A membrán-fehérjék térbeli szerveződése a plazmamembránban: Fehérje asszociáció, klaszterek, hálózatok

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "A membrán-fehérjék térbeli szerveződése a plazmamembránban: Fehérje asszociáció, klaszterek, hálózatok"

Zsuzsanna Mezeiné
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 2. A membrán-fehérjék térbeli szerveződése a plazmamembránban: Fehérje asszociáció, klaszterek, hálózatok

2 A membránfehérjék globális szerkezete és kapcsolódása a lipid kettősréteghez: osztályozási elvek, kategóriák Ext membrán Int. 1.) antigének, receptorok 2.) multi-span fehérjék 3.) transzport fehérjék (multi-alegység komplexek) 4.) glikozil-foszfatidilinozitol (GPI) horgonyzott külső perifériás fehérje 5.) zsírsavval (mirisztoil-, palmitoil-, prenyl-) acilált belső perifériás fehérje 6.) sejtváz struktúrfehérje (pl. spektrin és analógjai, aktin filamentum) 7.) dinamikus kapcsoló fehérjék (pl. ERM fehérjecsalád) 8.) transzmembrán adaptor fehérjék (pl. LAT, NTAL) 9.) pányvázó (scaffolding) fehérjék 6 7 7

3 A membránfehérjék dinamikus, szupramolekuláris klaszterei ( mintázatai ) a sejtfelszínen: molekuláris homo- és heteroasszociátumok; clusterek; membrán mikrodomének Ezeket kiváltó/stabilizáló tényezők: genetikailag determinált komplexek (pl. TcR/CD3, BcR komplex, FcεRI) ligand indukált aggregáció (pl. EGF-receptor TK család) fehérje-fehérje kcsh.: konformáció/affinitás hajtott asszociációk (pl. MHChomoasszociáció, MHC-I és MHC-II közötti hetero-asszociációk, tetraspan web ) lipid mikrodomének általi kompartmentalizáció (diffúziós barrier, fehérjelipid kölcsönhatás): raftok, caveolák (pl. GPI-fehérjék /CD14,CD48/,acilált Src kinázok összegyüjtése, IL-2/IL-15 receptorkomplex alegység kompartmentalizáció) citoszkeletális kihorgonyzás/kapcsolás: adhéziós (vinculin/talin), accessory/kapcsoló/adapter fehérjék (pl. LAT, NTAL, Gab1, MAGUK-family, ERM-family)

4 A fehérje-asszociáció / csoportosulás (clustering) különböző szintjei membránokban: molekuláris szint Homo-asszociáció: (5-10 nm) Hetero-asszociáció: (5-10 nm) pl. HLA-DR pl. FasR (CD95) pl. HLA-I Insulin Receptor szupramolekuláris szint Fehérje cluster: ( nm) Membrán mikrodomén: (20 nm 2 μm) pl. (TcR-CD3) n aktivált T sejteken pl. raft (tutaj)

5 burkolt csapda vezikuláris transzport, fúzió a sejtmembránnal Dinamikus szupramolekuláris membrán struktúrák (mikrodomének) Chlatrin burok R ligand asszociáció speciális lipid mikrodoménekkel (raft, caveola) (Golgi) Kölcsönhatás a membrán szkeletonnal: kötődés, kerítéshatás Fehérje asszociáció, aggregáció Jelátviteli kaszkádok (PTK, G-protein, PI, kalcium)

6 Többláncú Immunfelismerő Receptorok családja ( Multichain Immune Recognition Receptor, MIRR) BCR TCR FcεR I

7 PM organization of the interleukin-2 receptor complex Nanometer-scale organization of the alpha subunits of the receptors for IL2 and IL15 in human T lymphoma cells Bärbel I. de Bakker, Andrea Bodnár, Erik M. H. P. van Dijk, György Vámosi, Sándor Damjanovich, Thomas A. Waldmann, Niek F. van Hulst, Attila Jenei, María F. Garcia-Parajo. J Cell Sci : ; doi: /jcs

8 Az IL-2 és IL-15 citokinek immunszabályozó funkciói függenek az aktuális membrán receptor szerveződéstől/affinitástól

9 A plazmamembránok laterális doménszerkezete Laterális fehérje denzitás: /μm 2 ; lipid fajlagos felület: 0.68 nm 2 ; α-helix fajlagos felület: 1.1 nm 2 ; fehérjék által elfoglalt terület: single-span: ~ 1 nm 2, tetraspan: 4.5 nm 2, sevenspan: ~ 8 nm 2 Egy 30x30 nm 2 területű membrándoménbe belefér pl. : vagy 32 lipid, vagy 15 single-span fehérje, vagy 12 tetraspan, vagy 8 sevenspan fehérje ill. ezek megfelelelő kombinációi

