A gerincvelı caudalis végének szerkezete (conus medullaris, filum terminale)

Átírás

1 A gerincvelı caudalis végének szerkezete (conus medullaris, filum terminale) Doktori értekezés Dr. Boros Csaba Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola Témavezetı: Dr. Réthelyi Miklós, egyetemi tanár, az orvostudomány doktora Hivatalos bírálók: Dr. Matesz Klára, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Mitsányi Attila, tudományos tanácsadó, az orvostudomány kandidátusa Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Vígh Béla egyetemi tanár, az orvostudomány doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kamondi Anita, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Czéh Gábor, tudományos tanácsadó, az orvostudomány doktora Budapest 2009

2 Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke Bevezetés (irodalmi háttér) Célkitőzések Módszerek Kísérleti állatok Fixálás és metszetkészítés Többes immunfluoreszcens jelölés - konfokális mikroszkópia Elektronmikroszkópos feldolgozás BDA neuronális pályajelölés Golgi Kopsch módszer Eredmények A szürkeállomány morfológiai transzformációja a gerincvelı caudalis részén A filum terminale szerkezete patkányban Makro-mikroszkópos viszonyok Neuronok, gliasejtek A filum terminale neuronjainak neurokémiai jellemzése Kolokalizációk, szoros kapcsolatok Quantitatív mérések eredményei Ultrastruktúra A filum terminale szerkezete macskában A filum terminale szerkezete majomban A filum terminale kapcsolatai (elızetes eredmények) Megbeszélés Neuronális átrendezıdés a gerincvelı caudalis szakaszán A filum terminale definíciója A filum terminale rendezett idegszövet A filum terminale rendezettsége állatfajonként változó volt A filum terminale chemoarchitecturája A filum terminale finomszerkezete A filum terminale kapcsolatai

3 5.8 Perspektíva Következtetések Összefoglalás Summary Irodalomjegyzék Saját közlemények jegyzéke Köszönetnyilvánítás

4 Rövidítések jegyzéke CGRP Calcitonin gene-related peptide (Kalcitonin gén-kapcsolt fehérje) ChAT Choline acetyltransferase (Kolin acetyltranszferáz) CM Conus medullaris Cy 5 Cyanin 5 FT Filum terminale GLYT2 Glycine transporter 2 (Glicin transzporter) GFAP Glial fibrillary acidic protein (Savanyú gliális fibrilláris fehérje) EM elektronmikroszkópos IB 4 Griffonia simplicifolia lectin NeuN Neuron-specific nuclear protein (Neuron-specifikus nukleáris fehérje) NK-1r Neurokinin 1 receptor NOS Nitric oxide synthase (Nitrogén-oxid szintetáz) RIP Receptor integrated protein (Receptorhoz kapcsolódó fehérje) PKCgamma Protein kinase C gamma (Protein kináz C gamma) SP Substance P (P anyag) VGLUT1 Vesicular glutamate transporter 1 (Vezikuláris glutamát transzporter 1) VGLUT2 Vesicular glutamate transporter 2 (Vezikuláris glutamát transzporter 2) VIP Vasointestinal Polypeptide (Vazointesztinális polipeptid) 3

5 1. Bevezetés (irodalmi háttér) A gerincvelı és a gerinccsatorna közti térbeli kapcsolat három formában fordul elı a gerincesek törzsében (Catala et al., 2000). Halakban, kétéltőekben a metamorphosis elıtt, valamint hüllıkben a gerincvelı kitölti a gerinccsatorna teljes hosszát. Madarakban a gerincvelı ugyan végig húzódik a gerinccsatorna teljes hosszában, de a farok végsı szakaszára (pygostyl) esı gerincvelı részhez sem motoros, sem érzı gyökerek nem kapcsolódnak. Az emlısökre jellemzı gerincvelı rövidebb, mint a gerinccsatorna. A gerincvelınek a gerinccsatorna caudalis részében található folytatását nevezik filum terminalénak. 1 A madarakhoz hasonlóan, a filum terminaléhoz nem kapcsolódik sem motoros, sem érzı gyökér, sem pedig gerincvelıi dúc. A gerincvelı fejlıdését részletezı leírások nem egységesek. Általánosan elfogadott, hogy a gerincvelı egy cranialis és egy caudalis telepbıl fejlıdik. A cranialis telep maga a velıcsı, míg a caudalis telep a farokbimbó (tail bud) mesenchymája. Eltérnek azonban a vélemények azon a ponton - ami részben a megfigyelt speciesek közötti különbségekbıl is származik - hogy hol a határ, illetve az átmenet a két telepbıl kialakuló gerincvelı szakasz között. Találunk olyan leírást, amely szerint már a lumbosacralis gerincvelı szakasz is a farokbimbó származéka (Schoenwolf, 1984), mások a határt a filum terminale (FT) cranialis végére teszik (Nievelstein és mtsai., 1993). A leírások többsége szerint a farokbimbóval párhuzamosan a dúcléc vagy egyáltalán nem differenciálódik, vagy megjelenik, de a dúcléc sejtjeibıl csak támasztósejtek és melanocyták fejlıdnek ki (Catala et al., 2000). Az általunk vizsgált mindhárom speciesben (patkány, macska, majom) a gerincvelı caudalisan hirtelen elvékonyodva végzıdik. Ezen utolsó szakasz a conus medullaris (CM), amelynek csúcsáról indul a kötegszerő, vékony filum terminale. A CM területén találjuk a coccygealis gerincvelıi szelvényeket, amelyek a coccygealis mellsı és hátsó gyökerekkel kapcsolódnak a perifériához. Szemben a conus medullarisszal, a filum terminalét mind a klasszikus, mind a modern leírások idegszövetmentes kötegnek tartják. Lenhossék (1922) szerint A végkúp (conus terminalis) vékony fonalban, a végfonalban, filum terminale, folytatódik. Ez már csak 1 Az értekezés folyamatos olvasása érdekében a gyakran elıforduló filum terminale és conus medullaris anatómiai kifejezések csak akkor szerepelnek rövidítve FT és CM, ha rag vagy jel nem kapcsolódik a kifejezéshez. 4

