Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Átírás

1 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A

2 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Tananyag címe: PROTEIN BIOTECHNOLÓGIA Tantárgyfelelős: Dr. Tőzsér József

3 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Csősz Éva Protein biotechnológia 1. előadás A FEHÉRJÉK BIOKÉMIAI TULAJDONSÁGAI. A FEHÉRJÉK SZINTÉZISE. A PROKARIÓTA ÉS EUKARIÓTA FEHÉRJESZINTÉZIS KÖZTI KÜLÖNBSÉGEK ÁTTEKINTÉSE.

4 A fehérjéket felépítő leggyakoribb 20 aminosav Alanin Arginin Aszparagin Aszpartát Cisztein Glutamin Glutamát Glicin Hisztidin Izoleucin Leucin Lizin Metionin Fenilalanin Prolin Szerin Treonin Triptofán Tirozin Valin

5 A globuláris fehérjék szerkezete TÁMOP /1/A

6 A detergensek csoportosítása töltöttségük szerint Detergensek: Nem ionos Anionos Kationos Amfoter

7 A detergensek hatása a fehérjékre A. B. EC PM aggregátum + IC +

8 A redukálószerek hatása a fehérjék szerkezetére A. Fehérje S S Fehérje SH SH B. SDS Urea Tiourea Fehérje S S Fehérje S S SDS Urea + Tiourea β-merkaptoetanol DTT TCEP Fehérje SH SH

9 A trns szerkezete A. B. C.

10 Az aminosavak aktiválása, a trns feltöltése Met 1. Met-tRNS szintetáz + PPi Met-AMP ATP 2. Met trns Met AMP Aminoacil-tRNS

11 A prokarióta és az eukarióta mrns szerkezete A prokarióta mrns Riboszóma kötőhely Shine-Dalgarno szekvencia Shine-Dalgarno szekvencia: AGGAGGxxAUG 5 5 UTR Start kodon (AUG) Kódoló régió fmet-t kódol 3 UTR Stop kodon (UAG, UAA, UGA) 3 Az eukarióta mrns Riboszóma kötőhely 5 m7 G 5 sapka Kozak szekvencia Kozak szekvencia: Gcc 5 UTR Kódoló régió 3 UTR Start kodon Stop kodon (AUG) Met-t kódol (UAG, UAA, UGA) A G ccaugg AAAAAA 3 polia farok

12 A prokarióta és eukarióta mrns-ek közötti különbség A. DNS Promóter Operátor Gén 1 Gén 2 Gén 3 Shine-Dalgarno szekvencia Shine-Dalgarno szekvencia Shine-Dalgarno szekvencia mrns AUG AUG AUG AUG fehérje fmet Met fmet fmet B. Gén DNS 5 m 7 G AUG AUG mrns AAAAAA 3 Met Met fehérje

13 A riboszómák szerkezete Prokarióta riboszóma (70S) 50S nagy alegység 23S RNS 5S RNS 35 fehérje 70S riboszóma 30S kis alegység 16S RNS 21 fehérje Eukarióta riboszóma (80S) 60S nagy alegység 28S RNS 5S RNS, 5.8S RNS 49 fehérje 80S riboszóma 40S kis alegység 18S RNS 33 fehérje

14 A működő riboszóma szerkezete P hely a peptid lánctrns kötődésére Naszcens peptid lánc A hely az aminoacil-trns kötődésére 60S nagy alegység E P 5 3 A A riboszóma haladási iránya mrns E hely az üres trns távozására 40S kis alegység

15 A fehérjeszintézis iniciációja prokariótákban IF-1 IF-2 30S alegység IF-3 fmet Shine-Dalgarno szekvencia 5 5 UTR AUG 3 UTR 3

16 A fehérjeszintézis iniciációja eukariótákban 40S alegység Met Kozak szekvencia eif-2 5 m7 G AUG 5 UTR 3 UTR AAAAAA 3

17 Az iniciáció befejeződése GDP eif-2 Met 60S alegység Met GTP eif-2 5 m7 G 5 UTR AUG 40S alegység 3 UTR AAAAAA 3

18 A fehérje szintézis második lépése: az elongáció Ala GTP EF-Tu GDP EF-Tu Met Ala Met Ala GTP 5 mrns E P A 3 EF-Tu Új aminoacil-trns belépése 5 E P A 3 mrns Met Ala GDP EF-G GTP EF-G Met Ala Új peptid kötés kialakulása (Peptidil transzferáz) 5 E P A 3 mrns Transzlokáció 5 E P A 3 mrns

