A sejttani kutatások főf. módszerek IN SITU ELJÁRÁSOK MIKROSZKÓPOS BERENDEZÉSEK. és s a mikrosebészet. szet. Élő sejtek vizsgálata

Átírás

1 A sejttani kutatások főf módszerei IN SITU ELJÁRÁSOK Fixált sejtek vizsgálata Fixálás, fagyasztás Beágyaz gyazás, metszés Festés, s, kontrasztosítás Citokémiai eljárások: -Enzimcitokémiamia -immunocitokémiamia Autoradiográfia EM röntgen r mikroanalízis Élő sejtek vizsgálata Mikrokinematográfia Egysejtűek ek vizsgálata Vitális festés Mikromanipuláci ció Elektrofiziológiai módszerek patch clamp módszer Sejt- és s szövetteny vettenyésztés Sejthibridizáci ció MIKROSZKÓPOS ÉRTÉKELŐ BERENDEZÉSEK Fénymikroszkóp hagyományos, fluorescens, polarizáci ciós, fáziskontraszt, f interferencia, konfokális Citofotométerek terek Transzmissziós elektronmikroszkóp Scanning elektronmikroszkóp, mikroszondák Számítógépes képanalizátor berendezések Mikromanipulátor Mozgókép-rögz gzítő berendezések Sterilizáló és s szövetteny vettenyésztő Elektrofiziológiai erősítő és adatrögz gzítő berendezések FRAKCIONÁLÁSI TEHNIKÁK Sejtek szeparálá Sejtek izolálá Immunológiai szeparáci ció Sejtmentes rendszerek Sejtfrakciók k izolálá Homogenizálás Centrifugálási technikák Elektroforetikus módszerek Molekulák k izolálá Molekuláris szűrés Kromatográfi fiás módszerek A vitális festés Az élő sejtek membránjai a festékeket ck részben r engedik át, ezért az élő sejtek festésének korlátozottak a lehetőségei. A vitális festési si eljárások nem a sejt általános szerkezeti felépítésének tanulmányoz nyozására, sokkal inkább a festékek felvétel telének, kötődésének és leadási mechanizmuinak vizsgálat latára alkalmak. A mikrokinematográfia és s a mikrosebészet szet A mikrokinematográfia a sejtek mozgáinak tanulmányoz nyozására alkalmas eljárás. Lényege abban áll, hogy az élő sejtekről l filmet készk szítenek, és s azt gyorsítva vagy lassítva vetítik tik le. A sejtben lezajló mozgások ugyanis részben túl t l lassúak ak vagy túl t l gyork ahhoz, hogy azokat mikroszkóppal közvetlenül l tanulmányozhassuk. nyozhassuk. Az ecetmuslica embrionális sejtjének osztódá 1

2 A mikrosebészet szet eszköze ze a mikromanipulátor Lehetővé teszi a sejten belüli li preparáci ciós műveleteket Pl: : sejtalkotók eltávol volítá, sejtmag transzplantáci ció stb. Sejt és s szövetteny vettenyésztési si eljárások fontobb feltételei: telei: A szövetnek tenyészt sztésre sre alkalmasnak kell lennie A sejttenyészetnek szetnek fenntarthatónak nak kell lennie A táptalajnak, t tápoldatnak t megfelelőnek kell lennie Sterilitás s biztosítá A szomatikus sejtek hibridizáci ciója: Lépései: Frakcionálási technikák: k: a) A (növényi, nyi, állati, speciális) sejtek szeparálá b) A szubcelluáris komponensek elkülönítése - Homogenizálás s ( Potter- féle homogenizátor tor) - Centrifugálás s (Differenci( Differenciál l centrifugálás) Homogenizálás Első lépés s a minta homogenizálá vagy a sejtek összetörése. se. Ha a vizsgáland landó anyag a sejtbe van zárva, akkor a sejtet fel kell törnit a sejt eredetétől l függf ggően igényel erőteljes vagy kevésb sbé erőteljes eljárást. Kevésb sbé erőteljes eljárást igényel pl. a hemoglobin tisztítá A sejtek feltárá az esetek túlnyomt lnyomó részében sokkal nehezebb feladatot jelent. A sejtfal vagy membrán n szétt ttörésére re sokszor alkalmazzák k az ultrahangos kezelést st,, mely a leghatékonyabb feltárási módszerek közék tartozik. Az úgynevezett french press segíts tségével a sejtszuszpenziót t nagy nyomáson keskeny résen r préselik át, így a sejtet mechanikus úton tárjt rják k fel. 2