6 kötıszövetbıl, nevezetesen a gerincvelı burkainak folytatásából áll, idegszövet nincs benne. A gerincvelı a conus medullaris és az agyburkokból álló (meningealis) filum terminaléval ér véget - írta Altmann és Bayer (2001). A filum terminale a pia materbıl és neuroglia komponensekbıl áll; a gerincvelınek az embryonalis farokban megmaradt része, felnıttben semmi jelentısége nincs olvasható egy modern tankönyvben (Barr és Kiernan, 1993). Ugyanezt az álláspontot képviselik klinikai munkák szerzıi is (Yamada és mtsai., 2001; Selcuki és mtsai, 2003). Az idézett leírások nem tárgyalják, de nyilvánvalónak veszik, hogy a filum terminaléból nem indulnak ki a hátsó, illetve a mellsı gyökerekkel egyenértékő képletek. Emberben a FT intraduralis és extraduralis szakaszból áll, ezen utóbbival rögzül a farokcsont periosteumához (Pinto és mtsai, 2002). Adataik szerint a FT hossza 112,8 és 211,1 mm között változott (átlagos hossz: 156,4 mm). Leggyakrabban az L1 csigolyatest közepén kezdıdött FT intraduralisan, és az S2 csigolya felsı szélén indult az extraduralis szakasz. Hasonló mérési adatok ugyanabból a laboratóriumból: átlagos hosszúság: 155,4 mm; átlagos átmérı a FT kezdetén: 1,56 mm; a FT közepén az átlagos átmérı: 1,03 mm (Fontes és mtsai., 2006). A dura zsákon belül a FT a lumbalis, sacralis és coccygealis gyökerekkel együtt alkotja a cauda equinát. A klasszikus elképzelések szerint, a FT a gerinccsatorna és a gerincvelı közötti aránytalan hossznövekedés eredménye (Streeter, 1919; Pinto és mtsai, 2002). A 30 mmes emberi embryoban a gerincvelı kitölti a gerinccsatornát, caudalis végét a farki csigolyák mélységében találjuk, a rövid S1 gyökerek végén a gerincvelıi ganglion a S1 csigolya síkjában van. A 67 mm-es embryoban az aránytalan növekedés már jelentkezik, a gerincvelı caudalis vége az alsó sacralis csigolyák mögött található, és megjelenik a FT. Ezzel párhuzamosan a mutatóként használt S1 gyökér egyre hosszabb lesz, mivel az S1 gerincvelıi ganglion nem változtatta meg eredeti helyzetét. A canalis centralis kiszélesedve, ventriculus terminalisként végzıdik. Az aránytalan növekedés folytatódik, a 220 mm-es embryoban a gerincvelı a conus terminalisszal az L3 és L4 csigolya között ér véget, innen indul lefelé a farokcsigolyákig a megnyúlt, vékony FT (1. ábra). Hozzánk idıben közelebb álló leírásokból az derül ki, hogy emberben a gerincvelı a conus medullarisszal bezárólag a velıcsı caudalis részébıl differenciálódik. A 5

7 velıcsıvel együtt fejlıdı dúclécbıl származnak a gerincvelıi ganglionok. A FT viszont már a farokbimbóból származik (Nievelstein és mtsai., 1993) 1. ábra. A filum terminale kialakulásának sémás ábrája Streeter (1919) szerint.. Patkányokon, a conus medullarison végzett kísérleteink során észrevettük, hogy a CM-FT átmenetnél sem a canalis centralis, sem a fehérállomány nem szőnik meg, hanem folytatódik a filum terminaléban. Ez után az sem volt meglepı, hogy a szürkeállomány sem ér véget, hanem több lépésben átalakul, és egy része szintén folytatódik a filum terminaléban. Ezen megfigyelés adta az ötletet, hogy a FT neurohisztológiai szerkezetét módszeres vizsgálatokkal derítsük fel. I. táblázat: Az irodalmi adatok összefoglalása Kísérleti állat Neuronok Idegrostok Szinapszisok Glia sejtek Hivatkozás Béka degenerált González-Robles és + + neuronok Glusman (1979) Béka liquorkontakt Chesler és neuronok; Nicholson (1985) + + speciális, arcuate neuronok Béka neuronok elektrofiziológiai vizsgálatok) + Chvátal és mtsai 2001) Macska + +(?) + Miller (1968) Macska liquorkontakt Rascher és mtsai + + neuronok 1988) Humán fetus degenerált degenerált Gamble (1971) + neuronok idegrostok Humán degenerált degenerált Choi és mtsai + neuronok idegrostok (1992) 6

8 A FT szerkezetével foglalkozó, régebbi, egy kivételével neurohisztológiai kutatások eredményeinek összefoglalását az I. táblázatban találjuk meg. Nem meglepı, hogy glia sejteket mind a két állat speciesben, és az emberi anyagban is találtak a kutatók. Idegrostokat is ki lehetett mutatni a béka és macska filum terminaléban, az emberi filum terminaléban mindkét szerzı degenerált idegrostokat talált. Neuronok kimutathatók a béka filum terminaléban mind morfológiai, mind neurofiziológiai módszerekkel. Az ependyma sejtek közé ékelıdı liquorkontakt neuronokat találtak békában és macskában. A humán FT vizsgálatokat bemutató közleményekben degenerált neuronokról lehetett olvasni. Amennyire ritkán lehetett a FT mikroszkópos szerkezetét leíró, neurohisztológiai módszereket alkalmazó közleményt találni, annál több publikáció jelent meg a klinikai gyakorlatból. Vascularis malformatiok (Hurst és mtsai, 1999), velıcsı záródási zavarok (dysraphismus; Phuong és mtsai, 2002; Wagner és mtsai, 2002) és különösen a rövid FT által okozott komplex panaszok (rögzített gerincvelı = tethered spinal cord; Selcuki és Coskun, 1998; Yamada és mtsai, 2000) eredetének magyarázatára a filum terminaléhoz nyúlnak vissza a klinikusok. A tethered spinal cord syndrome klinikai tünetegyüttes, amelynek az alapja a feszülés által kiváltott neuronális mőködészavar. Klinikailag az alsó végtagon jelentkezı motoros és érzı zavarokból, inkontinenciából, és deformitások (scoliosis, fokozott lordosis) kialakulásából áll (Yamada és mtsai., 2001). A neuronális mőködészavar feltételezett okát a gerincvelı lumbo - sacralis szakaszában jelentkezı, megzavart oxidatív folyamatokban keresik. Különbözı tényezık (tumor, meningomyelocele), közöttük kitüntetett helyen a tethered cord syndrome húzzák a gerincvelı caudalis részét a gerinccsatorna vége felé. Az így kialakuló feszítettség az a mechanikai tényezı, amely a vérellátás megzavarásával a mitochondriumokban kialakuló oxidatív folyamatok zavarához vezet. 7

9 2. Célkitőzések A CM és a FT módszeres neurohisztológiai kutatásával az alábbi körülményeket kívántuk felderíteni: I. Hogyan alakul át a gerincvelı szürkeállományának szerkezete a CM-FT átmenetnél? Ismert, hogy a szürkeállomány a központi területbıl (central core) és ehhez kapcsolódó hátsó-, mellsı- és oldalsó szarvból áll (Réthelyi, 1976). A szürkeállomány transzformációja kapcsolatba hozható-e a fenti szerkezet részenkénti megszőnésével vagy átalakulásával? II. A klasszikus neurohisztológiai módszerek alkalmazása mellett a neuronok és glia sejtek neurokémiai jellemzésére használatos ellenanyagokkal kívántuk kideríteni laboratóriumi fehér patkányban a FT chemoarchitecturáját. III. A fénymikroszkópos vizsgálatok eredményei alapján vizsgáltuk a FT ultrastruktúráját laboratóriumi fehér patkányban, macskában és majomban. IV. A FT és caudalis gerincvelı között neuronális összeköttetések lehetıségét nyomkövetı (tracer) anyagok befecskendezésével kívántuk megismerni (elızetes eredmények). V. A morfológiai vizsgálatok eredményeinek az értékelésével kerestük a magyarázatot arra, hogy a neuronokban igen változatos FT hogyan kapcsolódik szerkezetében és funkcionálisan a központi idegrendszer egyéb területeihez és a perifériához. 8

