VAKCINA GYÁRTÁS. 2. Az állat az immunválasz hatására antitestet termel, amit izolálni kell belőle, ehhez szükségessé válik az állat levágása.

Átírás

1 VAKCINA GYÁRTÁS A vakcinák vagy más néven az oltóanyagok arra szolgálnak, hogy az immunrendszert felkészítse a kórokozókkal szembeni hatékonyabb ellenállásra. Az oltóanyag segítségével immunitást, vagyis védettséget szerezhetünk az egyes patogén mikrobákkal szemben. Az immunizálásnak alapvetően két módja van, az aktív és a passzív immunizálás. Az aktív immunizálás során antigéneket vagyis ellenanyagokat visznek be a szervezetbe, ezáltal kiváltva az antitest termelést. Ezt a módszert általában profilaxisra (megelőzésre) használják. Passzív immunizálás során kész antitesteket juttatnak be a szervezetbe, így érthető, hogy ezt leginkább gyógyterápiára használják. A passzív immunizáláshoz szükséges antitestek előállítása: Az ellenanyagokat nagy testű, szövetrokon állatokkal állítják elő a következő technológiával (ezek az állatok általában lovak vagy szarvasmarhák): 1. Az állatot megfertőzzük azzal a kórokozóval, amelyre az antitestet termelni akarjuk, vagy legalábbis antigént juttatunk a szervezetébe, ami beindítja az immunválaszt. 2. Az állat az immunválasz hatására antitestet termel, amit izolálni kell belőle, ehhez szükségessé válik az állat levágása. A fent említett klasszikus módszer helyett egyre inkább szövettenyésztési és génmanipulációs módszereket használnak, hogy az állatok kínzását és levágását elkerüljék. Az aktív immunizáláshoz szükséges vakcinák előállítása: Szűkebb értelemben az aktív immunizálás céljára készített oltóanyagokat nevezik vakcinának. Az elnevezés Jenner felfedezéséből (1798) származik, aki megfigyelte, hogy a tehenek himlőjével fertőzött tehenészek nem kapják meg az emberi himlőt. A vakcina elnevezés a himlőoltóanyag nevéből származik (vacca latinul tehén). A feladat ebben az esetben az, hogy olyan készítménnyel oltsuk be az embereket, ami kiváltja az immunválaszt, de ugyanakkor nem okoz fertőzést. Ezt négy féle módon érhetjük el: Inaktivált kórokozót alkalmazunk, ekkor esetleg probléma lehet, hogy akad kis számú olyan mikroba, ami nem inaktiválódott, így fertőzést okoz. Az inaktiválás történhet hővel, de ezt ritkán alkalmazzák, mivel ekkor az antigén tulajdonságért felelős fehérjék is denaturálódhatnak. Továbbá lehet kémiai ágensekkel is inaktiválni, itt főleg a DNS-t károsító anyagok jönnek szóba, mint az alkilező szerek és az etilénimin. Legyengített (attenuált) formában alkalmazzuk a patogén mikrobákat. Ezt a módszert alkalmazták a BCG oltás kifejlesztésénél is. A BCG a tuberkolózis ellen véd és nevét két francia felfedezőjéről kapta (BCG = Bacterium de Calmette et Guerin). 14 éven keresztül gyengítették a baktériumot, míg kellően legyengült ahhoz, hogy vakcinaként alkalmazható legyen. Az attenuált törzsek veszélye, hogy reverziók történhetnek, ami oltási balesethez vezethet. Ezért a vakcinákat gyakran ellenőrizni kell. Az eljárás előnye viszont, hogy erősen ragályos betegség esetén a legyengített kórokozó spontán szóródhat a populációban, s immunizálhatja az oltásban nem részesülteket is (ugyanakkor a spontán szóródás közben is lehet reverzió!). Csak az antigén tulajdonságért felelős fehérjéket juttatjuk be a szervezetbe, szétszerelve a mikroorganizmust. Ezek lehetnek inaktivált eutoxinok, melyeknek az antigén tulajdonságuk megmarad (toxoidoknak vagy anatoxinoknak hívják őket), vagy a kórokozó tisztított antigénjei (alegység vagy kivonat vakcinák). Jelenleg még kísérleti fázisban vannak a liposzómába zárt vírus