19 Az elongáció jellegzetességei Riboszóma haladási iránya NH 3 mrns + NH 3 Peptidlánc növekedésének iránya + NH 3

20 A fehérje szintézis harmadik lépése: a termináció RF1 5 UAG 3 mrns STOP kodon + NH 3 RF1 5 UAG 3 mrns + NH 3 COO -

21 A fehérje szintézis helye az eukariótákban Sejtmag DNS mrns Citoszol + NH 3 + NH 3 mrns + NH 3

22 A fehérje szintézis helye a prokariótákban TÁMOP /1/A

23 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Csősz Éva Protein biotechnológia 2. előadás A FEHÉRJÉK FELTEKEREDÉSE, A 3D SZERKEZET KIALAKULÁSA. CHAPERONOK. A FOLDING HIBÁI, FOLDING BETEGSÉGEK

24 Az élő rendszerekben előforduló főbb kötéstípusok: hidrogén hidak Kovalens kötés Hidrogén donor Hidrogén akceptor N H N H O H O H 3,1 Å 3,04 Å 2,88 Å 2,7 Å N O N O Erős hidrogén hidak O O H Gyenge hidrogén híd Hidrogén kötés/hidrogén híd

25 Az élő rendszerekben előforduló főbb kötéstípusok: elektrosztatikus kölcsönhatás A. R COO - 2,8 Å + H 3 N R B.

26 Az élő rendszerekben előforduló főbb kötéstípusok: hidrofób kölcsönhatás A. B. apoláros molekula apoláros molekula apoláros molekula apoláros molekula

27 A víz poláros molekula, az élő rendszerekben stabilizálja a szerkezetet A. B

28 A fehérjék feltekeredése/foldingja TÁMOP /1/A

29 A fehérjék szerkezete Másodlagos szerkezet Lokális rendezett szerkezet Elsődleges szerkezet Aminosav sorrend Harmadlagos szerkezet A polipeptid lánc térbeli szerkezete Negyedleges szerkezet Több polipeptid láncból álló fehérje szerkezete

30 A fehérjék elsődleges szerkezete: az aminosav-sorrend N-terminus + NH 3 S S S S COO - C-terminus

31 Az egyes aminosav egységeket összetartó peptid kötés TÁMOP /1/A

32 Az alfa hélix A. B.

33 A béta redő Béta redő Béta fordulat

34 A fehérje szerkezetének jóslása a hidrofób aminosavak pozíciója alapján Hidrofobicitási skála Hidrofób aminosavak belül, hidrofilok kívül

35 A fehérjék harmadlagos szerkezete másodlagos szerkezeti elemekből épül fel Másodlagos szerkezeti elemek Modulok Harmadlagos szerkezet

36 Az Anfinsen kísérlet RNáz RNáz RNáz Natív forma (100 % aktivitás) Redukálás Széttekerés (8M urea) Denaturált forma (0 % aktivitás) Urea eltávolítása Oxidálás Natív forma (90 % aktivitás) RNáz RNáz RNáz Natív forma (100 % aktivitás) Redukálás Széttekerés (8M urea) Denaturált forma (0 % aktivitás) Oxidálás Urea eltávolítása Véletlenszerűen feltekeredett forma (1-2 % aktivitás)

37 Szabad energia csökken TÁMOP /1/A Lehetséges konformációk száma csökken A fehérjék feltekeredése metastabil köztes állapotokon keresztül Folding funnel

38 A rendezetlen fehérjék szerkezete 1. alegység 2. alegység Rendezetlen régió

39 A rendezetlen fehérjék szerkezete a fehérje-fehérje interakciók során módosulhat TÁMOP /1/A

40 A GroEL chaperon kristályszerkezeti képe TÁMOP /1/A

41 A chaperonok működési mechanizmusa Chaperon Hibás szerkezet Natív szerkezet

42 A chaperonok szerepe a fehérjék feltekeredésének elősegítésében

43 A chaperonok osztályozása szerkezetük alapján Hsp oligomerek Hsp 60 oligomerek Hsp 70 monomerek Hsp 90 dimerek Hsp 110 oligomerek

44 A Hsp60 működése Hibás szerkezet Anfinsen kalitka Natív szerkezet hsp10 ATP ADP 15 s ATP ATP ADP ADP ADP ADP ATP ATP hsp60 ADP ATP

