AZ AMILÁZ SZEKRÉCIÓ VIZSGÁLATA PATKÁNY PAROTISBAN

Átírás

1 Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Fogorvostudományi Kutatások Ph.D. program AZ AMILÁZ SZEKRÉCIÓ VIZSGÁLATA PATKÁNY PAROTISBAN Doktori (Ph.D.) értekezés Készítette: Dr. Barta Adrienn egyetemi tanársegéd Témavezető: Prof. Dr. Zelles Tivadar Társtémavezető: Prof. Dr. László Ferenc Budapest, Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Gera István egyetemi tanár Prof. Dr. Boros Ildikó egyetemi tanár Dr. Kelentey Barna egyetemi adjunktus Hivatalos bírálók: Dr. Lohinai Zsolt egyetemi adjunktus Dr. Varga Csaba egyetemi docens

2 TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK* 4 BEVEZETÉS, A SZAKIRODALOM ÁTTEKINTÉSE 6 A NYÁLMIRIGYEK ANATÓMIÁJA 6 BEIDEGZÉS 8 A NYÁL ÖSSZETÉTELE 9 AZ AMILÁZ 10 A SZEKRÉCIÓ 12 A SZEKRÉCIÓ MECHANIZMUSA 16 A NITROGÉN-MONOXID (NO) 19 A NITROGÉN-MONOXID SZINTÉZISE 20 A NITROGÉN-MONOXID HATÁSAI 22 A NITROGÉN-MONOXID LOKALIZÁCIÓJA NYÁLMIRIGYEKBEN 24 A NITROGÉN-MONOXID ÉS A SZEKRÉCIÓ KAPCSOLATA 26 A NYÁL SZEREPE A GYULLADÁSBAN 28 CÉLKITŰZÉSEK 32 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 33 ANYAGOK 33 KÍSÉRLETI ÁLLATOK 33 MÓDSZEREK 33 IN VIVO VIZSGÁLATOK Kísérleti terv Elektroforézis Amiláz aktivitás meghatározása Gyulladás létrehozása a parotisban NOS enzim aktivitás mérése Parotis acinus sejtek izolálása Immunhisztokémia Western-blot analízis Amiláz szekréció meghatározása az izolált parotis acinus sejtekben 39 STATISZTIKAI VIZSGÁLATOK 40 EREDMÉNYEK 41 IN VIVO VIZSGÁLATOK Az éheztetés hatása a parotis és szérum izoamiláz enzim aktivitásra A táplálákfelvétel hatása a parotis és szérum izoamiláz enzim aktivitásra 41

3 TARTALOMJEGYZÉK IN VITRO VIZSGÁLATOK A NOS2 expressziója, endotoxin alkalmazása után Az acinussejtek amiláz szekréciója, endotoxin alkalmazását követően 47 MEGBESZÉLÉS 48 KÖVETKEZTETÉSEK 56 GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG 57 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 59 IRODALOMJEGYZÉK 60 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK 76 ÖSSZEFOGLALÁS 77 SUMMARY 78 3

4 RÖVIDÍTÉSEK RÖVIDÍTÉSEK* AC adenilát cikláz Ach acetil-kolin BSA bovin szérum albumin Ca 2+ kalcium camp ciklikus adenozin-monofoszfát cgmp ciklikus guanozin-monofoszfát Cl - klór cnos konstitutív nitrogén-monoxid szintáz enzim COX2 ciklooxigenáz 2 enzim Da dalton DAB diamino-benzidin DAF-2 4,5-diamino-fluoreszcein DNS dezoxi-ribonukleinsav EDRF endothelium-derived relaxing factor EDTA etiléndiamin-tetraecetsav EGTA etilénglikol-bisz(α-aminoetil)-n,n,n',n'-tetraecetsav enos (NOS3) endothelialis nitrogén-monoxid szintáz enzim F - fluorid FAD flavin-adenin-dinukleotid FMN flavin-mononukleotid - HCO 3 hidrogén-karbonát HRP horseradix peroxidase = tormaperoxidáz H 2 O 2 hidrogén-peroxid H 4 BP tetrahidrobiopterin IgG immunglobulin-g inos (NOS2) indukálható nitrogén-monoxid szintáz enzim ip. intraperitoneális IP 3 inozitol trifoszfát iv. intravénás K + kálium

5 BEVEZETÉS kda kilodalton LBP LPS binding protein L-NAME N G -nitro-l-arginin metil-észter L-NNA N G -nitro-l-arginin LPS lipopoliszacharid Na + nátrium NADPH nikotinsavamid dinukleotid-foszfát NADPHd nikotinsavamid dinukleotid-foszfát diaforáz NANC non-adrenerg és non-cholinerg NO nitrogén-monoxid NOS nitrogén-monoxid szintáz enzim nnos (NOS1) neuronális nitrogén-monoxid szintáz enzim p valószínűségi érték PAR proteináz-aktivált receptor PB perfusion buffer PBC perfusion buffer concentrate PBS phosphate buffered saline PGE2 prosztaglandin E2 PIP 2 foszfatidil-inozitol-4,5-bifoszfát 2- PO 4 foszfát SB suspension buffer SBC suspension buffer concentrate scd14 solubilis CD14 sc. subcutan SDS sodium dodecile sulphate sgc solubilis guanilát-cikláz enzim TLR4 Toll-like receptor 4 * Rövidítések és latin szavak: Brencsán orvosi szótár szerint. Medicina Könyvkiadó,

6 BEVEZETÉS BEVEZETÉS, A SZAKIRODALOM ÁTTEKINTÉSE A NYÁLMIRIGYEK ANATÓMIÁJA A nyálmirigyek típusos exokrin mirigyek, az általuk termelt nyál szerepet játszik az emésztési folyamat előkészítésében, valamint a szájüreg és a nyelőcső mucosajának védelmében. Ezek a mirigyek nagyon hasonlítanak az egyik legtöbbet vizsgált exokrin mirigyhez, a pancreashoz, mégsem kaptak akkora figyelmet a kutatás területén. A hasnyálmirigy jelentős homogenitást mutat a nyálmirigyekkel mind morfológiailag, mind funkcióját tekintve. A nyálmirigyeket azonban emlősökben nagyfokú diverzitás jellemzi lokalizáció, fejlődés, mikroszkopikus szerkezet, valamint funkció tekintetében nemcsak az egyes fajok között, hanem fajon belül is. Ezek a tulajdonságok jelentősen megnehezítik a nyálmirigyek vizsgálatát, ugyanakkor kutatásuk a tudomány jóval szélesebb területeit öleli fel, mint a pancreas esetében. A nyálmirigyeket méretük alapján nagy és kis nyálmirigyekre csoportosíthatjuk. A legtöbb emlős faj 3 pár nagy nyálmiriggyel rendelkezik: fültőmirigy (glandula parotis), állkapocs alatti mirigy (glandula submandibularis) és nyelv alatti mirigy (glandula sublingualis). A néhány száz (>600) kis vagy járulékos nyálmirigyet lokalizációjuk szerint nevezték el és többnyire az ajak, bucca, nyelv, palatum és a sublingualis tájék submucosajában találhatók. Morfológiailag a nyálmirigyek ductusrendszerből és acinusokból állnak. A ductusrendszer és a kiválasztást végző acinusok mentén kötőszövet található, amely a mirigyparenchymát lebenyekre és lebenykékre tagolja. A kötőszövet egyrészt megtámasztja a mirigyállományt, másrészt a mirigyet ellátó ereket és idegeket tartalmazza. A ductusrendszer a fő kivezetőcsővel (ductus excretorius) kezdődik, mely az oralis mucosaba nyílik. A mirigy belseje felé haladva kisebb extralobularis (vagy interlobularis) ductusokra tagolódik, melyek a lebenyek közötti kötőszövetben haladnak. Hámbélésük a ductusok tagolódásával többrétegű laphámból többrétegű hengerhámmá alakul, mely fokozatosan egyrétegűvé válik. Ezek ágai már a lebenyeken belül találhatók (ductus intralobularis) és ductus striatusnak hívják őket, ugyanis a ductust bélelő hengerhámsejtek a bázisra merőleges csíkolatot mutatnak. Ennek oka a bazális membrán betüremkedése, mely jelentősen növeli a felületet. A ductusrendszer 6