10 3. Módszerek 3.1 Kísérleti állatok Az állatkísérleteket az Állatvédelmi Törvény, a Semmelweis Egyetem Állatkísérleti Bizottságának Állatvédelmi Szabályzata és az ÁNTSZ 1809/003/2004 számú engedélye alapján végeztük. A vizsgálatokat Sprague-Dawley (Charles River, Magyarország) mindkét nembeli felnıtt patkányokon ( g) végeztük. A standard körülmények között tartott állatok (ketrecenként négy) a szabványos tápot (CRLT AM, Charles River, Magyarország) és a vizet szabadon fogyaszthatták. A helységek állandó hımérséklete (21±1 o C) és 12 órás sötét/fény periodicitása (a világítás kezdete reggel 6:00 óra) biztosítva volt. Kísérleteink során különbözı nemő házimacskák (3 állat) caudalis gerincvelıi szakaszát is vizsgáltuk. Ezen állatok a patkányokhoz hasonló módon, az elıírt körülmények között voltak tartva. Morfológiai összehasonlítás céljából, munkánk során 1 hím, felnıtt Rhesus majom (Macaca mulatta, Dr. Karmos György ajándéka) caudalis gerincvelıi szakaszát vizsgáltuk elektronmikroszkópos módszerrel. 3.2 Fixálás és metszetkészítés A kísérleti állatokat (fehér patkányokat és házimacskákat) mély narkózisban, ketamine (Calypsol) és xylazine (Primazine) 1:2 arányú kombinációját alkalmazva transzkardiális perfúzióval fixáltuk. A fixáló oldat összetétele a további vizsgálatok követelményeitıl függött. A rögzített gerincvelıt kivettük a felnyitott gerinccsatornából, a vizsgálandó szakaszokat (CM és/vagy FT) 5 mm hosszúsága szakaszokra vágtuk szét. A µm vastagságú transzverzális metszetek Vibratómmal készültek. A gerincvelı hosszában történı szerkezeti változások megfigyelése érdekében a metszeteket ötös csoportokban szedtük fel és tároltuk. Indokolt esetben hosszmetszetek is készültek a filum terminaléról. A metszetek egy részét 1%-os toluidinkék oldattal festettük meg. A metszetek másik csoportján egy vagy több immunszérum alkalmazásával a neuronok 9

11 kémiai tulajdonságait tanulmányoztuk. A metszetek harmadik csoportját elektronmikroszkópos vizsgálatok céljára dolgoztuk fel. A hímnemő Rhesus majom gerincvelıjének feldolgozását (5 kg) elızetes 4%-os formaldehyddel történı fixálás után kezdtük el. Elsıként laminectomiát végeztünk, majd a caudalis gerincvelıt 4%-os formaldehyd és 1%-os glutáraldehyd keverékében utófixáltuk. Az érintett gerincvelı szakaszt 5 kisebb részre vágtuk és a standard elektronmikroszkópos víztelenítést és beágyazást végeztük el. A beágyazott anyagból 0,5 µm vastag félvékony metszetek készültek, melyeket 1%-os toluidinkék oldattal festettünk meg. A kijelölt területekbıl ultravékony metszetek készültek. 3.3 Többes immunfluoreszcens jelölés - konfokális mikroszkópia Immunhisztokémiai vizsgálatokhoz a patkányokat és macskákat 4%-os frissen elkészített, ph 7, 4-re pufferolt formaldehyd oldattal perfundáltuk. A szövetmintákat elıször 0,1 M foszfát pufferben mostuk, majd 10%-os agarba (Sigma) ágyaztuk. Az agarba ágyazott szöveteket 50 µm vastag transzverzális és longitudinális Vibratóm metszeteket készítettünk. Pufferes mosás után antigén feltárást végeztünk 50%-os alkoholban. Az alkohol kimosása után a nem specifikus kötıhelyeket 3%-os normál ló szérummal (Vector) blokkoltuk 30 percig. A metszeteket 2 napig inkubáltuk a különbözı primer antitest koktélokban, +4 o C-on. Az antitestek felsorolása a II. táblázatban olvasható. Az elsı inkubálást követıen többször váltott 0,1 M foszfát pufferben mostuk a metszeteket. A második inkubálást a megfelelıen összeállított, fluorofórral jelölt másodlagos antitest koktélban végeztük el, +4 o C-on, 1 éjszakán keresztül. Alkalmazott fluorofórral jelzett szekunder ellenanyagok: szamárban termelt nyúl-ellenes antitest (1: 500, Alexa 488), egér-ellenes antitest (1: 500, Alexa 594), kecske-ellenes antitest (1: 200, Cy5), mindegyik Molecular Probes termék. Alapos pufferes mosás után zsírtalanított tárgylemezre húztuk fel, majd Vectashielddel (Vector) fedtük le a metszeteket. A metszeteket fénytıl védve, -20 o C-on tároltuk. Az immunhisztokémiai reakciók elemzését Bio-Rad Radience 2100 Rainbow konfokális mikroszkóp segítségével végeztük el. Az ábráknál feltüntettük, ha az ábra több, mint egy optikai metszetbıl származó kép összessége. 10

12 II. táblázat: Primer antitestek hígítása és eredete Antitest Állatfaj Felhasznált koncentráció Calcitonin gene-related peptide (CGRP) Gyártó Kecske 1: 1000 Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Calretinin Nyúl 1: 2000 Millipore (Chemicon), Budapest Cholin acetyltransferase (ChAT) Kecske 1: 100 Millipore (Chemicon), Budapest Enkephalin Egér 1: 1000 Millipore (Chemicon), Budapest Glial fibrillary acidic protein (GFAP) Glycin transporter 2 (GLYT2) Neurokinin 1 receptor (NK- 1r) Neuron-specific nuclear protein (NeuN) Nyúl 1: 5000 Sigma-Aldrich, St. Luise, Mo. USA Bárány 1: 2000 Millipore (Chemicon), Budapest Nyúl 1: 2000 Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Egér 1: 1000 Millipore (Chemicon), Budapest Nitric oxide synthase (NOS) Kecske 1: 2000 Dr. Emson ajándéka Oligodendrocita (NS-1 RIP) Egér 1: Millipore (Chemicon), Budapest Protein kinase C (PKC) gamma Nyúl 1: 1000 Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Serotonin Nyúl 1: 5000 DiaSorin, Stillwater, MN, USA Substance P Patkány 1: 200 AbD Serotec (Oxford Biotechnology Ltd.) Synaptophysin Egér 1: Novocastra (Biomarker Ltd), Budapest Vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1) Vesicular glutamate transporter 2 (VGLUT2) Tengerimalac Tengerimalac 1: 1000 Millipore (Chemicon), Budapest 1: Millipore (Chemicon), Budapest A neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunreakcióval jelzett neuronális sejtmagokat ábrázoló metszeteken quantitatív becslést végeztünk. A µm vastag metszetekbıl egymástól 4 µm távolságra optikai metszeteket készítettünk. Az optikai metszetekbıl készített felvételeken megszámoltuk, hogy a neuronok, amelyeket a sejtmagjuk képviselt, hány optikai szinten voltak követhetık. Több sorozat átvizsgálása után azt találtuk, hogy a neuronok 10%-a két optikai metszeten, 53%-a legalább három optikai metszeten, 26%-uk legalább négy optikai metszeten, és 11%-uk legalább öt optikai metszeten volt követhetı. A FT cranialis szakaszán NeuN pozitív neuront lehetett megszámolni, a fenti arányokat figyelembe véve 8 olyan neuron került metszésre, amely csak két metszetben, 39 olyan, amely három metszetben, 20 neuron, 11