10 Plazma membrán mikrodomének: lipid raft caveola

11 A tetraspan web : TM4-SF fehérjék 34 tetraspan fehérje ismert emlősökben, ebből 33 humán is Képesek konformációs pányvázóként (scaffolding) többféle fehérje szelektív horgonyzására a membrán egy területén. A kapcsolódó fehérjékkel nagyobb, több száz fehérjéből álló hálózatot is tudnak képezni a membránban TM4-SF specifikum: erősen konzervatív szekvencia/motívum (LED) N-glikoziláció (SED) palmitoiláció

12 Sejtkommunikáció: Komplex fehérje hálózatok-jelátviteli és regulációs rendszerek Modellezés (in silico): Interactome analízisfehérjeszerkezeti, kölcsönhatási (vektoriális) adatbázisok alapján DNS (sejtmag) Sejtfelszínen: in situ biofizikai képalkotó technikákmobilitás és kölcsönhatás mérése (FRET, FRAP, SPT, stb...)

13 Betegségek sejtszintű jelátviteli, kommunikációs zavarainak felismerése a protein-interactome tanulmányozásával Példa: a szindrómás autism spectrum disorder kulcsfehérjéinek interactome térképe

14 Hogyan vizsgálhatjuk a membránfehérjék molekuláris szerveződését, a fehérjék asszociációit/csoportosulásait? klasszikus immun-biokémia: pl. immun-koprecipitáció Fluoreszcens immuncitokémia/mikroszkópia: CLSM, SRM - cocapping (sapkásodás) - kolokalizáció (intenzitás kereszt-korreláció és cluster-analízis) Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET): - mikroszkópiás photobleaching FRET (pbfret) vagy - intenzitásmérésen alapuló FRET (RI-FRET) Nagyfeloldású (~nm- ~ x10 nm) optikai (STED,SIM, STORM, PALM), ill. pásztázó szonda- mikroszkópiák: atomi erőmikroszkópia (AFM) ill. közeli mező mikroszkópia (SNOM) sejtfelszíni topográfia

15 Molekuláris ko-lokalizáció detektálása immuno-koprecipitációval Protein G gyöngy (A)-specifikus mab Overnight, 4 o C Mosás, forralás SDS PAGE puff. centrifugálás B SDS PAGE A A Sejtlizátum, Ag + anti-b mab + HRP-anti Ig + ECL reagens blotting

16 Hogyan mutatható ki élő sejteken a membránfehérjék in situ molekuláris szintű szerveződése? - homo- és hetero-asszociációik - membrán lipid mikrodoménekhez való viszonyuk

17 Élő sejtek immunfluoreszcens jelzése Ellenanyag konjugálása fluoreszcens festékkel; sejt jelölése fluoreszcens ellenanyaggal vagy biotin-avidin reakcióval a. NH 2 (-SH) (R: isothiocianát, v. szukcinimid, ill. maleimid) kovalens + R- (pl. FITC, Cy2,3,5,7; APC; RPE; Alexa 488,546,647) (NaHCO 3, ph:8.0) b. Ig Fab Immunoglobulinok (mab) avidin Kd: M biotin (Fab ) 2 M perc, jégen M

18 Konfokális fluoreszcens mikroszkópia (lézer-pásztázás: point scanning X-Y, optikai szeletelés: Z-scan, nm, digitális fluoreszcens képalkotás, 3D-rekonstrukció)

19 Példa: Az IL-2 citokin-receptor lokalizációja és kompartmentalizációja a T sejtek plazmamembránjában. Az IL2-R és a GPI-horgonyzott CD48 raft-asszociált membránfehérje viszonya Immun-koprecipitáció (mindkét irányban) pozitív Jelentős mértékű co-capping figyelhető meg a két fehérjénél green channel: XSF-anti-CD48 red channel: Cy5-anti-CD25 A CD25 (IL-2Rα) és a CD48 kolokalizáltak T sejt-membránban (azonos mikrodoménben vannak)

20 MOLEKULA-KOLOKALIZÁCIÓ CLSM-el j Pixel: pl. 0.1 x 0.1 μm Két, spektrálisan izolált optikai csatorna: (pl. zöld: x, vörös: y) -kettősen jelölt sejtminta - digitálisan rögzített képek -a kolokalizációt a kereszt-korrelációs koefficiens (CC) értéke alapján kvantitatívan is megítélhetjük egy pl. 512x512 v. 1024x1024 pixeles image-ből. i A Pearson s koefficiens definíciója: CC = Σi Σj (xi,j - <x>) (yi,j - <y>) / Σi Σj (xi,j - <x>) 2 Σi Σj (yi,j - <y>) 2, ahol x i,j ill. y i,j az i és j koordinátákkal jellemzett pixel fluoreszcencia értékei az x (zöld) ill. y (vörös) képen (optikai csatornában). Csak a detektálási küszöb (zaj/háttér) fölötti értékekkel rendelkező pixeleket vesszük figyelembe a summázás során. A CC szélső értékei: CC= 1, két teljesen azonos kép esetén, CC = -1 a kétféle festék (jelölt molekula) teljesen szeparált lokalizációja esetén CC: 0-1 a random eloszlástól eltérő mértékű valós molekuláris kolokalizáció