7 BEVEZETÉS legdistalisabb elemei az intercalaris ductusok, melyek falát lap- vagy köbhámsejtek bélelik. Ezek a sejtek kevésbé differenciáltak, mint a mirigy többi sejtje, és a ductusok, valamint az acinusok prekurzor sejtjeinek tekinthetők, bár a szekrécióban betöltött csekély szerepüket is igazolták. A parotistól és a glandula submandibularistól eltérően a sublingualis nyálmirigynek nincsen elágazó ductusrendszere. Ehelyett számos (8 és 20 között) különálló ductusa nyílik közvetlenül a szájüregbe vagy a ductus submandibularisba. Az acinussejtek piramis alakúak és gömbszerű acinust alkotnak, körülvéve a központi lument, ahová a szekrétum kiválasztása történik. A primer nyál termelését végző acinussejtek festődés, valamint a granulumok mérete alapján kétfélék lehetnek. A hematoxilin-eozin festéssel halványkékre festődő (basophil plazma miatt) serosus sejtek kisebb granulumokat tartalmaznak és sok riboszómát, ennek megfelelően híg, fehérjedús szekrétumokat termelnek. A rózsaszínre festődő (eosinophil) mucinosus sejtek sűrű, nyálkás váladékot termelnek és szekréciós vesiculáik hatalmas méretűek. A kevert acinusokban mindkét sejttípus előfordul, a mucinosus sejtek helyezkednek el a kivezetőcsőhöz közelebb, a serosus sejtek pedig félhold alakban körülveszik őket (Gianuzzi-féle félhold) (Lerner és mtsai 1991). Myoepthelialis sejtek is jelen vannak a nyálmirigyekben, főként az acinusok és az intercalaris ductusok környékén. Mind a szimpatikus, mind a paraszimpatikus idegrendszerből kapnak idegágakat. Ezek a sejtek kosárhoz hasonlóan veszik körül az acinussejteket, és összehúzódásukkal elősegítik a szekrétum kiürülését. Még fontosabb szerepük azonban az acinusok védelme a kitágulással szemben, ami a könnyen bekövetkezhetne a szekréció ideje alatt, a nagy intraluminalis nyomás miatt (Cook és mtsai 1994) (1. ábra). A nyálmirigysejtek mind szerkezetileg, mind funkcionálisan polarizáltak, és így a membrán is két részre osztható. Az apikális membrán a lument határolja, míg a bazolaterális membrán a sejtek közötti tér, illetve a capillarisok felé néz. A nyálmirigyeket a termelt szekrétum alapján 3 csoportra oszthatjuk. A parotis - hasonlóan a pancreashoz - tisztán serosus mirigy. A glandula submandibularis és sublingualis kevert típusú mirigyek, az előbbi serosus, míg az utóbbi inkább mucinosus túlsúllyal. A submandibularis nyálmirigyek dimorfizmusa figyelhető meg számos állatfajban, például a disznóban vagy a rágcsálókban. Hím disznóban az acinusok 7

8 BEVEZETÉS többnyire serosus jellegűek és többek között egy androsteron nevű feromont szintetizálnak, amely nagy mennyiségben termelődik a párzás ideje alatt. Ugyanakkor a nőstény disznók submandibularis acinusai jórészt mucinosusak (Cook és mtsai 1994). 1. ábra Az acinusok és a ductusrendszer egyszerűsített vázlata nyálmirigyben (Nagy 2000) BEIDEGZÉS A nyálmirigyek működését a vegetatív idegrendszer szabályozza, szimpatikus és paraszimpatikus efferensek útján. A szimpatikus praeganglionalis rostok a gerincvelő felső mellkasi szegmentumainak (Th1-3) oldalszarvából indulnak ki, majd a felső nyaki ganglionban (ganglion cervicale superior) átkapcsolódnak, és az erekkel együtt haladva érik el a nyálmirigyeket. A paraszimpatikus rostok a nucleus salivatorius superiorból és inferiorból lépnek ki, és a nyálmirigyekhez közeli magvakban kapcsolódnak át. A glandula parotishoz futó rostok az alsó magból (nucleus salivatorius inferior) kiindulva a nervus glossopharyngeusszal jutnak el a ganglion oticumba, ahol átkapcsolódás után már a nervus auriculotemporalisszal együtt haladva érik el a mirigyet. A glandula submandibularis és sublingualis felé futó rostok a nucleus salivatorius superiorból 8

9 BEVEZETÉS indulnak és a nervus facialisszal jutnak el a submandibularis ganglionba, onnan pedig átkapcsolódás után, a mirigyekhez. A paraszimpatikus idegek kolinergek, ingerlésükre (vagy a nyálmirigy arteriájába acetil-kolint (Ach) fecskendezve) bőséges, híg nyál elválasztása és értágulás jelentkezik. A paraszimpatikus ingerlésnek trophicus hatása is van a mirigyszövetre. A szimpatikus (adrenerg) rostok ingerlése (például noradrenalinnal) a mirigyben vasoconstrictiot és kevés, nagyobb szárazanyagtartalmú viscosus nyál elválasztását idézi elő. Ezen idegek szerepét a reflexes nyálelválasztásban (például étkezések alatt) jól bizonyítják a kísérleti állatokon végzett denervációs vizsgálatok. Az acinussejtek beidegzése mind szimpatikus, mind paraszimpatikus idegágakkal bőséges. Mind a két ideg ellátja gyakorlatilag az összes acinussejtet. A nyálmirigyeket ellátó idegek azonban nemcsak a szekrétoros, hanem a kontraktilis elemekkel myoepithelialis sejtekkel is kapcsolatban állnak, ugyanis nyálelválasztás során ez utóbbi sejtek kontrahálnak, így egyrészt védik az acinus sejteket, másrészt elősegítik a nyál ürülését (Garrett és Emmelin 1979). Emmelin feltételezése szerint egyetlen axon kapcsolatban áll az acinussejtekkel, myoepithelialis sejtekkel, és vérerekkel is (paraszimpatikus ideg esetében) (Emmelin 1987). Mindkét típusú neurotranszmitter, az Ach és a noradrenalin is gyorsan lebomlik, az acinussejtek membránjában található kolinészterázok, valamint a nyálmirigyekben kimutatott monoamin-oxidázok révén (Ferguson 1999). A NYÁL ÖSSZETÉTELE A nyál összetétele nem egyezik a plazma ultrafiltrátumáéval, mivel a hidrogén-, klorid-ionok, a glükóz és más komponensek koncentrációja eltérő (Baum 1993). A nyál túlnyomórészt (99 %-ban) vízből áll. A fennmaradó rész nagyobb (fehérjék, glikoproteinek, lipidek) és kisebb méretű szerves molekulákból (urea, glükóz), illetve elektrolitokból (nátrium (Na + ), kalcium (Ca 2+ ), klorid (Cl - ), foszfát (PO 2-4 ), hidrogén-karbonát (HCO - 3 ), fluorid (F - )) tevődik össze. A szerves anyagokat általában az acinussejtek termelik, kis részük a ductusból származik, vagy a vérből jut be a nyálba. A nyálmirigyek szekréciós rátájuk függvényében eltérő mértékben járulnak hozzá a szájüregbe kerülő nyál mennyiségéhez és összetételéhez. Így például a nyál 9