2 antigéneket tartalmazó oltóanyagok. Az alegység-vakcinák rekombináns technológiával is előállíthatók, továbbá egyes esetekben szintetikus úton is. A rekombináns technika alkalmazásának további érdekes lehetősége a következő: az emberre ártalmatlan vacciniavírus genomjába is beültethető a Hepatitis B vírus génje, így ezzel a rekombináns vírussal a Hepatitis B ellen lehet oltani az embereket. Legelső, ősrégi módszer: Testről testre, Jenner módszerével: a tehénhimlő és a fekete himlő között keresztimmunitás lépett fel: hasonló törzset keresünk az immunizáláshoz, ami nem okoz betegséget, de védettség szerezhető általa. A feladat végrehajtása szempontjából érdemes kettéosztani a vakcina gyártási technológiáját a baktériumok elleni és a vírusok elleni oltóanyagokra. Baktériumok elleni vakcinák előállítási technológiája: A baktériumokat hagyományos fermentációs technológiával elszaporítják azzal a különbséggel, hogy igen szigorú biztonsági előírásokat kell betartani a gyártás során. Szigorú containment-et kell megvalósítani, vagyis semmi sem kerülhet ki a fermentorból. Ennek biztosítására a fermentor minden egyes csőcsatlakozását gőzzár védi, továbbá szükségessé válik a kimenő levegőáram szűrése is (a bemenőé is a sterilitás megőrzése miatt). A fermentáció során a containment általában nem ütközik nagy nehézségekbe, a fő gondot leginkább a feldolgozási technológia okozza. Itt sok speciális gépet és műszert kell alkalmazni, hogy az ember csak a legvégén kerüljön kapcsolatba a termékkel. A gyártás legvégső lépése a dozirozás, amit általában védőöltözetes emberek végeznek. Fontos továbbá még az is, hogy a tisztítás is zárt rendszerben megoldható legyen. Ilyen esetben legtöbbször a gyártósort úgy tervezik, hogy az hővel visszasterilezhető vagy/és formalinos vízzel kiáztatható legyen. Ha ezek a műveletek megtörténtek, akkor már nagy valószínűséggel elpusztultak a patogén mikrobák, így szét lehet szerelni a gyártáshoz szükséges eszközöket. A tisztításra felhasznált mosóvizet egy ún. killer tank-ban gyűjtik és naponta egyszer sterilezik, majd így engedik a csatorna hálózatba. Fontos még megjegyezni, hogy a fermentáció során a baktériumok egyéni érzékenysége is számít, mert bizonyos mikrobák zárt technológia mellett is inaktiválódhatnak, s így szabadabban lehet kezelni őket. A gyártás során figyelni kell arra is, hogy pirogén mentes legyen a készítmény, vagyis ne tartalmazzon lázkeltő anyagokat. Ezek a pirogének általában hőálló endotoxinok és a sterilezés során mennyiségük növekszik, mivel a szétesett mikrobákból kiáramlanak. Nehéz elkülöníteni őket, mivel molekulatömegük a számunkra hasznos fehérjék közelében van, így a fehérje méret szerinti elválasztási technikák nem jöhetnek szóba, általában adszorpciós technikát használnak. Ha már készen áll a baktérium tömeg, következik az inaktiválás, amit leggyakrabban etilénimines kezeléssel érnek el. Az etilénimin erősen bomlékony és mérgező anyag, általában a felhasználás előtt közvetlenül állítják elő. A koncentrációja max. 0,8% lehet, mert különben polimerizációs reakciók lépnek előtérbe. Vírusok elleni vakcinák előállítási technológiája: Fermentációval nem szaporíthatók, mivel abszolút paraziták, szükségük van a gazdaszervezet funkcióira és anyagaira. Szaporításukhoz tehát élő és specifikus sejtek kellenek, de sajnos például majmokra nem igazán lehet ipari eljárást alapozni. A szíriai aranyhörcsög e célre való felhasználására folynak a kísérletek, de eddig nem sok sikerrel. Alkalmazhatóak még a specializálatlan sejtek is vírus szaporításra. Ilyen sejteket az embriókban találhatunk. Ipari szempontból a leginkább elérhető embrió forrás a csirkeembrió, vagyis a tojás. A tojás további előnye, hogy kis egység lévén befertőződése esetén kisebb lesz a kár, továbbá nincs benne immunválasz. Gyógyszeripari célra csak a csíramentes tojás használható fel, így egy speciális tojó állomány segítségével állítják elő. Ezek a tyúkok születésüktől kezdve steril körülmények között élnek, védőoltást sem kapnak, hogy az