45 A Hsp70 működése TÁMOP /1/A

46 A Hsp90 működése Hsp70 Hsp40 HOP DNS kötő domén Hsp90 Hip Hsp90 HOP SHR Éretlen receptor hormon kötésre nem képes Hsp70 HOP Hsp40 Hip Hsp90 p23 SHR Foldoszóma Érett receptor hormon kötésre képes Hormon SHR Hip p23 SHR SHR DNS kötés ATP Immunofilin peptidil-prolil cisz-transz izomeráz

47 A Hsp110 működése Natív fehérje Natív fehérje Denaturált fehérje ATP Hsp 110 Aggregálódott fehérje hsp70

48 A kalnexin és kalretikulin működése TÁMOP /1/A

49 A protein diszulfid izomeráz (PDI) működése HS- PDI SH HS- S S SH PDI SH SH PDI SH S S S S 1. konformáció 2. konformáció

50 A peptidil-prolil izomeráz működése cisz Pro transz Pro

51 Szabadenergia TÁMOP /1/A A folding során kialakuló abnormális szerkezetű fehérjék megjelenése Entrópia abnormális állapot natív állapot

52 A rossz prionok számának növekedése Natív, endogén PrP c PrP sc interakciója endogén PrP c -vel Spontán PrP sc keletkezik PrP sc interakciója endogén PrP c -vel

53 Az amiloid plakkok kialakulásának feltételezett mechanizmusa olvadt (molten globule) natív olvadt (molten globule) denaturált aggregáció Amiloid rostok Amiloid plakkok Amiloid rostok natív

54 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Csősz Éva Protein biotechnológia 3. előadás A FEHÉRJÉK CÉLBAJUTTATÁSA (SORTING ÉS TARGETING)

55 A fehérjék irányítása az endoplazmatikus retikulumba I. ER membrán 5. SRP receptor SRP ER lumen mrns 3 citoszól

56 A fehérjék irányítása az endoplazmatikus retikulumba II. ER membrán Szignál peptidáz 6. ER lumen SRP receptor mrns citoszól 5 5. SRP 7. 3

57 A fehérjék irányítása az endoplazmatikus retikulumba III. ER membrán 10. SRP receptor 8. ER lumen 5 mrns SRP citoszól UAA 9. 3

58 A fehérjék endoplazmatikus retikulumba történő irányítása és kotranszlációs módosítása

59 A fehérjék kotranszlációs N-glikozilációja az endoplazmatikus retikulumban

60 Az N-glikoziláció mechanizmusa, az oligoszacharid lánc kialakulása dolikol-foszfáton TÁMOP /1/A N-Acetil glükózamin Mannóz Glükóz Reorientáció P Dolikol-foszfát Citoszól P P P P P P P ER membrán P P P P AsnXxxSer/Thr ER lumen 3 4

61 Minőség-ellenőrzés az endoplazmás retikulumban Helyesen feltekeredett fehérje Hibásan feltekeredett fehérje PDI Grp78 ERAD chaperon ER lumen Citoszól Fehérje lebontása U U U U U Proteoszóma

62 A fehérjék útja a különböző kompartmentek között sejtmag 1. DER 2. Plazma membrán Lizoszóma 7. citoszól Cisz Golgi hálózat Extracelluláris tér Sejtmag Golgi ciszternák Szekretoros vezikula 7. Citoszól Transz Golgi hálózat

63 A fehérjék módosítása a Golgi kompartmentjeiben N-Acetil glükózamin P Mannóz Glükóz P P P P

64 A Golgi készülékben változatos cukortartalmú N-glikozilált fehérjék keletkeznek N-Acetil glükózamin Mannóz Glükóz Galaktóz Mannóz gazdag típus Lizoszóma Sziálsav Komplex típus Extracelluláris tér/plazma membrán

65 A fehérjék irányítása a mitokondriumba C Hsp 70 C Külső membrán N C N Import receptor Belső membrán mhsp 70 N Mitokondriális mátrix N C

66 A fehérjék irányítása a sejtmagba TÁMOP /1/A

67 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Csősz Éva Protein biotechnológia 4. előadás A FEHÉRJESZERKEZET TANULMÁNYOZÁSA: RÖNTGEN KRISZTALLOGRÁFIA, NMR, TÖMEGSPEKTROMETRIA

68 A kristályszerkezet és a fehérje rendezettsége közötti viszony Rendezettség jóslás a szekvencia alapján - IUPred (iupred.enzim.hu) A fehérje kristályszerkezete