10 BEVEZETÉS amiláz 80 %-át a parotis szekretálja (Nederfors és mtsai 1994), az acinussejtek révén. Jól bizonyítják ezt Kurahashi munkacsoportjának vizsgálatai, ahol a kísérleti állatok parotisának ductusát lekötötték. Táplálkozás hatására az operált állatoknál sem a szérum, sem a parotis amilázaktivitása nem változott, míg a kontroll állatok esetében a szérumban nőtt, a parotisban csökkent az amiláz aktivitás (Kurahashi és Inomata 1999b). Minimális mennyiségű amiláz megtalálható a glandula submandibularisban és sublingualisban is, de feltehetően ez is parotis eredetű. Ezt igazolták azok a kísérletek, melyekben bizonyítást nyert, hogy a kolinerg agonista pilokarpin adását követően a megnövekedett amilázaktivitás a glandula submandibularisban és sublingualisban a parotis szekréciójának eredménye (Ikeno és mtsai 1982). AZ AMILÁZ Az amiláznak 2 típusa létezik, az egyik az α-amiláz, vagy más néven endoamiláz, amely egyaránt megtalálható baktériumokban, gombákban, hüvelyes növényekben, állatokban és az emberben. A másik típus a β-amiláz, vagy exoamiláz csak növényekben fordul elő. A humán α-amiláznak 2 típusát ismerjük, a bioszintézis helye alapján. Az egyik a pancreas eredetű α-amiláz, a másik a parotis eredetű α-amiláz. Mára már nemcsak mindkét enzimnek, hanem a kódoló géneknek a szerkezetét is pontosan ismerjük (Nishide és mtsai 1986, Horii és mtsai 1987). Újabb vizsgálatok kimutatták, hogy létezik egy kevésbé ismert 3. típus is: a tumor-asszociált α-amiláz, melyet egy ritka tüdőkarcinómában mutattak ki (Tomita és mtsai 1989, Yokouchi és mtsai 1990). Mindhárom enzimet külön gén kódolja, Amy 1, Amy 2A és Amy 2B néven. Az előbbieken kívül az amiláz előfordul számos más szövetben is, így például jejunumban, májban, placentában, vázizomzatban, herében és lépben, bár szer kisebb koncentrációban (Whitten és mtsai 1988). Állatokban az α-amiláz megjelenéséért fajtól függően 2 vagy 3 gén felelős, és az enzim ugyancsak megtalálható többféle szervben. Így például patkányban elsősorban a parotisban és a pancreasban fordul elő, de ezen kívül májban, bélben, gyomorban, herében és a vázizomzatban is kimutatták az α-amiláz jelenlétét (Janowitz és Dreiling 1959, Hokari és mtsai 2003). 10

11 BEVEZETÉS A humán parotis és pancreas eredetű izoamiláz egyetlen, 496 aminosavat számláló polipeptidláncból áll, és a 2 típus 97 %-os homológiát mutat (Nishide és mtsai 1986). Mindkét típus számos izoenzimet tartalmaz, melyeket gélelektroforézissel különítettek el (Keller és mtsai 1971). A parotis nyálban a fehérjék mintegy 30 %-át az α-amiláz adja. Az α-amiláz kda súlyú molekula, és a keményítő és glikogén α-1,4-glikozidos kötéseit bontja, melynek eredményeképpen maltóz, maltotrióz és maltodextrin keletkezik (Karn és Malacinski 1978). Az enzim ph=6 felett működik, ezért a gyomorban, annak savas phja miatt többnyire inaktiválódik. A hatóidő tehát igen rövid a szájüregben, bár az amiláz a fogakon maradt keményítőt étkezések után is képes emészteni. Ez a hatás azonban kariológiai szempontból kedvezőtlen, mivel az így keletkezett diszacharidok szubsztrátként szolgálnak a szájüreg baktériumainak. Régóta ismert, hogy az amiláz néhány más emésztőenzimmel (például lipáz és tripszin) együtt megtalálható a szérumban is (Fridhandler és mtsai 1974, Ryan és Appert 1975, Levitt és mtsai 1977, Isenman és mtsai 1999). Az α-amiláznak 2 típusát (pancreas és parotis eredetű) is kimutatták a humán szérumban. Az emésztőenzimek jelenlétét a vérben sokáig azzal magyarázták, hogy az exokrin szekréció patológiás változásának eredményeként (például gyulladás), vagy véletlen melléktermékként kerültek oda. Egybevág ezzel az a tény is, hogy az emésztőenzimek növekvő koncentrációja a szérumban általános jelenség és fontos diagnosztikus faktor a különböző gyulladásos betegségekben, mint például acut pancreatitis és mumpsz (Leclerc és Forest 1982, Levitt és Eckfeldt 1986, Scully és mtsai 1981). Azonban az emésztőenzimek a vér normál alkotórészei fiziológiás körülmények között is, és számos tanulmány bizonyítja, hogy koncentrációjukat a szérumban fiziológiás mechanizmusok szabályozzák (Isenman és mtsai 1999). Az α-amiláz két fő forrása emberben és patkányban egyaránt a parotis és a pancreas (Karn és Malacinski, 1978). Fiziológiás körülmények között mindkét mirigy juttat amilázt a szérumba: emberben egyenlő arányban (O'Donnell és mtsai 1977), míg patkányban a pancreas jóval kevesebb amilázt szekretál a keringésbe, mint a parotis (Proctor és mtsai 1991). Szintén kimutatták, hogy ha a parotis működését stimulálják pilokarpinnal (Ikeno és mtsai 1988, Ikeno és mtsai 1982) vagy ha a mirigyet beidegző paraszimpatikus ideget stimulálják (Proctor és mtsai 1989), megemelkedik a szérum 11

12 BEVEZETÉS amiláz aktivitás. Éheztetett állatok táplálékfelvétele során szintén emelkedett a parotis eredetű szérum amiláz szintje (Proctor és mtsai 1990). Ugyanakkor sokáig nem ismerték, hogy a nem éheztetett állatokban a spontán táplálás hogyan befolyásolja a szérum izoamiláz szintet. A SZEKRÉCIÓ A különböző nyálmirigyek eltérő mértékben vesznek részt a szekrécióban. A kis nyálmirigyek folyamatosan, aktívan szekretálnak és a nagy nyálmirigyekre ható stimulusok csak kis mértékben hatnak szekréciójukra. A glandula submandibularis és sublingualis szintén folyamatosan szekretál, de alacsony szinten. Stimuláció hatására azonban a szekréció szorosára nő. A parotis szekréciója nyugalomban elhanyagolható (nem mérhető), míg stimuláció alatt a nyál nagy részének szekréciójáért felelős. Így elmondható, hogy a nyugalmi nyál összetétele leginkább a glandula submandibularis, míg a stimulált nyál többnyire a parotis által termelt nyál összetételére hasonlít (Ferguson 1999). Az acinussejtek alapvetően kétféle szekréciós válaszra képesek, melyek jól elkülöníthetők a szekrétum mennyisége és minősége alapján. Étkezések között bazális szekréció zajlik, és ez tartja fenn a szájüreg homeosztázisát (például vízfelvétel, mineralizáció révén). Táplálkozás hatására azonban a bőségesen termelődő nyál elősegíti a szájképletek nedvesítését és elkezdi a bevitt táplálék emésztését (Huang és mtsai 2001). Az exokrin szekréció két lépésben történik. Az 1. lépcsőben az acinussejtek izotóniás primer nyálat termelnek, amely a 2. lépcsőben, a ductusrendszeren való áthaladás során módosul: Na + és Cl - szívódik vissza, ugyanakkor K + - és HCO 3 szekretálódik. Ennek eredménye a szájüregbe kerülő hipotóniás nyál, amely többnyire a parotisból és a glandula submandibularisból származik. A glandula sublingualisban és a kis nyálmirigyek többségében ugyanis kimarad ez a 2. lépés, vagyis a nyál összetételének módosulása. Az alacsony Na + -koncentráció jelentősége abban rejlik, hogy megnöveli a fehérjeoldékonyságot, és csökkenti az ízérző receptorok NaCl iránti érzékenységének a küszöbét (sós íz érzékelése) (Ferguson 1999). A nyálszekréció funkcionálisan két történést foglal magába: a víz- és sótranszportot, valamint a fehérjeszekréciót. A fehérjék szintézisét többnyire a 12

