SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA A LOKÁLIS NEURONHÁLÓZAT SZEREPE A STRESSZVÁLASZ ÉS A HYPOTHALAMUS-HYPOPHYSIS- MELLÉKVESEKÉREG GÁTLÓ SZABÁLYOZÁSÁBAN Doktori (Ph.D.) értekezés Dr. Bali Balázs Témavezetı: Dr. Kovács Krisztina, az MTA doktora MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Molekuláris Neuroendokrinológia Laboratórium Budapest, 2005

2 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola (Multidiszciplináris orvostudományok) 6/2 Neuroendokrinológia Program Doktori Iskola vezetıje: Dr. Réthelyi Miklós, az MTA doktora Programvezetı: Dr. Liposits Zsolt, az MTA doktora Szigorlati Bizottság: Elnök: Dr. Csillag András, az MTA doktora Tagok: Dr. Nagy György, az MTA doktora Dr. Urbanics Rudolf, Ph.D. Védés: Elnök: Dr. Rácz Károly, az MTA doktora egyetemi tanár (Semmelweis Egyetem, II. sz. Belgyógyászati Klinika) Tagok: Dr. Halasy Katalin, az MTA doktora egyetemi tanár (Szent István Egyetem, Anatómiai és Szövettani Tanszék) Dr. Köves Katalin, az MTA doktora egyetemi tanár (Semmelweis Egyetem, Humánmorfológiai és Fejlıdésbiológiai Intézet) Hivatalos Bírálók: Dr. Párducz Árpád, az MTA doktora egyetemi tanár (MTA SzBK, Biofizikai Intézet) Dr. Kiss József, az MTA Doktora tudományos tanácsadó (Semmelweis Egyetem, Humánmorfológiai és Fejlıdésbiológiai Intézet) 2

3 TARTALOMJEGYZÉK ÁBRÁK JEGYZÉKE...5 TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE...5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ÖSSZEFOGLALÓ SUMMARY ELİSZÓ BEVEZETÉS Stressz és stresszelméletek Stresszorok és a stresszválaszban szerepet játszó agyterületek A nucleus paraventricularis hypothalami anatómiája és neuropeptidjei Corticotropin-releasing hormon Vazopresszin Glükokortikoid feedback A paraventricularis mag afferensei és neuronális szabályozása Visceroszenzoros bemenetek Limbikus bemenetek Intrahypothalamikus kapcsolatrendszer GABAerg szabályozás CÉLKITŐZÉSEK ALKALMAZOTT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK In vivo vizsgálatok Kísérleti állatok Mőtéti beavatkozások Mikroinjekció Mikrodialízis Stressz Vérvétel és hormonmérés Intrakardiális perfúzió Szövettani módszerek Metszés és szövettárolás Immuncitokémia Kombinált immuncitokémia és in situ hibridizáció Kvantitatív képelemzés Statisztikai módszerek In vitro vizsgálatok Kísérleti állatok és szeletkészítés Tenyésztési körülmények, oldatok és kezelések Hormonmérés

4 Szövettani módszerek Fixálás és szövettárolás Immuncitokémia In situ hibridizációs hisztokémia és autoradiográfia Kvantitatív képelemzés Statisztikai módszerek EREDMÉNYEK Intrinsic GABAerg gátlás organotipikus hypothalamus szelettenyészeten Az organotipikus hypothalamus szeletpreparátum jellemzése A CRH és az AVP transzkripció jellegzetességei in vitro Glükokortikoid hormonok és TTX hatása a PVN CRH expressziójára in vitro körülmények között Paraventricularis sejtaktiváció a GABA A -antagonista kezelést követıen a szelettenyészeten CRH és AVP expressziós válaszok a GABA A -receptorok blokkolásának hatására in vitro Centrális GABAerg tónus a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg rendszerben in vivo Neuronális aktiváció a patkány hypothalamusában GABA A -antagonista paraventricularis beadását követıen A PVN CRH és AVP expressziója a GABA A -antagonista lokális beadása után A PVN-be juttatott GABA A -antagonista hatása a plazma ACTH-szintre Stressz által okozott GABAerg aktiváció a központi idegrendszerben A GAD65-eGFP egértörzs hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg rendszerének és stresszválaszának jellemzése Stressz-indukálta c-fos/egfp kolokalizáció GABA A -agonisták hatása a PVN stressz-indukálta c-fos immunreaktivitására MEGVITATÁS Az organotipikus szelettenyészet mint a lokális neuronhálózat vizsgálatának modellje módszertani megfontolások A CRH-génexpresszió szabályozásának lokális elemei Lokális interneuronok a PVN-bemenetek integrálásában Stressz, glükokortikoidok és GABAerg szabályozás KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

5 ÁBRÁK JEGYZÉKE 1. ábra. A hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg rendszer 2. ábra. A nucleus paraventricularis hypothalami almagjai és projekciói 3. ábra. A PVN afferens kapcsolatai 4. ábra. Az organotipikus hypothalamus szelettenyészet vizsgált sejttípusai 5. ábra. A PVN CRH mrns expressziója a tenyésztı tápoldat kortikoszteron koncentrációjának függvényében 6. ábra. Alapszintő és forskolinnal stimulált AVP-transzkripció organotipikus hypothalamus szelettenyészeten 7. ábra. Glükokortikoidok és TTX hatása a PVN CRH mrns expressziójára in vitro 8. ábra. A c-fos korai gén indukálhatósága organotipikus hypothalamus szeleten 9. ábra. GABA A -antagonista hatása a hypothalamus szelettenyészet c-fos expressziójára 10. ábra. GABA A -antagonista kezelés hatása a szelettenyészet CRH és AVP expressziójára 11. ábra GABA A -receptorblokád hatása a paraventricularis régió c-fos expressziójára 12. ábra A nucleus paraventricularis hypothalami CRH és AVP expressziója GABA A - antagonista helyi mikroinjekciója után 13. ábra A GABA A -antagonista paraventricularis mikroinjekcióját követı ACTHválasz 14. ábra. egfp és GAD65 mrns expressziós mintázat a GAD65-eGFP génmódosított egerek paraventricularis régiójában 15. ábra. A GAD65-eGFP transzgenikus egértörzs HPA mőködésének és stresszreaktivitásának vizsgálata 16. ábra. Stressz által okozott c-fos-indukció a GAD65-eGFP génmódosított egér paraventricularis régiójában 17. ábra. Stressz által kiváltott sejtaktiváció a lateralis septumban 18. ábra. A c-fos/egfp kolokalizáció mértéke a GAD65-eGFP transzgenikus egér stresszel kapcsolatos agyterületein 19. ábra. A GABA A -receptorok aktivációja csökkenti a stressz által okozott c-fos indukciót a PVN-ben. 20. ábra. A PVN lokális neuronhálózatának modellje a neuroszekréciós CRHrendszer alacsony és magas aktivitású állapotaiban TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE 1. táblázat. A limbikus - hypothalamikus pályák neurokémiai fenotípusa 2. táblázat. A PVN limbikus bemeneteinek átkapcsoló területei 5

6 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 5-HT szerotonin AII angiotenzin II ABC avidin-biotin-peroxidáz komplex ACSF mesterséges cerebrospinalis folyadék ACTH adrenokortikotrop hormon ADX mellékveseirtás AHA area hypothalamica anterior ANOVA varianciaanalízis AP akciós potenciál AP1 1-es típusú aktivátor protein ARC nucleus arcuatus AVP arginin-vazopresszin BLA basolateralis amygdala BME Basal Medium Eagle BMI bicuculline methiodide BNST nucleus interstitialis striae terminalis BSA borjú szérum albumin camp ciklikus adenozin-monofoszfát CART cocain and amphetamin related transcript CB1 1-es típusú kannabinoid receptor CCK kolecisztokinin CeA centralis amygdala CNQX 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3- dione CRH corticotropin-releasing hormon DAB 3.3 -diaminobenzidin tetrahidroklorid DAG diacilglicerin DBH dopamin β-hidroxiláz DEPC dietilpirokarbonát DHDOC dihidro-dezoxikortikoszteron DIV DMN dpm days in vitro nucleus dorsomedialis hypothalami radioaktív bomlások száma percenként EDTA etiléndiamin-tetraecetsav EPSC serkentı posztszinaptikus áram egfp felerısített zöld fluoreszcens FITC fehérje fluoreszcein izotiocianát GABA gamma-amino-vajsav GAD GR GRE glutaminsav dekarboxiláz glükokortikoid receptor glucocorticoid-responsive element hnrns heteronukleáris RNS HPA IL ir ISH hypothalamus-hypophysis mellékvesekéreg interleukin immunreaktív, immunreaktivitás in situ hibridizáció 6

7 IPSC gátló posztszinaptikus áram KCl kálium-klorid KPBS kálium-foszfát puffer LHA lateralis hypothalamikus area LPS lipopoliszacharid MeA medialis amygdala mpd medialis parvocellularis dorsalis MR mineralokortikoid receptor MSH melanocyta stimuláló hormon mrns messenger RNS NA noradrenalin Ni nikkel intenzifikáció NO nitrogén-monoxid NMDA N-metil-d-aszpartát nnos neuronális nitrogén-monoxid szintáz NTS nucleus tractus solitarii P születés utáni kor PFC prefrontalis cortex PKC protein kináz C PLC foszfolipáz C POA area preoptica PSL fotostimulálható luminescencia PVN nucleus paraventricularis hypothalami RIA radioimmunassay SCN nucleus suprachiasmaticus hypothalami SEM standard hiba SFM szérummentes táp SPVZ subparaventricularis zóna SUB subiculum Tg transzgenikus TH tirozin hidroxiláz THDOC allotetrahidrodezoxikortikoszteron TMN nucleus tuberomamillaris ttkg testtömegkilogramm TTX tetrodotoxin VGLUT vezikuláris glutamát transzporter VMN nucleus ventromedialis hypothalami Wt vad típusú 7

8 1. ÖSSZEFOGLALÓ Az emlıs szervezet stresszre adott endokrin, autonóm és magatartási válaszának hypothalamikus kulcseleme a nucleus paraventricularis hypothalami (PVN) corticotropin-releasing hormont (CRH) és arginin-vazopresszint (AVP) termelı parvocellularis sejtcsoportja. Alapvetıen két gátló mechanizmus ismert, amely korlátozhatja a CRH neuronok és a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg rendszer aktivitását: a glükokortikoid hormonok negatív visszacsatolása és a GABAerg interneuronok által kifejtett neuronális gátlás. Célunk a GABAerg gátlás lokális összetevıinek felderítése volt immuncitokémiai és in situ hibridizációs módszerekkel patkányokon, GAD65-eGFP transzgenikus egereken és organotipikus szelettenyészeten in vitro. Organotipikus hypothalamus szeleten kimutattuk, hogy 1.) a PVN-ben a CRH génexpresszióját a közeli neuronális bemenetek alapvetıen meghatározzák; 2.) a CRHgénexpresszió akcióspotenciál-függı, illetve érzékeny a glükokortikoidok gátló hatására, valamint 3.) a CRH és AVP expressziója tónusos GABAerg gátlás alatt van, amelyet részben a lokális neuronhálózat tart fent. In vivo erre a hálózatra vetülnek a limbikus bemenetek, és szabályozzák a hypophyseotrop rendszer transzkripciós és szekréciós aktivitását. Kimutattuk továbbá, hogy 4.) a PVN GABAerg tónusának felfüggesztése jelentısen aktiválja a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg tengelyt in vivo, 5.) akut éter stressz hatására gátló neuroncsoportok aktiválódnak a hypothalamusban és a limbikus rendszerben, illetve 6.) a GABAerg rendszer képes lecsökkenteni a parvocellularis neuronok stressz-indukálta aktiválódását. Eredményeink alapján a parvocellularis PVN lokális GABAerg bemenete számos olyan neuronhálózati és funkcionális sajátosággal bír, amelyek alkalmassá teszik, hogy CRH-neuroszekréció egyik lényeges meghatározója legyen. Mind az alapszintő tónusos GABAerg gátlás, mind ennek a felfüggesztése hatékonyan képes befolyásolni a parvocellularis rendszer transzkripciós és neuroszekréciós aktivitását. Hipotézisünk szerint a GABAerg tónus lecsökkentése a PVN-ben jelentısen hozzájárulhat a stresszválasz beindításához, míg a stressz által aktivált lokális és extrahypothalamikus GABAerg neuroncsoportok párhuzamosan a glükortikoidok negatív visszacsatolásával részt vesznek a centrális stresszválasz befejezésében. 8

9 2. SUMMARY Coordinated neuroendocrine, autonomic and behavioral responses to stress critically depend on a specific cell population in the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN). Parvocellular neurons in the PVN synthesize and release corticotropin-releasing hormone (CRH) and arginine-vasopressin (AVP) to activate the hypothalamo-pituitaryadrenocortical (HPA) axis during stress. There are two major inhibitory mechanisms that constrain the activity of parvocellular neurons: the hormonal feedback inhibition provided by the glucocorticoids and the neuronal inhibitory drive posed by GABAergic interneurons. Aim of our study was to characterize the local component of GABAergic inhibition of the PVN by means of immuncytochemical and in situ hybridization techniques in rats, in GAD65-eGFP transgenic mice, and in organotypic slice culture in vitro. Using hypothalamic slice cultures we have revealed that i) CRH expression in the PVN is substantially influenced by local neuronal inputs, ii) CRH transcription is actionpotential dependent and responsive to the inhibitory effect of glucocorticoids, iii) expression of CRH and AVP genes is under tonic GABAergic inhibition maintained by local GABAergic interneurons in the slice. In vivo, this local GABAergic circuit provides an inhibitory tone to the stress-related effector neurons, and also mediates effects of limbic efferents to the PVN. We have demonstrated that iv) suspension of GABA A - mediated inhibitory tone in the PVN effectively stimulates the HPA-axis in vivo. In addition, v) acute ether stress activates inhibitory neuron populations in the hypothalamus and limbic structures, and vi) GABAergic system has a capacity to reduce stress-induced activation of parvocellular neurons in the PVN. Our results reveals that local GABAergic input to the parvocellular PVN exhibits distinct neuroanatomical and functional properties allowing effective control of CRH neurosecretion. Either maintaining or suspending the GABAergic tonic inhibition have a profound effect on the transcriptional and secretional activity of the parvocellular neuron population. We propose that reduction of the GABAergic inhibitory tone substantially contributes to stress initiation, while activation of local and extrahypothalamic GABAergic circuits, along with steroid negative feedback, is involved in termination of the central stress response. 9

10 3. ELİSZÓ A doktori értekezésem célkitőzése, hogy összefoglalja a jelenlegi ismereteket a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg rendszer és a stresszválasz gátló szabályozásáról, és bemutassa azokat a vizsgálatokat, amelyeket az MTA Kísérleti Orvostudományi Intézetének Molekuláris Neuroendokrinológia Laboratóriumában ebben a témában végeztem. A felvázolt problémák és megközelítések alapkutatás jellegőek: a HPA-rendszer és a stressz hypothalamikus kulcselemének, a nucleus paraventricularis hypothalami GABAerg gátlásával foglalkozik, azon belül is a lokális neuronhálózati elemekre összpontosít. Az írás során törekedtem az idegen szakkifejezések magyaros átírására és következetes használatára. Latin nevezéktan kizárólag az anatómiai neveknél és a hatóanyagoknál szerepel; ugyanakkor az olvasó dolgát megkönnyítendı az irodalomban megszokott angol rövidítéseket (pl. HPA, PVN, BNST) használtam. 10

11 4. BEVEZETÉS Az élı szervezet sajátossága, hogy képes változással reagálni a környezetébıl, illetve a saját biológiai rendszerébıl érkezı kihívásokra. Ezek a külsı fizikai és szociális tér, vagy valamely belsı élettani paraméter megváltozását jelentik. Lehetnek az egyed számára negatívak ( fenyegetıek ) vagy pozitívak ( jutalmazóak ), de mindenképpen fontosak, és homeosztatikus, illetve viselkedéses választ igényelnek. A válasz többnyire összetett, több szervrendszert magába foglaló reakció Stressz és stresszelméletek Ebben a komplex válaszmintázatban mind történetileg, mind a témakör mai fogalomrendszere szempontjából kiemelkedı jelentıséggel bír a mellékvesék glükokortikoid felszabadításának gyors és nagymértékő fokozódása. A jelenséget felismerve alkotta meg Selye János a múlt század harmincas éveiben az általános adaptációs szindróma elméletét, illetve az egyed és környezete közötti kölcsönhatás új paradigmáját, a stressz fogalmát [338]. Definíciója szerint stresszor minden olyan tényezı, amely az adrenokortikotrop hormon (ACTH) és a glükokortikoidok elválasztását fokozza. Alapvetı megfigyelése szerint az egymástól nagyon különbözı behatásokra hasonló patológiás elváltozások jöhetnek létre szervezetben, amelyet stresszszindrómának nevezett [339]. A tünetegyüttes mindhárom elváltozását a mellékvesék megnagyobbodása, thymolymphaticus involúció és gasztrointesztinális fekélyek - a glükokortikoid hormonok fokozott elválasztásával hozta összefüggésbe. A glükokortikoidok teszik lehetıvé a szervezet számára a stresszel való megbirkózást és az adaptációt. Részt vesznek a kardiovaszkuláris tónus fenntartásában, az energiaraktárak mobilizálásában, és gátolják az immunrendszer mőködését. Bár számos hatásukat jól ismerjük, és elválaszthatatlanok a stressz fogalmától, pontos szerepük a mai napig sem kellıen tisztázott. Számos stresszelmélet létezik, amelyek különbözı nézıpontból értelmezik a stressz és a glükokortikoidok kapcsolatát és jelentıségét. Alan Munck elmélete szerint a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg (HPA) tengely elsıdleges funkciója a szervezet stresszre adott saját válaszának korlátozása, megelızve, hogy ezek a reakciók elszabaduljanak és önkárosítóvá váljanak 11

12 [257]. Ismert, hogy állatkísérletekben az autoimmun betegségekhez hasonló krónikus gyulladásos kórképek alakulnak ki, ha a glükokortikoidokat valamilyen módon tartósan eltávolítjuk a szervezetbıl [81, 90]. Bruce McEwen allosztázis modelljében homeosztatikus és allosztatikus paramétereket különböztet meg [239]. Az elıbbiek csak egy szők tartományon belül változhatnak, extrém kilengéseik nem összeegyeztethetıek az élettel. Ide tartozik a vér glükóz koncentrációja, az extracellularis tér ozmolaritása és elekrolitösszetétele stb. Ezzel szemben az allosztatikus rendszerekre a nagyobb amplitúdójú változások a jellemzıek, és éppen e változásokkal stabilizálják a homeosztatikus paramétereket ( állandóság a változás révén ). Az allosztatikus rendszerek típuspéldája az endokrin rendszer, és különösképpen annak tekinthetı a HPA-tengely. A stressz jelenségét az egyed szintjérıl a populáció nézıpontjába helyezi Gerald Hüther evolúciós stresszelmélete [147]. Hüther szerint minden élılény rendelkezik egy genetikusan meghatározott, viszonylag rigid ún. archaikus típusú stresszválasszal. A törzsfejlıdésben a magasabb rendő gerincesek felé haladva ezt kiegészíti egy nyitott viselkedéses programokra épülı, rugalmasabb válasz. A stressz jelentısége ebben a modellben a szelekció: a stresszt kísérı tanulási és plaszticitási folyamatok megváltoztatják, újraszervezik az egyed viselkedéses stratégiáit, és bekövetkezhet az adaptáció (kontrollálható stressz). Ebbıl a szempontból különösen érdekes megemlíteni azt a tényt, hogy a központi idegrendszerben a glükokortikoid receptorok legnagyobb számban a tanulási, emocionális és motivációs folyamatokban szerepet játszó limbikus rendszerben vannak jelen [289, 312]. Amennyiben a stressz tartósan fennáll, olyan patológiás következmények alakulhatnak ki, amelyek alkalmasak az adott genotípust eltüntetésére a populációból (nem kontrollálható stressz). A stressz által kiváltott gonadotrop funkciócsökkenés [180, 389], kognitív deficit [77, 314] és depressziós tünetegyüttes [113] jelentısen csökkenti az egyed reprodukciós esélyeit a közösségben. Mára a stressz fogalma széles körben elterjedt, más tudományágak, így a pszichológia, pszichiátria, pszichoszomatikus orvoslás stb. is használják. A pszichológia az újszerő, magatartási döntést igénylı helyzeteket nevezi stresszhelyzetnek [182]; a még szőkebb pszichopatológiai értelmezés szerint az adott helyzet feletti kontroll 12