69 A fehérjeszerkezet megállapítása Röntgen krisztallográfiával I Fehérjék kristályosítása Megfelelő kristályok kiválasztása Nagy energiájú Röntgen sugárzás A fehérje kristályban levő elektronokon ütközik a Röntgen sugár és jellegzetes diffrakciós képet hoz létre

70 A fehérjeszerkezet megállapítása Röntgen krisztallográfiával II Elektroneloszlási kép (Fourier transzformációt felhasználva) Diffrakciós kép Illesztett szerkezet

71 Az aminosav-sorrend illesztés minősége meghatározza a kristályszerkezet minőségét 5 Å 3 Å 1,5 Å

72 A fehérjeszerkezet megállapítása mágneses magrezonancia (NMR) segítségével

73 A megállapított fehérjeszerkezetek tárolása a PDB (Protein Data Bank) adatbázisban

74 A tömegspektrométerek felépítése Minta bemenet Elektronika Ion forrás Tömeg analizátor Detektor Adatfeldolgozó rendszer Vákuum rendszer Tömeg spektrum

75 A MALDI Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) működési elve Mintatartó lemez Minta Lézer AH Analizátor Detektor Mátrix kv

76 TÁMOP /1/A Az elektrosprey ionizáció (ESI) elve Szárító gáz Fűtött lemez LC 2-4 kv Kapilláris Analizátor Detektor

77 Az ionok útja a repülési idő (Time-Of-Flight) TOF analizátorban Ionforrás Analizátor Detektor

78 A tömegspektrométer felbontásának javítása a reflektron segítségével Reflektron detektor

79 Az ionok útja a kvadrupólban Kvadrupól Detektor

80 Az ionok útja az ioncsapdában Ioncsapda Detektor

81 Aminosavszekvencia meghatározása elektrospray ionizációs tandem MS (ESI MS/MS) készülékkel m/z m/z ESI ionforrás Q1 Ütközési cella Q3 Detektor QFIENGSEFAQK

82 Intenzitás Intenzitás TÁMOP /1/A Az ionok útja a nagyfelbontású tömegspektrométerben (HDMS) IMS T-hullám Ionforrás Detektor (GRGDS) ,7 Å 2 (SDGRG) ,7 Å 2 Sodródási idő Érkezési idő (ms)

83 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Csősz Éva Protein biotechnológia 5. előadás FEHÉRJÉK TISZTÍTÁSA (KROMATOGRÁFIÁS TISZTÍTÁSI MÓDSZEREK) ÉS ANALÍZISE (SDS- PAGE, 2DE, TÖMEGSPEKTROMETRIA)

84 Lépések száma A megfelelő fehérjetisztítási stratégia kiválasztásának szempontjai Tisztaság 4. A kisebb szennyeződések eltávolítása 3. A nagyobb szennyeződések eltávolítása 2. Izolálás, koncentrálás és stabilizálás 1. Extrakció

85 Fehérjék tisztítása affinitás kromatográfiával A megfelelő fehérje hozzákötődése az oszlophoz A nem kötődött fehérjék lemosása A specifikusan kötődött fehérjék elúciója

86 Fehérjék tisztítása/elválasztása analitikai gélszűréssel Vizes oldat Vizes oldat Vizes oldat Vizes oldat

87 Fehérjék sómentesítése dialízissel TÁMOP /1/A

88 SDS-poliakrilamid gélektroforézis - Vándorlási irány +

89 Fehérjék izoelektromos fókuszálása ph 3 ph 10

90 Kétdimenziós gélelektroforézis TÁMOP /1/A

91 A gélben levő fehérjék vizualizálása különféle festési módszerekkel SyproRuby festés oomassie festés ph 3 ph 10 4% Ezüst festés 18%

92 A fehérjék tisztítása immunprecipitációval (IP) Y Y Y Protein A/G beadek + Antitest Mosás Y Y Indirekt IP specifikus kötődése Y Y Y Y Mosás Y Centrifugálás Ag-Ab kötés hasítása Direkt IP

93 A fehérjék vizsgálata Western blot segítségével Blottolás PVDF membrán Megfelelő antitest hozzáadása

94 A proteomikai munkafolyamat szemléltetése Fehérjét tartalmazó foltok kivágása Enzimes (tripszin) emésztés A sejt lízise 2DE Fehérjék azonosítása Tömegspektrometriás analízis