13 BEVEZETÉS nyálmirigyek acinussejtjei végzik. Az acinussejtek szerepe tehát a szekrécióban többrétű, nemcsak vizet juttatnak a nyálba, hanem a nyál eredetű fehérjék 85 %-át termelik - néhány fehérje (például lizozim, laktoferrin, szénsav-anhidráz) azonban a ductus-sejtek terméke. Ugyanakkor sok fehérje eredetét még mindig nem ismerjük (Cook és mtsai 1994, Castle és Castle 1998). A parotis acinussejtjei serosusak, és főként amilázt termelnek, így a parotisnyál híg, kevésbé viscosus. A sublingualis mirigy mucinosus sejtjei glikoproteinben gazdag, sűrű, viszkózus nyálat termelnek. A glandula submandibularis acinussejtjei kevertek, és az előbbi kettő közötti, átmeneti viszkozitású nyálat produkálnak. A víz- és elektrolittranszport a vér felől a mirigy lumene felé irányul. Ez a transepithelialis transzport lehet paracelluláris (sejtek közötti), amely mindig passzív, és lehet transzcelluláris (sejtmembránon keresztüli), amelyhez csatornákra és különböző transzporterekre van szükség. Ugyanakkor a fehérje transzport intracellulárisan történik, és a vesiculumok vagy granulumok exocytosisával végződik, többnyire a sejtek apikális oldalán (Nagy 2000). A parotis számos szekrétoros fehérjét állít elő, többek között amilázt, prolinban gazdag fehérjéket és parotis eredetű szekrétoros fehérjét (parotid secretory protein - PRP). A szekrétoros fehérjék szekréciójának szabályozása biztosítja, hogy szükség esetén a megfelelő összetételű nyál termelődjön. Mivel ezek a fehérjék túl nagyok a sejtmembránon való átjutáshoz, ezért a sejten belül vesiculumok (granulumok) formájában tárolódnak és exocytosis útján jutnak ki a sejtből. A szekréciós granulumok egyben elosztó és osztályozó centrumokként működnek, és ha szükséges, tárolják is a szekrétoros fehérjéket. A granulumok a Golgi-komplex transz régiójából (trans-golgi network) keletkeznek kétféle módon: vagy a Golgi-komplex egy részének érése során, vagy ez utóbbiról fűződnek le kerek vesiculákként (bimbózás). Az éretlen granulumok még lizoszómális és egyéb, nem oda tartozó fehérjéket tartalmaznak. A későbbi érés eredménye az érett szekrétoros granulum, mely bőségesen tartalmaz nyálfehérjéket. Mind az érett, mind az éretlen szekréciós granulum kiürülhet exocytosis révén, azonban a fehérjék relatív mennyisége a kétféle granulumban eltérő (Gorr és mtsai 2005). A fehérjék szekréciója igen összetett, bonyolult folyamat, melyről különböző kísérleti modellek (például szövet szelet, izolált acinus sejtek, sejtvonalak) alkalmazásával sikerült információkat szerezni. Jelenlegi ismereteink alapján a 13

14 BEVEZETÉS szekréciónak 7 útvonala ismert a parotis acinus sejtekben (2. ábra). A parotis acinus sejtjei folyamatosan szekretálnak fehérjéket agonisták jelenlétében és hiányában egyaránt. A szekréciós útvonalakat megkülönböztethetjük a szekréció idejének, a szekretált fehérjék összetételének és a stimulációra adott válasz érzékenységének a vizsgálatával. Ezen útvonalak részletes felderítése és a szekretált fehérje komponensek pontos ismerete jelenleg is kiterjedt kutatások tárgyát képezik (Gorr és mtsai 2005). Mai tudásunk alapján a parotis acinus sejtekben 2 regulált (szabályozott) szekréciós útvonal működik, melyek segítségével a sejtek extracelluláris stimuláció hatására fehérjéket szekretálnak a lumenbe (Castle 1998). A nagyobb (major) szekréciós útvonal [1] nagy méretű szekréciós granulumokat foglal magába, melyek kolinerg vagy adrenerg stimuláció hatására ürülnek ki. Ez a klasszikus szekréció az exokrin sejtekben, mely a fehérje szekréció %-át jelenti a parotis acinussejtjeiben. A kisebb (minor) szekréciós útvonal [2] kis transzport vesiculái pilokarpin vagy kis koncentrációjú izoproterenol hatására képződnek és ürülnek ki. Ez utóbbi ágensek azonban hatástalanok a nagy szekréciós granulumokra (Castle és Castle 1998). Ezek a szabályozott szekréciós utak a sejtek más egyéb funkcióiban is részt vesznek (például fehérjék szekréciója akut stimuláció hiányában, víz- és elektrolitszekréció támogatása) (Castle és Castle 1998). Az acinus sejtek erős extracelluláris stimulációtól független szekrécióját bazális szekréciónak nevezzük. Ez az étkezések között alapszekréciót jelenti. Ugyanakkor magában foglalja az enyhe stimulációra, étkezések között működő kisebb szabályozott szekréciós útvonalat [2], valamint ide tartozik még a konstitutív [3] és konstitutív-szerű szekréciós útvonal [4] is (Gorr és mtsai 2005). Az acinus sejtekben stimuláció hiányában (illetve autonom blokád esetén) is folyamatosan mérhető egy enyhe fehérje "output" az apikális membrán irányába. Ez a fajta szekréció 2 fő fázisból áll. Korai fázisát konstitutív szekréciónak nevezzük, és újonnan szintetizált fehérjék szekrécióját jelenti, melyek többnyire az éretlen granulumokból származnak. Erre a szekréciós útvonalra specifikus szekrétoros fehérje markert még nem sikerült azonosítani. Feltételezik, hogy a bazolaterális membrán és az extracelluláris mátrix fehérjéi is ezen útvonal révén szekretálódnak. Ezek a szekréciós útvonalak a sejt bazolaterális felszíne felé irányulnak és a Golgi-komplex transz régiójával (trans-golgi network) közvetlen kapcsolatban állnak [5]. A bazolaterális 14

15 BEVEZETÉS irányú szekréció lehet polarizált szekréció is, amikor az eredetileg apikális irányba szánt szekréciós vesiculák "átirányítódnak" a sejt bazolaterális felszíne felé és ott ürülnek ki [6 és 7] (von Zastrow és mtsai 1987, Gorr és mtsai 2005). A bazális szekréció második, lassabb, de jelentősebb fázisa a konstitutív-szerű szekréciós útvonalat [4] jelenti. Az ide tartozó transzport vesiculák olyan fehérjéket tartalmaznak, melyek kikerülnek az érési folyamaton átesett nagy szekréciós granulumokból, és így a sejtek bazális szekréciójához járulnak hozzá (von Zastrow és Castle 1987, Gorr és mtsai 2005). A parotis acinus sejtek - csakúgy, mint a többi exokrin sejt - képesek igen nagy fehérjemennyiséget tárolni szekréciós granulumaikban. A granulumok tartalma hasonlít a nyál összetételéhez, ami azt jelenti, hogy a nyál fő komponenseit tartalmazzák a granulumok. Becslések szerint ez a szekretált fehérjék %-át teszi ki. A granulumok keletkezéséért és szabályozott kiürüléséért specifikus reguláló fehérjék jelenléte is szükséges lehet (Day és mtsai 1995). Ezen kívül a ph is hatással van a fehérjék tárolására. Az exokrin sejtekben az éretlen granulumok belsejében savas ph uralkodik, míg az érett granulumokban a ph csak enyhén savas, a neutrálishoz közeli értéket mutat (Orci és mtsai 1987). Az éretlen granulumokban a savas ph biztosítja a fehérjék visszatartását, azonban enyhén bázikus ágensek hatására az újonnan szintetizált fehérjék stimulált szekréciója következhet be (von Zastrow és mtsai 1989). A fehérjék osztályozásában és raktározásában szerepe van a szulfatált proteoglikánoknak is (Venkatesh és Gorr 2002). Feltételezik, hogy ezek a savas ph-jú, nagy molekulák nem közvetlenül fejtik ki hatásukat, hanem a granulum ph-jának megváltoztatása révén. A szulfatált proteoglikánok elősegítik a granulumok fehérjetárolását és érését nemcsak a parotisban, hanem a szintén exokrin pancreasban is (Blair és mtsai 1991, De Lisle 2002). Azonban a pancreasszal ellentétben a Ca 2+ jelenléte vagy hiánya a parotis acinus sejtekben nem befolyásolja a fehérjék aggregációját és a granulumok stabilitását, sőt kimutatták, hogy az amiláz a granulum érése során nem mutat aggregációs hajlandóságot (Gorr és Tseng 1995). A parotis szekréciós granulumaiban a fehérjék tárolásának mechanizmusa ugyanis eltérő a pancreashoz képest: míg a parotis sejtjeiben a szulfatált proteoglikánoké a fő szerep, a pancreasban ezen kívül fontos a kalciumionok és az alacsony ph által kiváltott aggregáció is (Venkatesh és mtsai 2004). 15

