Fehérje és antitest termelési core facility

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Fehérje és antitest termelési core facility"

Imre Farkas
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 DE OEC Debreceni Klinikai Genomikai Központ Fehérje és antitest termelési core facility Keresztessy Zsolt, PhD MBA K+F projektvezető

2 1. Küldetés Funkcionális genomika: antitestek/citokinek Minden nagyobb egyetemen van antitest/citokin/rekombináns protein core facility Baross Gábor pályázat pilot projekt Egyetemünkön sokan rendelkeznek hasonló tudással, de Szükség van egy koncentrált szolgáltató kapacitásra Küldetés: technológia és kapacitás kiépítése Belső igények, nemzetközi piacok Spin-off vállalkozás

Egyetemünkön sokan rendelkeznek hasonló tudással, de Szükség van egy koncentrált szolgáltató

3 2. Háttér Baross Gábor Program (REG_EA_KFI_09-INNANTet) Innovatív antitest és citokin előállítási technológiák fejlesztése Futamidő: Támogatás: 78 MFt Projektvezetés: Prof. Dr. Nagy László, akadémikus, BMBI, igazgató, Genomika Központ Dr. Bálint Bálint László, egyet. adjunkt., BMBI, laborigazgató, Genomika Dr. Zahuczky Gábor, tud.mnkts., BMBI, ügyvezető igazgató, UD-Genomed Kft. Dr. Vámosi György, tud.főmnk., Biofizikai Int. Tanácsadók: Prof. Kurucz István, Prof. Rajnavölgyi Éva, Prof. John Scwabe Executive projektvezető: Dr. Keresztessy Zsolt, tud. mnkts, BMBI, ügyvezető, INDEVION Biotech Kft. Laboratóriumi analítikus: Szabó Ibolya, BSc lab. anal.

, BMBI, laborigazgató, Genomika Dr. Zahuczky Gábor, tud.mnkts., BMBI, ügyvezető igazgató, UD-Genomed Kft. Dr. Vámosi György, tud.főmnk., Biofizikai Int.

4 Baross Gábor Program (REG_EA_KFI_09-INNANTet) Innovatív antitest és citokin előállítási technológiák fejlesztése A projekt célja olyan szerkezeti információkon alapuló antitest tervezési algoritmus kidolgozása, optimalizálása és általa olyan antitest prototípusok előállítása, amelyek natív antigén fehérjék felismerésére képesek, így alkalmazhatóságuk szélesebb körű, hatékonyságuk és megbízhatóságuk pedig sokkal jobb a jelenleg piaci forgalomban lévő készítményekénél. Génexpresszió, kromatin immunoprecipitáció (ChIP), ChIP-seq, ChIP-on-Chip A mai orvos-biológia egyre szélesebb körben használ rekombináns fehérjéket. A fehérje munkák egyik legfontosabb eszköze az antitest. Mára az antitesteket kiterjedten használják a kutatásban, patológiai diagnosztikában, terápiában és a személyre szabott orvoslásban is. Az antitestek mellett a citokinek tekinthetőek az egyik legfontosabb reagens-családnak az immunológiai és az őssejetkutatásban, de terápiás felhasználásuk is kiterjedt.

megbízhatóságuk pedig sokkal jobb a jelenleg piaci forgalomban lévő készítményekénél.

5 Biogyógyszer piac 2008 Global Pharma market: $735 billion Biopharmaceuticals: $ billion Recomb. proteins, mabs: $40-50 billion Cytokine drugs: $20 billion Current Drug Development Market for Cytokines, Chemokines and Growth Factors, Current Drug Development Market for Cytokines, Chemokines and Growth Factors Drug and Market Development Publishing, Jan 2007

proteins, mabs: $40-50 billion Cytokine drugs: $20 billion Current Drug Development Market

6 Baross Gábor Program (REG_EA_KFI_09-INNANTet) Innovatív antitest és citokin előállítási technológiák fejlesztése Céljaink: A Debreceni Egyetemen egy olyan kutatólaboratóriumi facilitást létrehozni, amelyik képes gyorsan, magas minőségben és a szükséges mennyiségben előállítani a kutatás terén helyi és nemzetközi szinten igényelt antitesteket és citokineket. Olyan új, szerkezetbiológiai információkra épülő epitóp tervezési algoritmust meghonosítani az antitest fejlesztésben, melynek segítségével innovatív módon, nagy affinitású antitestek hozhatók létre. Olyan jelölt citokineket létrehozni, amelyeknek az útja nyomon követhető biológiai rendszerekben, ezáltal egy új altípusát létrehozni ennek a reagens családnak.