3 A homogenizáló készülékek A homogenizáló készülékek általában ck a már m r durván felaprított szöveteket képesek k elpépes pesíteni. Az egyik legegyszerűbb homogenizáló készülék k a Potter- féle homogenizátor. Ez egy vastag falú üvegcső,, amelyben üveg vagy teflon dugattyú mozgatható kézzel vagy motorral. A cső fala és s a dugattyú közé szoruló szövetdarabk vetdarabkák szétken tkenődnek, sejtjeik összeroncsolódnak. Az ultrahangos homogenizátorokat nem annyira szövethomogenizálásra, mint inkább tisztított sejtorganellumok beltartalmának feltárására használják, mert ezzel az eljárásl a mechanikailag el nem aprítható partikulumok is roncsolhatók. A centrifugálás A frakciók k elkülönítésének nek legáltal ltalánobb módszere m A centrifugálás s közben k fellépő centrifugális erő a szétv tválasztandó részecskék k súlys lyának illetve a nyugalmi helyzetben mért m gravitáci ciós s gyorsulásnak snak sokszoro. A forgás s közben k fellépő centrifugális erő következtében a különböző sűrűségű,, méretm retű és s alakú részecskék k eltérő sebességgel ülepednek,, ezért eltérő szedimentáci ciós állandóval jellemezhetők, függ a centrifuga fordulatszámától is. Centrifugálási módszerekm A sűrűséggrs ggrádens- centrifugálás Lényege: hogy a centrifugacsőbe töltt ltött tt oldószerben sűrűséggrádenst hozzunk létre, l az oldószer sűrűsége s a felszínen a legkisebb, a cső alján n a legnagyobb. A vizsgáland landó mintát, t, mely több t eltérő sűrűségű komponenst tartalmazhat, óvaton az oldószer tetejére rétegzik, r majd a centrifugát t elindítj tják. Az oldatban lévől komponensek a megnövekedett erőtér r hatására a centrifugális erő irány nyába, a cső alja felé kezdenek vándorolni. v Az ultracentrifuga Amikor azonban elérik azt az oldószerr szerréteget, amelynek sűrűsége s megegyezik ját t sűrűségükkel, s tovább nem vándorolnak: v mert a felhajtó erő azonos lesz a nehézs zségi erővel. Az egyensúlyi helyzet beállta után n a centrifugát leáll llítják, a cső tartalmát t térfogati t frakciókra kra bontva óvaton leszívj vják ezzel tiszta formában izolálhat lhatók k az eltérő sűrűségű komponensek. segíts tségével nagy pontossággal lehet meghatározni a makromolekulák molekulatömeg megét. A centrifugában kialakuló igen nagy gravitáci ciós tér r a forgórész speciális kiépítését és meghajtását t teszi szüks kségessé. Az ultracentrifuga mérőcellm cellája kvarc ablakokkal zárt, így a rotor forgá közben k folyamaton mérhető a cella teljes hosszában a fényelnyelf nyelnyelés. 3

4 Amint azonban a rotor elindul, a molekula vándorolni kezd a centrifugális térérőt irány nyába Ez azt eredményezi, hogy megváltozik a cellán n belül l a homogenitás. Centrifugák A molekula vándorlv ndorlásának nak sebessége (szedimentáci ciós s sebesség) így fotometrián követhető Mikrocentrifugák Ultracentrifuga Differenciál l centrifugálás Elválaszt lasztás s méret m alapján A dialízis: --A A molekulaméret szerinti legegyszerűbb lasztás s a félig f áteresztő hártyák tulajdonságán n alapul ma is fontos eszköz z a laboratóriumi riumi gyakorlatban. A dialízis segíts tségével viszonylag könnyen k választhatjuk el a kis és s nagymolekulákat, kat, --sz szétválasztandó molekulakeverékünket két frakcióban kapjuk meg. 4