16 BEVEZETÉS A szekretoros fehérjék visszatartása és szekréciója a parotis acinus sejtekben tehát igen bonyolult és összetett folyamat, amelynek pontos részleteit még ma sem ismerjük. A jelenségek pontos ismerete igen fontos lehet számos betegség (például Sjögren-szindróma) kezelése szempontjából, és jól hasznosítható a génterápia számára is (lásd Gyakorlati következtetések című fejezet). 2. ábra A fehérjék szekréciójában részt vevő útvonalak a parotis acinus sejtben (Gorr és mtsai 2005) 1: major szabályozott szekréciós útvonal 2: minor szabályozott szekréciós útvonal 3: apikális konstitutív szekréciós útvonal 4: konstitutív-szerű szekréciós útvonal 5: bazolaterális konstitutív szekréciós útvonal 6: granulumok bazolaterális irányú szekréciója 7: váltakozó bazolaterális konstitutív útvonal A SZEKRÉCIÓ MECHANIZMUSA A szekréció folyamatát alapvetően a vegetatív idegrendszer szabályozza, bár egyéb tényezők, például a rágás, a táplálkozás és a hormonok is befolyásolják. Anderson és munkatársai nyulakon végzett kísérleteikben kimutatták, hogy a parotis 16

17 BEVEZETÉS szekréciója csökkent, ha a tápot pépesítették, továbbá rágás során a munkaoldalon (ahol a rágás történik) mindig több nyál termelődött, mint a balanszoldalon (ahol rágás alatt nincs fogsorérintkezés) (Anderson és mtsai 1985). A szekréciót a táplálék összetétele is befolyásolja. Így például csökkent fehérje bevitel hatására a stimulált nyáltermelés szignifikánsan csökken (Menaker és Navia 1974). A hormonok is hatással vannak a nyálmirigyek szekréciójára. A hipofízis eltávolításának hatása mirigyatrófia és az amiláztartalom csökkenése (Bixler és mtsai 1957). Adrenalectomia hatására a parotis atrófizál, és ez a hatás mellékvesekéreg-szteroidokkal is kiváltható (Liu és Lin 1969, Zelles és mtsai 1981). A pajzsmirigy eltávolítása után a nyálelválasztás csökken, a fehérjetartalom azonban nő (Johnson és Cortez 1985). A nyálmirigyek minden külső inger nélkül is folyamatosan termelnek nyálat, ezt nyugalmi nyálnak nevezzük. A jelenség hátterében feltehetően a központi idegrendszerben elhelyezkedő nucleus salivatoriusok spontán aktivitása áll (Nagy 2000). Stimuláció hatására a vegetatív idegrendszer közreműködésével az impulzusok eljutnak a nyálmirigyekbe, és a nyáltermelés fokozódik. A szimpatikus és paraszimpatikus idegeken keresztül továbbított jel az acinussejtek felé neurotranszmitterek segítségével jut el, melyek a szekréciós válasz első messengerei. A neurotranszmitterek kötődnek a specifikus sejtfelszíni receptorfehérjékhez, mely elindít egy transzdukciós mechanizmust. Ennek során a külső szignál továbbítódik a sejt belseje felé. A nyálmirigyek sejtjeiben a transzdukciónak két fő útvonala létezik: camp (ciklikus AMP)-képződés és PIP 2 (foszfatidil-inozitol-4,5-bifoszfát)-bontás útján történő transzdukció (Putney 1986, Baum 1987) (3. ábra). 17

18 BEVEZETÉS 3. ábra Az acinussejtek szekréciójában részt vevő szignál transzdukciós útvonalak (Looms és mtsai 2002) Számos neurotranszmitter létezik, mely szerepet játszhat a nyálmirigyszekréció szabályozásában. A receptorok közül a legkorábbi ismereteink a muszkarinerg (kolinerg) és adrenerg (α és β) receptorokról vannak (van Zwieten 1991). Ezek a receptorok mind transzmembrán fehérjék, melyeknek ligandkötő doménje a membrán extracelluláris oldalán található. Az α- és β-receptorok dimerek. Két szubtípusuk van: α1/α2 és β1/β2; az egyes szubtípusok az agonsitákhoz és antagonistákhoz való affinitásukban különböznek. A kolinerg receptor monomer, és mint klónozással kiderült, 5 altípusa (M1-M5) létezik (Bonner és mtsai 1987). Ezek a receptorok specifikusak nemcsak szöveti eloszlás (Levey és mtsai 1991), hanem a szignál transzdukciós mechanizmus tekintetében is. Az M1, M3 és M5 receptorok hatására többnyire PIP 2 -bontás történik, míg az M2 és M4 receptorok aktivációjakor megemelkedik a camp-szint a sejtben (Peralta és mtsai 1988). Ugyanakkor léteznek átfedések is, mivel mindegyik receptor altípusnak számos effektora van. Az M1, M3 és M5 receptor képes aktiválni a foszfolipáz A2-t, a foszfolipáz Cγ-t csakúgy, mint a különböző Ca 2+ -csatornákat. Az M2 és M4 receptor egyaránt hatással van a foszfolipáz A2-re, a foszfolipáz Cβ-ra és az adenilát ciklázra (AC) is (Felder 1995). 18

19 BEVEZETÉS A nyálmirigyekben a receptorok eloszlása eltérő. A parotisban többnyire csak M3 receptor található, míg a glandula sublingualisban az M3 receptoron kívül az M1 receptor (40-60 %-ban), a glandula submandibularisban pedig az M3, M5 és kis számban az M1 receptor is felelős a kolinerg szekrécióért (Tobin és mtsai 2002). A nyálmirigyek acinussejtjeiben muszkarinerg vagy α-adrenerg stimuláció hatására PIP 2 -bontás, míg β-adrenerg stimuláció hatására camp-képződés következik be. Az adrenerg és kolinerg szabályozáson kívül nem adrenerg és nem kolinerg (non-adrenerg és non-cholinerg - NANC) mechanizmusok is befolyásolhatják a szekrétoros sejtek működését (Ekström 1987). Adrenoceptor antagonisták és atropin jelenlétében szekréciós akitivitást figyeltek meg patkány parotisban, táplálkozás után (Ekström és mtsai 1998). Megállapították, hogy a NANC szabályozás a kolinerg és adrenerg mechanizmusokkal együtt, azokkal összhangban szabályozza a nyálmirigyek szekrécióját. A NANC szabályozás neurotranszmitterei különböző neuropeptidek, elsősorban a substance P, a vasoactive intestinal peptide (VIP), a neuropeptide Y (NPY) és a calcitonin gene-related peptide (CGRP); de a nitrogén-monoxid (NO) is szerepet játszik a szabályozásban (Fehér és mtsai 1999). A NITROGÉN-MONOXID (NO) Ismeretes, hogy testünkben a NANC idegek egyik fő mediátora a NO, mely a nyálszekréció szabályozásában is részt vesz. A NO-ról sokáig csak annyit tudtak, hogy egyike az egészségre ártalmas égéstermékeknek. Az első komoly eredmény 1987-ben született meg, amikor Moncada munkacsoportja bebizonyította, hogy a korábban EDRF-ként (endothelium-derived relaxing factor) ismert anyag azonos a NO gázzal (Palmer és mtsai 1987). Azóta a NO az egyik legkedveltebb kutatási témává vált, az orvostudomány szinte valamennyi ága foglalkozik ezzel a molekulával és a megjelenő publikációk száma exponenciálisan növekszik. A XX. század egyik legnagyobb felfedezésének tartják a NO-ot, és a Science nevű lap 1992-ben az év molekulájává választotta (Culotta és Koshland 1992). 19