13 képességének hiánya, illetve ennek észlelése minısül stressznek [345]. Bár számos tudományterület használja a stressz fogalmát, nincs általánosan elfogadott definíciója az élettudományokban [267]. A klinikai tudományok közül a pszichiátria a stresszt mint kórállapotot kiváltó, illetve rontó tényezıt tekinti. Az Amerikai Pszichiátriai Társaság nozológiai rendszerében (DSM IV, 1994) az öt diagnosztikus tengely közül kettı tekinthetı stresszel kapcsolatosnak: a III. tengely az egyént érintı kóros testi állapotokra és betegségekre, a IV. tengely a pszichoszociális és környezeti tényezıkre kérdez rá [12]. A jelen munka elsıdlegesen a HPA-tengely központi idegrendszeri szabályozásával foglalkozik, ezért a továbbiakban stressz alatt Selye élettani (endokrin) definícióját használom Stresszorok és a stresszválaszban szerepet játszó agyterületek A stresszre adott endokrin, vegetatív és magatartási válasz kialakításában a központi idegrendszer számos területe vesz részt. Bár a különféle stresszorok eltérı szenzoros és feldolgozó rendszereket mozgósítanak az agyban, minden esetben elérik a stresszválasz végsı közös útját jelentı hypophyseotrop parvocellularis neuronokat a hypothalamus paraventricularis magjában (PVN). Ez a sejtcsoport szabályozott módon corticotropinreleasing hormont (CRH) és vazopresszint (AVP) juttat az agyalapi mirigy portális keringésébe, ezzel fokozva az adenohypophysis ACTH-elválasztását és végsı soron a mellékvesekéreg glükokortikoid-felszabadulását [67, 130, 329]. A stresszválasz centrális pályarendszere a HPA-szabályozásában közvetlenül szerepet játszó PVN-en túl számos más agyterületet magába foglal, többek között agytörzsi, középagyi és kérgi struktúrákat. A stresszorokat az irodalom alapvetıen pszichogén és fizikális kategóriákba sorolja aszerint, hogy részt vesznek-e magasabbrendő elıagyi (pl. limbikus) területek a feldolgozásban vagy sem [71, 91, 93, 130, 267, 330]. A stressz által mozgósított központi idegrendszeri sejtcsoportok nyomonkövetésére gyakran használt módszer a c-fos indukálható korai gén mrns vagy fehérjetermékének szöveti kimutatása [47, 190, 306]. A c-fos gén bazális expressziója alacsony szintő, a sejtet érı különféle extracellularis stimulusokra azonban gyorsan és tranziens módon megnı [117, 253]. Elınye, hogy az indukció sztereotíp, tehát nem függ 13

14 a stimulus fajtájától, valamint a módszer mennyiségi meghatározást is lehetıvé tesz. Ez a megközelítés olyan funkcionális térképet szolgáltat, amelyen az egyedi sejt szintjén azonosíthatóak az adott kihívásra aktiválódott neuronok. Pályajelöléssel, agyterületek vagy pályák szelektív léziójával, illetve a neuronok fenotípusának immuncitokémiai vagy in situ hibridizációs meghatározásával összekötve az aktiválódott pályarendszer neuroanatómiája és neurokémiája pontosan leírható [46, 343]. 1. ábra. A hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg rendszer. A PVN parvocellularis neuronjai CRH-t és AVP-t juttatnak az eminentia mediana portális keringésébe, ami az adenohypophysis corticotrop sejtjeibıl ACTH-felszabadulást és így a mellékvesekéreg glükokortikoid szekrécióját okozza. A hypothalamikus és hypophyseális feedback helyek mellett számos központi idegrendszeri terület expresszál kortikoszteroid receptorokat. Szemben az általánosan kifejezıdı kis affinitású glükokortikoid receptorral (GR, zöld szín), a nagy affinitású mineralokortikoid receptorok (MR, sárga szín) expressziója a limbikus rendszerre, azon belül is a hippocampus, a septum laterale és az amygdala területére jellemzı. Rövidítések: ACTH: adrenokortikotrop hormon, AMY: amygdala, AVP: arginin-vazopresszin, CRH: corticotropinreleasing hormon, GR: glükokortikoid receptor, HC: hippocampus, LS: spetum laterale, MR: mineralokortikoid receptor, NTS: nucleus tractus solitarii, PFC: prefrontalis cortex, PVN: nucleus paraventricularis hypothalami 14

15 Fizikális stresszor az a hatás, amely közvetlenül valamelyik homeosztatikus paramétert fenyegeti, és ezért azonnali választ igényel. Használatos még a szisztémás, homeosztatikus, vagy fiziológiás stresszor elnevezés is. Olyan stresszorok tartoznak ide, amelyeknél nem jelentıs a kérgi neuronális aktiváció, ugyanakkor kifejezett a visceroszenzoros területek részvétele. Jellemzıen ezek ozmotikus, metabolikus, kardiovaszkuláris vagy immunológiai kihívást jelentenek a szervezet számára. A fizikális stressz állatkísérletes modelljeként leggyakrabban vérvesztést [367], hipoxiát [344], hipoglikémiát [94], IL-1 vagy bakteriális lipopoliszacharid (LPS)-injekciót alkalmaznak [93, 203, 405]. A fizikális stresszorok közvetlenül aktiválják az agytörzs visceroszenzoros központjait (nucleus tractus solitarii [NTS] és nucleus parabrachialis), és az innen felszálló pályán keresztül a PVN hypophyseotrop neuronjait [267, 297, 315, 328]. A stresszorok e csoportjára jellemzı, hogy egyféle, jól meghatározható szenzoros rendszer felıl viszonylag egyszerő, néhány neuronból álló pályán keresztül érik el a CRH-neuronokat [130]. A fenyegetett élettani változótól függıen a neuronális bemenetek is többfélék lehetnek. A baro- és volumenreceptorok, illetve a gasztrointesztinális rendszer kemoreceptorai és lokális peptidhormonjai az NTS vagális/glossopharyngeális rendszerét használják [48, 49, 330, 406]. A szisztémásan keringı citokinek és peptidhormonok, valamint a plazma ozmolaritás kilengései a circumventricularis szerveket [93, 165, 330], a maghımérséklet változásai az elülsı hypothalamus termoreceptív területeit mozgósítják [331]. Más típusú igénybevételt jelent az új környezetbe kerülés [91, 242], bezártság szők helyre [58, 70], az immobilizáció [46], vagy a tanult félelem modell [111]. Ezekben az esetekben összetett szomatoszenzoros és/vagy nociceptív stimulusok váltják ki a HPAválaszt, amelyet a korábbi tapasztalatokra épülı emocionális és tanulási elemek alapvetıen módosíthatnak. A léziós vizsgálatok alapján a limbikus rendszer bizonyos területei (prefrontalis cortex, hippocampus) alapvetıek az ilyen típusú stresszorokra adott neuroendokrin válasz létrehozásában, ezért a stresszorok e másik csoportja a limbikus, processzált vagy más megjelöléssel a pszichogén stresszor elnevezést kapta [130, 329, 330]. 15

16 A pszichogén stresszre jellemzı, hogy a multimodális és kevéssé specifikus ingerek elıagyi kérgi (prefrontalis cortex) és kéreg alatti (lateralis septum, nucleus interstitialis striae terminalis [BNST], amygdala) területeket mozgósítanak. Az elıagyi aktiváción túl a középvonali thalamus, a középagyi substantia grisea centralis, az agytörzsben a locus coeruleus, az NTS és a ventrolateralis medulla katekolaminerg sejtjei mutatnak c-fos indukciót [58, 71, 210]. Bár az agytörzsi katekolaminerg rendszer részvétele dominálóan a fizikális stresszre jellemzı, kisebb mértékben a pszichogén stresszoroknál is megfigyelhetı. Ez utóbbi esetben a medulláris aktiváció valószínőleg másodlagos: egy, a PVN-bıl leszálló pálya révén alakul ki [72, 209, 330]. Fontos hangsúlyozni, hogy ez a csoportosítás nem kizárólagos, és e kategóriák egy kontinuum két végpontját jelentik. A legtöbb környezeti, illetve kísérletes stresszor fizikális és pszichés összetevıt egyaránt magába foglal. A laboratóriumi állatoknál gyakran alkalmazott úszásstressz például erıteljes pszichés (a környezet új és fenyegetı) és fizikális (a hideg víz által okozott hypothermia) elemekbıl áll [59]. A saját vizsgálatainkban használt éterstressz ugyancsak tartalmaz pszichés (új környezet, averzív szag), valamint fizikális (respirációs distressz, hipoxia) összetevıket. Tovább árnyalja a képet, hogy vannak olyan limbikus területek, amelyek mindkét típusú stresszor esetén aktiválódnak, ilyen a lateralis septum és a BNST [130]. A behatás idıtartama/frekvenciája alapján a stresszorok tovább csoportosíthatóak akut, ismétlıdı és folyamatosan fennálló, krónikus stresszre. Ezek részletezése, valamint a többszöri stressznél fellépı habituációs és facilitációs folyamatok leírása meghaladja az értekezés kereteit (áttekintı munkák: [128, 194]) A nucleus paraventricularis hypothalami anatómiája és neuropeptidjei A PVN a rostralis hypothalamus 3. agykamrával szomszédos kétoldali sejtcsoportja. A magot patkánynál mintegy neuron alkotja [175], melyek citoarchitektúrája, peptid és neurotranszmitter tartalma, afferens és efferens kapcsolatrendszere, valamint elektrofiziológiai tulajdonságai alapján a PVN további almagokra osztható [173, 354, 355, 357, 361]. A mag lateralis szegletében találjuk az oxitocin- és vazopresszintermelı magnocellularis neuronokat, amelyek a hypophysis hátsó lebenyébe küldik a rostjaikat. 16

17 A medialis rész tartalmazza a parvocellularis neuronokat, amelyek részben neuroendokrin, részben autonóm mőködésőek. A különbözı funkciójú sejtek nem véletlenszerően helyezkednek el a magban; a PVN funkcionálisan is bizonyos mértékig felosztható (lásd 2. ábra). A neuroendokrin sejtcsoport az anterior és dorsalis medialis parvocellularis, valamint a periventricularis almagban található. Axonjaik az eminentia mediana portális kapillárisrendszere körül végzıdnek, és a hypophysis elülsı lebenyének hormontermelését szabályozzák. A PVN vegetatív funkciójú sejtjei a neuroendokrin résztıl dorsalisan és ventrolateralisan helyezkednek el, az innen eredı parvocellularis rostok elhagyják a hypothalamust, és az agytörzs és gerincvelı preganglionáris autonóm központjaiban végzıdnek. 2. ábra. A nucleus paraventricularis hypothalami almagjai és projekciói. A rajz a patkányagy frontalis metszetén mutatja a PVN magnocellularis és parvocellularis sejtcsoportját. A magnocellularis rendszer (kék szín) vazopresszint és oxitocint szekretál a neurohypohysis területén a szisztémás keringésbe. A parvocellularis hypophyseotrop axonok (sárga szín) az eminentia mediana külsı zónájában végzıdnek, ahol hypophyseotrop neuropeptideket, pl. CRH-t és AVP-t juttatnak a portális perikapilláris térbe. A parvocellularis autonóm neuronok (zöld szín) a gerincvelı és az agytörzs preganglionaris vegetatív neuronjait innerválják. Rövidítések: 3v: 3. agykamra, AHA: anterior hypothalamikus area, AVP: arginin-vazopresszin, CRH: corticotropin-releasing hormon, dp: parvocellularis dorsalis, fx: fornix, mpv: medialis parvocellularis ventralis, mpd: medialis parvocellularis dorsalis, pml: posterior magnocellularis lateralis, OXY: oxitocin, PVN: nucleus paraventricularis hypothalami, SPVZ: subparaventricularis zóna Az egyes funkcionális PVN sejtcsoportok specifikus hormonokat és neurotranszmittereket tartalmaznak. A periventricularis almag jellemzı neuropeptidje a szomatosztatin, ettıl lateralisan találhatóak a thyreotropin-releasing hormont (TRH) expresszáló neuronok, még lateralisabban a CRH-sejtek [214]. Fontos hangsúlyozni, hogy a PVN neuroncsoportjainak a peptidtartalmuk alapján történı jellemzése nem jelenti az egyes sejtpopulációk teljes elkülönülését, csupán annyit, hogy az adott neuropeptid legnagyobb mennyiségben az adott területen van jelen. A parvocellularis 17

18 területre különösen jellemzı, hogy több neuropeptid van egyidejőleg jelen az adott sejtben (koexpresszió). Többek között AVP, CCK, enkefalinok (ENK), neurotenzin (NT), galanin (GAL), vazoaktív intesztinális peptid (VIP), pitvari nátriuretikus peptid (ANP), cocain and amphetamin related transcript (CART), angiotenzin II jelenlétét bizonyították parvocellularis neuronokban [45, 173, 327, 393]. A vazopresszin kivételével, a kolokalizált neuropeptidek funkciója a HPA-mőködés szabályozása szempontjából kevéssé feltárt [8]. A magnocellularis neuronokat elsıdleges neuropeptid tartalmuk alapján oxitocinerg és vazopresszinerg sejtekre osztják, bár mindkét sejttípus további peptideket is expresszál. A magnocellularis AVP-sejtekben dinorfin, galanin és CCK mutatható ki, az oxitocintermelık CRH-t is expresszálnak [327]. A sejtek neurokémiai fenotípusa nem állandó. Kimutatták, hogy laktáló patkányban a magnocellularis neuronok %-ában az oxitocin és a vazopresszin egy sejten belül is kifejezıdik [244, 320]. Hasonló módon neuropeptid Y (NPY) jelenik meg ozmotikus stimuláció után a magnocellularis rendszerben [199]. A HPA szempontjából a parvocellularis CRH-sejtek AVP-koexpressziója alapvetı fontosságú. Szemben a magnocellularis rendszer folyamatos és magas szintő bazális AVP-expressziójával, a parvocellularis neuronokban nyugalmi körülmények között az AVP hnrns, mrns és peptid tartalom a kimutathatóság határán van [189]. Bár az alapszintő parvocellularis AVP-kifejezıdés alacsony, elektronmikroszkópos immuncitokémiával a patkány CRH sejtjeinek mintegy 50 %-ában tudtak AVP-ir-t kimutatni [402]. Ezek a CRH+/AVP+ sejtek a magon belül lateralisan és dorsalisan helyezkednek el, míg az AVP-t nem termelı CRH-neuronok inkább medialisan és ventralisan [403, 404]. Más fajokban a parvocellularis CRH+/AVP- és CRH+/AVP+ neuronok aránya eltérı lehet, egérben például a CRH-tartalmú idegvégzıdések 100 %-a immunpozitív AVP-re is [11]. A két sejttípus arányát az állat stressz-, illetve kortikoszteron státusza nagyban meghatározza. Kétoldali mellékveseirtás (ADX) után az eminentia mediana területén az összes CRH-immunpozitív axon AVP-pozitívvá is válik, ami glükokortikoidok adásával visszafordítható [172, 227, 321, 324, 401, 410]. A CRH és az AVP nem csupán sejtszinten, hanem subcellularisan is kolokalizál: Hisano és mtsai kimutatták, hogy az eminentia mediana területén a két neuropeptid kimutatható egyazon szekréciós 18

19 granulumban is [140]. Akut és krónikus stressz hatására a CRH-sejtekben ugyancsak megjelenik az AVP-expresszió [4, 17, 172, 189, 227, 228, 235]. A stressz neurobiológiájával fogalkozó szakirodalom a vazopresszint mint elsıdlegesen szabályozott élettani változót tekinti a stresszválasz során. Ebben a modellben a CRH a HPA-tengely alaptónusát biztosítja, és az AVP határozza meg a HPA-válasz specificitását és érzékenységét mind a serkentı (stresszorok), mind a gátló szignálokra (szteroid negatív feedback) [2, 4, 14, 17, 189, 192, 229, 234, 333]. A parvocellularis AVP mellett a magnocellularis eredető vazopresszin is hatással lehet az adenohypophysis ACTH-felszabadulására. Kimutatták, hogy a magnocellularis AVP-axonok módosult varikozitásaiból (Herring-testek) in passage AVP szabadulhat fel az eminentia mediana területén [8, 142, 255]. A portális vérben stresszmentes körülmények között is amikor nincs kimutatható AVP-expresszió a parvocellularis neuronokban számottevı mennyiségő AVP van jelen [279, 402]. A magnocellularis AVP jelentıségénél fontos figyelembe venni ugyanakkor, hogy azok a stresszorok, amelyek a PVN parvocellularis CRH és AVP rendszereit mozgósítják nem befolyásolják lényegileg a magnocellularis AVP-expressziót [189]. További különbség, hogy glükokortikoid receptorok (GR) jellemzıen a parvocellularis neuronokban vannak jelen, a magnocellularis neuronok GR-expressziója minimális [174, 184]. Az ADX-es állatoknál a hiányzó glükokortikoid feedback gátlás erıteljesen megnöveli a parvocellularis CRH- és AVP-expressziót, ugyanakkor nem változtatja meg a magnocellularis AVP-szintézist [127, 172] Corticotropin-releasing hormon Az emlısök többségében a corticotropin-releasing hormon (CRH) az elsıdleges ACTH-szekretagóg anyag. A CRH pontos kémiai leírása és szintetikus elıállítása Vale és mtsai nevéhez főzıdik, akiknek 1981-ben sikerült birka hypothalamusából izolálni és szekvenálni a peptidet [371]. A korábban használt CRF ( factor) alatt mindazokat az anyagokat értjük, amelyek képesek fokozni az ACTH felszabadulását. Ide tartozik a CRH, az AVP, az angiotenzin II, a CCK stb. A CRH 41 aminosavból álló egyláncú polipeptid, amely hasonlóan a neuropeptidek többségéhez egy hosszabb prekurzor molekulából, a 196 aminosav hosszúságú pre-pro-crh-ból enzimatikusan hasítódik ki. A 19

20 humán és patkány eredető CRH nagyfokú (83%-os) homológiát mutat a birka CRH aminosav szekvenciájával [365]. Ennél is nagyobb egyezés található a molekula N- terminális szakaszának 5-19 helyzető részén, amely a receptorhoz való kötıdésben és a biológiai hatás kiváltásában meghatározóan fontos. A CRH génjét 1990-ben klónozták elsıként egérbıl, majd birkából és emberbıl is [102]. A gén 5 promoter régióból, két exonból és egy közbeékelt intronikus részbıl áll. Az elsı exon nem íródik át, a teljes pre-pro-crh-t a második exon kódolja. Az 5 promoter szakasz számos ismert regulátoros szekvenciát tartalmaz, így TATA- és CAATelemeket, ún. camp-responsive element -et (CRE), CACCC-részeket, AP-1 kötıhelyet, glucocorticoid-responsive element -et (GRE) és ösztrogénre érzékeny kötıhelyet (ERE) és [366]. A CRH gén átíródását mind a camp - protein kináz A (PKA), mind az 1,2- diacilglicerol - protein kináz C (PKC) útvonal befolyásolni képes. A transzkripció szabályozásának genomiális elemei az elsı esetben feltehetıen a CRE, az utóbbinál az AP-1-es kötıhely. További regulációs lehetıség az intronikus szakaszon taláható 1-es típusú restriktív elem (RE-1). A központi idegrendszer legjelentısebb CRH-t termelı sejtcsoportját a PVN hypophyseotrop parvocellularis neuronjai adják [322]. A hypophyseotrop CRH-sejtek axonjai az eminantia mediana külsı rétegéhez futnak, ahol a peptid nm átmérıjő sötétmagvú neuroszekréciós vezikulákban tárolódik és stimulusra a periportális térbe ürül [214, 220]. A CRH nem csupán mint neuroendokrin szignál mőködik a szervezetben, hanem mint neurotranszmitter és neuromodulator részt vesz a szinaptikus ingerületátvitelben az idegrendszer számos területén. A hypothalamusban CRH-immunpozitív sejtek mutathatóak ki a supraopticus, a medialis és periventricularis preopticus, illetve a premammillaris magokban, valamint a lateralis hypothalamusban. Extrahypothalamikusan a kéregben, az amygdala centralis magjában (CeA), a BNST-ben, a raphe magokban, locus coeruleusban, a nucleus dorsalis nervi vagi és az oliva inferior területén, valamint a kisagyban találhatóak CRH-tartalmú sejttestek [356]. A peptidet a központi idegrendszeren kívől számos más szövetben azonosították, ahol hatását parakrin módon fejti ki. CRH mrns és peptid mutatható ki a mellékvese velıállományában, a lépben, az ováriumban, a here Leydig-sejtjeiben, a gastrointestinalis 20