3 immunrendszerük minél intaktabb legyen. Az ilyen tyúkokat SPF állománynak nevezik és az általuk előállított tojás az SPF tojás. Egy ilyen tojás ára meglehetősen drága, 1998-ban kb 250Ft-ba került darabja. Az SPF tojást keltetik 6-8 napig, majd steril körülmények között fogászati fúróhoz hasonló eszközökkel kilyukasztják és belefecskendezik a vírust, amit kb. 2-3 napig szaporítanak, majd kiszívják a vírus tartalmú folyadékot a tojásból. Ez a módszer sajnos eléggé körülményes és sok kézimunkát igényel, így az ipari termelés szempontjából kedvezőbb a következő módszer. A másik módszer a szövettenyészetekben történő vírus tenyésztés. Ebben az esetben először a sejteket kell elszaporítani, utána következhet a vírussal történő fertőzés. A sejtek jó szaporíthatóságának általában két akadálya van, az egyik az, hogy a sejtek többségének szükségük van arra, hogy felülethez kötődjenek, különben nem képesek szaporodni (ezek az anchorage-dependent sejtek), továbbá a legtöbb sejtnél létezik az ún. kontakt gátlás, ami azt jelenti, hogy csak egy rétegű sejthalmazt tud létrehozni (monolayert) majd abbahagyja a szaporodást. Ezek a negatívumok bizonyos sejtvonalak alkalmazásával kiküszöbölhetőek. A vírus vakcina termelésére jelenleg három féle eljárás létezik: hagyományos (felületi) technológia, ekkor a vírus számára szükséges sejteket felületen szaporítják. microcarrieres technológia, ennek során kis apró szemcsés hordozókhoz kötik a sejteket szuszpenziós technológia, ekkor olyan sejtvonalakat használnak, melyek képesek szuszpenzióban is szaporodni A következőkben ismertetésre kerülnek a szövettenyésztéshez használt eszközök a laboratóriumitól az üzemi léptékig. Hagyományos (felületi) technológia Laboratóriumi léptékű a Roux-palack, a palackban van egy kis réteg tápoldat, csak az alsó felületen nő a szövet, így a sejtek a tenyésztő edény szilárd alján rögzülnek. Szintén nem ipari léptékű a Rolling bottles, vagy más néven forgó palackok. Ebben az esetben teljesen hengeres palackokat alkalmaznak, amelyek lassan forognak, így az egész hengerpaláston végigkenődik a tápanyag ezáltal a teljes felületen szaporíthatóvá válik a szövet.

4 Microcarrieres technológia Kis szemcséket alkalmaznak speciális anyagból (pl. dextrángélből), méretük pár µm, melyek nagy mennyiségben nagy felületet jelentenek a tápoldatban. Egy ilyen apró kis szemcse felületén pár száz sejt képes megtelepedni. Az oltásnál vigyázni kell arra, hogy minden egyes microcarrierre jusson sejt, különben üres marad a microcarrier, mivel csak akkor tud a sejt elszaporodni rajta, ha már egy a felületén megtelepedett. Az oltást ezért statisztikai számítások segítségével tervezik meg. A microcarriereket töltött oszlopban nem nagyon lehet alkalmazni, mivel nem jó a tápanyag ellátás és a nyíró erők is gondot okozhatnak leszakítva a sejteket a felületről. Így inkább megfelel nekik egy olyan tartály, ahol lassú, örvénymentes kevertetés történik. Ezt legjobban az ún. bim-bam keverővel lehet elérni, ami kíméletesen keveri a tenyészetet. A bim-bam keverőelemének végén található egy mágnes. A tartály alá egy forgó mágnest tesznek, ami ahogy körbeforog, folyamatosan mozgatja körbe-körbe a keverőt. A levegőbuborékok leszedhetik a sejteket a microcarrierekről, emiatt fejtér levegőcserével oldják meg a levegőztetést (a levegőztető cső vége nem lóghat a folyadékba).