20 BEVEZETÉS A NITROGÉN-MONOXID SZINTÉZISE A NO igen egyszerű, és az egyik legkisebb súlyú (30 Da) molekula, előállításában azonban egy meglehetősen bonyolult és igen nagy ( kda), Hemalegységet is tartalmazó enzim, a nitrogén-monoxid szintáz (NOS) vesz részt (Nathan és Xie 1994). A folyamat során L-argininből NO és L-citrullin keletkezik (Moncada és mtsai 1991). A szintézis két külön lépcsőben történik és zavartalan lezajlásához különböző kofaktorokra (NADPH, FAD, FMN, kalmodulin, protoporphyrin IX (hem), tetrahidrobiopterin), valamint oxigénre van szükség (Knowles és Moncada 1994) (4. ábra). 4. ábra A NO szintézise L-argininből. Az első lépésben N-hidroxi-L-arginin keletkezik, mint köztes termék, majd ez alakul át NO-dá és L-citrullinná (Stuehr 1999). A NOS enzimnek három izoformája ismert, melyek különböző gének termékei. A neuronalis NOS-t (nnos vagy NOS1) elsőként idegszövetben fedezték fel. Az indukálható (inos vagy NOS2) forma különböző hatásokra expresszálódik számos sejtben és szövetben. Az endothelialis (enos vagy NOS3) izoformát ér endothelből mutatták ki először. Az NOS1 és NOS3 nevét az elsőként leírt anatómiai lokalizáció alapján kapta, azóta azonban számos más szövetben például a nyálmirigyekben - is igazolták jelenlétüket (Mitsui és mtsai 1997). Az NOS1 folyamatosan expresszálódik az agyban, a központi idegrendszerben és a perifériás idegekben, ugyanakkor megtalálható az izomsejtekben és az epithelialis sejtekben is. Az NOS3 expressziója szintén folyamatos, 20

21 BEVEZETÉS és az enzim nemcsak endothelsejtekben, hanem szívizomsejtekben és más sejtekben is előfordul. A NOS1 és NOS3 konstitutív enzimek (cnos): folyamatosan jelen vannak a sejtben (a citoszólban vagy a sejtpartikulumokban), szemben az indukálható formával. Működésükhöz Ca 2+ -ot igényelnek, mert a NO-szintézis csak akkor indul be, ha a kalmodulin Ca 2+ -ot köt meg, és a cnos-hoz kapcsolódik. Azok a stimulusok tehát, amelyek a citoszól Ca 2+ -szintjét emelik, NO-szintézist indítanak be. A NO szintézise addig tart, amíg a kalmodulin le nem disszociál az enzimről. A NOS2 (inos) nyugalmi körülmények között nincs detektálható mennyiségben jelen a sejtekben, de különböző ingerek (bakterialis toxinok, infekció, citokinek) hatására expresszálódik és a stimulust követő 2-4 órán belül a makrofágokon kívül számos más sejtben, így többek között az érfal és a szív izomsejtjeiben, immunsejtekben és a bélben is megjelenik. Működése független az intracelluláris Ca 2+ - szinttől, mivel irreverzibilisen köti a kalmodulint. Tetrahidrobiopterin-mentes közegben azonban megszűnik működése, mivel a tetrahidrobopterint gyengén köti (Nathan és Xie 1994, Alderton és mtsai 2001, Stuehr 1999). Újabban kimutatták, hogy az nnos-nak 4 altípusa létezik, melyek alternatív mrns splicing-gal jönnek létre. Eszerint a teljes hosszúságú nnos variánst nnosαnak nevezzük. A splicing utáni 4 rövidebb nnos-változat: nnosβ, nnosγ, nnosη és nnos-2 (Alderton és mtsai 2001). Bár a NO elsődleges forrása a NOS enzim, egyes szerzők kimutatták, hogy a NO nem-enzimatikus úton is létrejöhet nitritből savas közegben (ph=3). Így például fiziológiás körülmények között a gyomor lumenében, vagy ischemiás szövetekben (például szívizom) figyeltek meg NOS-független NO-képződést. Ez a fajta NOtermelődés dominál az ischemia progressziója alatt és NOS-inhibitorokkal nem gátolható, a magas koncentrációjú NO pedig végül sejtkárosodást hoz létre (necrosis) (Zweier és mtsai 1999). A keletkezett NO negatív feedback mechanizmussal képes gátolni a NOS működését azáltal, hogy reverzibilisen hozzákötődik az enzim hem részéhez. A NOS2- NO komplex kialakulása függ az oldatban lévő NO szintjétől, a NOS1-NO komplex viszont független tőle (Stuehr 1999). 21

22 BEVEZETÉS A megtermelt NO nem raktározódik, hanem azonnal felszabadul. Felezési ideje nagyon rövid, csupán néhány másodperc, azonban rendkívül gyorsan átdiffundál a membránon és kis idő alatt is nagy távolságok megtételére képes. Hatása nemcsak azon a sejten érvényesül, amelyben szintetizálódik, hanem a környező sejteken is, tehát intraés intercelluláris hatásról egyaránt beszélhetünk. A NO-nak konkrét receptora nincs. A sejtekben szabad gyökökkel, fémekkel, oxigénnel, s a keringésben többek között az oxihemoglobinnal lép reakcióba. A reakció során nitritté, illetve nitráttá alakul. A NOS3 esetében a fő támadáspont a solubilis guanilát cikláz (sgc). A NO az erek simaizomsejtjeiben található sgc hemcsoportjához kötődik, nitrozohem jön létre, amely az enzimaktivitás fokozódásával jár. Ennek hatására a cgmp-szint megemelkedik és egy cgmp-függő protein-kináz foszforilálja a miozin könnyű láncát, ez pedig a simaizom elernyedéséhez vezet. Ez volt az a hatás, amelyről a NO az első nevét (endothelium-derived relaxing factor) kapta. Kimutatták, hogy a NO a felelős a terápiában több, mint 100 éve használt különböző nitrovazodilátor értágító vegyületek (nitroglicerin, nitromint, stb.) hatékonyságáért, mivel a belőlük felszabaduló NO a fent leírt mechanizmussal simaizomrelaxációt okoz. Így ezekkel a NO-donorokkal számos kórkép vált kezelhetővé, mint például a stabil vagy instabil angina, coronaria vasospasmus, szívinfarktus, vagy a kongestiv szívelégtelenség (Moncada és Higgs 1995). Nem valószínű azonban, hogy a NO számtalan hatását (lásd A nitrogén-monoxid hatásai című fejezet) kizárólag a sgc-on keresztül fejti ki. Számos tanulmány bizonyítja, hogy a NO hatással van az AC-ra is. Az enzim terméke, a camp ugyanis mind a cnos aktivitását, mind az inos transzkripcióját szabályozza, az AC-5 és AC-6 enzim izotípusokra pedig közvetlenül hat a NO. Ezen kívül még számtalan más szignál transzdukciós útvonalat feltételeznek, melyben a NO és az AC is szerepet játszik (Klein 2002, Adam és mtsai 1999, Hudson és mtsai 2001, Hill és mtsai 2000). A NITROGÉN-MONOXID HATÁSAI A NO hatása sokrétű. Bár az első publikációk még csak az értónus szabályozására irányuló szerepét hangsúlyozták, azóta kiderült, hogy a NO-nak számos és széleskörű fiziológiás és patológiás hatása van. Kimutatták, hogy többféle kórképben 22