21 rendszer számos helyén, továbbá a bırben, a tüdıben és májban [15]. Az utóbbi években további három neuropeptidet fedeztek fel, amelyek mintegy 45 %-os szekvenciaegyezést mutatnak a CRH-val: urocortin I [385], urocortin II [291] és urocortin III [206]. Az eddigi vizsgálatok két receptort azonosítottak, amelyek felelısek a CRH biológiai hatásaiért [50, 274]. Mindkét receptor G-proteinhez kapcsolódó 7 transzmembrán szakasszal rendelkezı fehérje, amelyeket két különálló gén kódol. A receptorok nagy hasonlóságot mutatnak a kalcitonin/vip/glükagon receptorcsaláddal. Mindkét CRH-receptor serkentı G-proteinhez kapcsolt membránfehérje, amely az adenilát-cikláz camp- PKA szignáltranszdukciós útvonalat használja a célsejtben. Az 1. típusú CRH-receptor (CRH-R1) 70 kda-os transzmembrán fehérje, amely nagy affinitással (Kd=1-2 nm) köti a CRH-t. Elısorban az adenohypophysis corticotrop sejtjein található meg, de az agy számos területén kimutatható, így a bulbus olfactorius, a hippocampus, a BNST, az amygdala basolateralis (BLA) és medialis (MeA) magjában, valamint a neocortex és a cerebellum sejtjein. CRH és glükokortikoidok hatására a receptor deszenzitizációja és a mennyiségének csökkenése következik be. A 2. típusú CRH-receptor (CRH-R2) kisebb affinitást mutat a CRH iránt (Kd=10-20 nm), mint a CRH-R1, ugyanakkor nagy affinitással köti az urocortinokat, illetve az alacsonyabb rendő gerincesekbıl származó CRH-szerő peptideket (sauvagine, urotensin). A 2. típusú CRH-receptornak több funkcionális variánsát leírták, ezek közül kiemelendı a CRH-R2α és a CRH-R2β. Míg a CRH-R2α az agy bizonyos területein, a CRH-R2β a periférián (szív, tüdı, bél) expresszálódik [222]. Szemben a centrális CRH-R1 anatómiai eloszlásával, a CRH-R2α kizárólagosan bizonyos limbikus struktúrákban van jelen. CRH-R2-t legnagyobb sőrőségben a lateralis septum, a BNST és az amygdala corticalis magjában mutattak ki [384]. A CRH-R1 felelıs elsısorban a stressz által okozott HPAaktivációért és a stressz extrahypothalamikus (pl. viselkedéses) hatásaiért. CRH-R1 hiányos egerek csökkent anxietást mutatnak különféle viselkedéstesztek során, valamint csökkent a stresszre adott HPA-válaszuk [369]. Hasonló eredményeket adtak a szelektív CRH-R1 antagonistákkal végzett kísérletek is [120]. A CRH-hatás szabályozásának extracellularis tényezıje az ún. CRH-kötı fehérje (CRH Binding Protein) [282]. Affinitása a CRH iránt egy nagyságrenddel nagyobb 21

22 (Kd=0,1-0,2 nm), mint az 1. típusú CRH-receptornak [335]. A CRH-kötı fehérje anatómai eloszlása megegyezik a két CRH-receptor lokalizációjával; átíródását a CRH fokozza, a glükokortikoidok pedig gátolják [20]. A kötıfehérje csökkenti a CRH elérhetıségét a receptora számára, ugyanakkor az agyi extracellularis CRH-kötı kapacitás növelése (pl. krónikus stressz során) egy lehetséges kiegyenlítı válasz, amely csökkenheti a CRH-receptorok deszenzitizációját [21]. Számos kísérletes és klinikai megfigyelés szól amellett, hogy a CRH-rendszer zavara hozzájárulhat néhány pszichiátriai kórkép (pl. depresszió, szorongásos betegségek) kialakulásához. Mind rágcsálóknál, mind fıemlısöknél az agykamrába juttatott CRH félelmi és depresszív magatartási reakciót váltott ki [181, 340]. A peptid megnöveli a kísérleti állatok lokomotoros aktivitását [242], csökkenti az alvásmennyiséget [198] és a táplálékfelvételt [22]. A CRH-t túltermelı génmódosított egértörzs viselkedési fenotípusa is megerısíti a peptid anxiogén hatását [348]. Nemeroff és mtsai depressziós betegek cerebrospinalis folyadékában megemelkedett CRH-szintet találtak [258], más vizsgálatok a CRH-pozitív sejtek számának növekedést figyelték meg a PVN-ben ugyanezen betegcsoport hypothalamusának post mortem szövettani vizsgálatakor [285] Vazopresszin A PVN parvocellularis neuronjaiból a portális keringésbe kerülı CRH hatását a vazopresszin jelentısen fokozni képes. Bár a vazopresszin önmagában gyenge ACTHszekretagóg, CRH jelenlétében annak ACTH-szekréciót fokozó hatását sokszorosan potencírozza [8, 226]. A vazopresszin (régebben anti-diuretikus hormon) nonapeptid, amelyet arginin-vazopresszinnek (AVP) is szoktak nevezni, megkülönböztetve ezzel a sertésfélék egy aminosavban különbözı lizin-vazopresszinétıl. Szerkezete nagyban hasonlít az oxitocin szerkezetére, mindössze két aminosavban térnek el egymástól. Az AVP génje 3 exonból áll, az elsı exon ( A ) kódolja a szignál peptidet, magát a vazopresszint és a vazopresszinnel együtt termelıdı neurophysin N-terminális részét. A B és C exonok a neurophysin molekula középsı, illetve C-terminális szekvenciáit tartalmazzák. A neurophysin molekula feltehetıen az AVP intracellularis transzportjában 22

23 vesz részt, az AVP lehasítását endopeptidáz aktivitású enzimek, ún. prohormon konvertázok végzik. Az AVP-gén defektusa okozza embernél a diabetes insipidus familiáris formáját, illetve a Brattleboro (di/di) patkánytörzs jellegzetes polyuriás, polydipsiás fenotípusát. A neurophysin molekula fontosságát jelzi, hogy a Brattleboro patkányoknál a neurophysin középsı szakaszát kódoló B exonon történt egyetlen bázis deléciója okozza a jellegzetes vazopresszinhiányos fenotípust [382]. AVP termelésére számos idegsejt képes a központi idegrendszerben. A hypothalamusban AVP-szintézis mutatható ki a nucleus suparopticusban és PVN magnocellularis és parvocellularis neuronjaiban, valamint a nucleus suprachiasmaticusban (SCN). Extrahypothalamikusan vazopresszinerg neuronok vannak a BNST és a CeA területén. A vazopresszinre számos szövet (vese, vascularis simaizom, idegsejtek) érzékeny, hatását a különféle sejttípusokon három receptorrendszeren keresztül fejti ki. A vazopresszin receptorai G-proteinhez kapcsolódó 7 transzmembrán régióval rendelkezı fehérjék. Az 1. típusú receptorok a foszfolipáz C (PLC) IP 3 /DAG szignáltranszdukciós útvonalon keresztül megemelik az intracellularis Ca 2+ -szintet a célsejtben. A receptor V1a altípusa a májban, az érfali simaizomzatban, a herében, a vér alakos elemein (pl. limfociták, monociták) és számos más perifériás szövetben expresszálódik. A V1b receptor szabályozza az adenohypophysisben az ACTH szekrécióját. A 2. típusú receptor (V2) az adenilát cikláz PKA útvonalon keresztül a vese medulla sejtjeiben fokozza az urea és a szabad víz visszavételét a tubuláris folyadékból, ezáltal csökkentve a vizelet mennyiségét. Az adenohypophysisben a vazopresszin fokozza a CRH ACTH-szekretagóg hatását mind in vitro [110], mind in vivo [298]. Az AVP a corticotrop sejtek V1b receptorán hatva aktiválja a PLC IP 3 /DAG útvonalat [41]. Az IP 3 szignált követı intracelluláris Ca 2+ -szint emelkedés az intracellularis ACTH-raktárak - CRH-tól független - kiürülését okozza [353, 363]. Az intracelluláris Ca 2+ -emelkedéssel párhuzamosan a DAG aktiválja a protein kináz C-t, ami potencírozza a CRH-R1 ACTHszekretáló hatását (CRH-tól függı útvonal) [41]. Megemlítendı, hogy szemben a CRHval, amely fokozza a corticotrop sejtekben az ACTH prekurzorának, a 23

24 proopiomelanokortinnak (POMC) az átíródását, az AVP nem növeli meg a POMC génexpresszióját, csupán az ACTH felszabadulását serkenti [8] Glükokortikoid feedback A HPA szabályozása szempontjából a mellékvesekéreg glükokortikoid hormonjai - embernél a kortizol, patkányál a kortikoszteron - jelentik a legfontosabb humorális gátló szignált. A glükokortikoidok fı hatásukat a célsejten két magreceptoron keresztül fejtik ki [11, 289]. Az I. típusú receptor (mineralokortikoid receptor, MR) nagy affinitással köt kortikoszteront és kortizolt (Kd=0,2-0,5 nm), valamint aldoszteront. Antagonistája az RU26752 és a spironolakton [290]. Az MR központi idegrendszeri expressziója jellegzetes mintázatot mutat: bizonyos limbikus struktúrákra jellemzı. Immuncitokémiával és in situ hibridizációval jelentıs MR-expressziót mutattak ki a lateralis septumban, a hippocampusban és az amygdalában [378]. Ez az eloszlás lényegesen eltér a II. típusú szteroidreceptor (glükokortikoid receptor, GR) lokalizációjától, amely a legtöbb vizsgált agyterületen és az adenohypophysisben egyaránt jelen van. Expresszálódik az agytörzsben, a hypothalamusban, a limbikus rendszerben és a neocortexben (lásd 1. ábra) [104, 254, 378]. A GR kevésbé köt kortikoszteront és kortizolt (Kd=3-5 nm), ugyanakkor a szintetikus dexamethasonhoz nagy affinitást mutat [289]. A mellékvesekéregbıl származó szteroidok celluláris hatásának kialakításában két további mechanizmus érdemel említést az idegrendszerben. A vér-agy gát 1-es típusú multidrog rezisztencia proteinje (mdr-1) nagy affinitással köti meg és zárja ki az idegszövetbıl a szintetikus szteroidokat (pl. dexamethasone-t) és a kortizolt [241, 370]. Ezáltal válik a kortikoszteron az agyszövet számára elsıdleges szteroiddá rágcsálóknál, és válik jelentıssé embernél [164]. A másik mechanizmussal az idegsejtek inaktív szteroidmetabolitokat képesek aktív szteroiddá (kortikoszteronná) alakítani a 11βhidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim 1-es típusának segítségével (11β-HSD-1) [336]. Az adrenális szteroidoktól függetlenül az idegszövetben de novo keletkezı szteroidok (neuroszteroidok) is befolyásolni képesek a neuronális aktivitást [19]. 24

25 Mind az MR, mind a GR a nukleáris receptor szupercsalád tagjai [9]. Ezek a receptorfehérjék ligand által aktivált transzkripciós faktorok, amelyek szerkezetileg három funkcionális doménbıl állnak. 1.) az N-terminális vég a transzaktivációs kötıhelyeket, 2.) a centrálisan elhelyezkedı a DNS-kötı domént tartalmazza, 3.) a molekula C-terminális vége felelıs a ligand (szteroid) és hısokk proteinek (pl. hsp70, hsp90) megkötéséért [283]. A szteroidreceptorok hısokk proteinekkel (hsp70, hsp90, immunophilin, p23) alkotnak komplexet a citoplazmában. A szteroidkötés hatására a dajkafehérjék disszociálnak, lehetıvé téve, hogy a hormon-receptor komplex dimert alkosson egy másik hormonkötött szteroidreceptorral, vagy a GR esetében egy transzkripciós faktorral (AP-1, NFkB), majd a sejtmagba vándoroljon [9]. A magban a komplex a DNS kitüntetett helyeihez (GRE) vagy a partner transzkripciós faktor által meghatározott promoterszakaszokhoz kötıdik, és a célgének expresszióját pozitívan vagy negatívan szabályozza. Ezt a típusú hatást nevezik a glükokortikoid hormonok lassú, más néven genomiális hatásának. A glükokortikoidok (vagy metabolitjaik) képesek a neuronális aktivitás gyors megváltoztatására is. Ez a jelenség nem függ a génexpresszió változásától, és annál sokkal gyorsabban kialakul. Valószínőleg a sejthártyán való áthaladásukkor lépnek kölcsönhatásba a membrán fehérjemolekuláival (pl. 5-HT 3, GABA A, NMDA-receptor) és változtatják meg az excitabilitást. Létezik tehát egy gyors, nem-genomiális szteroidhatás is [233, 304, 352]. A glükokortikoid magas koncentrációban gátolják, alacsony szintjük pedig aktiválja a HPA-tengelyt. Ez a negatív visszacsatolás (feedback) a HPA legfontosabb autoregulációs tényezıje [67, 166]. A folyamatban a két receptortípus valószínőleg a HPA-szabályozásának két különbözı aspektusát valósítja meg [74]. Ismert, hogy a glükokortikoidok plazmakoncentrációja jelentıs diurnális ingadozást mutat: az aktív periódus patkánynál a fényciklus sötét, embernél a világos szakaszának kezdetekor a legmagasabb, a végén a legalacsonyabb. Maximális hormonszintek embernél kora reggel, közvetlenül ébredés elıtt mérhetık, patkánynál ugyanez a késı délutáni órákban tapasztalható. [67]. Az alapszintő diurnális plazmaszinteknél a GR csak kismértékben köt kortikoszteront, miközben a nagy affinitású MR már szinte teljes mértékben (70-95%) telített [289]. A GR-ek nagy részét telítı kortikoszteron szintek csak a diurnális 25

26 maximumon és stressz során észlelhetıek [32, 286, 312]. Patkányoknak reggel alacsony keringı kortikoszteron-szinteknél icv beadott MR-antagonista RU28318 után átmeneti kortikoszteron- és ACTH-emelkedést tapasztaltak [286]. Hasonló körülmények között a GR-antagonista mifepriston (RU38486) nem aktiválta a HPA-tengelyt [286], azonban fokozta az ACTH és kortikoszteron plazmakoncentrációjának esti megemelkedését [380]. A cirkadián csúcs idején tapasztalható HPA-aktivitás visszafogásához a GR szteroidkötése alapvetıen szükséges [32]. Hasonló módon, az adenohypophysis GRrendszere is csak a kortikoszteron magas plazmaszintjeinél vesz részt a negatív feedbackben [205]. Azok a patkánytörzsek, amelyeknél magas az MR hippocampalis expressziója és alacsony az adenohypophysisben a GR kifejezıdése (pl. Lewis törzs) csökkent bazális és stressz-indukálta HPA-értékekkel rendelkeznek [263]. Az öregedéssel együttjáró alacsony MR- (és GR-) expressziót magas bazális és elhúzódó stresszindukálta ACTH-felszabadulás kíséri [252, 302, 379]. Valószínőnek tőnik, hogy az MR a HPA alaptónusát állítja be, míg a GR-rendszer a cirkadián csúcsértékeknél és stressz során gátolja a tengelyt, illetve hozzájárul a stresszválasz perifériás részéhez (pl. az energiaraktárak mobilizálásához) [32, 312]. Részben ezzel magyarázható az is, hogy a stresszérzékenység, vagyis a stresszre adott kortikoszteron-válasz mértéke a hormonális minimum idején a legnagyobb. A glükokortikoid feedback hypothalamikus és extrahypothalamikus összetevıket egyaránt tartalmaz. GR kimutatható a PVN parvocellularis területén [104], azon belül is a neuroszekréciós CRH-sejtekben [44, 53]. Szteroidmegvonás (ADX) után magasabb a bazális ACTH-szint, és kifejezettebbek a cirkadián és stressz-indukálta ACTH-változások [67]. A szteroidhiány jelentısen stimulálja az adenohypophysis corticotrop sejtjeinek POMC expresszióját és az ACTH szekrécióját [155]. Az ADX hatására a parvocellularis neuronokban fokozódik a CRH-termelés és az AVPkoexpresszió, ami a glükokortikoidok pótlásával csökkenthetı [324, 410]. A hypothalamikus szteroid feedback létezését mutatják azok a szteroidimplantációs vizsgálatok is, amelyekben a PVN közvetlen közelébe juttatott dexamethasone képes volt visszaszorítani az ADX által kiváltott parvocellularis CRH- és AVP-immunreaktivitás emelkedését, valamint a fokozott ACTH-szekréciót [184, 325]. Ugyanez a kísérletsorozat igazolta, hogy a szintetikus szteroid hasonló hatású, ha 26

27 nem a PVN-be, hanem a dorsalis hippocampusba implantálják [184]. Egy másik vizsgálatban az MR-antagonista RU3848 intrahippocampalis injekciója után megemelkedett ACTH és kortikoszteron értékeket mértek [381]. A hippocampus sérülése, vagy fı hypothalamikus efferensének, a fornixnak az átvágása a plazma kortikoszteron, ACTH és β-endorfin szintjének megemelkedését okozza [125, 153, 313]. A hippocampusnak tehát kitüntetett jelentısége van a glükokortikoid negatív visszacsatolásban mind a cirkadián minimum idején (MR), mind a napszaki csúcsértékeknél és stresszben (MR + GR) [153]. Hasonló indirekt feedback szerepe lehet a medialis prefrontalis cortexnek is pl. stressz során [84]. Olyan transzgenikus modellben, ahol specifikusan elıagyi GR-hiányt hoztak létre feedback rezisztencia (magas és nem szuppresszálható kortikoszteronszint) tapasztalható [30]. Ezeknél az egereknél a PVNben változatlan CRH mrns és GR-ir szint mellett az AVP mrns mennyisége 65%-kal emelkedett meg a magban. Ez utóbbi eredmények alapján az elıagyi (hippocampalis, prefrontalis) feedback kevésbbé a CRH-t, mint inkább a parvocellularis AVP-t célozza. A HPA glükokortikoid szabályozásának molekuláris részletei részben feltártak. A humán CRH-gén promotere tartalmaz egy összetett negatív GRE-et, amelyen képes a GR kötıdni és a CRH-gén átíródását csökkenteni [236]. Az AVP promoter régiójában szintén megtalálható egy GRE-szekvencia, de valószínőbbnek tőnik, hogy a GR más negatív transzkripciós molekulákon keresztül transz-represszálja az AVP expresszióját [152]. A POMC-gén promotere a CRH stimuláló hatását közvetítı AP-1 és CREB kötıhelyeken túl [28], rendelkezik negatív GRE-vel is [86]. Ez utóbbi közvetlen szerepét a POMC-expresszió szabályozásában a dim/dim génmódosított egerek fenotípusa is megerısíti [288]. Ebben a modellben a glükokortikoid receptorok egy pontmutáció miatt nem képesek a DNS-hez kötıdni, ugyanakkor megmaradnak a fehérje-fehérje interakcióik más transzkripciós faktorokkal. A GR-GRE kapcsolat hiánya jelentısen megemelte az adenohypophysis corticotrop sejtjeiben a POMC mrns és ACTH peptid tartalmat. A hatásosan mőködı glükokortikoid gátlás fontosságát azok a patológiás állapotok mutatják meg, amelyekben nem megfelelıen mőködı negatív feedback és kóros HPA-aktivitás figyelhetı meg. A major depressziós betegek mintegy %-ánál kortizol hiperszekréció figyelhetı meg, amelyet a kívőlrıl beadott dexamethasone sem 27