13 amely négy metszetben és 8 neuron, amely öt metszetben szerepel. Ha a neuronok számát elosztjuk az elıfordulási gyakoriságukkal (vagyis a sejtmagok hosszméretével), akkor elfogadható közelítéssel kapjuk meg a 4 µm vastag optikai metszetben lévı neuronok számát, ami a fenti példában 8/2+39/3+20/4+8/5 = = Elektronmikroszkópos feldolgozás Elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz az állatokat intrakardiális perfúzióval fixáltuk, olyan aldehyd fixálóval, mely 2,5% formaldehydet és 1,5% glutáraldehydet tartalmazott (ph 7,4). Pufferes (0,1 M foszfát puffer) mosás után 1%-os ozmiumtetroxidban (Sigma) utófixáltuk a szövetblokkokat, 1 órán keresztül. Ezután felszálló alkoholsorban, majd propilén-oxidban (Sigma) víztelenítettük és felszálló Durcupan (Fluka) koncentrációban infiltráltuk a mintákat. A kis szövetdarabokat lapos beágyazó formába helyeztük, majd tiszta Durcupanba ágyaztuk. A blokkokat úgy orientáltuk a beágyazó formában, hogy azokból transzverzális metszeteket lehessen készíteni. A caudalis gerincvelı rostrendszerének vizsgálata céljából longitudinális irányultságú metszeteket is készítettünk. Ezután a beágyazott anyagot 56 C-os termosztátba helyeztük, ahol 48 órán keresztül polimerizálódott. Az elektronmikroszkópos analízishez Reichert ultramikrotómmal készítettünk metszeteket. Elıször 0,5 µm vastag félvékony metszetek készültek, melyeket tárgylemezen szárítottunk és 1%-os toluidinkék oldattal festettünk meg. A metszetekben kijelölt területekbıl ultravékony metszetek készültek. A metszetek kontrasztozása 5%-os uranilacetáttal (Merck) és Reynolds-féle ólomcitráttal történt. Az elektronmikroszkópos metszeteket JEOL elektronmikroszkópban vizsgáltuk. 3.5 BDA neuronális pályajelölés Mindkét nemhez tartozó, 5 felnıtt Sprague-Dawley patkány esetében biotinilált dexránamin (BDA-10000, Sigma) neuronális jelölést végeztünk. A BDA-t fiziológiás sóoldatban 10%-os koncentrációra hígítottuk. A pályajelölési procedúrát mély narkózisban, aszeptikus körülmények között végeztük el. A caudalis gerinccsatorna feltárása után a lumbosacralis gerincvelıi átmenetnél vékony kapilláris üveggel (átmérı: 0,3 µm) állatonként 5 µl BDA-t sikerült a gerincvelı állományába juttatni. A megfelelı szöveti rétegek egyesítése után minden mőtött állat külön ketrecbe került. Egy hetes túlélési idı után az állatokat mély altatásban, 4%-os formaldehyddel fixáltuk a fent 12

14 leírtak szerint. A vizsgált gerincvelı szakaszból 50 µm vastag Vibratóm metszetek készültek, melyeket 0,1 M foszfát-pufferben győjtöttünk. A metszeteket 2 órán keresztül inkubáltuk peroxidázzal jelölt avidin-biotin oldatban (Vectastain Elite, Vector). A specifikus jelölést diaminobenzidin (DAB) reakcióval tettük láthatóvá. A metszeteket tárgylemezre húztuk fel és felszálló alkoholsorban víztelenítettük majd DEPEX-xel (Fluka) lefedtük. A metszeteket LUCIA (Nikon) képanalizáló rendszer segítségével vizsgáltuk és fényképeztük. 3.6 Golgi Kopsch módszer Négy fiatal Sprague-Dawley patkányt (60 80g) transzkardiális perfúzióval fixáltuk 4%-os formaldehyd és 1%-os glutáraldehyd kombinációját tartalmazó 0,1 M foszfát pufferel (ph 7,4). A perfúzió körülményei megegyeztek a fent leírtakkal. Laminectomiát végeztünk, majd a gondosan preparált caudalis gerincvelıt en block (metszés nélkül) 3,6%-os káliumbikromát (Sigma) oldatba helyeztük, ahol a szövetet négy napon keresztül tartottuk. Ezután a mintát többször desztillált vízben, majd 0,75%- os ezüstnitrát (Sigma) oldatban öblítettük. Ugyanezen oldatban a szövetmintát 24 órán keresztül pácoltuk, fénytıl óvott helyen. A CT és FT területeirıl µm vastag transzverzális metszetek készítettünk Vibratómmal, majd a metszeteket zselatinnal bevont tárgylemezen rögzítettük. A preparátumok értékelését és fényképes analízisét LUCIA (Nikon) képanalizáló rendszer segítségével végeztük el. 13

15 4. Eredmények 4.1 A szürkeállomány morfológiai transzformációja a gerincvelı caudalis részén Ozmiumozott vastag és toluidinkékkel festett félvékony metszeteken végzett vizsgálataink azt mutatták, hogy a CM cranialis részének keresztmetszetén a gerincvelı szürkeállományának klasszikus elemei ismerhetık fel: a hátsó szarv, az intermedier zóna és az elülsı szarv. Megkülönböztethetık az áttetszı substantia gelatinosa (lamina II 2 ) és az alatta lévı tömöttebb laminák (lamina III és IV), melyek a hátsó szarv részét képezik. A canalis centralist az intermedier zóna szürkeállománya veszi körül. A keresztmetszeti képeken myelinhüvellyel borított rostok jelölik a hátsó szarv és az intermedier zóna határát. Az elülsı szarv nagy átmérıjő, alfa típusú motoneuronokat tartalmaz, amelyek kisebb-nagyobb csoportokat alkotnak. A motoneuronok között longitudinális irányban rendezett dendritek keresztmetszetei láthatók (2A ábra). Caudalis irányban haladva, a szürkeállomány morfológiai transzformációjának elsı lépése a motoneuronok perikaryonjainak eltőnésével jellemezhetı. Emellett a szürkeállomány területének jelentıs csökkenése figyelhetı meg a metszetekben. A motoneuronok keresztmetszetben látható dendritjei még felismerhetık az elülsı szarvban, melynek mérete jelentısen csökken. A hátsó szarvak elkülönülnek a canalis centralist körülvevı szürkeállománytól. A canalis centralis dorsalis végének magasságában a szürkeállomány kezd lefőzıdni. A hátsó szarv általános megjelenése nem változott (2B ábra). A CM végsı szakaszán a szürkeállomány a majdnem önállóvá vált hátsó szarvakból és a canalis centralist körülvevı intermedier zónából áll (2C ábra). A hátsó szarvban a myelinhüvellyel borított rostok kötegeinek térfogata és a substantia gelatinosa állománya is jelentısen csökken. Majd a mellsı szarvat követıen hátsó szarvak is teljesen eltőnnek. A gerincvelı ezen caudalis területe a FT (3. ábra). 3 2 A gerincvelı szürkeállományának a felosztásában, a konvencióknak megfelelıen, a Rexed (1954) által leírt réteges beosztást követtük. 3 Az értekezés 2. és 3. ábráit a Brain Research szerkesztısége a folyóirat 1028 (2) füzetének amely az eredeti közleményt tartalmazta (Réthelyi és mtsai, 2004) - a címlapjára tette. 14