95 Kvalitatív és kvantitatív különbségek analízise kétdimenziós gélelektroforézis segítségével A Minta 2DE B Minta 2DE gélanalízis kvalitatív és kvantitatív különbségek

96 Kvalitatív és kvantitatív különbségek analízise differenciál gélelektroforézis (DIGE) segítségével H. influenzae (Kontrol) Jelölés DIGE festékkel H. influenzae (aktinonin kezelt) Minták összekeverése 2DE

97 intenzitás TÁMOP /1/A SILAC - Sejtkultúrák metabolikus jelölése stabil izotópok segítségével Tápfolyadék normál Arg-el (könnyű Arg) Tápfolyadék 13 C tartalmú Arg-el (nehéz Arg) Sejtek lízise és homogenizálása Minta összekeverése MS/MS 6 Da m/z

98 Az itraq jelölőanyag szerkezete Jelölő csoport (114, 115, 116, 117) Kiegyenlítő csoport Fehérjéhez való kötődésért felelős csoport Izobár csoport

99 intenzitás intenzitás TÁMOP /1/A Kémiai jelölés itraq módszerrel Kontroll Kezelt sejt 60 min Kezelt sejt 120 min Sejtek összekeverése MS 117 Kezelt sejt 240 min m/z MS/MS 115 Fehérje mennyiségi adat a görbe alatti területből számolva m/z

100 Célzott fehérjék kimutatása MRM segítségével m/z m/z ESI ionforrás Q1 Ütközési cella Q3 Detektor Komplex fehérje elegy Meghatározott m/z-jű ionok kiválasztása és fragmentációja Meghatározott m/z-jű ionok kiválasztása és detektálása

101 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Csősz Éva Protein biotechnológia 6. előadás A FEHÉRJÉK POSZT-TRANSZLÁCIÓS MÓDOSÍTÁSA ÉS A MÓDOSÍTÁSOK KIMUTATÁSA PROTEOMIKAI MÓDSZEREKKEL

102 Glikálás Glükóz Glükóz + Glükóz HbA1c

103 A fehérjék módosítása foszforiláció és defoszforiláció révén Ser Tyr ATP Kináz ADP Tyr Kináz Tyr Foszfatáz P Thr Ser/Thr Kináz Ser/Thr Foszfatáz Foszfatáz Pi

104 A fehérjék módosítása preniláció révén Farneziláció Geraniláció 3

105 A fehérjék módosítása zsírsav módosítások révén Palmitinsav Mirisztinsav

106 A fehérjék módosítása proteolízis révén Limitált proteolízis Degradáció

107 A proteolitikus hasítás helye TÁMOP /1/A

108 A poszt-transzlációs módosítások géntranszkripciót befolyásoló szerepe TÁMOP /1/A

109 Izopeptid kötés létrehozása a transzglutaminázok által katalizált reakcióban Gln Lys Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ TG2 Gln Lys Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+

110 Poszt-transzlációs módosítások kimutatására szolgáló specifikus festési eljárások Sypro Ruby Minden fehérjét megfest ProQ Diamond Csak a foszfoproteineket festi ProQ Emerald Csak a glikoproteineket festi

111 A fehérjék oldalláncán levő foszfát csoport sorsa a tömegspektrometriás analízis során Ser P Foszfoproteinek Dúsítás (TiO2, IMAC) Ser P Ser P Ser P CID PO 3-79 Da H 3 PO 4 vesztés 98 Da

112 Prekurzor ion keresés m/z m/z 79 ESI ionforrás Q1 Ütközési cella Q3 Detektor

113 Semleges vesztés m/z m/z ESI ionforrás Q1 Ütközési cella Q3 Detektor

114 Poszt-transzlációs módosítások kimutatása MRM segítségével ESI ionforrás m/z Q1 Ütközési cella m/z Q3

115 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Csősz Éva Protein biotechnológia 7. előadás FEHÉRJE-FEHÉRJE KÖLCSÖNHATÁSOK KIALAKULÁSA ÉS VIZSGÁLATI LEHETŐSÉGEI

116 Interakciós hálózat Csomópontok hub-ok

117 Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata ko-immunoprecipitációval Antitest a komplex egyik tagja ellen Fehérje komplex Immunprecipitáció Y Sávok kivágása és tripszines emésztése Tripszines emésztés SDS-PAGE A peptid keverék LC-MS/MS analízise A peptidek MS/MS analízise Az ismert fehérjével kapcsolatban levő fehérjék azonosítása