23 BEVEZETÉS a megváltozott NO termelődés játszik szerepet, a szeptikus sokktól a rosszindulatú daganatig (1. táblázat). 1. táblázat Kórképek és elváltozások, melyekben a megváltozott NO-produkció játszik szerepet (Brennan és mtsai 2003) Hypertensio és hypertonia Thromboemolia Septicus shock Bronchospasmus Acut respirációs distress szindróma (ARDS) Pulmonalis eredetű hypertensio Veseelégtelenség Immundeficiencia HIV-fertőzés okozta encephalopathia Impotencia Depressio Malignus tumorok A NO főbb hatásai a következők: 1. A keringés működésének szabályozása A NO folyamatosan jelen van a kis artériák falában és szerepe van a bazális tónus beállításában. A vénák falában azonban nem mutatták ki a NO jelenlétét. A vérlemezkékben is jelen van a NO, megakadályozva a túlzott aggregációt. Az endocardium által termelt NO befolyásolja a szívizom relaxációját a diasztólés fázis alatt (negatív inotrop hatás) (Moncada és mtsai 1991). 2. Az immunrendszer működésének szabályozása A szervezetet ért különböző hatásokra (például infekció) a NOS2 által termelt NO szerepet játszik a szervezet védekezési mechanizmusaiban. Szabályozza a lymphocyták és más immunsejtek működését (baktericid, fungicid, citotoxikus hatás). Részt vesz a kórokozók elpusztításában, és egyes tumorsejtekre toxikus. A gyulladásos válasz létrejöttében is szerepe van, ugyanis a gyulladásos mediátorok fokozzák a NOS3 működését, valamint a NOS2 expresszióját. Az így képződött NO pedig segíti az értágulat létrejöttét, és a szövetpusztulást (Moncada és mtsai, 1991). 23

24 BEVEZETÉS 3. Az idegrendszer működésének szabályozása A NANC idegek többsége NO-ot használ mediátorként. A NO retrográd messengerként is működik az ingerületátviteli folyamatokban. Ezen kívül fokozza egyes neurotranszmitterek (például noradrenalin, dopamin) és neuropeptidek exocytosis úján történő felszabadulását. A NO tehát intra- és intercelluláris messengerként is működik a központi és környéki idegrendszerben (Moncada és mtsai 1991). Ezt bizonyítják azok a kísérletek, amelyek során egyes NO-ot felszabadító ágensek növelték a noradrenalinszintet a hipokampuszban (Lonart és Johnson 1995, Meffert és mtsai 1994), valamint gátolták a luteinizáló hormon felszabadulását a hipofízis elülső lebenyében (Ceccatelli és mtsai 1993), illetve a corticotropin-releasing hormon felszabadulását a hipotalamuszban (Costa és mtsai 1993). A NO-nak szerepe van a gastrointestinalis funkció szabályozásában is. Számos tanulmány vizsgálta a termelődött NO elhelyezkedését és eloszlását a gyomor-bél traktusban, különböző fajokban, beleértve az embert is. NO-termelő helyek (NOS enzim) megtalálhatók a nyálmirigyekben, a nyelőcsőben, a gyomorban, a vékony és vastagbélben, a végbélben, a pancreasban és májban, továbbá az epehólyagban és epevezetékben. A NOS eloszlása azonban nagyfokú faj- és szövetspecificitást mutat (Salter és mtsai 1991, Schleiffer és Raul 1997). A NO tehát hat az exokrin mirigyek működésére is. A pancreasban amely az egyik leggyakrabban vizsgált külső elválasztású mirigy a NO növeli a bazális protein szekréciót macskában és kutyában (Patel és mtsai 1995, Konturek és mtsai 1993). Patkányban azt találták, hogy a NO in vivo fokozza a pancreas fehérje szekrécióját, in vitro körülmények között azonban nem befolyásolja sem a bazális, sem a stimulált fehérje szekréciót, pancreas acinus sejtek esetén (Konturek és mtsai 1994). A NITROGÉN-MONOXID LOKALIZÁCIÓJA NYÁLMIRIGYEKBEN Miután bebizonyosodott, hogy a NO egy fontos messenger molekula, számos kutatócsoport kezdte vizsgálni, milyen szerepet játszik a NO a gastrointestinalis exokrin szekréció szabályozásában. Azóta számos direkt és indirekt módszert dolgoztak ki a sejtekben termelődött NO, valamint az expresszálódott NOS enzim kimutatására (2. táblázat). 24

25 BEVEZETÉS 2. táblázat NO termelődés és NOS expresszió acinus sejtekben való mérésére alkalmas módszerek (Looms és mtsai 2002) NO TERMELŐDÉS Direkt meghatározás - fluoreszcens indikátor (például 4,5- diamino-fluoreszcein (DAF-2)) Indirekt meghatározás NOS EXPRESSZIÓ - Western-blot - immunhisztokémia - a NO metabolitjainak (nitrit és nitrát) mérése - a GC stimulációja - jelölt L-citrulline mérése szövetben vagy sejt homogenizátumban NADPH-diaforáz hisztokémia (Hope és mtsai 1991) segítségével kimutatták, hogy a NO széles eloszlást mutat a gastrointestinális traktusban, valamint a nyálmirigyekben (Grozdanovic és mtsai 1992). Sőt, az immunhisztokémiai vizsgálatok is igazolták, hogy az exokrin mirigyeket így a nyálmirigyeket is - beidegző végágak NOS-t (NOS1) tartalmaznak. NOS immunoreaktivitást találtak humán kis nyálmirigyeket (Pederson és mtsai 1999), macska submandibularis nyálmirigyeket (Lohinai és mtsai 1995), valamint patkány és macska nagy nyálmirigyeket ellátó idegágakban (Ceccatelli és mtsai 1994, Alm és mtsai 1997, Takai és mtsai 1999). Ugyanakkor NO-ot szintetizálhat az exokrin mirigyek ereiben és capillarisaiban megtalálható NOS3 izoforma is (Forstermann és mtsai 1995, Xu és mtsai 1997). Ezen kívül kiderült, hogy maguk az acinus sejtek is képesek endogén NO-ot termelni (Xu és mtsai 1997, Looms és mtsai 2000, Tritsaris és mtsai 2000). Tritsaris és munkatársai (2000) izolált parotis acinus sejtekben különböző agonisták adását követően igazolták a NO jelenlétét egy fluoreszcens indikátor, a DAF-2 (4,5-diamino-fluoreszcein) segítségével. Ez a molekula a NO-dal való reakcióba lépése után erős fluoreszcens jelet ad. A NO jelenlétét a patkány parotis acinus sejtekben Western blot analízissel is igazolták (Ishikawa és mtsai 2002). Az eredmények azt mutatták, hogy NOS2 és NOS3 nem expresszálódik a sejtekben, az anti-nos1 antitest kötődése után azonban egy jól 25