21 Fehérje-fehérje, fehérje-lipid kolokalizáció: CLSM képalkotás j b c T sejten GM-1 gangliozidok, FITC-CTX B-vel jelölve (a raftok lipid markere) T sejten IL-2 receptor α (CD25) Cy-3- monoklonális antitesttel jelölve Overlay (pixel-helyes) A + B image. i Pearson koefficiens: > 0.6! Probléma: nincs molekuláris szintű feloldás! (LF: nm)

22 Ki kihez van közel vagy távol a molekuláris,nanométeres skálán? Az optikai képalkotás feloldási határral rendelkezik (Abbe-korlát) és egy kompromisszum: nem látjuk közvetlenül a molekuláris kölcsönhatást, (d:<10-20 nm) de detektálhatjuk pl. a pixelenkénti Förster-Rezonancia Energia Transzfer (RET) hatásfokának meghatározása alapján

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) A D* A* D* Donor and acceptor far apart - No FRET Donor and acceptor close together - FRET Nem-sugárzó (elektromágneses/rezonancia) energiaátadás egy

23 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) A D* A* D* Donor and acceptor far apart - No FRET Donor and acceptor close together - FRET Nem-sugárzó (elektromágneses/rezonancia) energiaátadás egy fluoreszcens (donor) molekuláról egy energia-felvevő (acceptor) molekulának dipól-dipól csatolás útján (Förster, 1958) A dinamikus Förster-típusú energiaátadás erősen távolság függő, a sebességi állandó (valószínűség) ~ 1/R 6 Hatékony módszer az intra-és intermolekuláris távolságok (molekuláris konformációváltozások, asszociációk) vizsgálatában

24 Példa: az Akceptor photobleaching mérése

25 Nagyfeloldású, nem diffrakció-korlátozott pásztázó szonda-mikroszkópiák : 1.) Atomic Force Microscopy /AFM/ - Transzmissziós Elektron mikroszkópiával és immunogold jelzéssel kombinálva 2.) Scanning Near Field Microscopy /SNOM/ *Feloldás: igen jó, elvben a szonda mérete határozza meg: ~ 5-50 nm z irányban, nm x-y irányban **Hátrány: a mintaelőkészítés (beágyazás, fixálás, dehidratálás, stb.) erősen befolyásolhatja a natív struktúrát!

26 Atomi erő mikroszkópia (AFM) működési elve (G. Binnig 1996 Nobel díj) - pn/nn erőállandójú rugó (kar) - pásztázó hegy (tip:sin3 kristály) mérete (alakja) határozza meg a feloldási határt (elvben néhány Angstrom z irányban). - piezo-vezérelt vonal-pásztázás - lézerfény visszaverődés kvadráns diódával történő detektálása: pozíciójelzés

27 Immuno-gold jelzés arany-gyöngy átmérő: 5-50 nm (5 nm-ként elérhető) gold R anti-fc mab-al fedett aranygyöngy primer antitest sejt

28 MHC-I glikoproteinek sejtfelszíni eloszlása (clusterei) AFM: immunogold jelölést követően humán T limfóma sejteken

29 MHC-I és MHC-II molekulák hetero-asszociációja APC-n, szekvenciális immunogold jelölést (2 féle méretű gold bead) követően, TEM és AFM pásztázó mikroszkópiákkal detektálva TEM image AFM image

30 A TEM és AFM image fehérjeeloszlásának cluster-analízise random eloszlás: Poisson eloszlás (üres karika) immunogold szám (gyakoriság) mátrix elemenként a mintában (fekete karika) -függvényillesztés A jelölt fehérje (MHC-II) Klaszteresedést mutat B limfómák felszínén (n obs > n elm ) Proc Nat Acad Sci USA,1997

Hasonló dokumentumok

A sejtmembrán molekuláris szerveződése, membrán mikrodomének

A sejtmembrán molekuláris szerveződése, membrán mikrodomének A sejtmembrán molekuláris szerveződése A membránfehérjék globális szerkezete és kapcsolódása a lipid kettősréteghez: Ext. 1 2 8 3 GPI 4 membrán