118 Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata pull-down technikával x Y X elleni antitest Fehérje komplex IP x Y X ellenes antitest Y ellenes antitest SDS-PAGE Western blot

119 Y TÁMOP /1/A Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata far-western technikával Immobilizált X fehérje x x Y x Y Y + Y fehérje + Y fehérje elleni antitest Előhívás Membrán

120 Dithiobisz-szulfoszukcinimidil-propionát TÁMOP /1/A

121 Bisz-szulfoszukcinimidil-szuberát TÁMOP /1/A

122 Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata fotoaktív keresztkötő ágensek segítségével TÁMOP /1/A Foto-Leu Foto-Met tartalmú tápfolyadék UV Keresztkötés alakul ki az egymástól pár Å-re levő fehérjék között (interakciós partnerek) Interakciós partnerek azonosítása Keresztkötött fehérjék további analízise

123 Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata élesztő két hibrid rendszer segítségével Gal4BD domén Gal4AD domén BD lacz Y Y X lacz BD X X lacz Y + BD Y X lacz

124 Fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatása fehérje chipek alkalmazásával Y Indirekt módszer Direkt módszer Y Y Üvegfelület Y Y Y Y Üvegfelület Y Üvegfelület Antitest chip Antitest chip A pozitív jelet adó helyek detektálása

125 Fehérje chipeken megkötött fehérjék analízise SELDI technika segítségével Fehérje chip Komplex fehérje elegy Mátrix hozzákeverése lézer SELDI lemez Detektor Analizátor MALDI-TOF

126 Fág bemutató rendszer Megfelelő fágok kötődése Specifikus elúció és felszaporítás mátrix

127 Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata FRET fluoreszcencia rezonancia energia transzfer segítségével h 436 nm Y CFP Donor csoport 480 nm h 436 nm Y CFP 480 nm FRET X YFP Akceptor csoport X YFP 535 nm

128 Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata felületi plazmon rezonancia (surface plasmon resonance) elvén Fényforrás Szenzor chip P-polarizált fény Prizma Visszavert fény Detektor Felületi arany réteg Minta Y Y Y Y Felületi plazmon Áramlási cella Immobilizált ligand

129 Felületi plazmon rezonancia elvén alapuló fehérje-fehérje interakciók vizsgálata Biacore készülékkel Rezonancia jel (kru) 18 Y Y Y Y Disszociáció Y Y Y Y x Y k d k a x Y k d Y Y Y Y 12 Asszociáció Regenerálás Y Y Y Y k a Koncentráció Y Y Y Y Idő (s)

130 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Emri Tamás Protein biotechnológia 8. előadás HETEROLÓG EXPRESSZIÓ I

131 Az expressziós vektor részei az expresszáló organizmusban működő replikációs origó (replikatív vektorok) egyéb szekvenciák (pl. a plazmid stabil replikációját, vagy integrácóját segítő gének, a promóter működését szabályozó gének) E. coli szelekciós marker gén (shuttle vektorok) a hatékony expresszióhoz szükséges szekvenciák (promóter régió, riboszómakötő szekvenciák, transzkripcó terminációs szekvenciák stb.) az expresszálandó gén (cdns, intronokkal mesterségesen kiegészített cdns is lehet; szignál szekvencia beépítése, eltávolítása, ritka kodonok számának növelése, csökkentése, tag szekvenciák beépítése stb.) E. coli replikációs origó (shuttle vektorok) az expresszáló organizmusban működő szelekciós marker gén (replikatív vektoroknál fontos)

132 Az RNS I és RNS II szerepe a plazmidok replikációjában RNS II RNS I trns ori rop replikáció nincs replikáció fokozott replikáció

133 Levan sucrase szelekción alapuló integráció kétszeres rekombináció egyszeres rekombináció integrálódott kazetta integrálódott plazmid

134 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Emri Tamás Protein biotechnológia 9. előadás HETEROLÓG EXPRESSZIÓ II

135 A Sec és a Tat szekréciós útvonalak összehasonlítása extracelluláris tér Sec folding Tat citoszol transzláció transzláció és folding

136 A Sec-útvonal felépítése és működése extracelluláris tér SPáz sece secy secg secdf citoszol seca ftsy yajc b- SRP

137 A S. carnosus expressziós kazetta felépítése promóter SP pro gén CWA

138 A Saccharomyces cerevisiaere és a Pichia pastorisra jellemző N-glikozid oldalláncok P S. cerevisiae mannán -típus 2 NacGlc és 50 < Man n x Asn S. cerevisiae core -típus 2 NacGlc és <15 Man b-1,4-n-acetil glükózamin b-1,4-mannóz a-1,3-mannóz a-1,6-mannóz a-1,2-mannóz a-mannóz Asn Asn P. pastoris