16 2. ábra. Ozmimummal kezelt Vibratóm metszetek a CM cranialis (A), középsı (B) és caudalis részébıl (C). A szürkeállomány részei: hátsó szarv (Hsz), zona intermedia (ZI) és mellsı szarv (Msz). A cranialis metszetben a mellsı szarvban motoneuronok (nyilak) találhatók. A középsı metszetben a mellsı szarv nagyrészt eltőnt, a motoneuronok hosszanti lefutású dendritjeinek csoportja (nyilak) követhetı. A caudalis metszetben a mellsı szarv teljesen eltőnt, a canalis centralis (CC) két oldalán a zona intermediát találjuk. A hátsó szarvakat a fehérállomány rostkötegei (nyilak) egyre teljesebben elválasztják a zona intermediatól. Mérték: 100 µm 3. ábra. A FT keresztmetszete, toluidinkékkel festett félvékony metszeten. A résszerő canalis centralis (CC) mindkét oldalán kiterjedt szürkeállomány (SZÁ), a metszet perifériáján idegrostokat tartalmazó fehérállomány (FÁ) található. Mérték: 100 µm A conus medullarisban a hátsó szarv fokozatos átrendezıdését és eltőnését immunhisztokémiai módszerrel vizsgáltuk tovább. A mellsı szarvak eltőnését követıen a hátsó szarvak egyre inkább oldalfelé dılnek, dorsalis felszínüket csak vékony fehérállomány borítja. Az ozmiumozott félvékony metszeteken jól látszik az ozmiummal alig reagáló, felszínes áttetszı csík, majd ettıl ventromedialisan az ozmiummal reagáló sötétebb terület (4. ábra). Mivel az ozmium az idegrostokat körülvevı myelinhüvellyel lép reakcióba, az áttetszı felszínes csík megfelel a myelinhüvely-mentes substantia gelatinosának, a mélyebb terület a lamina III és IV réteg. A 4. ábrán látható keresztmetszetnek megfelelı szintben készített Vibratóm metszeten az elsıdleges érzı rostok három csoportjának hátsó szarvi végzıdését vizsgáltuk többes immunhisztokémiai reakcióval (Réthelyi és mtsai, 2008). A vékony érzı rostok egy csoportjára jellemzı calcitonin gene-related peptide (CGRP) jelölés a 15

17 hátsó szarv perifériás csíkjában, az áttetszı területnek megfelelıen jelentkezett, míg a vastag érzı rostok végzıdésére jellemzı vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1) jelölés a hátsó szarvnak a ventromedialis részét fedte be. Izolált CGRP jelölést találtunk a VGLUT1 által jelzett területen is (5A ábra). CGRP és IB4 jelölés együttes alkalmazásával kiderült, hogy az IB4 pozitív idegrostok is, amelyek a vékony érzı rostoknak egy másik csoportját jelentik, a hátsó szarv felszínes részében, annak inkább a ventralis csíkjában, a CGRP pozitív idegrostokkal részlegesen átfedve találhatók (5B ábra). Az érzı rostok három csoportjának - vékony rostok: CGRP és IB4, vastag rostok: VGLUT1 - a conus medullarisban látható végzıdési mintázata mindenben megegyezik a lumbalis szelvényekben látottakkal. 4. ábra. Ozmiummal kezelt Vibratóm metszet a CM középsı részébıl (az ábra azonos az 2B ábrával). A hátsó szarv felszínes csíkjaként az áttetszı substantia gelatinosát (SG) találjuk, mélyebben a myelinhüvelyes rostokat tartalmazó lamina III-IV helyezkedik el. Mérték: 100 µm 5. ábra. A 4. ábra síkjának megfelelı Vibratóm metszetek, hár-mas immunhisztokémiai jelölés. A: CGRP tartalmú rostok (piros) mezıszerően kitöltik a hátsó szarv felületes csíkját, és egyenként megjelennek a hátsó szarv mélyebb rétegeiben is (nyilak), amelyet szintén mezıszerően, a myelinhüvelyes ros-tokat jelölı VGLUT1 pozitivitás (zöld) tölt ki. B: A CGRP (piros) és az IB4 (zöld) jelölés a hátsó szarv felszínes csíkjában jelentıs átfedést mutat (sárga). Mérték: 100 µm A CM caudalisabb területén, a hátsó szarv szerkezet az ozmiumozott félvékony metszeten váratlan aszimmetriát mutatott. Az ábrán bal oldali hátsó szarvban eltőnt, míg a másik oldalon a hátsó szarv lateralis területére zsugorodott a felszínes áttetszı csík (substantia gelatinosa; 6. ábra). Hasonló keresztmetszeti szintben készített Vibratóm metszeten, az immunhisztokémiai eredményekben hasonló eltérés mutatkozott. Az egyik oldali hátsó szarvban nem kaptunk IB4 jelölıdést, míg az ellenoldalon az IB4 jelölıdés a hátsó szarv lateralis részére szorítkozott (7B ábra). Megváltozott a CGRP 16

18 jelölıdés elrendezıdése is. Ahol az IB4 jelölıdés kiesett, azon az oldalon a CGRP pozitív idegrostok a hátsó szarv felszínén, vékony csíkban maradtak meg. Ugyanilyen felszínes, vékony jelölıdést találtunk az ellenoldalon a hátsó szarv medialis felében, míg lateralisan, az IB4 jelölıdéssel együtt kiterjedt, részben átfedı CGRP jelölıdést találtunk (7A ábra). A VGLUT1 jelölıdés a baloldalon kiterjed az egész hátsó szarvra. Ellenoldalon a hátsó szarv medialis felében az immunjelölés eléri a hátsó szarv felszínét, lateralisan nem terjed ki arra a területre, ahol az IB4-CGRP jelölés található (7A ábra). 6. ábra. Ozmimummal kezelt Vibratóm metszet a CM caudalis részébıl (az ábra azonos az 2C ábrával). A hátsó szarvban bal oldalon eltünt a substantia gelatinosa, az ellenoldali hátsó szarvban is csak foltszerően, lateralisan található meg (*). Mérték: 100 µm 7. ábra. A 6. ábra síkjának megfelelı Vibratóm metszet, hármas immunhisztokémiai jelölés. A: CGRP tartalmú rostok (piros) mezıszerően csak a jobb oldalon, a hátsó szarv lateralis felében találhatók (*). Ellenoldalon és jobb oldalon medialisan a rostok a hátsó szarv felszínén alkotnak hálózatot, 1-1- CGRP pozitív idegrost a hátsó szarv mélyebb részeiben is látható (nyilak). A VGLUT1 pozitív idegrostok (zöld) mezıszerően kitöltik a hátsó szarvat. B: A CGRP (piros) és az IB4 (zöld) jelölés közti átfedés (sárga) jelentıs a jobb oldali hátsó szarv lateralis részén (*). A *- gal jelölt területek hasonlósága a 6. és 7. ábrákon meggyızı. Mérték: 100 µm A következı ábrasor ugyanezt a jelenséget ábrázolja a CM különbözı szintjeiben, egy másik állatban. Az IB4-CGRP átfedı immunjelölés aszimmetrikus a hátsó szarvban. Az IB4 jelölt elsıdleges érzı rostok teljesen, a CGRP jelölt elsıdleges érzı rostok túlnyomó többségükben eltőntek még mielıtt a hátsó szarv eltőnne a CM caudalis végén. A hátsó szarv mélyebb rétegeiben végzıdı vastag myelinhüvelyes rostok, amelyeket a VGLUT1 immunszérum jelöl, fokozatosan kitöltik a teljes hátsó szarvat. A CGRP jelölés megmarad a hátsó szarv felszínén, valamint izolált rostokként a hátsó szarv mélyebb részeiben is (8A, B és C ábra). 17

19 8. ábra. Vibratóm metszetek a CM cranialis (A), középsı (B) és caudalis szakaszáról (C), hármas immunjelölés. Cranialisan a CGRP jelölés (piros) mezıszerően kitölti a hátsó szarv felszínes csíkját (A), a két oldal között jelentıs aszimmetria látható. A mezıszerő CGRP jelölés az egyik oldali hátsó szarv lateralis oldalára zsugorodik a CM középsı szakaszán (B). Izolált CGRP pozitív idegrostokat (nyilak) találunk cranialisan a hátsó szarv mélyebb rétegében, a középsı és caudalis szakaszon a hátsó szarv felszínén, és mélyén (B és C). IB4 jelölés (zöld) mezıszerő és aszimmetrikus a cranialis metszeten (A), egy oldalra szorítkozik a középsı metszeten (B), és csak kis foltban látható a caudalis metszeten (C). A VGLUT1-gyel jelölt myelinhüvelyes rostok (kék) a hátsó szarv mélyebb rétegében láthatók cranialisan (A), majd az IB4 jelölés eltőnésével párhuzamosan egyre nagyobb területet foglalnak el a hátsó szarvból (B és C). Mérték: 100 µm 9. ábra. Vibratóm metszet a CM cranialis szakaszáról, kettıs immunjelölés (a 8A ábrán látható metszettel szomszédos metszet). NeuN immunreakció jelzi a neuronok peri-karyonjait (zöld). PKCgamma tartalmú neu-ronok a hátsó szarvban, aszimmetrikusan ta-lálhatók (piros). A két oldal közötti eltérés tükrözi a 8A ábrán az IB4 jelölésben látható eltérést. 18