5 --A A dialízist elsősorban sorban akkor alkalmazzák, ha példp ldául szervetlen sókts któl,, valamilyen oldószert szertől,, esetleg kis molekulatömeg megű gátló komponenstől kívánjuk megszabadítani a tovább tisztítand tandó makromolekulát tartalmazó oldatot. A gélkromatogrg lkromatográfiás s eljárások A gélszemcse g ck bizonyos méretm retű molekulák számára járhatj rható át. Ennél l nagyobb méretm retű részecskék k ck a szemcse mellett tudnak elmozdulni. Ha egy oszlopot ilyen szemcsékkel töltt ltünk meg, a szemcse belsején áthaladó kisebb részecskéknekknek hosszabb utat kell megtenniük az oszlop aljáig ig, mint a szemcsék k közötti k térben t mozgó molekuláknak knak, így az oszlop mosá során n más-m más s térfogatban t jelentkeznek. A membránsz nszűrés Az edénybe bemért, különbk nböző méretű molekulákat kat tartalmazó oldatot az edény alját elzáró membránon nyomatják k keresztül. A membrán n pórusmp rusmérete rete adott, ennél l kisebb molekulák k a membránon átjutnak, ezzel a keverék k két k t részre r bontható. Pl. az átfolyó frakcióban van minden molekula, melynek a molekulatömege mege alatti,, a felső térben marad minden molekula, melynek molekulatömege mege feletti. Elválaszt lasztás s specifikus töltt ltés s alapján A biológiai makromolekulák k nagy része r töltt ltést hordoz Ezt a töltést, illetve töltésváltozást a molekulák frakcionálásánál jól ki lehet használni. A preparálási és az analitikai módszerek sok esetben a molekulák különbözőségére alapoznak. Ezek közül k l két k t olyan módszercsoport m van, mely a molekulák k töltt ltésének eltérésére re építi az lasztást: st: - az elektroforézis - és s az ioncserélő kromatográfia Az lasztásban sban a molekula mérete m és s az lasztó közeggel kialakult kölcsk lcsönhatái is közrejátszanak. Ez az első olyan módszer, amit sikerrel alkalmaztak a fehérj rjék lasztására. Tiselius-féle le elektroforézises rendszer Az elektroforézis 5

6 Papírelektrofor relektroforézis A papírelektrofor relektroforézis módszere Az elektroforézis első sikere akkor következett k be, amikor oldat helyett megfelelő hordozót használtak közegkk zegként, mely biztosította, totta, hogy az elektroforézis tudjanak szétdiffund tdiffundálni. befejeztével a zónák z k ne Hordozóként elősz ször r speciális szűrőpap papírt alkalmaztak, amit pufferrel átnedvesítettek. tettek. A gélelektroforézis Hordozóként gélt g használnak, mely az and lasztandó anyaggal nem lép l kölcsönhatásba. Leggyakrabban alkalmazott gél g l a kemény nyítő,, az agaróz,, az akrilamid polimerek. A gél g l nagyobb felbontású lasztást st tesz lehetővé,, mint a papír, a diffúzi ziós hatások kevésb sbé érvényesülnek. A gél g l pórusmp rusmérete rete meghatározhat rozható (a két k monomer arány nyát t a célnak c megfelelően en szabják meg) befolyásolja a komponensek mozgását. Grádiens diens-elektroforézis: A gél g l pórusmp rusméretét t a két t elektróda között k egy intervallumon belül folyamaton változtatjv ltoztatják, pórusgrádienst hoznak létre. l Elektroforézis poliakrilamid gélen Izoelektromos fókuszf kuszálás A gélelektroforézis alkalmas a molekulatömeg meg meghatároz rozására. ra. Elérhet rhető,, hogy különbk nböző molekulatömeg megű komponensekből álló keverék k minden eleme azonos specifikus töltt ltéssel rendelkezzék. k. Az elektroforetikus mozgékonys konyságot elsődlegesen a gélben g létesl tesített tett térht rháló méret ret változá fogja megszabni. Grádiens gélben a mozgékonys konyság g alapján meghatározhat rozhatók k a komponensek molekulatömegei. megei. 6

