rns (pri-mirns) keletkezik. A kettős szálú RNS-re specifikus endoribonukleáz, a Drosha nevű enzimkomplex hasítja a pri-mirns formát, létrehozva a körülbelül 70 nt hosszúságú pre-mirns-t. Ez a forma jut ki a sejtmagból (az Exportin-5 által). A pre-mirns végső átalakítását a Dicer ribonukleáz végzi: eltávolításra kerül a terminális hurok, és az egyik szál lebontásra kerül, így kialakul az 195

208 A génkifejeződés szabályozása eukariótákban egyszálú érett mirns. A mirns a citoplazmában beépül a RISC (RNS indukálta silencing komplex) nevű komplexbe, létrehozva a mirisc ribonukleoprotein komplexet. Kötődése a cél-mrns-ekhez a RISC-kel kapcsoltan történik meg. A kötődés leggyakrabban a cél-mrns 3 UTR régiójánál történik. Általános szabálynak tűnik, hogy ha a mirns teljesen komplementer a cél-mrns egy szakaszával, akkor a cél-rns a RISC által lebontásra kerül, ha pedig csak részben komplementer, akkor a cél-mrns transzlációját gátolja ( ábra). Állati sejtekben a transzláció-gátlás gyakoribb ábra - mirns-ek keletkezése, érése és hatása A sirns-ek többnyire egyetlen mrns-re specifikusak, és tökéletesen komplementerek a célszekvenciával. A sirns-ek jellemzően a target mrns enzimatikus degradációját (slicer aktivitás) idézik elő. Ez a klasszikus értelemben vett RNS-interferencia jelenség. Az utóbbi évek felfedezése, hogy a kis RNS-ek a transzkripció csendesítésében is részt vesznek. Egyes eredmények szerint hozzájárulnak a kromatin metilációs mintázat módosításához, tehát az epigenetikai kód megváltoztatásához. A Schizosaccharomyces pombe hasadó élesztőről írták le, hogy az RNS-interferencia útvonal elemeire szükség van a centromer régiók heterokromatinizációjának elindításához. Egy elképzelés szerint a sirns-t tartalmazó RITS (RNA-induced transcriptional silencing) komplex és az RNS-polimeráz II naszcens (éppen keletkező) transzkriptuma közötti kapcsolódás indítja el hisztonmódosító enzimek és/vagy DNS-metiltranszferázok megjelenését. A mirbase adatbázisban ( számos taxonómiai csoport mirns-eit gyűjtik össze. Az adatbázis jelenleg körülbelül 2000 humán mirns-t tartalmaz. Bioinformatikai becslések szerint számuk a valóságban ennél sokkal nagyobb. Valószínűsítik, hogy a humán gének 30%-a mirns-ek szabályozása alatt áll. A komplexitást növeli, hogy egy mrns-t több mirns is szabályozhat, egyes eredmények szerint kompetíció is felléphet a mirns-ek között. Mai tudásunk arra utal, hogy a mirns-ek általi szabályozás a génexpresszió finomhangolását jelenti. Ez az evolúciósan ősi mechanizmus (növényekben, valamint állatokban a gerincteleneken át az emlősökig jelen van) olyan alapvető sejtfunkciók szabályozásában vesz részt, mint például a sejtosztódás, sejthalál, sejtdifferenciálódás. 196