20 A hátsó szarv területén NeuN jelöléssel a neuronok sejtmagjait, majd protein kinase C (PKC) gamma jelöléssel a hátsó szarvi neuronoknak azt a csoportját tettük láthatóvá, amelyek csíkszerően, nagyrészt a substantia gelatinosában helyezkednek el (Polgár és mtsai, 1999). A PKCgamma jelölés, az érzı rostokhoz hasonlóan, aszimmetrikus elrendezıdést mutat. A PKCgamma pozitív neuronok nagyrészt azon a területen találhatók, ahol az IB4 pozitivitást mutató érzı idegrostok, illetve hiányzanak azon a területen, ahol az IB4 immunjelölés már eltőnt (9. ábra). 4.2 A filum terminale szerkezete patkányban Makro-mikroszkópos viszonyok Patkányban a FT 2,4-2,8 cm hosszú. A CM-FT átmenetnél a FT szélessége 0,5-0,6 mm, amely distalis irányban, 5 mm-nyi távolságra 0,2-0,3 mm-re csökken. A FT mellett, vele sokszor kötıszövettel és erekkel összekapcsolva találjuk a coccygealis szelvényekbıl induló hátsó és mellsı gyökereket (10. ábra). Vizsgálataink a FT elsı, 1,0 cm hosszú szakaszára vonatkoznak. Laboratóriumi fehér patkányban a CM-FT átmenet nem mutat éles szögeltérést, az átmenet kívülrıl folyamatosnak tekinthetı. A két szakasz között, az 10. ábrán látható intenzitásbeli különbség nem volt minden esetben látható. Ezért volt fontos, hogy a CM-FT közötti határt a szürkeállomány szerkezetében is keressük. Az átmenet területén azt a metszeti síkot tekintettük filum terminalénak, amelyben a hátsó szarv már nem látszott. 10. ábra. FT lupe nagyítású képe. A CM elkeskenyedik, és a filum terminaléban folytatódik. Az átmenetet nyilak jelzik. A cauda equniához tartozó gyökérre, amely a filum terminaléhoz rögzült, nyílhegy mutat. Mérték: 1 mm A FT területén megfigyelhetı struktúrák: a canalis centralis, az ezt körülvevı keskeny szürkeállomány és a szintén keskeny fehérállomány. Caudalis irányban a FT to- 19

21 vább vékonyodik. Fokozatosan eltőnik a szürkeállomány, de a myelinhüvelyes rostok még hosszan követhetık (11. ábra). 11. ábra. Sorozat félvékony metszetek a filum terminaléból, toluidinkék festés. A FT cranialis részén (A és B) az ependyma sejtekkel bélelt canalis centralis (CC) függıleges helyzető, késıbb vízszintesbe fordul (C), majd lumene alig láthatóvá szőkül (D és E). A canalis centralis két oldalán lévı szürkeállomány a csatorna vízszintesbe fordulásával gyakorlatilag megszőnik (C), caudalisabban az ependyma sejtek, és néhány idegrost a periférián jelenti a filum terminalét. Az a. spinalis anterior átmetszete (*) hosszan követhetı. A nyíl a cauda equinához tartozó gyökér metszetére mutat (D). Mérték: 50 µm A FT rostralis szakaszán a canalis centralis a gerincvelı más szakaszaihoz hasonlóan sagittalis irányultságú. Lefelé haladva ebbıl a helyzetbıl haránt irányba fordul, és a vizsgált FT metszeteken végig követhetı (11. ábra). A FT rostralis részébıl készült félvékony metszetek közepén jól látható a keskeny lumenő canalis centralis, amely dorso-ventralis irányban µm hosszúságú Neuronok, gliasejtek Vizsgálataink kezdetén azt kellett bizonyítanunk, hogy a filum terminaléban neuronokból és gliasejtekbıl álló idegszövetet találtunk. A toluidinkékkel megfestett félvékony metszeteken azonosítani tudtuk a kismérető neuronokat. Próbálkoztunk a klasszikus Golgi módszerrel, de az elsı, másokat is meggyızı bizonyítékot az immunhisztokémia módszerének és a neuronok sejtmagját kimutató antitest NeuN alkalmazásával kaptuk. Az immunhisztokémia a neuronok azonosítása mellett lehetıséget adott a FT gliaszerkezetének a vizsgálatára is. Így együtt tudtuk vizsgálni az 20

22 idegszövet három alapvetı komponensének neuronok, astrocyták és oligodendrocyták kölcsönös elıfordulását a filum terminaléban. A neuronok kémiai sokféleségének a kimutatása a vizsgálatok második szakaszában történt. Toluidinkékkel megfestett félvékony metszeteken jól látszik a FT szerkezete (12. ábra). A sagittalis állású canalis centralis két oldalán nagyobb (nucleus lateralis; NL), a canalis centralistól dorsalisan kisebb szürkeállomány területet találunk (nucleus dorsalis; ND). A magokat a különbözı vastagságú, myelinhüvelyes rostokat tartalmazó fehérállomány veszi körül. A fehérállomány, mely µm vastagságú, ventralisan és két oldalról körülöleli a szürkeállományt, és FT legkülsı rétegét alkotja. A fehérállományt fıként myelinhüvelyes rostok építik fel. A FT mellett gyakran láthatók keskeny falú, de széles lumenő érképletek is. A szürkeállományban a kismérető idegsejtek perikaryonjai már a toluidinkékkel festett félvékony metszeten is egyértelmően felismerhetık. Keresztmetszeti képen a perikaryonok kerek vagy enyhén ovális alakúak, a kerek sejtmag homogén szerkezető, gyakran mutat behúzódást, a magvacska kerek, sötétre festıdik. Hosszmetszeten az ugyancsak kerek perikaryonok mellett gyakran találtunk elnyújtott perikaryonokat is, ugyancsak elnyújtott sejtmaggal (13. ábra). A perikaryonok mérete keresztmetszeti képeken 8-15 µm, az ovális perikaryonok hosszmérete elérheti a µm-t. 12. ábra. FT keresztmetszeti képe, félvékony metszet, toluidinkék festés. A canalis centralist az összefekvı ependyma sejtek (Ep) jelölik. A canalis centralis két oldalán lévı, összefüggı szürkeállományt neveztük nucleus lateralisnak (NL). A canalis centralis felett apró szürkeállomány szigetek láthatók, ezek összessége a nucleus dorsalis (ND). A fehérállomány U-alakban veszi körül a szürke-állományt. Dorsalisan, a nucleus dorsalis területén, hiányos. Mérték: 100 µm 21