26 BEVEZETÉS látható immunoreaktív csík jött létre, mely egy 155 kda súlyú fehérjét jelzett a citoszólban. Nyúl parotis acinus sejtekben hasonló eredményt kaptak, ott egy 160 kda citoszól eredetű fehérjét találtak, ami reakcióba lépett az NOS1 antitesttel (Sugiya és mtsai 2001). Ugyanakkor a submandibularis mirigy acinussejtjeiben csak nyomokban találtak NOS1 expressziót a citoszólban, a fehérje nagy része a sejt perifériáján, közvetlenül a membrán alatt lokalizálódott (Xu és mtsai 1997). Egy évvel később Lomniczi és munkatársai más módszereket (NADPH-diaforáz festődés és immunhisztokémia) alkalmazva a patkány glandula submandibularisban csak az idegvégződésekben, valamint a ductusrendszerben találtak NOS-t, az acinussejtekben nem (Lomniczi és mtsai 1998). A NITROGÉN-MONOXID ÉS A SZEKRÉCIÓ KAPCSOLATA Régóta tudjuk, hogy a muszkarinerg receptorok stimulációjakor megemelkedik az intracelluláris Ca 2+ -szint a parotisban (Takemura 1985, Merritt és Rink 1987). A NOS1 működéséhez Ca 2+ -ra és calmodulinra van szükség. A muszkarinerg Ach-receptorok stimulációjával tehát emelkedik az intracelluláris Ca 2+ -szint és így a NOS-aktivitás is. Ezt bizonyították Wang és munkatársai, akik a muszkarinerg agonista karbakol alkalmazásakor megnövekedett NO-releaset észleltek (Wang és mtsai 1994). Muszkarinerg stimuláció során megemelkedik az intracelluláris cgmp-szint is. A cgmp pedig szerepet játszik az amiláz és K + szekréciójában, mint intracelluláris messenger (Watson és mtsai 1982). A NO szekrécióra kifejtett hatásával kapcsolatos vizsgálatok ellentmondásos eredményeket hoztak. Patkány submandibularis mirigyen végzett in vivo kísérletek szerint a NO aktiválja a nyálszekréciót, melyet különböző NOS-inhibitorok alkalmazásával bizonyítottak (Lomniczi és mtsai 1998). Lohinai és munkatársai azonban azt találták, hogy a NOS-inhibitorok fokozzák az amiláz szekréciót patkányban (Lohinai és mtsai 1999). Igaz ugyan, hogy ez utóbbi munkacsoport kevert nyálat vizsgált, s eredményeik inkább a parotis szekréciójára utalnak, mivel ez a mirigy az amiláz fő forrása (Ikeno és mtsai 1982). Az utóbbi években a kutatások fontos területévé vált annak vizsgálata, hogyan befolyásolja a cgmp-szint a Ca 2+ -homeosztázist. Két útvonal ismert, melynek során a cgmp-szint emelkedése a Ca 2+ felszabadulását eredményezi az intracelluláris 26

27 BEVEZETÉS raktárakból. A cgmp egyrészt fokozhatja a Ca 2+ -influxot a cgmp-dependens protein kinázon (G-kináz) keresztül. Másrészt a Ca 2+ felszabadulhat a rianodin-szenzitív intracelluláris raktárakból egy olyan mechanizmuson keresztül, melyben a G-kináz és a cadp-ribóz érintett (Looms és mtsai 2001). Újabban kimutatták, hogy a NO/cGMP szignáltranszdukciós útvonal hatással van az amiláz szekrécióra patkányban. Ennek lényege, hogy a karbakol aktiválja a foszfolipáz C-t, melynek hatására megemelkedik az intracelluláris IP 3 szintje. Az IP 3 hatására felszabadul a Ca 2+ az intracelluláris raktárakból, és a NOS enzim aktiválódik. A keletkezett NO pedig aktiválja a sgc-t, és cgmp termelődik a sejtben, amely a cgmp-dependens kinázokra, többek között a G-kinázra hat. A G-kináz foszforilációja amiláz szekréciót eredményez (Shimomura és mtsai 2004). Ugyanakkor igazolták, hogy a NO/cGMP kaszkád hatása a nyálszekrécióra a különböző fajokban eltérő. Mitsui közlése szerint nyúl parotisban 20-szor nagyobb a Ca 2+ -függő NOS-aktivitás, mint patkányban (Mitsui és mtsai 1997). A muszkarinerg receptorok aktivációja izolált patkány parotis acinus sejtekben 1,5-szeresére növelte a cgmp mennyiségét (Glenert és Nauntofte 1988), míg nyúl parotis acinus sejtekben 7-10-szeresére (Michikawa és mtsai 1998). Ennek ellenére bizonyították, hogy a cgmp nem vált ki amiláz szekréciót a nyúl parotis acinus sejtekben (Michikawa és mtsai 1998), míg patkány és egér (Watson és mtsai 1982) parotis acinus sejtjeiben igen. Az acinussejtekben termelődött endogén NO kis mérete és lipofil természete miatt könnyen kidiffundál a sejtből, a rövid féléletidő miatt azonban hamar lebomlik, így valószínűsíthető, hogy hatását a környező sejtekre fejti ki. Főbb funkciói a következők: 1. Megfelelő vérellátást biztosít a szekréció ideje alatt. Jól ismert tény, hogy a nyálmirigyek paraszimpatikus stimulációja vasodilatatiot okoz, a folyamatos szimpatikus stimuláció pedig egy intenzív vasoconstrictio után szintén vasodilatatiohoz vezet. A pontos mechanizmus, mellyel az exokrin mirigyek keringésének neuronális szabályozása történik, még mindig nem ismert. Az azonban tény, hogy a β-adrenerg stimuláció (például izoproterenollal) NOfelszabadulást idéz elő az acinusssejtekben, míg a paraszimpatikus ingerlésnek (például Ach-nal) nincs ilyen hatása (Looms és mtsai 2001). 27

28 BEVEZETÉS 2. A NO retrográd messengerként is működik (feedback hatás a periacinaris idegvégződések felé). A negatív vagy pozitív visszacsatolás valószínűleg mind a szimpatikus, mind a paraszimpatikus idegvégződések felé működik, hiszen a kétféle idegág között összeköttetés van a szekréció során (Looms és mtsai 2001). 3. A nyálmirigyek környezetében található szövetek sejtjeinek, főként az ideg és ér eredetű sejteknek a növekedését és differenciálódását is szabályozza a NO (Looms és mtsai 2001). 4. A NO részt vesz a host defence barrier fenntartásában a mikroorganizmusokkal, illetve tumorsejtekkel szemben (Looms és mtsai 2001). 5. Szerepe van számos kórkép patogenezisében, melyekben a NO-termelés túl alacsony vagy túl magas (például Sjögren-szindróma, periodontalis kórképek, egyes tumorok) (Looms és mtsai 2002, Brennan és mtsai 2003). A NYÁL SZEREPE A GYULLADÁSBAN A nyálmirigyek által termelt nyál szerepe igen sokrétű. A nyál egyik fő feladata a szájüreg védelme, egyrészt a szövetek nedvesen tartása, másrészt a mucin (illetve prolindús fehérjék), mint az epithelium felületén ható síkosító közeg szekréciója révén. Ugyanakkor a nyál egy olyan állandó milliőt biztosít, amelyben a zománc oldódásának kivédése miatt igen magas a Ca 2+ és PO 2-4 (valamint F - ) koncentráció, a bekerülő savak pedig közömbösítődnek a HCO - 3 pufferhatása révén. A nyál hatására kezdődik el a fő emésztő enzim, az amiláz által az egyik legfontosabb tápanyag, a szénhidrát lebontása a cavum orisban (Ferguson 1999). A nyál antibakteriális hatása révén védelmet nyújt a szájüregen keresztül a szervezetbe elkerülhetetlenül behatoló baktériumokkal szemben is. Ennek a rendszernek az egyik tagja a laktoperoxidáz-tiocianát-rendszer. Szerepe a szájüregben a baktériumok által termelt és a nyálkahártya hámsejtjei számára káros hidrogén-peroxid átalakítása. A laktoperoxidáz a nyálban található tiocianát jelenlétében a hidrogén-peroxidból vizet és a hámsejtekre sokkal kevésbé toxikus hipotiocianátot képez. A lizozim szintén antibakteriális tulajdonságokkal rendelkezik. Muramidáznak is hívják, mivel feladata a baktériumok sejtfalában található muraminsav bontása. Az IgA (Immunglobulin A) viszonylag magas koncentrációban fordul elő a nyálban a többi immunglobulinhoz 28