28 képes szuppresszálni [114, 143]. Hasonló HPA-szabályozási zavart írtak le bizonyos neurodegeneratív kórképeknél (pl. Alzheimer betegség) és a fiziológiás öregedés során is [75, 99, 115] A paraventricularis mag afferensei és neuronális szabályozása A parvocellularis PVN afferens pályrendszerei rendkívől sokrétőek, ezek áttekintése és a stressz szempontjából történı csoportosítása nagyban hozzásegíthet a mag stresszel kapcsolatos mőködésének megértéséhez. A PVN serkentı és gátló bemeneteket kap az agytörzsbıl, a középagyból, lokális hypothalamikus területekrıl és magasabbrendő (kérgi) területek felıl. Az afferens hatások értelmezésében fontos az ún. peri-pvn modell [130, 133, 134]. A PVN-t körülölelı sejtszegény zóna olyan elsısorban GABAerg interneuronokat tartalmaz, amelyek a mag parvocellularis neuronjaira vetülnek [26, 301]. A különbözı agyterületekrıl érkezı axonok vagy közvetlenül innerválják a PVN neuroendokrin sejtjeit, vagy indirekt módon, a perinuclearis interneuron-hálózaton átkapcsolva érik el a parvocellularis neuronokat Visceroszenzoros bemenetek Elsısorban a fizikális, de kisebb mértékben a pszichogén stresszorokra is jellemzı az agytörzsi katekolaminerg rendszer részvétele a stresszválaszban [72]. Az agytörzs A1, A2 és A6 noradrenerg neuronjai közvetlenül innerválják a PVN neuroendokrin sejtjeit [216, 217, 315, 316]. Az A1-bıl felszálló pálya elsısorban a magnocellularis neuronokat, az A2 és A6 a parvocellularis neuronokat látja el noradrenerg rostokkal [62]. Megemlítendı, hogy ez a topográfiai elkülönülés nem teljes, valamint az agytörzs katekolaminerg sejtcsoportjaira igen jellemzı a nagyfokú anatómiai és funkcionális kapcsoltság [316]. Az agytörzsbıl felszálló tirozin hidroxiláz (TH) és dopamin β-hidroxiláz (DBH) tartalmú axonvégzıdések aszimetrikus szinapszisokat alkotnak a parvocellularis CRH-sejteken [216], hasonlóan a C1, C2 és C3 területekrıl felszálló adrenerg rostokhoz [217, 326]. A CRH-neuronokon α1 és β adrenerg receptorokat mutattak ki [69], ami a katekolaminerg rendszer közvetlen részvételére utal a HPA hypothalamikus szabályozásában. Az agykamrába, illetve a PVN-be adott noradrenalin megemeli a portális CRH- [280], a szisztémás ACTH- [359] és kortikoszteron szintet [204]. Akut stressz során gyors c-fos indukció zajlik a medullaris katekolaminerg neuronokban [48, 58]; az innen felszálló 28

29 pálya átvágása pedig lecsökkentette a PVN hypophyseotrop sejtjeinek fizikális stresszorra (IL-1) adott c-fos válaszát [209]. A PVN szerotoninerg (5-HT) beidegzését a középagyi raphe rendszer B7, B8 és B9 sejtcsoportjai adják [276, 277, 319]. Szemben a noradrenerg/adrenerg innervációval, jóval kevesebb szerotonintartalmú rostot lehet kimutatni a magon belül, a rostok jelentıs részben a mag körüli területen koncentrálódnak [200]. A PVN-en belül a szerotoninerg rostok axodendritikus és axoszomatikus aszimetrikus szinapszisokat képeznek CRHsejtek felszínén [218]. A szerotonin HPA-szabályozásban betöltött szerepe közel sem egyértelmő [130, 223]. Az irodalomban találunk adatokat az 5-HT 1A receptoron keresztül megvalósuló CRH mrns szintet, plazma ACTH-t és kortikoszteront emelı [96, 156, 177, 268], dózistól függıen facilitáló vagy gátló [183], illetve dominálóan gátló hatásról is [400]. 3. ábra. A PVN afferens kapcsolatai. A sémás rajz a patkányagy saggitalis metszetén ábrázolja a PVN fontosabb afferens pályarendszereit. A zöld szín a HPA-szabályozásában szerepet játszó limbikus területeket jelöli. Az innen induló projekciókra jellemzı, hogy nem közvetlenül érik el a PVN hypophyseotrop neuronjait; a pálya átkapcsol a lateralis septum, a nucleus interstitialis striae terminalis, az area preoptica vagy a hypothalamus területén (sárga szín). Rövidítések: AMY: amygdala, BNST: nucleus interstitialis striae terminalis/bed nucleus of the striae terminalis, C1: agytörzsi C1 adrenerg sejtcsoport, HT: intrahypothalamikus sejtcsoportok, NTS: nucleus tractus solitarii, LDT: lateralis dorsalis tegmentum, LS: septum laterale, OVLT: organum vasculosum laminae terminalis, PB: nucleus parabrachialis, PFC: prefrontalis cortex, POA: area preoptica, PPN: pedunculopontin nucleus, PVN: nucleus paraventricularis hypothalami, SFO: organum subfornicale. Kevés anatómiai bizonyíték van a PVN kolinerg innervációjáról és a HPA kolinerg szabályozásáról. Az irodalom valószínősíti, hogy lateralis dorsalis tegmentum 29

30 (LTD) és a pedunculopontin nucleus (PPN) a hypothalamikus acetilkolin fı forrása [277, 318], amelyhez a lateralis septumból eredı kolinerg rostok is hozzájárulhatnak [266]. A kolinerg axonok hasonlóan az 5-HT-tartalmú rostokhoz a peri-pvn területen koncentrálódnak [303], bár a PVN-ben is kimutatták az acetilkolin muscarinos [390] és nikotinos receptorát [395]. Az acetilkolin stimulálja a CRH génexpresszióját in vivo [262] és in vitro [139], valamint részt vesz a testhımérséklet és folyadékháztartás autonóm szabályozásában [360]. A neuronális hisztamin stresszválaszban és a HPA-szabályozásában betöltött szerepérıl ugyancsak kevés az irodalmi beszámoló. Ismert, hogy a H1 és H2 receptor agonisták c-fos-t indukálnak a CRH-sejtekben [178], valamint megnövelik a CRH, az ACTH és a kortikoszteron szekrécióját [176, 179]. A farmakológiai vizsgálatok neuroanatómiai értelmezését megnehezíti az a tény, hogy a célsejtet elérı hisztamin nem kizárólag a hátsó hypothalamus hisztaminerg tuberomamillaris (TMN) sejtcsoportjaiból származhat [269, 398], hanem egyéb nem-neuronális forrásból (pl. hízósejtekbıl, bazofil granulocitákból) is. A TMN része a stressz centrális pályarendszerének [337], és új adat, hogy a hisztaminerg magcsoportok stresszorspecifikus c-fos indukciót mutatnak [248]. Bár a hypothalamus számos magjában leírnak hisztaminerg rostokat [270], és a PVN is gazdag hisztamin-pozitív axonokban, a CRH-sejtek felszínén mindeddig nem sikerült hisztaminerg terminálisokat kimutatni [249]. Valószínőnek tőnik, hogy a hisztamin elsısorban nem-szinaptikus módon befolyásolja a hypophyseotrop CRH-rendszert. Az agytörzsbıl, közép- és köztiagyból felszálló pályákon túl létezik egy leszálló visceroszenzoros pályarendszer is. A subfornicalis szerv (SFO), az organum vasculosum laminae terminalis (OVLT) és a perifornicalis mag angiotenzin II tartalmú rostokkal látják el a PVN magnocellularis és parvocellularis rendszerét [251]. Az AT1 receptor magas szinten expresszálódik a parvocellularis neuronokban, azon belül is a CRH-pozitív sejtekben [3]. Valószínőnek tőnik, hogy az AII serkentı hatása a CRH-expresszióra közvetlenül a CRH-neuronokon jön létre, bár vannak bizonyítékok más transzmitter rendszereken keresztül történı indirekt hatásra is [202]. A peptiderg circumventricularis- PVN pálya az ozmotikus és kardiovaszkuláris homeosztázis fenntartásában alapvetı. 30

31 Limbikus bemenetek Az eddig tárgyalt agyterületeken túl a HPA szabályozása szempontjából a PVN limbikus kapcsolatai kiemelkedıen fontosak [40, 57, 130, 149, 153, 284, 294, 312]. Számos vizsgálat igazolta, hogy a hippocampus és a prefrontalis cortex részt vesz a glükokortikoidok negatív visszacsatolásában (összefogalók: [76, 124, 130, 312]). A hippocampus hypothalamikus kimenetének, a ventralis subiculumnak vagy a fimbriafornix pályának a léziója szelektíven meggátolta a PVN és a HPA-tengely pszichés stresszorok okozta aktivációját [84, 125, 129, 153]. A központi idegrendszerben a hippocampus mutatja a legerısebb glükokortikoid-kötıdést [238]. Mindkét glükokortikoid-receptort kimutatták a hippocampális régiókban; az MR expressziója a CA3 területén, a GR a CA1 területén a legmagasabb [289]. Mind a nagy, mind a kis affinitású receptor jelenléte alapján valószínőnek tőnik, hogy a hippocampus nem csak a stresszt kísérı magas kortikoszteron plazmaszintek mellett vesz részt a feedbackben, hanem a HPA-tengely alapszintő behangolásához is hozzájárul [124, 130]. A prefrontalis kéregrıl kevesebb az irodalmi beszámoló. A medialis prefrontalis cortex (gyrus cinguli) területén kimutatták a GR jelenlétét és valószínősítik, hogy az extrahypothalamikus glükokortikoid feedback egyik helye [84, 104]. Prefrontalis szteroidimplantáció után csökken a HPA-tengely aktivitása, és a terület léziója fokozta a bezártságstresszt követı ACTH- és kortikoszteron-emelkedést [84]. Egy másik vizsgálatban a prefrontális terület kiirtása után nıstény patkányoknál megemelkedett plazma katekolaminszintet és fokozott c-fos-indukciót tapasztaltak a PVN-ben [108]. A hippocampus és a prefrontális kéreg gátló hatásával szemben az amygdaláris lézió csökkentette a stressz-indukálta HPA-aktivációt [6, 7]. Az amygdala magjai a HPA-szabályozás szempontjából sem tekinthetıek homogénnek: a medialis és corticalis mag elektromos stimulációja emelte, a centralis nucleus pedig csökkentette a kortikoszteron plazmaszintjét [87]. Az elıbbi két mag kiirtása képes volt megakadályozni a stressz okozta ACTH- és kortikoszteron-emelkedést bizonyos stresszorok esetén [97], a CeA léziója ugyanakkor csökkentette a pszichés stresszorokra adott neuroendokrin választ [372]. 31

32 A limbikus-hpa kapcsolat stimulus specificitást mutat. A ventralis subiculum és az infralimbikus kéreg azoknál a stresszoroknál gátolja a HPA-aktivációt, amelyeknél a stimulus több szenzoros rendszeren keresztül érkezik (multimodális), továbbá nem jelent azonnali fenyegetést a homeosztatikus paraméterekre. E területek léziója után szelektíven a pszichogén stresszorok esetében (bezártság-, újdonságstressz) tapasztaltak fokozott HPA-választ, kiirtásuk azonban nem változtatja meg a HPA-érzékenységét hipoxiára vagy éter inhalációjára [31, 100, 131]. c-fos aktivációs térképezéssel és az amgydalamagok szelektív léziójával igazolták, hogy a MeA elsısorban a pszichogén stresszorokra (bezártság), a CeA pedig a szisztémás stresszorokra (IL-1, vérvesztés) adott viselkedéses és autonóm válasz kialakításában vesz részt [70, 71, 368, 411]. Általánosságban elmondható, hogy a limbikus területek nem közvetlenül érik el a PVN hypophyseotrop sejtcsoportját: nincs kimutatható monoszinaptikus kapcsolat limbikus elıagyi és parvocellularis PVN neuron között [130, 329]. A direkt szinaptikus kapcsolat hiánya legalább egy interneuron jelenlétét feltételezi a limbikus-hpa hálózatban, amit a neuroanatómiai megfigyelések is alátámasztanak. A ventralis subiculumból eredı axonok a peri-pvn régióban végzıdnek, magát a PVN-t elkerülik [39, 57]. Anterográd pályajelöléssel subicularis rostokat írtak le olyan intrahypothalamikus struktúrákban is, amelyekrıl korábban kimutatták, hogy a PVN-be vetítenek. Ilyen a DMN, a MePOA és a BNST anterior medialis, posterior és ventrolateralis almagja [134]. Hasonló a PVN-t elkerülı terminációs mintázatot mutatnak a medialis amygdalából eredı rostok azzal a különséggel, hogy ebben az esetben a PVN körüli zóna rostsőrőségét meghaladja az egyéb hypothalamikus (AHA, anterior preopticus mag) és BNST (ventrolateralis, ventromedialis) területek amygdaláris innervációja [40]. Anterográd és retrográd pályajelölés kombinációjával igazolták, hogy a ventralis subiculum és a medialis amygdala projekciós neuronjai olyan hypothalamikus interneuronokon végzıdnek, amelyek egyidejőleg a PVN-be vetítenek [57, 85, 284]. A limbikus-pvn kapcsolat tehát jellemzı módon indirekt: a limbikus projekciós neuron és a neuroendokrin célsejtje között általában találunk egy átkapcsoló neuront a BNST-ben, a preoptikus területen vagy intrahypothalamikusan. Ezeknek a relé-sejteknek [130] a hálózata győjti össze a limbikus elıagyi struktúrák bemeneteit a PVN-felé, így a 32

33 parvocellularis neuronhoz egy többszörösen a limbikus és helyi hálózatokon feldolgozott aktivitásmintázat jut el. Az irodalom következetesen hangsúlyozza az intrahypothalamikus interneuron-hálózat fontosságát a limbikus hatások közvetítésében (pl. a HPA tónusos gátlásában) [130, 135, 136, 329, 330], azonban keveset tudunk arról, hogy ez a lokális neuronpopuláció önmagában a limbikus bemenetek nélkül hogyan befolyásolja a PVN neuroszekréciós mőködését. GAD65/67 VGLUT1 VGLUT2 SUB [162, 396] PFC [162] MeA [358] CeA [358] BLA [358] LS [295] /- 1. táblázat. A limbikus - hypothalamikus pályák neurokémiai fenotípusa. A táblázat a HPAszabályozás szempontjából fontos limbikus területek eredısejtjeinek GABAerg és glutamáterg jellegét mutatja. Jelölés: -: a marker nincs jelen a régióban, a + jelek száma arányos a marker expressziójával. Rövidítések: BLA: basolateralis amygdala, CeA: centralis amygdala, GAD: glutaminsav dekarboxiláz, LS: lateralis septum, MeA: medialis amygdala; PFC: prefrontalis cortex; SUB: ventralis subiculum; VGLUT: vezikuláris glutamát transzporter (átvéve és átalakítva: [135]). Bár a limbikus területek többsége hypothalamuson belüli interneuronokon végzıdik, a BNST és a substantia innominata közvetlenül is innervál parvocellularis neuronokat. A BNST almagjai közül a fusiformis, anterodorsalis és interfascicularis subnucleus ad különösen sőrő rostozatot a parvocellularis PVN-felé. Kettıs jelöléses vizsgálatok szerint ebben a struktúrában a PVN-projekciós neuronok többsége GABAerg [57]. A BNST PVN-be vetítı sejtcsoportjainak léziójával, illetve stimulációjával igazolták, hogy a BNST-bıl eredı pálya gátló hatású a PVN CRH mrns expressziójára és a kortikoszteron felszabadulására [57]. Megemlítendı, hogy más BNST-almagok hatása (pl. az anterior és lateralis régióban) ellenkezı elıjelő a HPA-mőködésre [88, 116, 126]. A PVN másik direkt limbikus bemenete, a substantia innominata szerepe közel sem 33

34 világos. E régió rostokat kap az amygdalából, a BNST-bıl, a nucleus accumbensbıl és a ventralis striatum más területeirıl [118]; lehetséges, hogy az agyi jutalmazó rendszereket kapcsolja össze a neuroendokrin rendszerrel [136]. Régió Transzmitter Limbikus afferens SPVZ GABA SUB, PFC, MeA, LS BNST if,tr,am GABA MeA, SUB, PFC BNST fu GABA, CRH CeA POA GABA, Glu MeA, SUB LHA GABA, Glu PFC, SUB, MeA, LS DMN GABA, Glu CeA, SUB NTS Glu PFC, CeA 2. táblázat. A PVN limbikus bemeneteinek átkapcsoló területei. A táblazat azokat az intra- és extrahypothalamikus területeket foglalja össze, amelyek limbikus bemeneteket közvetíthetnek a PVN felé. A lokális relé -sejtek közül kiemelendı a PVN-nel közvetlenül szomszédos terület, az ún. subparaventricularis zóna GABAerg sejtcsoportja. amelyet az elıagyi limbikus projekciók jelentıs része elér. A subparaventricularis zóna interneuron-hálózatára egyaránt érkeznek glutamáterg (SUB, PFC) és GABAerg (MeA, LS) bemenetek. Rövidítések: BLA: basolateralis amygdala; BNST: bed nucleus of the stria terminalis / nucleus interstitialis striae terminalis anteromedialis (am), fusiformis (fu) intrafascicularis (if), transversalis (tr) almagja; CeA: centralis amygdala; CRH: corticotropin-releasing hormon; DMN: dorsomedialis nucleus; GABA: gamma-amino-vajsav; Glu: glutamát; LHA: lateralis hypothalamikus area, LS: lateralis septum, MeA: medialis amygdala; PFC: prefrontalis cortex; SUB: ventralis subiculum, SPVZ: subparaventricularis zóna (átvéve és átalakítva: [135]). A limbikus - PVN hálózatban jelen van még egy hosszabb, az elı- és köztiagyat elhagyó pályarendszer is. Az infralimbikus kéregbıl és az amygdala centralis magjából hosszú leszálló projekció indul az agytörzsbe [334, 377]. E két elıagyi struktúra ezáltal az NTS neuronjain végzıdve, az agytörzs felszálló katekolaminerg pályáin keresztül is befolyásolhatja a HPA aktivitását [411]. Az agytörzsi A1/A2 noradrenerg sejtcsoport léziója képes volt lecsökkenteni a bezártságstressz által a PVN-ben okozott c-fos aktivációt [71]. Az NTS katekolaminerg neuronjai mellett az agytörzsi peptiderg rendszer is része a pszichés stressz központi idegrendszeri pályarendszerének [201]. 34

35 Intrahypothalamikus kapcsolatrendszer A parvocellularis PVN kiterjedt intrahypothalamikus kapcsolatrendszerrel bír, gazdag innervációt kap számos hypothalamusmag felıl. Kiemelendı a nucleus preopticus anteroventralis, az area preoptica medialis (POA), a nucleus dorsomedialis (DMN), a nucleus arcuatus (ARC), a nucleus premammillaris ventralis és a hypothalamus lateralis területe (LHA) [317]. Ezek a struktúrák a reprodukció, az energiaháztartás, a folyadék- és elektrolitegyensúly, és a hıszabályozás hypothalamikus elemei [309]. Léziós és stimulációs kísérletekbıl tudjuk, hogy az intrahypothalamikus PVN-projekciók többsége gátló módon hat a HPA-tengely mőködésére. Az élettani vizsgálatok eredményeit a neuroanatómiai adatok is alátámasztják: a PVN-be vetítı intrahypothalamikus neuronok jelentıs része GABAerg (lásd késıbb pont) [57, 265]. A hypothalamikus bemenetek közül is különösen gazdagon innerválja a parvocellularis neuronokat két PVN-közeli struktúra: a subparaventricularis zóna és a perifornicalis régió [301]. A lateralis hypothalamus alvás-ébrenléti és táplálékfelvételi folyamatok összehangolásában fontos neuropeptidjei, az orexinek (orexin-a és B) ugyancsak hatnak a HPA-tengelyre. Depolarizálják a PVN parvocellularis neuronjait [341], fokozzák a CRH és az AVP expresszióját [5] és dózisfüggıen aktiválják a HPA-tengelyt [195, 308]. Az orexin-a centrális beadása után nagymértékő c-fos mrns indukciót figyeltek meg a PVN CRH-sejtjeiben, illetve a megfigyelések szerint a különféle stresszorok (immobilizáció, hidegstressz) képesek aktiválni az orexinerg neuronokat [307]. Funkcionálisan más rendszerhez, a táplálékfelvétel és anyagcsere szabályozásához köthetı a neuropeptid Y (NPY) innerváció. Ultrastruktúrálisan a CRH-neuronokon NPY-immunreaktív terminálisok mutathatók ki [219]. Az NPY-tartalmú rostok forrása kettıs: részben a nucleus arcuatusból, részben az agytörzs A1, C1, C2 katekolaminerg sejtcsoportjából erednek [245, 323]. Az ARC eredető axonokban az NPY mellett agoutirelated peptide (AGRP) is kimutatható, ez a dipeptiderg pálya fokozza a táplálékfelvételt és serkenti a HPA-tengelyt [121]. Az arcuatus magból eredı, de az NPY/AGRP rendszerrel ellentétes (anorexigén) hatású α-msh/cart tartalmú rostok jelenlétét a PVN-ben és szinaptikus kapcsolatát a CRH-sejtekkel ugyancsak bizonyították [219]. A CRH-rendszer peptiderg szabályozásánál megemlítendı a PVN-en belüli axonkollaterálisok révén kialakuló CRH-CRH kontaktusok. Kiss és mtsai kimutatták, 35