23 13. ábra. FT nagy nagyítá-sú hosszmetszeti képe, fél-vékony metszet, toluidin-kék festés. A canalis cent-ralist az összefekvı epen-dyma sejtek (Ep) jelölik. A neuronok alakja helyenként kerek (nyíl), máshol a FT tengelyével megegyezı irányban elnyújtott (nyíl-hegy). A fehérállományban a myelinhüvelyes idegrostok (az ábra alsó részében) hosszmetszetben találhatók. Tág lumenő eret * jelzi. Mérték: 100 µm A klasszikus Golgi módszer segítségével alig sikerült többet bemutatnunk, minthogy a FT neuronjainak a perikaryonjai ovális alakúak és hogy nyúlványokkal rendelkeznek (14. ábra). 14. ábra. FT, Golgi- Kopsch impregnáció. Neuronok kis csoportja impregnálódott a nucleus lateralisban (*). Betét jobbra lenn: A csillaggal jelölt neuronok nagyobb nagyítással. A nyíl az orsó alakú perikaryonból induló nyúlványra (valószínőleg dendrit) mutat. A két másik impregnálódott perikaryon eltérı fókúszsíkban helyezkedik el. Mérték: 100 µm 22

24 A NeuN segítségével egyértelmően tudtuk bizonyítani, hogy a filum terminaléban apró neuronok gazdag hálózata található (15. ábra). A toluidinkékkel festett metszetekben találtakhoz hasonlóan a keresztmetszeti képeken a perikaryonok kerek vagy enyhén ovális formájúak voltak, míg hosszmetszeten feltőntek a FT hosszában orientált perikaryonok is (16. ábra). A neuronok gyakran kisebb csoportokban helyezkednek el. Ezeket a csoportokat három, négy vagy öt sejt alkotja, gyakran a canalis centralis közvetlen szomszédságában (15. ábra). Ritkaságként tudunk bemutatni hosszmetszeti képen egy, a késıbbi vizsgálati sorozatból származó, neurokinin 1 receptor (NK-1r) tartalmú neuront, amelyen nemcsak az látszik, hogy a perikaryon hosszában orientált, hanem az is, hogy a perikaryon mindkét végérıl hosszú, enyhén elágazódó dendritfa indul (17. ábra). 15. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. A neuronok sejtmagját NeuN ellenanyaggal jelöltük (piros), a GFAP jelölés (zöld) az astrocyták nyúlványait tünteti fel. Az ependyma sejtek nem jelölıdtek. A neuronok perikaryonjai kisebb csoportokban vagy elszórtan helyezkednek el a szürkeállományban. Gyakran találunk neuront az ependyma sejtek közvetlen közelében. CC = canalis centralis. Mérték: 100 µm 16. ábra. Kettıs immunjelölés a FT hosszmetszeti képén. A neuronok sejtmagját NeuN ellenanyaggal jelöltük (piros), a GFAP jelölés (zöld) az astrocyta nyúlványokat tünteti fel. Az ovális alakú sejtmagok utalnak a neuronok elnyújtott a- lakjára. Mérték: 100 µm 23

25 17. ábra. NK-1r pozitív neuron a FT hosszmetszeti képén. A neuron dendritjei a FT hosszában húzódnak. Mérték: 100 µm Immunhisztokémia vizsgálataink során a sejtek azonosításával együtt gliasejtek azonosítására alkalmas ellenanyagokat is használtunk. Nagyszámú glial fibrillary acidic protein (GFAP) pozitivitást mutató sejtet is találtunk mind a szürke-, mind a fehérállományban. A GFAP immunreaktív, tehát glia sejtek gazdagon elágazódó nyúlványrendszerrel rendelkeznek. A gerincvelı más szakaszaitól eltérıen, a glianyúlványok sugaras irányba rendezıdve haladnak a pia mater illetve a canalis centralis felé (15. ábra). Az astrocyták átlagosan 4-6 µm átlagosan átmérıjőek, keskeny cytoplazmájúak (18. ábra). Nyúlványaik radier irányban futnak keresztmetszeti képen, míg hosszanti lefutású nyúlványokat találtunk a longitudinalisan metszett preparátumokon, különösen az alsóbb FT szakaszokon (16. ábra). A FT állományában GFAP pozitivitást mutató astrocyták mellett receptor interacting protein (RIP) immunpozitivitást mutató oligodendrocytákat is tudtunk jelölni (19. ábra). A FT szürke-, és fehérállománya nem különíthetı el a GFAP rajzolat alapján, viszont a RIP pozitív oligodendrocyták jellemzı megoszlást mutatnak. A RIP jelölıdések nagyobb nagyításban átmérıjükben változatos kis, győrőszerő struktúrákként jelennek meg. A RIP jelölıdés gyenge a szürkeállományban és kifejezett a fehérállományban, különösen az általunk váll-régiónak megnevezett dorsalis fehérállomány csúcsoknál. Ezen területtıl dorsalisan a fehérállomány mintegy félholdszerően - a gerincvelıi szelvényektıl eltérıen nyitott. 24

26 18. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. A neuronok sejtmagját NeuN ellenanyaggal jelöltük (piros), a GFAP jelölés (zöld) az astrocyta nyúlványokat tünteti fel. A nyilak az astrocyták sejt testeire mutatnak. CC = canalis centralis. Részlet a 16. ábrából. Mérték: 10µm 19. ábra. RIP jelölt (zöld) oligodendrocyták a FT keresztmetszeti képén. Az immunrekció kirajzolja a fehérállományt. Különösen intenzív immunreakciót látni a fehérállomány dorsolateralis részén (csillag). Mérték: 100 µm A filum terminale neuronjainak neurokémiai jellemzése Mivel feltételeztük, hogy a filum terminaléban található nucleus lateralisok a gerincvelıi szürkeállomány intermedier zónájának folytatásaként tekinthetık, ezért az intermedier zóna neuronjainak azonosítására használt immunhisztokémiai markereket alkalmaztuk vizsgálataink során (Boros és mtsai, 2008). Hármas jelöléső fluoreszcens immunhisztokémiai reakciókban NeuN, nitric oxide synthase (NOS) és calretinin antitesteket használtunk. NOS immunpozitivitású neuront egyet, esetleg kettıt találtunk metszetenként. A NOS jelölés körbe vette a NeuN pozitív sejtmagot, esetenként a dendritekben is megjelent (20A ábra). NOS jelölt neuronális perikaryont gyakran figyeltünk meg canalis centralist bélelı ependyma sejtek közelében. A jelölt neuronok többnyire a nucleus lateralis ventromedialis részében helyezkedtek el, a nucleus dorsalisban nem találtunk NOS pozitív neuront. Keresztmetszetben a NOS pozitív neuronok átmérıje átlagosan 7,96 µm (max: 11,96 µm, min: 5,2 µm, n=25). A citoplazmatikus jelölésen kívül NOS pozitív, finom varikozitású axonok láthatók a FT szürkeállományában. 25