5 A monolayer leszedését a hordozóról leginkább enzimes kezeléssel érhetjük el. Ez leggyakrabban tripszinezést jelent. Fontos, hogy a megfelelő enzim mennyiséget alkalmazzák, mert ha túl keveset használnak, akkor sok sejt rajta marad a hordozón, ha túl sokat, akkor a sejt is elpusztul. Vannak olyan dextrán gélek is, melyek felülete kollagénnel van bevonva. Ez azért jó, mert ekkor tripszin helyett lehet kollagenázzal bontani, ami sokkal szelektívebb enzim, így kevesebb kárt tesz a sejtekben. Másik módszer a leszedésre az, ha rábírjuk a sejtet arra, hogy gömb alakban növekedjen a hordozón, mert ekkor enyhébb fizikai hatásokkal is leválasztható onnan. A microcarrieres technika literes térfogatig működtethető jól. Szuszpenziós technológia Nagyobb léptékeknél az előbbi két technológia nem alkalmazható. Itt a szuszpenziós technológia a megfelelő, mivel ennél nagyobb sejtkoncentráció és produktivitás érhető el. Ehhez szükség van olyan sejtekre, melyek nem igénylik a felülethez kötődést szaporodásuk során. Több ilyen sejtvonalat is kifejlesztettek, többek között a BHK (baby hamster kidney), PK (pig kidney), HELA (tumorsejt, nevét arról a nőről kapta, akiből izolálták Helene L.) sejteket. A szuszpenziós tenyészeteknek is szüksége van kíméletes kevertetésre és fejtér levegőztetésre. A két leggyakoribb keverő elemet az alábbi ábrán láthatjuk. A spirális keverő a kis nyíróhatás érdekében percenként 5-10 fordulatot végez. A rezgőnyelves keverő vagy más néven vibrokeverő 1-2 mm-es amplitudóval rezeg.

6 A szövettenyészetek tápoldatai A sejtek tápfolyadéka igen bonyolult és összetett, mivel annak hasonlítania kell a vérre, pontosabban az intersticiumra, vagyis arra a folyadékra, ami a sejteket az eredeti környezetükben körülveszi. Ha ez az intersticium-modell nem megfelelő, akkor a sejtek könnyen elpusztulhatnak. Mindenek előtt az ozmotikus nyomásnak és a ph-nak kell ugyanolyannak lennie, de szükséges jó pár anyag jelenléte is a megfelelő koncentrációban. A kismolekulájú anyagok mellett a tápoldatnak a vérfehérjéket is tartalmaznia kellene. Erre a célra általában borjú vérsavót használnak. Azért borjúét, mert az még nem esett át annyi fertőzésen és védőoltáson, mint egy felnőtt tehén. A borjú vérsavó kb. 10%-át teszi ki a teljes tápoldatnak és nagy tisztaságban kell alkalmazni. Mindez nagyon megdrágítja az egész technológiát. Sokszor a vérsavó ára miatt nem tudják megfelelően támogatni anyagilag a vakcina gyártással kapcsolatos nagyobb léptékű kísérleteket. A tápoldatokat általában szűréssel sterilezik, mert a hővel történő sterilezés káros a hőre bomló komplex molekulák számára. Példa egy tápoldat összetételére: Vegyület neve Mennyiség (g/l) Vegyület neve Mennyiség (g/l) glükóz 1,0 fötál v. borjúsavó teljes menny. 10%-a KCl 0,4 L-Pro 0,0115 KH 2 PO 4 0,06 L-Ser 0,0105 CaCl 2 x 2H 2 O 0,185 L-Thr 0,048 MgSO 4 x 7H 2 O 0,2 L-Try 0,01 NaCl 8,0 L-Tyr 0,0363 NaHCO 3 0,5 L-Val 0,0468 NaHPO 4 x 2H 2 O 0,6 L-Gly 0,0075 Fenolvörös-Na só 0,017 L-Hys x HCL x H 2 O 0,42 L-Ala 0,0089 L-Ile 0,0526 L-Ala x HCl 0,126 L-Leu 0,0524