139 Az integráció alternatívája: mesterséges kromoszómák centromer replikációs origó, marker gén, shuttle vektror szekvenciák inzertált gének (a megfelelő promóterrel és segítő szekvenciákkal ellátva) telomer szekvenciák (a közöttük lévő szakaszt vágják ki a transzformáció előtt, hogy linearizálják a DNS-t)

140 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Emri Tamás Protein biotechnológia 10. előadás HETEROLÓG EXPRESSZIÓ III

141 Irányított integráció, funkcionalizált sejtek A B C

142 Néhány jellegzetes növényi N-glikozid oldallánc Az ER lumenben kialakuló alapváz: Asn Asn Asn Asn Asn b-1,4-n-acetil glükózamin b-1,4-mannóz a-1,3-mannóz a-1,6-mannóz a-1,2-mannóz b-1,2-n-acetil glükózamin a-1,3-fukóz b-1,2-xilóz b-1,3-galaktóz a-1,4-fukóz

143 T DNS Az Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid részei

144 Transzformálás Agrobacterium tumefaciens segítségével növényi sejt T-DNS Agrobacterium

145 N-glikoziláció rovar sejtekben Az ER lumenben kialakuló alapváz: Asn Asn Asn Asn Asn b-1,4-n-acetil glükózamin b-1,4-mannóz a-1,3-mannóz a-1,6-mannóz a-1,2-mannóz b-1,2-n-acetil glükózamin a-1,3-fukóz a-1,6-fukóz

146 Az expressziós kazetta beépítése a bacmidba 1. Tn7L és R szekvenciák E. coli donor plazmid transzpozázt kódoló segítő plazmid bacmid LacZ gén - Tn7 célszekvencia LacZ promóter E. coli donor plazmid 2. transzpozázt kódoló segítő plazmid a bacmidba beépült expressziós kazetta bacmid

147 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Emri Tamás Protein biotechnológia 11. előadás PROTEIN ENGINEERING

148 A de novo protein design jelentősége TÁMOP /1/A

149 Helix: -Gly-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Lys-Gly Loop: Pro-Arg-Arg Egy de novo protein design segítségével létrehozott fehérje szerkezete csak helix helix-loop-helix végső szerkezet NH 2 -Met-helix-loop-helix-loop-helix-loop-helix-COOH

150 A receptor tirozin kináz (RTK) működése ligand RTK membrán P P P P P intracelluláris hatások

151 Mesterséges növekedési faktorok oligomerizációs scaffold linker receptor kötő modul oligomer (dimer)

152 Receptor-specifikus peptid hormon változatok kifejlesztése A B

153 PCR alapú site directed mutagenesis deléció pont mutáció inzerció kivágásra szánt régió pont mutáció a primerben nem komplementer loop a primerben

154 Irányított evolúció gén vad típusú fehérje mutáns gének könyvtára ismétlés mutáns fehérjék könyvtára screening/szelekció kedvező tulajdonságú változat

155 DNA Shuffling 1 gén 1 gén 2 restrikciós emésztés ligálás rekombináns génváltozatok

156 DNA Shuffling 2 gén 1 gén 2 DNáz kezelés a fragmensek összekeverése, de- és renaturálása PCR primer nélkül PCR az eredeti végekre tervezett primerekkel

157 Staggered extension process (StEP) A B C D E

158 Exon shuffling homológ gének különböző láncvégződésű domainek az eredeti domaineket vegyesen tartalmazó rekombináns gének

159 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Emri Tamás Protein biotechnológia 12. előadás HUMÁNTERÁPIÁS FEHÉRJÉK ELŐÁLLÍTÁSA

160 Az inzulin szerkezete Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asp Val Phe Glu Hys Leu Cys Gly Ser Hys Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Thr Lys Pro Thr Tyr Phe Phe Gly Arg Glu Asn Tyr Cys Asn

161 vérszérum koncentráció TÁMOP /1/A Különféle inzulin változatok farmakokinetikai tulajdonsága aspart, lispro, glulisine inzulin NPH detemir glargine idő (h)