7 Antitest termelési workflow Upstream Midstream Downstream TARGET SELECTION EPITOPE DESIGN PEPTIDE SYNTHESIS IMMUNISE HYBRIDOM A TESTING PRODUCE PURIFY CHARACT. PRODUCTS SMRT RXR PPAR RAR VDR ER AR ACTR Conventiona l Innovative Companies Peptides Conjugation MONOCLO NAL Mouse Myeloma Spleen PEG fusion TECAN Screen1 ELISA Freeze/Clon e Monoclonal c. Screen2 ELISA SDS/PAGE Western blot Dot blot ELISA Titers Control lysates Control Abs CELLCULT URE CHO, HEK FERMENTATI ON Mouse ascites PROFINIA Protein A Q ionexchange Desalting Storage IHC IP MSA ChIP ChIP-Seq CHT ionexch ChIP-on- Chip AGILENT MS POLYCLON AL, MONOCLO AL ANTIBODIE S Protocols Kits Controls Control regions Grow/Freeze CD POLYCLON AL Rabbit Bleed Rabbits Serum proteins Peptide affinity

Screen2 ELISA SDS/PAGE Western blot Dot blot ELISA Titers Control lysates Control Abs CELLCULT URE CHO, HEK FERMENTATI ON Mouse ascites PROFINIA Protein A Q ionexchange Desalting Storage

8 Antitest pipeline TARGET SELECTIO N EPITOPE DESIGN PEPTIDE SYNTHESI S IMMUNISE HYBRIDOM A TESTING PRODUCE PURIFY CHARACT. PRODUCT S SMRT Anti-SMRTc pab SMRT mab PPAR Anti-PPAR pab RXR RXR mab RAR VDR ER AR ACTR

9 Anti-SMRT antitest helyzete TARGET SELECTIO N EPITOPE DESIGN PEPTIDE SYNTHESI S IMMUNISE HYBRIDOM A TESTING PRODUCE PURIFY CHARACT. PRODUCT S SMRT Conventiona l Recombinan t POLYCLON AL: Rabbit Bleed SDS/PAGE Western blot Rabbits PROFINIA Protein A IHC IP ANTIBODIE S Protocols Dot blot Q ionexchange MSA Kits ELISA CHT ionexch ChIP Controls Titers Desalting ChIP-Seq Control regions Control lysates Storage ChIP-on- Chip Control Abs AGILENT MS Ready In progress Next step Serum proteins Peptide affinity CD

PRODUCT S SMRT Conventiona l Recombinan t POLYCLON AL: Rabbit Bleed SDS/PAGE Western blot Rabbits PROFINIA Protein A IHC IP

10 3. Infrastruktúra LOCATION Klinika Telep, Elméleti Tömb, 3. emelet, 315. labor EQUIPMENT Általános molekuláris biológiai háttér Sejtkultúrás labor Small-scale bakteriális és emlőssejt fermentáció Protein tisztítás BIO-RAD PROFINIA automated protein affinity purification system Protein karakterizálás SDS/PAGE, Western, ELISA, Multiscreen, biológiai aktivitás

bakteriális és emlőssejt fermentáció Protein tisztítás BIO-RAD PROFINIA automated protein

11 3. Infrastruktúra PROFINIA

12 3. Infrastruktúra PROFINIA

13 3. Infrastruktúra STAFF Dr. Keresztessy Zsolt, MSc Biol-Biotech, PhD CelMolBiol, MBA - protein engineering, design, rekombináns DNS tehnológia, protein expresszió, tisztítás, biokémia, szerkezet, folding, karakterizálás Szabó Ibolya, BSc laboratóriumi analítikus, MSc MolBiol hallgató - hibridóma technológia, sejtkultúra

rekombináns DNS tehnológia, protein expresszió, tisztítás, biokémia, szerkezet,

14 4. Távlati fejlesztések Sejtkultúrás fermentációs kapacitás Hibridóma screening robotok Large scale protein tisztítás Cloning kapacitás Humán erőforrás fejlesztés

15 5. Mintaprojekt Futó alprojektek Anti-SMRT antitest tisztítás és karakterizálás Epitóp tervezési algoritmus mab fejlesztés (2) Rekombináns protein termelés fejlesztés (2) Rekombináns IL-4 termelés

16 Citokin termelési workflow TARGET SELECTION CLONING EXPRESSIO N TESTING PRODUCTIO N PURIFY CHARACTER. LABELLING PRODUCTS IL-4 GM-CSF LIF FLT3- LIGAND IL-2 IL-9 Human cdna Gene Design Gene synthesis Constructs E. COLI Rosetta INSECT Sf9 MAMMALIA N HEK, CHO SDS/PAGE Western Blot ELISA Biological act. Transfection Selection FACS sorting Stable celllines Cell supernat. FERMENTATI ON PROFINIA IMAC Q ionexchange CHT ionexch Desalting Storage SDS/PAGE Western blot ELISA Biological act. MS CD Fluorescent Q-Dot CYTOKINES LABELLED CYTOKINE S IL-15

COLI Rosetta INSECT Sf9 MAMMALIA N HEK, CHO SDS/PAGE Western Blot ELISA Biological act.