36 hogy a magnocellularis PVN szinaptikus kapcsolatainak több, mint 40%-a a magon belül ered (intranuclearis) [171]. Feltehetı, hogy ez az arány a parvocellularis neuronok esetében is hasonlóan jelentıs lehet. Ultrastruktúrális adatok vannak intrinsic axodendritikus és axoszomatikus CRH-CRH kapcsolatokra [215], ami az ultrarövid feedback morfológiai alapját jelenti. Az idegrendszeri gyors szinaptikus események neurokémiai alapját az aminosav transzmitterek (glutamát, aszpartát, gamma-amino-vajsav, glicin) képezik. Számos morfológiai és funkcionális bizonyíték szól a glutamáterg rendszer részvétele mellett a PVN és HPA-szabályozásában [34, ]. Az ACTH és kortikoszteron szekréciója egyaránt fokozható az agykamrába, illetve a PVN-be jutattott glutamáttal [68, 154, 232]; lokálisan a PVN-be adott ionotrop glutamát receptor antagonista meggátolta a HPA stressz által kiváltott aktivációját [413]. Celluláris elektrofiziológiai vizsgálatokkal a parvocellularis neuronról serkentı posztszinaptikus áramokat (EPSC) lehetett elvezetni, amelyeket az ionotrop glutamát receptor antagonisták gátoltak [27]. Ezzel összhangban vannak azok az anatómiai megfigyelések, amelyek ionotrop (NMDA, AMPA, kainát) és metabotrop glutamátreceptor-alegységeket mutattak ki a parvocellularis neuronokon [170, 261, 376]. A CRH-sejtek több, mint 70%-ában kimutatható az NMDA alegységei közül az NR1, NR2A és B mrns-e, ennél kisebb mértékben (20-40%) az AMPA GluR2, GluR4 és GluR5 alegysége, illetve a KA2 mrns [13, 132, 415]. A glutamáterg neuronok azonosítására használt vezikuláris glutamát transzporterek közül a hypothalamusban elsısorban a VGLUT2, kisebb mértékben a VGLUT1 expressziója figyelhetı meg [213, 414]. VGLUT2-immunpozitív rostokat mutattak ki a PVN parvocellularis területén, valamint floureszcens konfokális mikroszkópiával VGLUT2-pozitív appozíciókat azonosítottak a CRH-sejtek felszínén [415]. Ultrastruktúrálisan ezek axoszomatikus és axodentritikus szinaptikus kontaktusoknak bizonyultak [408]. Egy másik vizsgálat szerint a CRH-sejtek maguk is részben glutamáterg fenotípusúak: több, mint 90%-uk expresszál VGLUT2 mrns-t [145]. A PVN-t innerváló glutamáterg sejtcsoportokat az irodalom azokon a VGLUT2-pozitív területeken helyezi el, amelyekrıl ismert, hogy a PVN-be vetítenek (DMN, POA, LHA) [414]. A pontos neuroanatómiai lokalizálást Csáki és mtsai végezték el, akik a PVN-be mikroinjektált 3 H-D-aszpartát retrográd transzportját vizsgálták [64]. Eredményeik szerint a PVN glutamáterg bemenetét elsısorban 36

37 intrahypothalamikus területek adják (SCN, LHA, AHA, DMN, VMN, ARC), de a mag bemenet kap a POA, a BNST távoli glutamáterg neuronjaiból is [64, 65] GABAerg szabályozás A hypothalamust különösen gazdag GABAerg innerváció jellemzi: az ultrastruktúrális vizsgálatok szerint a szinapszisok közel 50%-a GABAerg [79, 80]. Kettıs immuncitokémiával a CRH-sejteken GABA-immunreaktív szimmetrikus szinapszisokat mutattak ki [247]. A GABAerg sejtkapcsolatok három receptortípust használnak az idegrendszerben: az ionotrop GABA A - és GABA C -receptort, valamint a metabotrop GABA B -receptort [24, 240]. A GABA A -receptorkomplex számos alegysége kifejezıdik a PVN-ben [89, 98, 103, 275, 278, 407], ezen belül is a CRH-pozitív neuronokon az α2, β1,3, χ2 alegység bizonyítottan jelen van [60]. A GABAerg neurotranszmisszió jelenlétét a morfológiai eredményeken túl a celluláris elektrofiziológiai adatok is alátámasztják: akut szeletpreparátumon a parvocellularis neuronokból spontán és kiváltott GABA A - közvetítette posztszinaptikus áramokat lehet elvezetni [26, 362, 386, 388]. Mind in vitro, mind in vivo a GABAerg jelátvitel befolyásolása erıteljes HPAválaszhoz vezet. Az agykamrába adott GABA csökkentette a portális vér CRHkoncentrációját [281] és a plazma ACTH szintjét [231]. E hatást kivédte a GABA A - antagonistával történı elıkezelés, ami szintén a GABA A -receptorok részvételére utal a HPA centrális szabályozásában. A PVN-be mikroinjektált GABA A -receptor agonista muscimol csökkentette a stressz által okozott ACTH-emelkedést [350]. Az agonistához hasonlóan, a perifériás benzodiazepinkezelés csökkentette a stressz-indukálta sejtaktivációt és a CRH expresszióját a PVN-ben [150, 151]. GABA A -receptor antagonista bicuculline centrális vagy intra-pvn beadása után az ACTH és a kortikoszteron megemelkedését figyelték meg [55, 231]. Ez utóbbi eredmények alapján vált széles körben elfogadottá, hogy a HPA-tengely alapszintő mőködése tónusos GABAerg gátlás alatt van [129, 130]. A GABAerg neuronokra általánosságban jellemzı, hogy célsejtük az adott régión belül van, és viszonylag ritkán alkotnak hosszú pályarendszereket. Bár a cerebellum, a striatum és a bazális elıagy GABAerg sejtjei távolra is vetítenek (projekciós neuronok), a 37

38 legtöbb agyterületen a GABAerg gátlósejtek célelemei a lokális neuronhálózatra korlátozódnak (interneuronok) [101]. Ez a megállapítás igaz a PVN GABAerg innervációjára is. Retrográd pályajelölés és a GABA szintézis markerenzimének, a glutaminsav dekarboxiláznak (GAD) egyidejő szövettani kimutatásával igazolták, hogy a PVN-be vetítı GABAerg sejtek túlnyomó része a hypothalamuson belül helyezkedik el [57, 301]. Ezek az interneuronok elszórtan találhatóak az anterior hypothalamikus területen, az anterior perifornicalis régióban és a PVN perinuclearis zónájában. Maga a PVN nem tartalmaz GABAerg sejteket, szemben a perinuclearis zónával, amely gazdag GABAerg neuronokban. A hypothalamus GABAerg neuronjain túl a BNST gátlósejtjei is hozzájárulnak a mag GABAerg innervációjához [125, 134]. A GABA-PVN neuronkapcsolatok anatómiai (pl. klasszikus pályajelöléses) leírását megnehezíti az a tény, hogy a GABAerg eredısejt és parvocellularis célsejtje igen közel vannak egymáshoz [ , 193]. A lokális, azon belül is a PVN közvetlen közelébıl eredı GABAerg bemenet létezésére Boudaba és mtsai elektrofiziológiai vizsgálatai mutattak rá [26]. A magot és a környezı területet egyaránt magába foglaló 300 µm vastag szeletpreparátumon a PVN körüli területek mikrostimulációjával gátló posztszinaptikus válaszokat (IPSP) tudtak a parvocellularis neuronokból elvezetni. A mérést mindhárom anatómiai síkban elvégezve olyan funkcionális térkép rajzolódott ki, amelyen a parvocellularis neuronokra vetülı GABAerg sejtcsoportok azonosíthatóak voltak. Ezzel a megközelítéssel a PVN parvocellularis neuronjait gátló preszinaptikus elemeket mutattak ki a medialis preopticus terület, az AHA, a peri-pvn régióban, a BNST és a DMN területén. A lokális hálózat GABAerg elemeit felértékeli az a tény, hogy a limbikus projekciók neurokémiai fenotípusa és hatása a parvocellularis rendszerre nem azonos elıjelő. A ventralis subiculum és az infralimbikus kéreg gátolja a HPA-tengely stressz által kiváltott aktivációját [84, 100, 131]. Mindkét régió projekciós neuronjai döntıen serkentı glutamáterg sejtek (1. táblázat) [396], amelyek hatását valószínőleg az intrahypothalamikus GABAerg interneuron-hálózat fordítja át a parvocellularis neuronokat elérı gátlássá. Hasonló módon magyarázható az a tény, hogy a MeA és a CeA principalis sejtjei fıleg GABAerg fenotípusúak [358], azonban mindkét régió serkenti a HPA-tengely mőködését. Az amygdalából eredı gátló pályák feltehetıen a 38

39 BNST és a hypothalamus GABAerg sejtjein végzıdve a gátlás felfüggesztése révén fokozzák a parvocellularis PVN neuroszekrécióját (2. táblázat). Fontos hangsúlyozni, hogy egy adott limbikus régió hypothalamikus kimenete nem kizárólagosan GABAerg vagy glutamáterg pálya, az eredısejt-populáció serkentı- és gátlósejteket egyaránt tartalmaz (1. táblázat). Az élettani és farmakológiai vizsgálatok alapján a GABAerg neurotranszmisszió meghatározó szerepet játszik a HPA-tengely szintetikus és szekréciós mőködésének a beállításában. Kevés az olyan vizsgálat azonban, amelyik a bazális GABAerg tónust létrehozó mechanizmusokat anatómiailag el tudná helyezni a hypothalamikus neuronhálózatban. A módszertani nehézségek miatt nem egyszerő külön vizsgálni a lokális neuronhálózatot és az azt kívőlrıl meghajtó bemeneteket. A vizsgálataink megkezdésekor nem ismertük, hogy a GABAerg tónus milyen módon befolyásolja a CRH és AVP génexpresszióját, illetve, hogy milyen intrinsic GABAerg mechanizmusok mőködnek stressz során. 39

40 5. CÉLKITŐZÉSEK A. A paraventricularis régió intrinsic GABAerg mőködésének vizsgálata in vitro organotipikus hypothalamus szelettenyészeten az alábbi szempontok szerint: A1. alkalmas-e az organotipikus szelettenyészet mint modell a parvocellularis CRH-neuronok szabályozási kérdéseinek vizsgálatára? A2. kimutatható ebben a rendszerben a PVN tónusos GABAerg gátlása? A3. hogyan befolyásolja a GABAerg neurotranszmisszió a CRH és az AVP bazális expresszióját in vitro? B. A PVN GABAerg bemenetének a HPA szabályozásában betöltött szerepét éber, szabadon mozgó patkányon kívántuk vizsgálni. Kérdéseink a következıek voltak: B1. milyen transzkripciós, sejtaktivációs és szekréciós következménnyel jár a GABAerg tónus felfüggesztése a paraventricularis régióban? B2. hogyan szabályozza a bazális CRH és AVP génexpressziót a PVN GABAerg bemenete in vivo? C. A GABAerg rendszer stresszválaszban betöltött szerepét két további kísérleti modellben kívántuk vizsgálni. C1. azonosítani kívántuk a stressz által aktivált központi idegrendszeri GABAerg neuronokat a GAD65-eGFP génmódosított egértörzsnél C2. meghatározni, hogy a GABAerg transzmisszió farmakológiai befolyásolása milyen hatással van a PVN stressz által okozott neuronális aktivációjára 40

41 6. ALKALMAZOTT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 6.1. In vivo vizsgálatok Kísérleti állatok A kísérleteket grammos felnıtt, hím Wistar patkányokon (Toxi-Coop, Budapest), valamint grammos felnıtt, hím Tg(GAD65_3e/gfp3.3)#15 transzgenikus, ill. C6CBA és C6CBAF2 vad típusú egereken (MTA KOKI Orvosi Géntechnológiai Részleg, Budapest) végeztük. A stresszel kapcsolatos vizsgálatoknál, így a jelen munkánál is alapvetı, hogy a laboratóriumi állatokat állandó és stresszmentes körülmények között tartsuk, és stressz csak általunk kontrollált módon és ideig érje az állatot. A ketrecenként 4-5 db patkányt, ill. 3-4 db egeret a kísérleteket megelızıen és közben állandó hımérséklető (21 ± 2 o C), páratartalmú (60 ± 10 %) és 12h/12h sötétvilágos fényciklusú (a világos periódus kezdete reggel 7.00) szobákban tartottuk, ahol szabványos rágcsálótáphoz és vízhez szabadon hozzáférhettek. A vizsgálatokba bevont génmódosított egértörzset Erdélyi Ferenc és Szabó Gábor (MTA KOKI Molekuláris Biológiai és Genetikai Laboratórium) hozta létre és bocsátotta a rendelkezésünkre. A Tg(GAD65_3e/gfp3.3)#15 vonal létrehozásának, valamint genetikai és anatómiai jellemzésének részletes leírását lásd Erdélyi és mtsai [92]. Az alkalmazott célkonstrukcióban az ún. felerısített zöld floureszcens fehérje (egfp) gén promotereként a humán glutaminsav dekarboxiláz 65 génjének egy 4.5 kilobázis hosszúságú szakasza szerepelt, amely tartalmazta a 5 régiót az elsı két exonnal és 3. exon egy részletét a megfelelı intronikus szekvenciákkal. A transzgenikus egerek genetikai alapjaként és a kísérletekben vad típusú kontrollként C6CBA és C6CBAF2 egértörzs szerepelt. A laboratóriumi állatok tartása, kezelése és a velük való bánásmód megfelelt a magyar (243/1998-as Állatvédelmi Törvény) és az európai (European Communities Council Directive, 86/609 EEC) elıírásoknak. Mőtéti vagy fájdalmas beavatkozás kizárólag mély anesztéziában történt, a kísérletek megtervezésénél pedig törekedtünk a felhasznált állatok számát minimalizálni. Kísérleteinket az MTA KOKI Állatkísérleti Etikai Bizottsága és a Budapest Fıvárosi Állategészségügyi és Élelmiszer Ellenırzı 41

42 Állomás Etikai Tanácsa hagyta jóvá (engedély száma: /1999) Mőtéti beavatkozások Mikroinjekció A GABA A -antagonista lokális beadása a Parada által leírt távbeadásos módszerrel [271] történt éber, szabadon mozgó patkányon. Az állatokat egyhetes akklimatizációs idıszakot követıen fájdalommentesen, mély anesztéziában mőtöttük meg a kísérlet elıtt két nappal. Altatóként ketamin (Calypsovet 50 mg/ttkg, Richter), xylazin (Rometar 60 mg/ttkg, Spofa) és prometazin (Pipolphen 5 mg/ttkg, Egis) keverékét használtuk intraperintonealisan adva. A teljes anesztézia elérésekor a parasagittalis bırmetszés és az os parietale feltárását követıen fém vezetıkanült ültettünk a jobb oldali PVN fölé sztereotaxiás célzással. A mőtéteket Stoelting gyártmányú agycélzó készülékkel végeztük ún. egyenes fejtetı ( flat skull ) helyzetben. A PVN helyzetét Paxinos és Watson atlasza [273] alapján határoztuk meg: 1,8 mm a Bregmától hátra; 0,3 mm lateralisan a középvonaltól; 7,8 mm ventralisan a dura mater szintjétıl. A kanült egy 3x3 mm-es, a csonton ill. a durán kialakított ablakon keresztül vezettük a helyére, majd fogorvosi cementtel (Harvard Cement, Berlin) rögzítettük a koponyacsonthoz. A mőtétet követıen a patkányokat egyedi ketrecekbe tettük, és így tartottuk ıket a kísérlet napjáig. A kísérlet napjának reggelén a vezetıkanült egy rugalmas polietilén kanül segítségével meghosszabbítottuk és kivezettük a ketrecbıl. A mikroinjekciós kísérleteket minden esetben azonos napszakban, reggel 8 és 9 óra között kezdtük, hogy elkerüljük a diurnális ingadozásból adódó hibát. 3 órás nyugalmi idıszak után - amikor a továbbiakban már nem értünk sem az állatokhoz, sem a ketrecükhöz, a meghosszabbított vezetıkanülön keresztül egy hajlékony fémkapillárist (Fused Silica Capillary, belsı átmérı: 75 µm, külsı átmérı: 150 µm, Composite Metal Services Ltd. Hallow, Worcester, USA) juttatunk be a megfelelı mélységi pozícióba és 25 pmol bicuculline methiodide (BMI, Fluka) oldatot injektáltunk a nucleus paraventricularisba. A BMI feloldására illetve kontroll oldatként mesterséges cerebrospinális folyadékot használtunk (ACSF), amely elektrolit-, ozmoláris- és ph-viszonyaiban megfelel az agyi extracelluláris tér paramétereinek (ACSF: 147 mm, Na +, 3.5 mm K +, 2 mm Ca 2+, 1 mm 42

43 Mg +, ph=7,3). A teljes beadott folyadékmennyiség 0,5 µl volt, amelyet 3 perc alatt kézi nyomással, egy Hamilton fecskendı segítségével adtunk be. A folyadékbeadás után a kapillárist további 3-5 percen keresztül a helyén hagytuk a szövetben, majd lassan kihúztuk. A mikroinjekciót követıen az állatok a ketrecükben maradtak további 90 ill. 120 percig, a perfúzió kezdetéig. Stresszmentes kontrollként minden kísérletbe bevontunk néhány intakt, nem injektált állatot is Mikrodialízis A GABA A -agonista muscimol és a benzodiazepin-receptor agonista chlordiazepoxid lokális infúziójára reverz mikrodialízis technikát használtunk. A módszer a félig áteresztı membránon keresztül történı anyagmozgás elvén alapul [148, 167]. Lényege az egyik végén zárt, kis mérető (0,2 mm átmérıjő, 2 mm hosszú) szemipermeábilis membráncsı, amelyet egy hasonlóan kis átmérıjő acélcsıhöz rögzítünk. Az így kialakított munkatérbe egy-egy hajlékony fémkapilláris (Fused Silica Capillary, lásd fent) vezet be ill. ki onnan, amelyeken keresztül ACSF-et áramoltatunk. A membránon keresztül történı diffúziót, a membrán pórusnagysága (jelen esetben 50 kd), a két oldala közötti koncentrációgrádiens, valamint az áramoltatott folyadék sebessége és a hımérséklet határozza meg. Amennyiben egy adott anyagra nézve a szöveti koncentráció nagyobb, mint a dializáló folyadékbeli koncentrációja, úgy szövet-dializáló folyadék irányú anyagmozgás jön létre. Fordított koncentrációviszonyok mellett az anyagáramlás iránya is megfordul. Kísérleteink során a mikrodialízis technikát folyamatos, helyi anyagbeadásra használtuk, hogy a szövet volumenterhelése nélkül jutassunk be GABAerg vegyületeket a paraventricularis régióba. Koncentrációjuk a szobahımérséklető dializáló folyadékban 100 µm muscimol (Sigma) és 1,2 mm chlordiazepoxid (Sigma) volt. A mikrodialízis szondát altatásban, sztereotaxiás eljárással ültettük be a jobb oldali PVN mellé (mőtét és PVN koordináták, lásd fent). A kísérletet az implantációt követı napon végeztük, így már nem kellett számolnunk az altató hatásaival, illetve a szonda körül kialakuló reaktív asztrogliózis még nem volt olyan mértékő, amely zavarta volna az anyagbeadást. A kísérlet reggelén 8 és 9 óra között a szonda be- és kivezetı szárát mőanyag kanül segítségével meghosszabbítottuk, majd egy mikroinfúziós pumpához (Stoelting, 43