7 Az ioncserélő kromatográfia Az ioncserélő kromatográfia elve A töltt ltéskülönbségek alapján n választ v el egymást stól l komponenseket. Oszlop- és s vékonyrv konyréteg-kromatográfiás változatban használj lják. Az ioncserélő vagy kationcserélő. komponens lehet anioncserélő Fehérj rjék k lasztására leggyakrabban az anioncserélő DEAE-cellul cellulózt (DiEtilAminoEtil) vagy a kationcserélő CM-cellul cellulózt (CarboxyMethyl)) használj lják, de nagy számban alkalmaznak egyéb b ioncserélő tulajdonságú anyagokat is. + H C 2 H 5 cellulóz CH 2 CH 2 N C 2 H 5 Dietilaminoetil-cellulóz cellulóz CH 2 C O O - Karboximetilcellulóz A vékonyrétegen kivitelezett ioncserélő ást elsősorban aminovak elkülönítésére alkalmazzák. A kromatográfia kationcserélő típusú, a hordozó alapanyaga szulfonált polisztirol. A vékonyrétegen kivitelezett ioncserélő ást elsősorban aminovak elkülönítésére alkalmazzák. Amino- vak lasztá FIXION vékonyré- tegen Elválaszt lasztás s adszorpciós s tulajdonságok alapján A ma alkalmazott kromatográfi fiás s eljárások az adszorpciós s kromatográfi fiából l fejlődtek ki. Az adszorpciós s kromatográfia alapja a nem ionos molekuláris kölcsk lcsönhatás s a molekula és valamilyen adszorbens között. k A kromatográfia hatékonys konysága függ f attól, hogy az adszorbenst milyen finom szemcseméretben tudják k előáll llítani. 7

8 Annál l hatékonyabb az eljárás, minél l nagyobb az adszorbens aktív v felülete. lete. Ezt mechanikai őrléssel el lehet érni, de az őrlés s során n keletkezett szemcsék összetöredeznek, majd még m g tovább töredeznek, t végül l használhatatlann lhatatlanná teszik az eszközt zt azáltal, hogy a kromatográfi fiás s oszlopot eltömítik. tik. A polimerizáci ciós s technika fejlődött A gömbszimmetria lehetővé tette, hogy nagy aktív felületű, viszonylag kis térfogatú oszlopokat készítsenek, melyek feloldóképessége rendkívül finom különbségek érzékelését teszi lehetővé. A nagy nyomás alkalmazá miatt ezeket a módszereket HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) módszerként tartják nyílván. A HPLC módszer Preparatív és s analitikai alkalmazá megfelel azoknak az igényeknek, melyeket a korszerű analitikai és preparatív laboratóriumok riumok támasztanak. Lehetővé tette, hogy kis mennyiségben kinyert fehérj rjék k szerkezetvizsgálat latához szüks kséges enzimes bontás s termékeit megtisztíts tsák. Ezt a technikát t vékonyrv konyrétegen is megoldották. Ezt a módszert m OPLC (Over( Pressure Chromatography) ) néven n tartják k számon. Liquid Az affinitáskromatogr skromatográfia A kromatográfi fiás s eljárásokn soknál l kihasználhat lhatók azok a specifikus kölcsk lcsönhatások, melyek pl. enzimműködés, vagy receptorhatás alapját képezik. Az enzimek működésének m alapja: az adott enzim ck egy adott szubsztráttal ttal tud reagálni, azt átalakítani. tani. Hasonló elven működnek m a receptorok is: egy- egy receptor specifikun képes k megkötni azt a kis molekulát, melynek kötése k indítja el a hormonhatás s eseményeit. Az affinitás- kromatográfia elve Autoradiográfia Gyakran alkalmazott módszer. m Használata: ha a mintában előfordul forduló anyagok némelyike radioaktív v anyaggal jelölt, lt, és s a továbbiakban ck annak a komponensnek a viselkedését t akarják k vizsgálni. A megszárított szűrőpap papírt röntgenfilmmel r fedik le, majd a radioaktivitás s erőss sségétől l függf ggő idő eltelte után n a filmet előhívj vják. A film megfeketedik azon a helyen, ahol a papíron radioaktív v komponens volt jelen. 8