7 L-Asp x H 2 O 0,015 Pantoténsav-Ca 0,001 L-Asp ac 0,0133 Folsav 0,001 L-Cys 0,024 Cholin-Cl 0,001 L-Glu ac 0,0146 m-inozitol 0,002 L-Glu 0,3 Nikotinamid 0,001 L-Lys x HCl 0,0731 Piridoxal x HCl 0,001 L-Met 0,015 Riboflavin 0,0001 L-Phe 0,032 Tiamin x HCl 0,001 Az eddigiekben megismerkedtünk az állati sejtek szaporításával, a következőkben nyomon követjük a technológia további lépéseit. A sejtek elszaporítása után következik a vírus szaporítás. A sejteket megfertőzik vírusokkal, melyeket előzőleg járványok során izoláltak és folyékony nitrogénben tároltak. A vírusokat órán keresztül hagyják szaporodni, majd a sejttörmeléktől elválasztják centrifugálással. Általában szupercentrifugát alkalmaznak erre a célra, a sejttörmelék kirakódik a cső palástjára, a felülúszó pedig valójában egy vírus szuszpenzió lesz, melyet lehet töményíteni különböző eljárásokkal, de általában nem szokták. A kész vírus tenyészetet az eddig már említett módszerek valamelyikével inaktiválják. Az inaktiváció után a rákkeltő etilénimint el kell távolítani, melyet tioszulfát hozzáadással oldanak meg. Az oldatot a sárga szín (kén keletkezik) eltűnéséig titrálják. Az inaktiválás után ellenőrizni kell, hogy tényleg megtörtént-e az inaktiváció, ezért a sarzsot + 4 Con tárolják addig, amíg a belőle vett mintákból biológiai tesztekkel ellenőrzik a vírus aktivitást (általában 2 napig tart). Ha nem fertőző, akkor következhet a formulázás, ami általában higítást jelent, mivel az előállított vírustenyészet titere a vakcináláshoz túl magas. Az utolsó művelet pedig az adjuválás, amely elnevezés a latin adjuvare, elősegíteni szóból származik, mivel a művelet elősegíti az antigén tulajdonságot. A vakcinát steril paraffinolajjal keverik, nagy nyomással keresztül nyomják egy homogenizátoron és ezáltal finom emulziót hoznak létre. Ennek hatására gyors, hosszú ideig tartó immunválaszt képes produkálni az antigén, továbbá kevesebb vakcinát kell alkalmazni és tovább eltartható a készítmény. Az adjuválás pozitív hatásai valószínüleg abból adódnak, hogy az antigén az adjuvánshoz kötődik, ezáltal az immunrendszer számára felismerhetőbbé teszi az antigént, így fokozottabb választ (antitest termelést) indukál. Természetesen a vírus vakcinák gyártásakor is, hasonlóan a bakteriális vakcinákhoz, be kell tartani a szükséges biztonsági előírásokat. Eddig még nem említettük, de a vakcina gyártás egyik fontos alapkövetelménye, hogy nagyon tiszta vizet használjanak fel. Fontos, hogy se szerves szennyező, se pirogén ne legyen benne, a vezetőképességét általában 1-2 µs alá csökkentik. A vízelőkészítési technológia során felhasználnak desztillációs, ionmentesítő, reverz ozmózisos modult, továbbá aktív szenes szerves anyag mentesítő patront és ultraszűrőt is a pirogén mentesítésre. A teljes technológia blokkvázlata az alábbi ábrán látható:

8 A vírusvakcina elõállítási technológiája Vízelõkészítés Tápoldat Elõkészítés Fermentáció (Szövettenyésztés) Vírusszaporítás Adjuválás Higítás Vírus inaktiválás Centrifugálás Homogenizálás Kiszerelés Az oltással kapcsolatos egyéb tudnivalók és a vakcinák fajtái Az oltással megszerezhető védettség időtartama változó, ugyanis vannak olyan betegségek, amellyel szemben az oltások életre szóló védettséget adnak (pl. mumpsz, kanyaró), más betegségek esetén rendszeresen ismétlődő oltási program szükséges akkor, ha életre szóló védettséget akarunk elérni (pl. a TBC esetén 5-10 évre szól a védettség). Egyénenként is változó az oltás hatása, előfordulhat az is, hogy valakinél nem ered meg az oltás, vagyis hatására nem alakul ki immunválasz, így védettség se. (Ezt ellenőrzik a tuberkulin próbánál, ha a tuberkulin tapasz alatt bőrpírt tapasztalnak, akkor az oltás megeredt, ha nem, akkor újra oltják a pácienst.) A védőoltások között vannak általános megelőző jellegűek, melyeket életkorhoz kötötten, kötelező jelleggel egy adott országban mindenki megkap, hazánkban ilyenek: BCG, tuberkolózis ellen, minden csecsemő megkapja három napos korától hat hetes koráig. DPT (DiPerTe), diftéria (torokgyík), pertusszisz (szamárköhögés), tetanusz (merevgörcs) ellen, három részletben adják négy, harminchat hónapos és hat éves korban. SABIN cseppek (OPV: orális poliovakcina) SALK vakcina (IPV: inaktivált poliovakcina), gyermekbénulás ellen jók, a Sabin cseppet szájon át adják (innen a neve is). Három hónaposnál idősebb csecsemők kapják, három alkalommal, hat hetes időközönként, majd három éves korig évente megismétlik. MMR mumpsz, morbilli (kanyaró), rubeola (rózsahimlő) ellen jó, 1992 óta kötelező jelleggel 15 hónapos korban minden újszülött megkapja. Az oltások egy másik csoportját csak közvetlen fertőzési veszély esetén adják, bizonyos esetekben kötelező jelleggel. Kötelező pl. a hastífuszos beteg vagy krónikus hordozó környezetében élőket elölt vagy attenuált Salmonella typhit tartalmazó vakcinával oltani, továbbá a kanyarós beteggel érintkezett 15 hónaposnál fiatalabb csecsemőt (aki még nem kapott MMR-t!) attenuált morbillivírussal immunizálni. Passzív védőoltásban kell részesíteni a hepatitis-a-vírus okozta májgyulladásos beteggel érintkezetteket (a HAV ellen még nincs aktív védőoltás). Tetanus ellen emlékeztető toxoidos oltásban kell részesíteni azokat, akik fertőzési veszélynek vannak kitéve (pl. földdel szennyezett sérülés esetén); viszont azoknak, akik tetanus alapimmunizálásban nem részesültek (hazánkban ilyenek az

9 1941 előtt születettek), antitoxint is kell adni (az aktív és passzív oltás együttes alkalmazását szimultán oltásnak nevezzük). Adható influenza-a vakcina időseknek és egészségügyi dolgozóknak, kullancs-encephalitis elleni aktív oltás erdészeknek, favágóknak illetve azoknak akik sokat kirándulnak. Az egészségügyi dolgozók kérhetik a Hepatitisz B elleni védőoltást. A Hepatitisz elleni oltás jelenleg minden orvostanhallgatónak kötelező. Léteznek még a külföldi utakkal kapcsolatos védőoltások, ilyenek pl. a kolera és a sárgaláz elleni aktív vakcinák, melyekkel a fertőzött területre utazókat oltják útjuk előtt. Az oltások során felléphetnek oltási reakciók, szövődmények, balesetek vagy szérumbetegségek is. Az oltási reakció enyhe betegségtüneteket (pl. láz, bőrpír) jelent, amelyek bizonyos aktív vakcináknál természetes velejárói az oltásnak és épp annak eredményességét jelzik. Az oltási szövődmény már kóros folyamat, amit az egyénnek az átlagosnál erősebb reakciókészsége vált ki. Az oltási baleset azt jelenti, hogy az oltóanyag rossz minősége következtében lép fel valamilyen kóros folyamat (pl. az attenuált törzsek reverziója vagy a toxin nem kielégítő inaktiválása); továbbá ide sorolandó az is, ha az orvos hibásan alkalmazza az oltást (pl. téves technika vagy rossz dózis). A szérumbetegség pedig fajidegen fehérjét tartalmazó passzív oltóanyagoktól jöhet létre: a tünetek az oltás helyén keletkező enyhe duzzanattól az anafilaxiás sokkig sokfélék lehetnek. Kiegészítés a microcarrieres technológia témaköréhez A sejttenyésztési technikák nélkülözhetetlenek az állatok sejtfelépítésének, funkcióinak és differenciálódásának tanulmányozása, illetve számos biológiailag fontos anyag (vakcinák, enzimek, hormonok, ellenanyagok, interferonok és nukleinsavak) szempontjából. A microcarrieres technika új utakat nyit meg ezek számára és először teszi lehetővé nagy sejthozam (akár több millió sejt milliliterenként) elérését hordozóhoz kötött sejtek tenyésztése esetén. Itt a tápközegbe lassú keveréssel szuszpendált sejtek monolayer nőnek kisméretű gömbök felületén. A nagy sejthozamon kívül más előnyökkel is rendelkezik ez a technika: hatalmas fajlagos felület (átlagosan 20 cm 2 /ml) érhető el vele; a tenyészet paraméterei kiválóan ellenőrzés alatt tarthatóak (ph, gáznyomások stb.); kisebb tápközegés laborfelszerelés-igény illetve kevesebb személyzet szükséges (egyben a költségek csökkentését is jelenti), mivel más tenyészetekhez képest egy ugyanakkora tartályban sokkal több sejt képződik; a tenyészet beszennyeződésének kisebb az esélye. A microcarrieres sejttenyésztés lépései:

10 A megfelelő microcarrier és a megfelelő tartály kiválasztása a szaporítandó sejt tulajdonságai és a tenyésztés célja szerint A microcarrierek hidratálása és sterilizálása Kisérlet Petri-csészében. A sejtek tapadáshoz szükséges idejének, a keverési sebességnek, a tápközeg összetételének meghatározása A kívánt sejttenyésztés kivitelezése megfelelő paraméterekkel Szükség esetén a körülmények optimalizálása A microcarrierek és a tartályok kiválasztása különböző táblázatok alapján történhet. Microcarriereknél gyakran használják a svéd Pharmacia Fine Chemicals cég által kifejlesztett Cytodex 1, 2 és 3 hordozókat, mivel ezek jól kielégítik a velük szemben támasztott követelményeket: felületi sajátságaik alapján a sejtek megfelelően tudnak osztódni, sűrűségük alapján jól szuszpendálhatóak a tápközegbe, jól vizsgálhatóak standard mikroszkópikus módszerekkel, nem toxikusak és rugalmasságuk révén ellenállóak a keverés következtében fellépő nyíróerőkkel szemben. A tartályok az előzőleg már leírtakon túl lehetnek különféle air-lift és fluid-lift rendszerek, perfúziós kamrák illetve más edények, csövek, tálkák. Üvegtartályok esetén lényeges a tartályok belső felületének szilikonozása, amely megóvja a sejteket az üveghez tapadástól. Érdemes a sejtek szállításához vagy tárolásához felhasznált egyéb üvegeszközöket is szilikonozni. A száraz microcarriereket Ca 2+ - és Mg 2+ -mentes PBS-ben duzzasztják, időnként gyenge keverés alkalmazása mellett. A hidratálás a hőmérséklet emelésével gyorsítható. Dekantálva szűrés után friss PBS-sel vagy 70%-os etanollal mossák, majd újabb adag PBS hozzáadása után autoklávban sterilezik. Bizonyos microcarrierek sterilezhetőek besugárzással is. A sejtek megtapadása többlépéses folyamat: a tapadási faktorok adszorpciója a tenyészet felületéhez, a sejtek és a felület közötti kapcsolat kialakulása, a sejtek megtapadása a felületen, a megtapadt sejtek szétterülése a felületen. A sejtek adhéziója előtt a tenyészet felszínének pozitív vagy negatív töltéssel kell rendelkeznie és hidrofilnek kell lennie. A gerinces állatok sejtjei egyenetlenül eloszlatott negatív felületi töltésűek és negatív és pozitív töltésű felületen is tenyészthetőek. A sejtek megtapadásához két faktor elengedhetetlenül szükséges: kétértékű kationok és glikoproteinek. Ezek hiányában csak nem specifikus adszorpció kivitelezése lehetséges. Glikoprotein vagy a tápközeg szérumban (coldinsoluble globulin-cig) vagy bizonyos sejtek által fibronektin formában kiválasztva található. Előnyös még szulfát-proteoglikánok szimultán használata, ami szintén a felület-sejt kölcsönhatást erősíti. A microcarrieres sejttenyészeteket gyakran kell keverni is. Mivel a sejtek megfelelő tapadásának elsődleges szerepe van a jó szaporítási hozam elérésében, sokszor érdemes egy keverés nélküli fázissal indítani a sejttenyésztést, hogy a sejtek megtapadásának összes szakasza teljesen végbemehessen. Egyes kutatók megfigyelései szerint a sejtek képesek a microcarrierek és a tenyészflaskák (vagy Petricsészék) felülete között "vándorolni". Ez azért jó, mert így a sejtek -a microcarrierek cseréje révénhosszú időn át