44 Wood Dale, IL, USA) csatlakoztattuk. Ezután 60 perces ACSF-infúziót kezdtünk, amely ekvilibrációs periódus alatt már nem értünk az állatokhoz. Ezt követıen kezdıdött a GABAerg vegyületek 130 perces infúziója 2 µl/min sebességgel. Az állatokat az anyagbeadás 10. percében rövid éter stressznek tettük ki. Kontrollként olyan állatokat használtunk, amelyek a kísérlet teljes ideje alatt ACSF-infúziót kaptak Stressz A kísérlet napján az egereket reggel 8 és 9 óra között, a mikrodialízis szondával felszerelt patkányokat a reggeli felszerelés után 3 órával éterstressznek tettük ki. Az éterstressz során az állatot 5 percre egy étergızzel telített, zárt üvegedénybe helyeztük. A mikrodialízis kísérleteknél az anyagbeadás folyamatos volt a stressz során és azt követıen a kísérlet végéig. Az éterexpozíció után az állatok visszakerültek a ketrecükbe, ahol a kísérlet végéig (patkánynál a stresszt követı 120. perc; egérnél a 10. ill. 90. perc) tartózkodtak Vérvétel és hormonmérés A sztereotaxiás mőtéttel párhuzamosan a patkányok egy csoportjánál kanült ültettünk a jobb oldali vena jugularisba, hogy a mikroinjekció hatására bekövetkezı hormonális választ mérni, és idıben követni tudjuk. A környezı lágyrészekhez rögzített és a nyak bıre alatt dorsalisan kivezetett polietilén kanült (PE50, Dow Corning, NY) a kísérlet reggelén hasonlóan a mikroinjekciós szerelékhez egy hosszabbító kanüllel vezettük ki a ketrecbıl. A kivezetés és az egyszeri heparinos átmosás után 3 órával történt a mikroinjekció és ezzel párhuzamosan az állatonként és idıpontonként a 0,1 ml mennyiségő vérminták győjtése. A mikroinjekció idıpontjához képest -10., 0., 5., 10., 20., 30., 60., 90. és 120. percnél levett mintákat EDTA-val kezelt, hőtött Eppendorfcsövekbe győjtöttük. Az egérkísérleteknél a stressz kezdete utáni 10. percnél mind a transzgenikus, mind a vad típusú állatok egy csoportját gyorsan dekapitáltuk, a nyakból vért győjtöttünk, és ezekbıl a mintákból határoztuk meg a plazma adrenokortikotropin (ACTH) szintjét. Az alapszintő ACTH-szint meghatározására olyan állatokat használtunk, amelyeket nem 44

45 ért semmiféle stressz. A patkányokból és egerekbıl nyert plazmákat centrifugálással (2500x g-s fordulatszámon, 30 percig, 4 o C-on) elválasztottuk, majd -20 o C-on tároltuk az analízisig. Az adrenokortikotrop hormon szintjének meghatározására direkt radioimmunassay-t (RIA) használtunk [186], amelynél az egyes méréseken belüli és közötti variancia 4,7 illetve 7 %-os volt. Minden mintából két párhuzamos meghatározást végeztünk, és az így kapott két mérési eredmény számtani közepét tekintettük az adott minta ACTHértékének Intrakardiális perfúzió Az állatokat a kísérlet végén túlaltattuk és perfundáltuk. A fixálás szobahımérséklető fiziológiás sóoldat és 0 o C-os 4 %-os paraformaldehid oldat (0,1 M-os borát pufferben, ph=9) intrakardiális perfúziójával történt. A perfúzió elsı két percében az érrendszert fiziológiás sóoldattal mostuk át, majd ezt követte a fixáló folyadék beadása 20 percen keresztül. Az eltávolított agyakat 10 %-os szacharózos paraformaldehid oldatban posztfixáltuk 3 órán keresztül 4 o C-on, majd ugyanilyen hımérséklető 10 %-os cukros kálium-foszfát pufferbe (KPBS) tettük egy éjszakára. Az egereknél a zöld floureszcens fehérje érzékenysége miatt a szövet posztfixálása mindössze 1 órát tartott. A KPBS oldat összetetétele a következı volt: 1 liter desztillált vízben 0,45 g KH 2 PO 4, 2,908 g K 2 HPO 4 és 9 g NaCl Szövettani módszerek Metszés és szövettárolás A perfúziót követı napon a patkányagyakból 30 µm, az egéragyakból 20 µm vastag, coronalis síkú sorozatmetszeteket készítettünk Reichert fagyasztó mikrotómon. A metszés után a szöveteket fagyálló folyadékban -20 C-on (a transzgenikus egerekbıl számazó mintákat ezen felül fénytıl is védve) tároltunk a szövettani feldolgozásig. A fagyálló folyadék összetétele az alábbi volt: 0,79 g NaH 2 PO 4 x H 2 O, 6,80 g Na 2 HPO 4 x 45

46 2H 2 O, 500 ml DEPC víz, 300 ml etilénglikol, 200 ml glicerin. Mivel a késıbbi szövettani feldolgozás in situ hibridizációs hisztokémiát is magába foglalt, ezért a szöveti RNS-ek megırzésének érdekében maximálisan törekednünk kellett a ribonukleázmentes körülmények kialakítására. Ez a következıket foglalta magába: 1.) a felületeket és az eszközöket kémiailag mentesítettük a ribonuklázoktól (RNazin, Sigma), 2.) gumikesztyőt használtunk a metszésnél és a késıbbi szövettani munkáknál, 3.) autoklávozott, ill. 0,1 %-os dietilpirokarbonátot (DEPC: ribonukleáz inhibitor, Sigma) tartalmazó oldatokat használtunk Immuncitokémia A stressz, ill. a beadott vegyületek hatására aktiválódott sejtek kimutatását c-fos immuncitokémiával végeztük. Elsıdleges antitestként a humán c-fos protein N- terminális része ellen nyúlban kifejlesztett poliklonális ellenanyagot (#sc-52, 1:20000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) használtunk. Az immuncitokémiai reakció standard avidin-biotin-peroxidáz (Vector, Burlingame, CA, USA) módszerrel történt. A fagyálló folyadék kimosása és az inkubációk közötti mosások KPBS pufferrel történtek (2x10 perc) szabadon úszó metszeteken. A szöveti peroxidázok kimerítésére 3 %-os H 2 O 2 -dal 10 percig, a nem-specifikus fehérjekötés elkerülésére pedig 2 %-os kecske szérummal 1 órán keresztül inkubáltuk a szöveteket a primer ellenanyag elıtt. A blokkoló lépések után az elsıdleges antiszérumot 4 o C-on 48 órán keresztül hagytuk a metszeteken. Ezt követte a másodlagos ellenanyag, a kecskében termelt és biotinnal konjugált antitest, amely a nyúl immunglobulinok F ab részét ismeri fel (1:500, Vector). A szérumok penetrációjának növelése érdekében mind a blokkoló normál savót, mind a specifikus primer és szekunder szérumot 0,3%-os Triton-X 100 tartalmú kálium-foszfát-pufferben vettük fel. A szekunder szérum kimosása után következett a biotin-avidin-tormaperoxidáz komplex 1 órás inkubációja, majd az elıhívás. Kromogénként 3,3 -diaminobenzidine tetrahidrochloride-ot (DAB, 0,5 mg/ml, Sigma), szabadgyök-donorként 0,03 %-os H 2 O 2 -t használtunk, a reakció erısségét 1,5 %-os nikkel-ammónium-szulfáttal intenzifikáltuk. Az elıhívás után a metszeteket zselatinos tárgylemezre húztuk fel, felszálló alkoholsorban dehidráltuk, majd Depex fedıanyaggal fedtük. 46

47 A transzgenikus és vad típusú egerek c-fos expresziójának összehasonlításához konvencionális avidin-biotin-peroxidáz immuncitokémiát használtunk (lásd fent). Az c- Fos/EGFP kolokalizáció vizsgálatára a c-fos proteint immunfluoreszcens módon mutattuk ki. Ebben az esetben elsıdleges szérumként nyúlban termelt c-fos elleni antitestet használtunk 1:40000-es titerben; másodlagos szérumként kecskében termelt és Alexa 594 fluoreszcens festékkel konjugált nyúl elleni savót 3 órán keresztül inkubálva szobahımérsékleten (1:500, Molecular Probes). A szekunder szérum alapos kimosása és a metszetek zselatinos tárgylemezre húzása után azokat speciális fedıanyaggal (Vectashield, Vector) fedtük, majd a mintákat fénytıl védve, -4 o C-on tároltuk. Mivel célunk a c-fos-immunreaktív sejtek mennyiségi és összehasonlító elemzése volt az egyes kezelési csoportok között, ezért az összetartozó és együtt értékelendı szövetek immuncitokémiai reakcióját minden esetben azonos körülmények között, ugyanabban az osztott immuncitokémiás inkubálótálcában végeztük In situ hibridizációs hisztokémia és autoradiográfia A CRH és az AVP génexpressziójában bekövetkezı változások nyomonkövetésére, valamint a GAD67 ill. GAD65 mrns-t expresszáló sejtek kimutatására izotópos in situ hibridizációs hisztokémiát alkalmaztunk. Az adott RNS szekvenciát felismerı próbákat [ 35 S]-uridin trifoszfáttal ( 35 S-UTP, DuPont NEN) jelöltük meg. Az AVP hnrns ribopróbát Dr. T.G. Sherman (Georgetown University), a CRH mrns próbát Dr. K. Mayo (Northwestern University), a GAD67 mrns próbát Dr. A.J. Tobin (UCLA), a GAD65 mrns próbát Dr. Szabó Gábor (MTA KOKI) által konstruált és rendelkezésünkre bocsátott plazmidról írtuk át. A paraventricularis régiót tartalmazó metszeteket poli-l-lizinnel bevont tárgylemezre húztuk fel, majd száradás után 4 %-os paraformaldehid oldattal posztfixáltuk (30 perc, 4 o C), proteináz K-s emésztéssel (10 mg/ml 50 mm Tris-ben, 5 mm EDTA, ph=8, 20 perc, 37 C) tártuk fel a sejtmembránt, acetiláltuk (0,25 % ecetsav anhidrid 0,1 M trietanolaminban, ph=8) és felszálló alkoholsorban dehidráltuk a szöveteket. Száradás után a 35 S-UTP-vel megjelölt ribopróbát (10 7 dpm/ml) tartalmazó hibridizációs elegy 100 µl-ét pipettáztunk a tárgylemezekre és hibridizáltattuk 56 C-on órán keresztül. A hibridizációs oldat 47

48 összetétele az alábbi volt: 50 % formamid, 0,3 M-os NaCl, ph=8-as 10 mm-os Tris, 2 mm-os EDTA, 1 Denhardt oldat, 10 % dextrán szulfát, 0,5 mg/ml élesztı trns. A hibridizáció után a metszeteket 4 SSC-vel mostuk (1 SSC: 0,15 M NaCl és 15 mm trinátrium-citrát, ph=7), majd a nem hibridizálódott, egyszálú ribonukleinsavakat ribonukleáz A-val (20 mg/ml, Tris-EDTA pufferben 0,5 M NaCl 37 C, 30 perc) emésztettük el. Ezután fokozatosan csökkenı sókoncentrációjú mosás (2, 1, 0.5 SSC, 5 perc) és 65 C-os 0,1 SSC-s inkubáció következett (30 perc). Alkoholos dehidrálás és száradás után a hibridizációs szignált röntgenfilmen (Betamax, Kodak), majd NTB-3 autoradiográfiás emulzióval (Kodak) tettük láthatóvá. Az emulzióba mártott tárgylemezeket a CRH, a GAD65 és a GAD67 mrns esetében 5-7 napig, az AVP hnrns esetében 2-3 hétig exponáltuk. Ezt követte az elıhívás D-19-es hívóoldatban, majd a háttérfestés Nissl szerint és a fedés. Az együtt értékelendı szöveteket - hasonlóan az immuncitokémiai reakcióhoz - ugyanabban a hibridizációs sorozatban kezeltük Kombinált immuncitokémia és in situ hibridizáció A c-fos immuncitokémia és GAD67 mrns in situ hibridizáció kombinációját Chan és mtsai által leírt módon végeztük el [47]. Az immuncitokémiai reakció történt az elsı lépésben, ezt követte az in situ hibridizáció a glutaminsav dekarboxiláz 67 enzim mrnsének kimutatására. Az immuncitkémiai reakció menete a fent leírt módon történt, azzal a lényegi különbséggel, hogy a szöveti RNS-ek megırzésének érdekében 1.) nem kezeltük H 2 O 2 -dal a szöveteket, 2.) szérum helyett 3 %-os BSA-t (Sigma) alkalmaztunk, 3.) az RNáz aktivitás gátlására 2,5 mg/ml heparint (25000 I.U./ml, Richter) adtunk az inkubáló oldatokhoz, 4.) a reakciót nikkel intenzifikáció nélkül hívtuk elı. Az elıhívott metszeteket poli-l-lizines tárgylemezre húztuk, és ezen történt az in situ hibridizációs reakció (lásd ), az emulzióba mártás, a metszetek 7 napos autoradiográfiás expozíciója és elıhívása. Ebben az esetben nem alkalmaztunk háttérfestést, mert az megnehezítette volna a DAB-reakciótermék detektálását az autoradiográfiás szemcsék alatt. 48

49 Kvantitatív képelemzés Az emulziós autoradiográfia kiértékeléséhez Nikon Eclipse E600 mikroszkópra (Nikon Corporation, Japan) szerelt SPOT RT kamerával (Diagnostic Instruments, Inc., IL) digitalizáltuk az anyagot. A denzitometria szempontjait figyelembe véve a sötétlátóteres felvételeket azonos fényút és megvilágítási beállítások mellett készítettük, és a képeken ezután már nem változtattunk. A mérést az NIH Image 1.59 szoftverrel (letölthetı: végeztük az alábbi módon. A beolvasott látótereket invertáltuk, az autoradiográfiás szemcsék sőrőségének megmérése 256 fokozatú szürkeségskálán történt a program Integrált Denzitás funkciójával. A CRH mrns hibridizációs jelének megméréséhez egy 625 µm x 525 µm-es téglalapot fektettünk a PVN medialis parvocellularis dorsalis (mpd) területére 10x nagyításnál. Mivel AVPexpresszió a paraventricularis mag két, szorosan érintkezı részében is jelen van, ezért itt a leolvasás a Nissl szerint megfestett metszetek alapján azonosított és körülhatárolt (magnocellularis és medialis parvocellularis dorsalis) területek elkülönítésével történt. Sorozatmetszeteinken két szomszédos PVN profil távolsága 120 µm volt, így állatonként 4-5 PVN-t tudtunk lemérni mindkét oldalon. Ezek átlagából képeztünk egy értéket, és a továbbiakban ezzel jellemeztük az adott állatot. Az optikaidenzitás-adatokat mértékegység nélkül, O.D. jelöléssel adjuk meg. A bemutatott sötétlátóteres in situ hibridizációs tablókat Adobe Photoshop 5.5 program (Adobe Systems, Mountain View, CA, USA) segítségével készítettük el. A c-fos-immunpozitív sejtek számának meghatározásánál a fénymikroszkópos anyagot a fent leírt képanalizáló rendszerrel, az immunfluoreszcens mintákat az ugyanerre a mikroszkópra szerelt epifluoreszcens feltéttel vizsgáltuk és digitalizáltuk. Az adott látótér egfp zöld fluoreszcens jelét (gerjesztési ill. kibocsátási maximum: 489 nm ill. 508 nm) FITC szőrıvel, az Alexa 594-nel (588 nm ill. 613 nm) megjelölt c-fos pozitív sejtmagokat G-2A szőrıvel olvastuk be, majd a SPOT 3.4 programmal hoztuk létre az adott látótér kettısen jelölt képét. A c-fos-immunpozitív sejtek számának meghatározásánal mind a fénymikroszkópos immuncitokémia, mind az immunfluoreszcens reakciónál a digitalizás után azonos módon jártunk el. A sejtszámoláshoz az ImageJ 1.29 programot használtuk (letölthetı: Az anatómiai struktúrákat Franklin és Paxinos egéragy-térképe 49

50 alapján azonosítottuk. A c-fos-immunpozitív sejteket a következı területeken határoztuk meg: area anterior hypothalami, nucleus paraventricularis hypothalami pars medialis parvocellularis, a nucleus paraventricularis subparaventricularis zónája, piriformis cortex, nucleus interstitialis striae terminalis medialis ventralis és lateralis posterior területe és a lateralis septum lateralis ventralis almagja. A PVN subparaventricularis zónája anatómiailag nem kellıen definiált régió. Jelen munkában Lu és mtsai által használt meghatározást követtük: a nucleus suprachiasmaticus dorsalis határától induló, és a PVN ventralis határáig húzódó alacsony sejtsőrőségő térség [224]. A digitalizált látótereket azonos mérési küszöbérték mellett és azonos leolvasási kerettel (300 µm x 300 µm mérető négyzet) mértük meg mindkét oldalon régiónként 4-5 szomszédos metszeten. Az így kapott mérési eredményt átlagoltuk, és ezzel az átlaggal jellemeztük az adott állat adott területét. A c-fos/egfp kolokalizáció mértékének megállapításánál a fenti módszerrel megszámoltuk külön a c-fos pozitív, illetve az egfp pozitív elemeket az adott látótér FITC, illetve G-2A szőrıvel beolvasott képén, majd a látóteret kettısen megjelenítve manuálisan megszámoltuk a mindkét fluoreszcens jelet kifejezı narancssárga profilokat Statisztikai módszerek Az eredményket az átlag ± SEM feltüntetésével ábrázoltuk. A statisztikai szignifikancia megállapításához a STATISTICA 6.0 programcsomagot (Statistica Inc., Tulsa, USA) használtuk. Két csoport esetén t-próbát, több csoport esetén variancianalízist (ANOVA) használtunk. Mindkét esetben a szignifikancia határát p<0,05-nél húztuk meg, és ezt a diagramm megfelelı oszlopában csillaggal ábrázoltuk. 50

51 6.2. In vitro vizsgálatok Kísérleti állatok és szeletkészítés Az organotipikus hypothalamus szelettenyészeteket House által leírt módon preparáltuk és tartottuk fent [144]. 6-7 napos hím Wistar patkányok agyából gyors dekapitálás után 6x6 mm-es hypothalamustömböt vágtunk ki. Ebbıl szövetdaraboló készülékkel (Sorwall Tissue Chopper, Newtown, CO, USA) 400 µm vastag coronalis síkú szeleteket készítettünk, amelyeket a vágás után azonnal 0 o C-os preparáló oldatba (5 mg/ml glükózzal dúsított Gey s Balanced Salt Solution (Gibco)) helyeztük. Itt a nem tökéletesen szétvált szeleteket finoman elkülönítettük, majd az anatómiai támpontok (3. agykamra mérete és alakja, fornix helyzete) segítségével sztereomikroszkóp alatt kiválogattuk a PVN-t tartalmazó szöveteket. Ezeket egy megfelelıen széles hegyő pipettába felszippantva vittünk át a tenyésztımembránra, amely 0,4 µm pórusmérető Millicell-CM membrán volt (Millipore, Bedford, MA, USA). A membrán csak az alsó felszínén érintkezett a tenyésztı táppal, így biztosítva az optimális gáz-folyadék fázishatárt a felsı felszínre ültetett szövetnek. A szeletkészítés teljes folyamatát steril körülmények között (lamináris szövettenyésztı fülkében, szőrt oldatokkal, hılégsterilizált sebészi eszközökkel), a szövet felesleges traumatizálását kerülve és viszonylag gyorsan végeztük: a dekapitálás és a szeletek membránra ültetése között körülbelül 4-5 perc telt el Tenyésztési körülmények, oldatok és kezelések A szelettenyészeteket 37 o C-os 5 % CO 2 tartalmú termosztátban tartottuk fent napig. Az tenyésztés elsı napja szérumos tápoldatban történt, amelyet kétnaponta friss oldatra cseréltünk. A szérumos tenyésztıoldat 50% Basal Medium Eagle (BME, Sigma), 25 % Hanks Balanced Salt Solution (Gibco) és 25 % hıinaktivált lósavó (Sigma) keveréke volt, amelyet 5 mg/ml glükózzal (Sigma), 1 mm L-glutaminnal és 25 µl/ml streptomycin-penicillin oldattal (Sigma) egészítettünk ki. A kísérletek elıtt két nappal a szérumos tápot szérummentesre cseréltük, és a kezeléseket is ebben az oldatban végeztük. Szérummentes tápként és kontroll oldatként 100 %-os BME oldatot használtunk 5 mg/ml glükózos (Sigma) és 1 mm L-glutaminos dúsítással. A kezeléseket 51