17 Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt TARGET SELECTION CLONING EXPRESSIO N TESTING PRODUCTIO N PURIFY CHARACTER. LABELLING PRODUCTS IL-4 Human cdna Gene Design Gene synthesis Constructs E. COLI Rosetta INSECT Sf9 MAMMALIA N HEK, CHO SDS/PAGE Western Blot ELISA Biological act. Transfection Selection FACS sorting Stable celllines Cell supernat. FERMENTATI ON PROFINIA IMAC Q ionexchange CHT ionexch Desalting Storage SDS/PAGE Western blot ELISA Biological act. MS CD Fluorescent Q-Dot CYTOKINES LABELLED CYTOKINE S

18 Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt 1. Gene design, optimisation, sythesis 2. Subcloning into expression vector

19 Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt 3. Production in Rosetta 2, (HEK293T) slow induction lower temperature extended expression soluble protein. 4. Purification: IMAC, Desalting 5. Testing: SDS/PAGE, Western, ELISA 6. Biological activity TF-I proliferation assay THP-1 cells, STAT6 phosforilation 7. Expression optimisation 8. Large scale production

soluble protein. 4. Purification: IMAC, Desalting 5. Testing: SDS/PAGE, Western, ELISA 6.

20 Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt Purification: IMAC + Desalting

21 Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt Testing: ELISA

22 6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció Kollaboráció Pályázatok Konzultáció Szolgáltatások Termékek ELÉRHETŐSÉGEK: Tel: /54616, Mobil:

23 6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 1. ANTITESTEK from target sequence to antibody service epitóp tervezés

24 6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 1. ANTITESTEK from target sequence to antibody service epitóp tervezés hibridóma könyvtárak, sejtvonalak termelés CHO sejtekben antitest tisztítás (SMRT) Monoklonális antitestek Poliklonális szérumok és tisztított antitestek (SMRT)

25 6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 2. CITOKINEK citokin tartalmú tápfolyadék (IL-4) citokintermelő stabil sejtvonalak (IL-4) tisztított citokinek (IL-4) jelzett citokinek

26 6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 3. REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK production to characterisation Termelés (bakteriális, rovarsejt, emlőssejt expresszió) Tisztítás (LC, FPLC, HPLC affinitás, gélszűrés, ioncserés kromatogr. stb.) Karakterizálás (SDS/PAGE, WESTERN, ELISA, CE, CD, MS, biológiai aktivitás) Expression vectors: pet, ptriex, pgex Hosts: Rosetta 2, Rosetta Gami B, BL21, DH5α... Cell lines: HEK293, CHO, Sf9 Purification/tags: His-tag, GST, Fc Cartridges: IMAC, GST, SUPrA, UNOsp.Q, CHT I, Desalting

27 6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció Speciális szolgáltatások, konzultáció 4. PROTEIN ENGINEERING (mutagenesis, IVE, structure-based design) 5. PHAGE DISPLAY TECHNOLOGY (peptide and protein display) 6. HIGH THROUGHPUT SCREENING (Tecan) 7. LARGE SCALE FERMENTATION (2-100 L bakteriális, 2-10 L emlőssejt)

28 6. Szolgáltatások Termékek - Kollaboráció Tervezett szolgáltatások - kapacitásnövelés függvényében GENE TO PROTEIN Services from custom DNA to engineered proteins 1. Géntervezés és optimalizálás 2. GÉNEXPRESSZIÓ Génszintézis 3. Paraméter Szubklónozás Optimális 4. Kodon Plazmid minőség: preparálás - adaptált kódonhasználat 5. GC Fehérje tartalom: expresszió optimalizálás - kiegyensúlyozott 6. DNS Rekombináns motívumok: fehérje termelés, - szekvencia tisztítás, ismétlődések karakterizálás kizárása Piaci árak - példák - más motívumok kizárása Gene-to-protein: mrns szerkezet: másodlagos Euro szerkezet kizárása Recombinant IL-4 (mg): USD Stable cell lines: Euro

29 6. Szolgáltatások Termékek - Kollaboráció Tervezett szolgáltatások - kapacitásnövelés függvényében GENE TO PROTEIN Services from custom DNA to engineered proteins 1. Géntervezés és optimalizálás 2. Génszintézis 3. Szubklónozás 4. Plazmid preparálás 5. Fehérje expresszió optimalizálás 6. Rekombináns fehérje termelés, tisztítás, karakterizálás Piaci árak - példák Gene-to-protein: Euro Recombinant IL-4 (mg): USD Stable cell lines: Euro

30 Futó kollaborációk Funkcionális genomika Epigenetika Antitest fejlesztés Rekombináns fehérje termelés DE OEC KBMPI

Hasonló dokumentumok

A genomikai oktatás helyzete a Debreceni Egyetemen

A genomikai oktatás helyzete a Debreceni Egyetemen Bálint Bálint L. GNTP Oktatás és Tudásmenedzsment Munkabizottság, 2009. június 10. Tények Debreceni Egyetemről 21000 nappali és 33000 összes hallgató