tarthatóak exponenciális fázisban. A sejtek áthelyezését alacsony Ca 2+ -tartalmú tápközeg alkalmazásával segítették. Természetesen a sejtek mobilizálhatóságának lehetősége előnyös vírusszaporítás vagy például egy adott tenyészet scale-up-ja szempontjából is. Sajnos nem minden sejttípus képes erre. A hepatocitáknál például a tenyészetet több órán át hagyják állni keverés nélkül, mert a legcsekélyebb mértékű keverés is lerontaná a sikeres transzfer esélyét. Tapasztalati tény, hogy a mitózisban lévő sejtek csak gyengén kötődnek az adott felülethez, ezért mechanikai rázással eltávolíthatóak onnan. A microcarriereken növő, exponenciális fázisban levő sejteket valamilyen mitótikus inhibitorral (pl. Colcemid) kezelik és megfelelő keverési sebesség kiválasztásával a sejtek eltávolíthatóak és a tápközegben összegyűjthetőek. A microcarrirek nagy fajlagos felülete előnyös a szaporított sejtek szállításánál és tárolásánál. Akár milliliterenként 10 7 darab sejt szállítható illetve tárolható úgy, hogy még mindig a szubsztrát felületéhez tapad. Így elkerülhető a rengeteg monolayeres tartály fuvarozása. Másik előny, hogy

11 szállítás vagy a tárolás utáni felolvadás után a sejtek folytathatják működésüket és osztódásukat. A microcarrieres sejttenyésztés alapvetően három kategóriában alkalmazható: sejtek, vírusok vagy sejttermékek nagyhozamú termelésére, in vitro és hagyományos sejttenyésztési technikák tanulmányozására. Emlős-, madár-, hal -és rovarsejteket sikeresen lehet tenyészteni microcarrieres technikával. Néhány limfoid sejttípusnál problémák léphetnek fel, mivel ezek a sejtek csak gyengén tudnak az adott felülethez kötődni és erősebb keverés hatására elszakadhatnak attól. Hordozó-független sejtek ugyan más körülmények között is tenyészthetők, viszont a microcarrieres szaporítás révén nagyobb sejthozam érhető el, a sejtek szeparálása a folyadékfázistól egyszerűbb, a tenyészetek sokkal inkább homogének, illetve a sejtek hatékonyabban nőnek a hordozók felületén. A vakcina termelésnél ez az alacsonyabb költségekkel és a csökkentett szennyezéssel együtt nagyon lényeges szempont. Bizonyos kisérletek szerint például a Sindbis vírus produktivitása 50-szerese lehet a "roller bottle" szaporításban elértnek. Hasonló dolgot tapasztaltak polio vírus tenyésztésénél is. Kutyavese sejttenyészeten szintén jelentős eredményeket értek el veszettség elleni vakcina termelésénél. A száj- és körömfájás vírusának vakcináját sertésvese sejtek szaporításával termelték igen jó minőségben és hosszú eltarthatósági idővel. Ezek a vakcinák védelmet nyújtottak az állatoknak rendellenes reakció és az antigén koncentrálásának szükségessége nélkül. Az interferonok és humán ráksejtek, valamint transzformált egér fibroblasztokból származó plazminogén aktivátor sejtek tenyésztésénél is szép eredményeket értek el. Néhány microcarrieres technológiával sikeresen szaporított vírus: Irodalom: Polio Rous szarkóma Száj-és körömfájás Veszettség Herpesz Papova vírus Rubeola Simian vírus 40 Sindbis Influenza Polyoma Adenovírus Sendai Kanyaró Parvovírus Gali A., Kovács Á., Kovács T., Oroszvári B.: Aujeszky és Rabiphil vakcina előállítása állati szövettenyészeteken, Tervezési feladat, BME MGKT, Budapest, 1994 Jellinek Harry: Egészségügyi ABC Medicina Könyvkiadó, Budapest 1985 Nyeste László: Biotermék technológia, Szövettenyésztés jegyzetek Pécs Miklós: Gyógyszeripari biotechnológia előadás jegyzet Sveiczer Ákos: Egészségügyi mikrobiológia elektronikus jegyzet Microcarrier cell culture principles and methods, Pharmacia Fine Chemicals