162 A hepatitis B vírus felépítés TÁMOP /1/A

163 A hepatitis B vírus egyszerűsített életciklusa TÁMOP /1/A

164 A hepatitis B vírus genotípusok földrajzi eloszlása TÁMOP /1/A

165 A Hansenula poliyorpha expressziós vektora TÁMOP /1/A

166 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Emri Tamás Protein biotechnológia 13. előadás HUMÁNTERÁPIÁS ENZIMEK ELŐÁLLÍTÁSA

167 Urát oxidáz (hugysav hidroxiláz) - H N O O N urát H N N H O O H H O 2 O + O H 2 N O H N + H N O 2 2 O N 5-hidroxiizourát xantin allantoin ureát + glioxilát

168 A human -galaktozidáz P P P P P P N-acetilglükózamin mannóz galaktóz sziálsav fukóz

169 A humán glükocerebrozidáz H O H O H O O O O O H N O H n 1 2 glükozilceramid +H 2 O H O H O H O O O H O H O H O N O H n glükóz ceramid

170 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Emri Tamás Protein biotechnológia 14. előadás DIAGNOSZTIKÁBAN HASZNÁLT ENZIMEK ELŐÁLLÍTÁSA

171 A GOX (glükóz oxidáz) által katalizált reakció O H O H H O O O H GOX O + H O O + H 2 O 2 O 2 H O O H b -D-glükóz H O +H 2 O O H D-glükono- d -lakton H O O H D-glükonsav O H C O O H H O O H

172 A GOX működése O H H 2 O 2 FAD H O H O O O H O H GOX O H O 2 FADH 2 H O O O H O O H

173 A GOX gyártása süllyesztett kultúrákban TÁMOP /1/A

174 A GAOX (galaktóz oxidáz) által katalizált reakció O H O H O O O H GAOX O + O 2 H O O + H 2 O 2 H O O H D-galaktóz H O O H 6-oxo-D-galaktóz

175 A GAOX működése +O 2 Cu + H O S Cys Tyr -H 2 O 2 + R-OH. O Cu 2+ S Cys Tyr -R=O

176 A ChOX (koleszterol oxidáz) által katalizált reakciók koleszterol H O FAD CHOX O FADH + H+ kolest-5-én-3-on CHOX O 2 H 2 O 2 O kolest-4-én-3-on

177 A HrP (tormaperoxidáz) által katalizált reakció O O O O O O H H 2 O H 2 O gvajakol O O O O tetragvajakol (vörösesbarna)

178 A HrP felhasználása immunoassay rendszerekben tormaperoxidázzal jelölt szekunder antitest O N H N H + 2OH - 2H 2 O 2 antigén HRP N H 2 O hv (~428 nm) C O O - primer antitest C O O N H H 2 O N 2 luminol oxidálása H 2 O 2 jelenlétében fotopapír

179 A HrP tartalmú bioszenzorok elektród H O O O H 2e - 2H + N O O OH H O O O H O Amplex Red N resorufin N H dihidroresorufin oxidáz szubsztrát H 2 O 2 2 HO. 2 H 2 O HRP

180 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Csősz Éva Protein biotechnológia 15. előadás A TERÁPIÁS FEHÉRJÉK FELHASZNÁLÁSA, JÖVŐBENI LEHETŐSÉGEK, PERSPEKTÍVÁK. A TERÁPIÁS FEHÉRJÉK ALKALMAZÁSÁVAL KAPCSOLATOS NEMZETKÖZI ÉS HAZAI KÖVETELMÉNYEK

181 A génterápia és fehérjeterápia összehasonlítása Génterápia Fehérje terápia DNS izolálása a beteg szervezetéből Mutálódott gén kicserélése egy normál génre Fehérje bejuttatása intravénásan, intramuszkulárisan, per os A normál gén beépítése vírus vektorba A normál gén bejuttatása a beteg szervezetébe a vektor segítségével

182 Antitest függő citotoxicitás mechanizmusa Tumorellenes antitestek Fc receptor Tumor sejt Ölő sejt (NK sejt vagy monocita)

183 Her2 ellenes antitestek alkalmazása emlőrák kezelésében Trasztuzumab Her2 Her2 Her2 Her2 Her2 Fc receptor Tumor sejt Ölő sejt (NK sejt vagy monocita)

184 A TNF alfát gátló fehérjeterápiás készítmények hatása Adalimumab Infliximab Golimumab Cetrolizumab pegol monoklonális antitestek Etanercept szolubilis TNF alfa receptor TNF alfa Pszoriázis Reumatoid arthritisz Crohn betegség Spondilitisz TNF alfa gátlás