52 az alábbi vegyületekkel és dózisokban végeztük: bicuculline methiodide (BMI: 50 µm, Fluka), corticosterone-hbc (CORT: 500 nm, Sigma), dexamethasone (DEX: 10 nm, Organon), forskolin (FORS: 10 µm, Sigma), kálium-klorid (KCl: 50 mm, Reanal), tetrodotoxin (TTX: 1 µm, Sigma) Hormonmérés A tenyésztıoldatok kortikoszteron szintjét direkt radioimmunassay segítségével határoztuk meg. Ellenanyagként a kortikoszteron-karboximetilamin-bsa konjugátum ellen nyúlban termelt antitestet, jelölıanyagként a 125 I-dal megjelölt kortikoszteronkarboximetilamin-tirozin-metilésztert használtuk. A tápból vett minták kortikoszteron tartalmát a -20 o C-os tárolás után extrakció nélkül, két párhuzamos méréssel határoztuk meg. A mérés érzékenysége 1 pmol/ml; a mérésen belüli és közötti variancia 7 és 24 % volt [192] Szövettani módszerek Fixálás és szövettárolás A kezelések végén a tenyészeteket 90 percen keresztül immerziósan fixáltuk szobahımérséklető, 0,2 %-os pikrinsavat tartalmazó 4 %-os paraformaldehid oldattal (ph=7,4). A immuncitokémiai reakciókat a fixáló alapos KPBS-es kimosása után, a szöveteket a membránon hagyva végeztük el. Az in situ hibridizációra kerülı szeleteket a fixálás után ecsettel finoman eltávolítottuk a membránról, fagyálló folyadékba tettük, és - 20 o C-on tároltuk a hibridizációs hisztokémia elvégzéséig. Az elektronmikroszkópos vizsgálathoz a tenyészeteket magas koncentrációjú glutáraldehides oldattal fixáltuk, amelynek az összetétele a kövekezı volt: 0,1 M-os foszfát pufferben feloldott 4 %-os paraformaldehid, 0,5 %-os glutáraldehid és 0,2 %-os pikrinsav. 52

53 Immuncitokémia A hypothalamus szelettenyészetek fénymikroszkópos vizsgálatára MAP2 (1:1000, monoklonális, Sigma) és c-fos (lásd ) immuncitokémiát, az elektronmikroszkópos vizsgálatra GABA-immunfestést végeztünk. A szeletpreparátum elektronmikroszkópos vizsgálatát Dr. Miklós Ildikó végezte. A GABAerg sejtek beágyazás utáni immunarany kimutatását Somogyi és Soltész által leírt módon végeztük [346]. A fixált szövetet felszálló alkoholsorban (30 %, 50 %, 70 % és 100 % etanol) és propilénoxiddal (Merck) dehidráltuk, majd tárgylemezen Durcupan ACM (Fluka) gyantába ágyaztuk be. A magas hımérséklető polimerizáció után a tenyésztett paraventricularis magot kimetszettük, átágyaztuk és utramikrotómmal 50 nm vastagságú sorozatmetszeteket készítettünk, amelyeket 1 %-os formval (Sigma) hártyával bevont nikkel gridre úsztattunk. Az immunarany festést ezen a felületen végeztük 2%-os perjódsav, 2 %-os nátrium-perjodát, 1 %-os BSA kezelés után. Primer antitestként a GABA-glutáraldehid-BSA konjugátum ellen nyúlban termelt ellenanyagot használtunk (1:2000; Dr. Somogyi Pétertıl, Oxford). Másodlagos antitestként kolloidális arannyal megjelölt kecske eredető nyúl elleni antitest (15 nm-es aranyszemcsékkel, Amersham) 1:50 higítását használtuk. A kontrasztozás telített uranil-acetátos, valamint ólom-citrátos oldattal (Ultrostain 2, Leica) történt In situ hibridizációs hisztokémia és autoradiográfia A szelettenyészeteket a fagyálló folyadék alapos kimosása után egészben ( in toto ) poly-l-lizines tárgylemezre húztuk, majd az in situ hibridizációs hisztokémiát és autoradiográfiát a pontban leírtak szerint végeztük el Kvantitatív képelemzés Az in situ hibiridizációs jel mérését a pontban leírtak szerint végeztük a GABAkísérleteknél, míg a szteroidos kezelések és szérummegvonás után a CRH mrns jel mennyiségi meghatározásához a Fuji FLA 3000 Phosphoimager rendszert és AIDA 53

54 kiértékelı programot használtunk. A hibridizációs jel erısségét itt a mőszer saját egységében (PSL/mm 2 : területegységre esı fotostimulálható luminenszcencia) adtuk meg. A kísérletek kezdetekor még nem rendelkeztünk a Fuji FLA Phosphoimager rendszerrel, ezért a hibridizációs méréseket az in vivo kísérleti minták teljes egészén és az in vitro minták döntı többségénél az emulzióról történı hagyományos optikaidenzitásméréssel végeztük, és csak a késıbbi in vitro kísérletekben (szteroidos kezelés és szérummegvonás) tértünk át a Phosphoimager rendszerre Statisztikai módszerek Az in vitro kísérletekben az adott szelet egyedi PVN-jében mért denzitásadatot tekintettük statisztikai egységnek, és a bemutatott adatok legalább két független tenyésztési sorozatból származnak. Az eredményket az átlag ± SEM feltüntetésével ábrázoltuk. A statisztikai szignifikancia megállapítása a STATISTICA 6.0 programcsomaggal történt (Statistica Inc., Tulsa, USA). Két csoport esetén t-próbát, több csoport esetén variancianalízist (ANOVA) használtunk. A post-hoc összehasonlításokra a Dunett-féle, illetve az Unequal N tesztet használtuk. Ez utóbbit abban az esetben, amikor a kezelési csoportok elemszáma lényegesen különbözött egymástól. A szignifikancia határát p<0,05-nél húztuk meg, és ezt a diagramm megfelelı oszlopában csillaggal ábrázoltuk. 54

55 7. EREDMÉNYEK 7.1. Intrinsic GABAerg gátlás organotipikus hypothalamus szelettenyészeten A CRH és AVP génexpresszió neuronhálózati szabályozásának lokális összetevıit organotipikus szelettenyészeten vizsgáltuk Az organotipikus hypothalamus szeletpreparátum jellemzése A szelettenyészetek minıségének általános megítélésére Nissl-festést használtunk. Minıségi mutatóként az intakt agyalapi felszín mutatkozott a legalkalmasabbnak, ahol nem történt vágási trauma a szeletkészítés során. A vágott felszíneknél minden esetben kifejezett degeneratív elváltozásokat tapasztaltunk, ezért már a hypothalamusblokk kialakításakor arra törekedtünk, hogy a PVN-tıl legalább µm-re legyen a szövettömb vágott széle. Azokat a tenyészeteket, amelyek durva makroszkópos vagy mikroszkópos elváltozásokat (a szelet zsugorodása, nagyfokú sejtpusztulás) mutattak, kizártuk az analízisbıl. Az in vitro vizsgálataink elsı lépéseként meghatároztuk, hogy a modellünkben milyen mértékben vannak jelen a CRH-t termelı idegsejtek morfológiai és funkcionális sajátosságai napos tenyésztési idı után CRH mrns-t expresszáló sejteket mutattunk ki a tenyésztett hypothalamus szöveten. A CRH mrns-t kifejezı neuronok hasonlóan az in vivo anatómiai viszonyokhoz a 3. agykamra ependymája mellett kétoldalt, lepkeszárnyra emlékeztetı sejtcsoportot alkottak (4. ábra: A). A PVN-en túl CRH mrns-t expresszáló sejteket találtunk a lateralis hypothalamusban a perifornicalis területnek megfelelıen is. A GABAerg sejtek jelenlétét a tenyészetben a GAD67 kd-os formájának mrnsét felismerı ribopróbával mutattuk ki (4. ábra: G). Szemben a CRH mrns jól körülírt a PVN-re és a perifornicalis területre lokalizálódó expressziójával a 35 S-UTP-vel jelölt GAD67 mrns hibridizációs jelét a szelet teljes kiterjedtségében megtaláltuk. A tenyészetek elektronmikroszkópos vizsgálatával 14 napos tenyésztési idı után is jól megırzött ultrastruktúrát találtunk. Beágyazás utáni immunarany technikával GABAimmunpozitív terminálisokat mutattunk ki, amelyek szimmetrikus szinapszisokat alkottak a PVN területén (4. ábra: H). 55

56 4. ábra. Az organotipikus hypothalamus szelettenyészet vizsgált sejttípusai. A) A szelettenyészetek makroszkópos képe. B,C) MAP2-immunfestıdést mutató differenciált hypothalamikus neuronok a tenyészetben a szelet teljes vastagságából (B), ill. félvékony metszetrıl (C) készült felvételen. D) CRH mrns-t expresszáló sejtcsoport elhelyezkedése a preparátumban. A kisnagyítású röntgenfilmen a sötét területek a 35 S-UTP-vel jelölt CRH mrns ribopróba kötıdését mutatják. A szaggatott vonal a szelet határát jelzi. E) Autoradiográfiás szemcsék a CRH mrns tartalmú sejtek felett. F) AVP-transzkripció az SCN-ben és hiányzó AVP hnrns a PVN-ben 13 napos in vitro tenyésztés után. G) GAD67 mrns-t tartalmazó sejtek a tenyészetben. H) A paraventricularis régió ultrastruktúrája szimmetrikus és aszimmetrikus szinapszisokkal. Az elektronmikroszkópos felvételen a kolloidális aranyszemcsék a GABA-immunreakció helyét mutatják. A világos nyíl egy nem jelölt aszimmetrikus, a sötét egy GABA-pozitív szimmetrikus szinapszist mutat. Rövidítések: AVP: arginin-vazopresszin, CRH: corticotropin-releasing hormon, GAD 67: glutaminsav dekarboxiláz enzim 67 kda-os formája, SCN: nucl. suprachiasmaticus, PVN: nucl. paraventricularis hypothalami. A léptéket jelzı szakaszok: 20 µm (B), 1 mm (D, F), 15 µm (E, G), 1µm (H). 56

57 A CRH és az AVP transzkripció jellegzetességei in vitro A szeletkísérleteket ismert összetételő, szérummentes tápoldatban végeztük, hogy elkerüljük a szérum eredető faktorok így a szteroid hormonok jelenlétébıl adódó hibát. Méréseink alapján a szérumos tenyésztı tápoldatunk tartalmazott kortikoszteront (12,1 ± 3,3 pmol/ml), szemben a szérummentes kezelı tápoldattal, amely kortikoszteron tartalma a RIA alsó méréshatára körüli tartományban volt (1,0 ± 0,3 pmol/ml). A paraventricularis mag CRH mrns denzitása a szérumos táppal kezelt tenyészeteken 35,5 ± 1,4 PSL/mm 2 volt, a szérummentes tápoldattal kezelt tenyészeteken 45,1 ± 3,6 PSL/mm 2 (5. ábra). 5. ábra. A PVN CRH mrns expressziója a tenyésztı tápoldat kortikoszteron koncentrációjának függvényében. A bal oszlopdiagram a szérumos és szérummentes tenyésztıoldat kortikoszteron koncentrációját mutatja. A tenyészeteket 14 napig 25 % szérumot tartalmazó médiumban tenyésztettük, majd 24 órára szérummentes, vagy továbbra is a szérumos tápoldatba helyeztük. Jobb oldalon az adott táppal kezelt PVN szelettenyészetek CRH mrns expressziója látható. Az eredményeket átlag ± SEM formában ábrázoltuk. CRH: corticotropin-releasing hormon, SFM: szérummentes tenyésztıtáp. ** p<0,01 57

58 Szemben a szeleten bazálisan is mérhetı CRH mrns expresszióval, nem tudtunk lényeges AVP hnrns-t kimutatni a PVN-ben in vitro (6. ábra: B). Annak eldöntésére, hogy ez az AVP-gén vagy a külsı bemeneteitıl megfosztott PVN hálózati sajátossága, egy másik parvocellularis vazopresszinerg sejtcsoportból, a nucleus suprachiasmaticusból készítettünk szelettenyészetet. Azonos in vitro körülmények között fenntartva az SCNben folyamatos AVP hnrns expressziót tudtunk kimutatni 14 napos tenyésztési idı után is (6. ábra: A). A tenyészetek 10 µm forskolinnal történı kezelése után a parvocellularis PVN-ben is megjelent az AVP hnrns hibridizációs jele (6. ábra: B). Mellékleletként vizsgálataink megerısítik Vutskits és mtsai megfigyelését [394], amely szerint a PVN magnocelluláris vazopresszinerg sejtjei szelektíven eltőnnek a szelettenyészetbıl. 6. ábra. Alapszintő és forskolinnal stimulált AVP-transzkripció organotipikus hypothalamus szelettenyészeten. 35 S-UTP-vel jelölt AVP hnrns ribopróba in situ hibridizációs jele a PVN-ben röntgenfilmen (felsı, kisnagyítású képek) és az autoradiográfiás emulzión (alsó, nagynagyítású képek). A) AVP hnrns jelenléte a suprachiasmaticus magban bazálisan és 3 órás forskolin kezelés után B) Kontroll körülmények között a PVN-ben nem mutatható ki AVP hnrns; a forskolin kezelés hatására megjelenik a hibridizációs jel. Rövidítések: AVP: argininvazopresszin, FORS: forskolin, hnrns: heteronukleáris RNS, PVN: nucleus paraventricularis hypothalami, SCN: nucleus suprachiasmaticus, SFM: szérummentes tenyésztıtáp. A szakasz a kisnagyítású képeken 1 mm-t, a nagyobb nagyításúakon 50 µm-t jelöl. 58

59 Glükokortikoid hormonok és TTX hatása a PVN CRH expressziójára in vitro körülmények között A CRH mrns stimulusra (szérummegvonás, illetve forskolin) adott transzkripciós válasza mellett megvizsgáltuk a génexpresszió in vitro válaszkészségét a gátló hatásokra is. A tenyészeteket 500 nm kortikoszteronnal és 10 nm dexamethasone-nal kezeltük 3 órán keresztül, majd az expressziós változásokat a 35 S-UTP-vel megjelölt CRH mrns ribopróba kötıdésével vizsgáltuk. Mindkét szteroid szignifikánsan lecsökkentette a CRH mrns hibridizációs jelét (7. ábra), hasonlóan a 10 µm TTX hatásához, amely a CRH mrns szintet 51 %-kal csökkentette le a tenyésztett PVN-ben. 7. ábra. A feszültségfüggı nátriumcsatornák gátlásának és a glükokortikoid hormonok hatása a PVN CRH mrns expressziójára in vitro. Az oszlopdiagram a paraventricularis mag CRH mrns szintjét mutatja 3 órás tetrodotoxin, kortikoszteron és dexamethasone után. Mind az akciós potenciálok blokkolása, mind a glükokortikoid agonisták szignifikánsan csökkentették a CRHexpressziót a magban. Az eredményeket átlag ± SEM formában ábrázoltuk. CRH: corticotropin-releasing hormon, CORT: kortikoszteron, DEX: dexamethasone, TTX: tetrodotoxin, SFM: szérummentes tenyésztıtáp, tetrodotoxin ** p<0,01; *** p<0,005 59

60 Paraventricularis sejtaktiváció a GABA A -antagonista kezelést követıen a szelettenyészeten A sejtaktivációt a c-fos protein immuncitokémiai kimutatásával követtük. A paraventricularis szelettenyészeteink alacsony alapszintő c-fos-ir-t mutattak: mindössze néhány elszórt sejtmag volt c-fos-immunpozitív a szérummentes kontroll csoportban (8. ábra: A). A c-fos gén indukálhatóságának megállapítására egy depolarizációs és egy intracellularis camp-szintet fokozó stimulust alkalmaztunk. Az 50 mm kálium-kloriddal, illetve 10 µm forskolinnal történı kezelés után három órával mindkét esetben erıteljes c- Fos festıdést tapasztaltunk diffúzan a hypothalamus szövet teljes kiterjedésében (8. ábra: B, C). 8. ábra. A c-fos korai gén indukálhatósága organotipikus hypothalamus szeleten. A DAB-Ni csapadék a c-fos fehérjét tartalmazó sejtmagokat jelöli. A) Alacsony alapszintő c-fos-immunreaktivitás a tenyészeteken. B) c-fos-ir megjelenése a szeleten 50 mm kálium-klorid kezelést követıen. C) c-fos-pozitív sejtmagok forskolin kezelés után a hypothalamusban. Rövidítések: FORS: forskolin, ir: immunreaktív, K + : kálium, SFM: szérummentes tenyésztıtáp. A vonal 30 µm-es távolságot jelöl a felvételeken. A szelet intrinsic GABAerg tónusának vizsgálatára a GABA A -receptorok kompetitív antagonistáját, bicuculline methiodide-ot (BMI) adtunk a tápoldathoz. Az antagonista alkalmazott 50 µm-os koncentrációja mellett a GABA A -receptorok többsége telített és a posztszinaptikus GABAerg jelátvitel gátolt. A 3 órás BMI-kezelést követıen jelentıs c-fos indukciót tapasztaltunk, amely szemben a KCl, illetve a FORS hatásával elsısorban a paraventricularis magra korlátozódott (9. ábra: B,D). 60

61 9. ábra. GABA A -antagonista hatása a hypothalamus szelettenyészet c- Fos expressziójára. A c-fos immunfestıdés mértéke és eloszlása a kontroll tenyészeteken (A) és bicuculline methiodide (B) kezelés után. A GABA A - antagonista hatására aktiválódott sejtek (D) elhelyezkedése megegyezett a PVN CRH mrns-t expresszáló medialis parvocellularis dorsalis részével (C). 3v: 3. agykamra, BMI: bicuculline methiodide, CRH: corticotropinreleasing hormon, FORS: forskolin, mpd: pars medialis parvocellularis dorsalis, pv: periventricularis terület, SFM: szérummentes tenyésztıtáp. A szakasz a kisnagyítású képeken (A, B) 150 µm-t, a nagynagyításúakon (C, D) 300 µm-t jelöl CRH és AVP expressziós válaszok a GABA A -receptorok blokkolásának hatására in vitro A BMI-kezelést követıen a szérummentes kontroll tenyészetekkel összehasonlítva megemelkedett CRH mrns szintet mértünk a paraventricularis magban (SFM: 2194,66 ± 288,8 O.D. vs BMI: 3525,23 ± 373,11 O.D.; n=31-60/csoport, egyszempontos ANOVA, Dunett-féle posthoc összehasonlítás, p=0,0156). Pozitív kontrollként forskolin kezelést alkalmaztunk, amely a GABA A -antagonistához hasonló mértékben emelte meg a 61

62 CRH mrns hibridizációs jelének intenzitását (BMI: 3525,23 ± 373,11 O.D. vs FORS: 3447,6 ± 582,19 O.D.; n=15-60/csoport, egyszempontos ANOVA, Dunett-féle posthoc összehasonlítás, p=0,9503). 10. ábra. GABA A -antagonista kezelés hatása a szelettenyészet CRH és AVP expressziójára. A) A sötétlátóteres felvételek a CRH mrns és az AVP hnrns in situ hibridizációs jelét mutatják a paraventricularis magban in vitro. Mind a 3 órás bicuculline, mind a forskolin kezelés megnövelte a PVN CRH mrns szintjét. Alapszinten hiányzó AVP hnrns jel a PVN-ben, amely megjelenik mind a GABA A -antagonista, mind a forskolin kezelést követıen. B) A CRH mrns és AVP hnrns mennyiségi vizsgálata az egyes kezelési csoportokban. Az eredményeket átlag ± SEM formában tüntettük fel. Egyszempontos ANOVA, Dunett post-hoc összehasonlítás. * p<0,05; ***p<0,001; Rövidítések: 3v: 3. agykamra, AVP: arginin-vazopresszin, BMI: bicuculline methiodide, CRH: corticotropin-releasing hormon, FORS: forskolin, SFM: szérummentes tenyésztıtáp Szérummentes körülmények között AVP-transzkripciót kizárólag a SCN-t tartalmazó szeleteken tudtunk mérni (SCN: SFM: 3670,58 ± 587,86 O.D., n=19); a parvocellularis PVN-nel szemben, ahol az AVP hnrns in situ hibridizációs jele a mérési küszöb környékén volt (PVN: SFM: 62,44 ± 14,02 O.D.; n=25) (10. ábra: A). Ugyanakkor mind a BMI-, mind a FORS-kezelés hatására AVP hnrns expresszió megjelenését figyeltük meg a PVN-ben (BMI: 1914,14 ± 609,9 O.D.; FORS: 7409,0 ± 62

63 1079,21 O.D.; n=7-25/csoport). A kezeléseket követıen a hibridizációs jel növekedését mindkét esetben a PVN CRH-t expresszáló, parvocellularis régiójában mértük (10. ábra: B). Az SCN-ben sem a BMI, sem a FORS-kezelés nem növelte meg szignifikánsan az AVP hnrns szintet (BMI: 4105,77 ± 741,13; FORS: 5011,42 ± 915,47, n=12-22/csoport, egyszempontos ANOVA, F(2,50)=0,6897; p=0,50644) Centrális GABAerg tónus a hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg rendszerben in vivo Annak vizsgálatára, hogy az in vitro kísérleteinkben tapasztalt tónusos GABAerg gátlás milyen módon vesz részt a PVN és a HPA in vivo mőködésében, bicuculline methiodideot mikroinjektáltunk éber, szabadon mozgó patkány PVN-jébe, majd követtük a GABA A - antagonistára adott sejtaktivációs, transzkripciós és szekréciós választ Neuronális aktiváció a patkány hypothalamusában GABA A -antagonista paraventricularis beadását követıen A mikroinjekció pontos helyét a késıbbi szövettani feldolgozás során azonosítottuk: intra-pvn beadásnak azokat az eseteket minısítettük, amelyeknél a beadó fémkapilláris hegye elérte, de nem haladta meg a PVN dorsalis határát (így a PVN szövetét nem érte sérülés), valamint parasagitalisan a fornix és a kamrafal síkja között maradt. A mikroinjekciót lassan végeztük, és a beadást követıen a kapillárist további 3-5 percig a helyén hagytuk, hogy megelızzük a beadott oldat hirtelen szöveti szétterjedését vagy visszaáramlását a szúrcsatornán keresztül. Azokat az állatokat, amelyeknél a GABA A - antagonista hatására konvulziót vagy abnormális lokomotoros választ észleltünk kizártuk a további analízisbıl. A mikroinjekciós technika és az ACSF oldat paraventricularis beadása önmagában nem okozott jelentıs c-fos-immunpozitivitást a hypothalamusban. Jelölt sejteket találtunk elszórtan a nucleus suprachiasmaticusban, a median preopticus magban, a lateralis hypothalamikus területen és a PVN körül a subparaventricularis zónában. Az 63

64 ACSF-mikroinjekciót kapott állatok agyában megfigyelt c-fos-ir erıssége és területi eloszlása nem különbözött az intakt állatoknál leírt c-fos mintázatától, valamint az ellenoldali, nem injektált félteke c-fos festıdésétıl. 11. ábra GABA A -receptorblokád hatása a paraventricularis régió c-fos expressziójára. c-fos-immunreaktív sejtmagok a paraventricularis régióban az ACSF és a BMI helyi mikroinjekciója után. A) Az ACSF beadását követıen minimális c-fos-ir tapasztalható a régióban. B) A GABA A -antagonista BMI jelentıs c-fos-immunpozitivitást idézett elı a PVN-ben és a magot körbefogó perinuclearis zónában. C) c-fos és GAD67 mrns egyidejő kimutatása. Az ezüstszemcsék a GAD67 mrns expresszáló sejteket (világos nyíl), a barna színő DAB-reakciótermék a c-fos-pozitív sejtmagokat (sötét nyíl) jelzik. A GABA A - antagonista hatására aktiválódott sejtek egy része GAD67 mrns-t tartalmazott (kettıs nyíl). Rövidítések: 3v: 3. agykamra, ACSF: mesterséges cerebrospinalis folyadék, BMI: bicuculline methiodide, GAD: glutaminsav dekarboxiláz. A lépték 150 µm (A, B), ill. 15 µm (C) a felvételeken. A csillag a beadókapilláris szúrcsatornáját, a szaggatott vonal a PVN határát jelzi. A 25 pmol bicuculline methiodide beadását nagymértékő c-fos-indukció követte az injekció oldalán a beadást követıen 120 perccel. Intenzív festıdést tapasztaltunk a perifornicalis területen és a subparaventricularis zónában, továbbá a DMN és a lateralis hypothalamus területén. A BMI mikroinjekciója által kiváltott c-fos-ir egyaránt jelentıs volt magában a PVN-ben és a maggal határos (perifornicalis és SPVZ) terüleken (11. ábra: A, B). A paraventricularis magon belül a c-fos festıdés nem mutatott sem magnocellularis, sem parvocellularis preferenciát. Annak eldöntésére, hogy a PVN körüli 64

65 sejtaktiváció érinti-e a perinuclearis GABAerg sejteket, kombinált c-fos immuncitokémiát és GAD67 mrns in situ hibridizációt végeztünk a két marker kolokalizációjának a kimutatására. A kettısen jelölt mintáinkon a BMI által elıidézett c- Fos-ir megtalálható volt a GAD67 mrns pozitív sejtekben, a c-fos-indukció azonban a régió jelöletlen, nem-gabaerg profiljaira inkább jellemzı volt (10. ábra: C). A BMI-mikroinjekció beadása után néhány esetben tisztálkodási, illetve táplálékfelvételi magatartást tapasztaltunk az állatoknál. Ez a jelenség azonban nem volt konzekvens, nem tudtunk összefüggést kimutatni a magatartási és a c-fos válasz között, valamint ritkán az ACSF-mikroinjektált csoportban is megjelent A PVN CRH és AVP expressziója a GABA A -antagonista lokális beadása után Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján a stressz által elıidézett parvocellularis AVP hnrns emelkedés maximuma a stressz utáni 60. és 120. perc között van, ezért a GABA A -antagonistára adott AVP transzkripciós választ a mikroinjekció utáni 90. percnél vizsgáltuk. Ez az idıpont egyben alkalmas a CRH mrns szintjében bekövetkezı változás észlelésére is [192]. Mivel az ACSF-mikroinjekció után mért CRH mrns és AVP hnrns in situ hibridizációs jelintenzitása megegyezett a nem injektált, intakt állatok agyában tapasztalható hibridizációs jellel, ezért a BMI mikroinjekcióját követı transzkripciós változásokat önkontrollos módon, a nem-injektált ellenoldali PVN-nel hasonlítottuk össze. 90 perccel a BMI egyoldali beadása után nem észleltünk mérhetı változást a PVN CRH mrns mennyiségében. A mikroinjekció oldalán a CRH mrns denzitásértéke 456,5 ± 81 O.D., az ellenoldali PVN-ben 473,6 ± 57,3 O.D. volt (egymintás t-próba, n=6, p=0,2647). 65

66 12. ábra A nucleus paraventricularis hypothalami CRH és AVP expressziója GABA A antagonista helyi mikroinjekciója után. A) A sötétlátóteres felvételek a CRH mrns és AVP hnrns hibridizációs jelét mutatják szabadon mozgó patkány PVN-jébe adott egyoldali bicuculline mikroinjekció után 90 perccel. B) A CRH mrns és AVP hnrns denzitometriai mérésének eredménye. Kontrollként a mikroinjekciót nem kapott ellenoldali PVN denzitásértékei szerepelnek. Az eredményeket átlag ± SEM formában tüntettük fel.* p<0,05; ***p<0,01. Rövidítések: AVP: arginin-vazopresszin, BMI: bicuculline methiodide, CRH: corticotropin-releasing hormon. A vonás 150µm-t jelöl. A GABA A -antagonista mikroinjekciója után szignifikáns AVP hnrns emelkedést tapasztaltunk az injektált oldali PVN parvocellularis részében, változatlan magnocellularis AVP hnrns expresszió mellett. Az autoradiográfiás emulzió denzitometriai vizsgálatával 83 %-os emelkedést mutattunk ki a parvocellularis AVP hnrns szintben a mikroinjekció oldalán (12. ábra: B). Az injekció oldalán a parvocellularis AVP hnrns hibridizációs jele 145,6 ± 29,6 O.D., contralateralisan 79,6 ± 8,5 O.D. (egymintás t-próba, n=6, p=0,0189). A magnocellularis AVP hnrns denzitásértékei a következık voltak: ipsilateralisan 249,30 ± 26,05 O.D., contralateralisan 265,73 ± 38,08 O.D. (egymintás t-próba, n=6, p=0,1586). 66

67 A PVN-be juttatott GABA A -antagonista hatása a plazma ACTH-szintre A plazma ACTH-szintet jugularis kanüllel felszerelt patkányok vérmintáiból határoztuk meg a mikroinjekciót megelızıen és azt követıen. A BMI paraventricularis beadása után a plazma ACTH-koncentráció gyorsan és tranziens módon megemelkedett (13. ábra). A mikroinjekció elıtti 13,6 ± 2,2 fmol/ml alapszintrıl 5 percen belül elérte a 256,6 ± 43,0 fmol/ml-es csúcsértéket. Az ACSF-oldat mikroinjekciójának nem volt szignifikáns hatása a plazma ACTH-szintre. 13. ábra A GABA A -antagonista paraventricularis mikroinjekcióját követı ACTH-válasz. A plazma ACTHkoncentrációt RIA-val határoztuk meg, az ábrázolt érték az adott idıponthoz tartozó átlag ± SEM. A PVN-be mikroinjektált BMI (vörös vonal) gyors és átmeneti plazma ACTH emelkedést okozott. Az azonos módon beadott ACSF-oldat (kék vonal) nem emelte meg az ACTH plazmakoncentrációját. Az egyenes szakasz a mikroinjekciót jelöli. Rövidítések: ACSF: mesterséges cerebrospinális folyadék, BMI: bicuculline methiodide. 67

68 7.3. Stressz által okozott GABAerg aktiváció a központi idegrendszerben Az eddig bemutatott kísérletekben a PVN bazális GABAerg tónusát vizsgáltuk, amelyet mind szelettenyészeten in vitro, mind szabadon mozgó patkánynál in vivo kimutattunk. Kísérleteink folytatásaként a GABAerg rendszer stresszben betöltött szerepét vizsgáltuk két további kísérleti modellben. Elsıként a stressz által aktivált központi idegrendszeri területeket vizsgáltuk a GAD65-eGFP génmódosított egértörzsnél, majd a GABA A - receptorkomplex agonistáinak hatását a stressz által okozott neuronális aktivációra patkányok PVN-jében A GAD65-eGFP egértörzs hypothalamus-hypophysis-mellékvesekéreg rendszerének és stresszválaszának jellemzése Elsı lépésként a Tg(GAD65_3e/gfp3.3)#15 egerek hypothalamusának egfp expresszióját hasonlítottuk össze a GAD65 mrns anatómiai eloszlásával. A vad típusú kontroll egerek hypothalamikus GAD65 mrns expressziójával megegyezıen, a transzgenikus egérvonalnál az egfp-pozitív sejteket a legnagyobb számban az area preopticában, az anterior és lateralis hypothalamikus területen találtuk Alacsonyabb szintő volt az egfp-transzgén kifejezıdése a nucleus dorsomedialis hypothalami és a perifornicalis területen. A paraventricularis régió egfp-fluoreszcenciája megfelelt az in situ hibridizációval kimutatott GAD65 mrns expressziós mintázatának (14. ábra). Ezen a területen jelentıs egfp-fluorescencia volt a PVN-t körülölelı perinuclearis részen. Magában a PVN-ben sem GAD65 mrns-t expresszáló, sem egfp-t tartalmazó sejttestet nem tudtunk megfigyelni, mindössze a magon kívül eredı és oda befutó zöld fluoreszcens rostokat. A hypothalamus GAD65 mrns in situ hibridizációs és az egfp fluoreszcens jele közötti egyetlen lényeges eltérést a nucleus suprachiasmaticusban találtuk: az SCN sejtjeinek többsége tartalmaz GAD65 mrns-t és GABA-t [43, 264], míg a transzgenikus vonalnál az SCN mindössze néhány sejtje volt egfp-pozitív. 68

69 14. ábra. egfp és GAD65 mrns expressziós mintázat a GAD65-eGFP génmódosított egerek paraventricularis régiójában A sötétlátóteres felvétel a transzgenikus egértörzs paraventricularis régiójának GAD65 mrns expresszióját (A), a fluoreszcens fotó a régió egfpmintázatát mutatja (B). Mindkét marker elsısorban a perinuclearis zónában és az anterior hypothalamikus területen expresszálódik. Rövidítések: 3v: 3. agykamra, AHA: area anterior hypothalami, GAD: glutaminsav dekarboxiláz, egfp: felerısített fluoreszcens fehérje, PVN: nucleus paraventricularis hypothalami. A léptéket jelzı szakasz 150 µm a felvételeken. A transzgenikus és vad típusú egér stresszre adott c-fos- és ACTH-válaszát éterbelélegzéses modellben hasonlítottuk össze. A mintavételi idıpontokat korábbi, egereken végzett kísérleteink alapján választottuk ki: a stressz kezdete utáni 10. percben győjtöttük a vérmintákat a hormonméréshez, illetve a 90. percben perfundáltuk az állatokat a c-fos fehérje immuncitokémiai kimutatásához. A stresszmentesen tartott egerek agyában alacsony c-fos-immunreaktivitást figyeltünk meg mindkét genotípusnál. Az éter belélegzését követıen jelentıs c-fos-indukciót tapasztaltunk a PVN parvocellularis részében (15. ábra: A), a piriformis kéregben, a középvonali thalamusmagokban, a septum laterale-ban, a nucleus interstitialis striae terminalisban és az anterior hypothalamikus területen. A stressz által kiváltott c-fos-immunpozitivitás területi eloszlása és erıssége megegyezett a GAD65-eGFP transzgenikus és a vad típusú csoport között (15. ábra: B). A c-fos-ir sejtmagok számának statisztikai kiértékelésre kétszempontos variancianalízist használtunk, amely szignifikáns hatást mutatott a stressz 69

70 esetében (F(1,5)=10164,34; p=0,0049), a genetikai háttérnek ugyanakkor nem volt hatása a PVN c-fos indukciójára (F(1,5)=0,1631; p=0,7030). Az alapszintő és stresszt követı plazma ACTH-szintet hasonlóan a c-fosválaszhoz kétszempontos ANOVA-val hasonlítottuk össze az GAD65-eGFP transzgenikus és vad típusú csoport között. A stressz ebben az esetben is szignifikánsak bizonyult (F(1,12)=16,7360; p=0,0015); a genotípusnak azonban nem volt hatása sem a bazális, sem a stressz utáni ACTH-szintre (F(1,12)=0,0159; p=0,9018). 15. ábra. A GAD65-eGFP transzgenikus egértörzs HPA mőködésének és stresszreaktivitásának vizsgálata. A) Bazális és a stressz-indukálta c-fos-immunreaktivitás a génmódosított és vad típusú egér parvocellularis PVN-jében. B) A c-fos-ir nagysága és a plazma ACTH-szintje az egyes kísérleti csoportokban (átlag ± SEM). A kétszempontos varianciaanalízis alapján a genotípusnak nem, míg a stressznek szignifikáns hatása volt mindkét vizsgált paraméterre. Rövidítések: 3v: 3. agykamra, ACTH: adrenocorticotropin hormon, AHA: anterior hypothalamikus area, PVN: nucleus paraventricularis hypothalami, tg: transzgenikus, wt: vad típusú kontroll. Az egyenes szakasz 150 µm-t jelöl. 70

71 Stressz-indukálta c-fos/egfp kolokalizáció A stresszmentesen tartott transzgenikus egerek agyában alacsony alapszintő c-fosimmunreaktivitást találtunk, az egfp-expresszió önmagában nem okozta a korai gén indukcióját a sejtben. Az éter belélegzése után számos egfp-pozitív profilban megjelent a c-fos-immunfluoreszcens jel, mutatva, hogy a transzgén celluláris expressziója nem akadályozta meg a sejt stimulusra adott c-fos-válaszát. 16. ábra. Stressz által okozott c-fos indukció a GAD65-eGFP génmódosított egér paraventricularis régiójában. A) A GAD65-eGFP transzgén kifejezıdése a paraventricularis régióban. Az egfp-jelintenzitás elsısorban a paraventricularis magot körülvevı zónában és az anterior hypothalamikus területen figyelhetı meg. B) c-fos-indukció éterstressz után 90 perccel. Jelentıs c-fos-ir látható a PVN medialis parvocellularis dorsalis részén, valamint kisebb mértékben a perinuclearis zónában és az anterior hypothalamikus területen. C) A látótér egyesített képén a narancssárga profilok jelölik a paraventricularis régió mindkét markert megjelenítı sejtjeit. Rövidítések: AHA: anterior hypothalamikus area, egfp: felerısített fluoreszcens fehérje, PVN: nucleus paraventricularis hypothalami, SPVZ: subparaventricularis zóna. A lépték 150 µm a felvételeken. A stressz-indukálta egfp/c-fos kolokalizáció mértékének és területi különbségeinek vizsgálatára meghatároztuk az adott régió egfp-pozitív, c-fosimmunpozitív és a kettısen jelölt elemeinek számát. Az egységnyi területre esı c-fospozitív sejtmagot legnagyobb számban a nucleus paraventricularis hypothalamiban (PVN: 110,5 ± 6,5 sejt/terület) és a piriformis cortexben (PIR: 81,8 ± 2,5 sejt/terület) 71

72 találtunk. A vizsgált régiók közül az egfp-expresszió a subparaventricularis zónában (SPVZ: 56,9 ± 2,2 sejt/terület) és az anterior hypothalamikus területen (AHA: 48,1 ± 5,4 sejt/terület) volt a legmagasabb. A legmagasabb kolokalizációs arányt a lateralis septumban számoltuk (17. ábra). Itt a c-fos-pozitív sejtek 21,0 ± 8,3 %-a, az egfp-pozitív sejtpopuláció 14,0 ± 4,2 %-a volt kettısen jelölt (18. ábra: B). A PVN, a piriformis cortex és a középvonali thalamus jelentıs c-fos-immunreaktivitást mutatott az éter belélegzése után 90 perccel, ugyanakkor ezeken a területeken az egfp expressziója alacsony volt (18. ábra). 17. ábra. Stressz által kiváltott sejtaktiváció a lateralis septumban. A) egfp-pozitív sejtek a GAD65-eGFP transzgenikus egér lateralis septumában. B) c-fos-immunpozitív septalis sejtcsoport éter belélegzését követıen. C) Kettısen jelölt septalis profilok a látótér egyesített képén. D-F) A nagynagyítású képeken a két fluoreszcens jel kolokalizációja látható. Rövidítések: egfp: felerısített fluoreszcens fehérje, PVN: nucleus paraventricularis hypothalami, SPVZ: subparaventricularis zóna. A lépték 150 µm a kisnagyítású (A-C) és 5 µm a nagynagyítású (D-F) felvételeken. 72

73 18. ábra. A c-fos/egfp kolokalizáció mértéke a GAD65-eGFP transzgenikus egér stresszel kapcsolatos agyterületein. A) Az oszlopdiagram a területegységre esı egfppozitív (zöld szín), az éterinhalációra indukálódott c-fos-pozitív (narancssárga szín), és a a mindkét markert megjelenítı sejteket (világos sárga) mutatja. B) A vizsgált területek kolokalizációs aránya a c-fos-pozitív sejtek (narancssárga) és az egfp-pozitív sejtszám százalékában ábrázolva. Rövidítések: egfp: felerısített fluoreszcens fehérje, AHA: area anterior hypothalami, BNST: nucleus interstitialis striae terminalis, LS: septum laterale, PIR: piriformis kéreg, PVN: nucleus paraventricularis hypothalami, SPVZ: subparaventricularis zóna GABA A -agonisták hatása a PVN stressz-indukálta c-fos immunreaktivitására A GABAerg transzmisszió hatását stressz során farmakológiailag vizsgáltuk: a GABA A - agonista muscimolt, a benzodiazepin-receptor agonista chlordiazepoxidot és kontrollként ACSF-et mikrodializáltunk éterstressznek kitett patkányok paraventricularis régiójába, majd a sejtaktivációt c-fos immuncitokémiával mutattuk ki (19. ábra: A). A mikrodialízis szonda beültetése, illetve az ACSF mikrodialízise nem változtatta meg sem az alapszintő, sem a stressz által indukált c-fos-indukciót a paraventricularis régióban. A GABAerg vegyületek közül a muscimol hatása bizonyult szignifikánsnak: 62 %-kal csökkentette a stressz-indukálta c-fos-ir sejtmagok számát a PVN-ben (19. ábra: B). 73

74 19. ábra. A GABA A -receptorok aktivációja csökkenti a stressz által okozott c-fos indukciót a PVN-ben. A) A Ni-DAB csapadék az éterstressz hatására indukálódott c-fos fehérjét mutatja a PVN parvocellularis neuronjaiban patkánynál. A stresszel egyidıben és azt követıen 120 percig mesterséges cerebrospinalis folyadékot, chlordiazepoxidot, illetve muscimolt mikrodializáltunk a paraventricularis régióba. B) Az oszlopdiagram az aktiválódott sejtek számát mutatja a kezelést nem kapott ellenoldal százalékában (átlag ± SEM). A GABA A -receptor agonista muscimol szignifikánsan csökkentette a PVN stressz-indukálta c-fosindukció nagyságát. 3v: 3. agykamra, ACSF: mesterséges cerebrospinalis folyadék, CDP: chlordiazepoxid, MUSC: muscimol 74