27 20. ábra Hármas immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. LN = nucleus lateralis, DL = nucleus dorsalis, CC = canalis centralis. A: NeuN (piros) és NOS (zöld) immunpozitív neuronok, a nyilak a NOS-pozitív neuron proximalis dendritszakaszaira mutatnak. Három optikai metszet. B: NeuN (piros) és, calretinin (zöld) immunpozitív neuronok, a nyíl a calretinin-pozitív neuron dendritjére mutat. Csillag jelzi a calretinin pozitív rostnyalábot a fehérállomány dorsolateralis területén. Négy optikai metszet. Mérték: 50 µm Calretininnel jelölt neuronokat szintén azonosítottunk a filum terminaléban, egyegy metszetben akár több calretinin pozitív neuront is találtunk. Elıfordult, hogy a jelölt neuronok dendritjeiben is látható volt az immunpozitivitás (20B ábra). Calretinin pozitív neuronokat figyeltünk meg az ependyma sejtek mellett is, valamint a fehérállományában vastag calretinin pozitív rostokat találtunk. Az immunpozitív rostok gyakran futnak szimmetrikusan a fehérállomány dorsalis régiójával. A calretinin pozitív neuronok átmérıje keresztmetszetben átlagosan 7,43 µm volt (max: 12,87 µm, min: 3,50 µm, n=42). Mérési adataink alapján megállapítottuk, hogy a calretinin pozitív neuronok száma a NOS pozititív neuronok számának kétszerese. A nucleus lateralis ventralis részében csoportosan, nagyobb számban helyezkednek el a calretinin pozitív neuronok, míg a dorsalis régióban az ependyma sejtek mellett láthatók. A nucleus dorsalis ventralis határán csak igen ritkán figyelhetık meg calretinin pozitív neuronok. A nucleus lateralisban azonosítottunk kerek, choline acetyltransferase (ChAT) immunreaktív neuronokat (21. ábra). Méréseink azt mutatják, hogy ezen neuronok átlagos átmérıje 7,0-9,0 µm. Kezdeti, rövid dendritek gyakran láthatók. ChAT im- 26

28 munreaktív, finom varikozitású arborizáció látható a szürkeállományban, mind a nucleus dorsalisban, mind a nucleus lateralisban. A filum terminaléban az NK-1r pozitív neuronok a legnagyobb neuronok közé tartoznak, melyek átmérıje keresztmetszetben µm. Az immunreakció típusosan körbejelöli a citoplazma és a dendritek extracelluláris membránjait (22. ábra). A canalis centralist körbevevı ependyma sejtek körül gazdag NK-1r pozitivitással rendelkezı dendritrendszer látható. Hosszanti metszetekben cranialis - caudalis irányultságú NK- 1r pozitív dendriteket találtunk. A szürkeállományban NK-1r pozitív, finom varikozitású axonok haladnak, melyek a fehérállomány váll-régiójában kötegeket alkotnak. A horizontális síkban készített metszeteken kicsi, kerek citoplazmával rendelkezı substance P (SP)-pozitív neuronokat találtunk, melyek gazdag dendritikus arborizációval rendelkeznek. A metszetekben SP-pozitív, finom varikozitású axonok láthatók (23A és B ábra). 21.ábra. FT keresztmetszeti képén ChATimmunjelölt (zöld) neuronok láthatók (nyilak). CC = canalis centralis. Öt optikai metszet. Mérték: 50 µm 22. ábra. FT keresztmetszeti képén a neuronok átlagához képest feltőnıen nagy mérető NK-1r immunjelölt neuron (piros), a neuron dendritjére nyíl mutat. A canalis centralist (CC) NK-1r pozitív neuronok dendritjei veszik körül. Varikózus, NK-1r immunpozitív axon nyaláb a vállrégióban (nyilak között). Tizenhét optikai metszet. Mérték: 50 µm 27

29 23. ábra Hármas immunjelölés a FT hosszmetszeti képén. A: NeuN jelölés az idegsejtek perikaryonjait tünteti fel (piros). Két neuron SP tartalmú (zöld; nyilak). A FT hosszában rendezett, NK-1r tartalmú (kék) vastag dendrit és vékony, varikozus axon (apró nyilak) láthatók. Tizennégy optikai metszet. Mérték: 50 µm B: Az A ábra felnagyított részlete. A SP-pozitív neuronok (zöld) perikaryonjaira nyilak mutatnak. Vékony, varikózus SP-pozitív axonok fogják körül az NK-1r festıdéső dendritet (kék). A SP jelölt axonoknál vastagabb NK-1r tartalmú axonra (kék) apró nyilak mutat-nak. Tizennégy optikai metszet. Mérték: 50 µm A filum terminaléban fellelt axonok arborizációjuk elhelyezkedése alapján négy csoportba sorolhatók: 1) kizárólag a nucleus dorsalisban arborizáló axonok, 2) elsısorban a nucleus latrealisban arborizáló axonok, 3) az egész szürkeállományban arborizáló axonok, 4) azon axonok, melyek fıként a váll-régióban arborizálnak. 1. Kizárólag a nucleus dorsalisban arborizáló axonok. A nucleus dorsalisban CGRP immunpozitív rostok haladnak longitudinális irányban. A gerincvelı hátsó szarvának felszínes lamináiban és a conus medullarisban CGRP és IB 4 immunreaktív primer afferens rostok dús arborizációját figyeltük meg (4A és B ábra). A filum terminaléban IB 4 pozitív rostokat már nem találtunk (24. ábra). 28

30 2. Elsısorban a nucleus lateralisban arborizáló axonok. Ahogyan már korábban ismertetésre került, NOS-, SP-, és NK-1r immunpozitív axon arborizációt figyeltünk meg a FT szürkeállományában, fıként a nucleus lateralisban. Sőrő, rendkívül finom vesicular glutamate transporter 2 (VGLUT2) pozitív rosthálózat van jelen a nucleus lateralisban, a szürkeállományban (25A ábra). A nucleus dorsalisban igen kis mértékő VGLUT2 pozitív arborizáció látható. VGLUT2 pozitív neuronokat nem azonosítottunk. 24. ábra. Kettıs jelölés a FT keresztmetszeti képén. CGRP immunpozitív (piros) rostok a nucleus dorsalisban, a VGLUT1 (zöld) immunpozitív rostok a szürkeállomány teljes területén láthatók. A nyilak a filum terminalével párhuzamosan elhelyezkedı hátsó gyökerekben lévı VGLUT1 pozitivitást adó idegrostokra mutatnak. Nyolc optikai metszet. Mérték: 50 µm A szinaptizáló axonterminálisok detektálására szinaptofizin immunreakciót használtunk. Sőrő, igen finom szinaptofizin pozitív varikozitás borítja a nucleus lateralist (25B ábra), míg a nucleus dorsalisban csak kis mértékben látható. A nucleus lateralisban finom glycin transporter 2 (GLYT2) axon arborizáció figyelhetı meg. 3. Az egész szürkeállományban arborizáló axonok. Cranio-caudalis irányban orientált VGLUT1 pozitív rostok és alkalmanként igen nagy mérető varikozitások vannak jelen mind a nucleus dorsalisban és lateralisban is (24. ábra). Ezenkívül az egész szürkeállományra ChAT pozitív axon arborizáció jellemzı (21. ábra). 4. Fıként a váll-régióban elágazódó axonok. A váll-régióban szerotonin pozitív rostok dús hálózata figyelhetı meg (26. és 28. ábra), míg a nucleus lateralisban elszórtan találunk jelölt rostokat. Enkephalin pozitív rostok szintén hálózatot alkotnak a váll-régióban (27. és 29. ábra), ezen rostok fıként a nucleus lateralisban ágazódnak el. Ezenkívül calretinin pozitív rostok alkotnak sőrő köteget a váll-régióban (20B ábra), 29

31 valamint a fehérállomány ezen régiójában hálózatot alkotó, varikózus, NK-1r pozitív axonok is láthatók ott (22. ábra). 25. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. A: VGLUT2 pozitív axonvégzıdések (piros) kirajzolják a nucleus lateralist (NL). B: Szinaptofizin-pozitív axonvégzıdések (zöld) ugyancsak a nucleus lateralisban halmozódnak. Betét balra fenn: Az axonvégzıdések jelentıs hányada mindkét antitesttel jelölhetı volt (sárga). CC = canalis centralis. Mérték: A és B 50 µm; betét: 10 µm 26. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. Szerotonin-pozitív axonvarikozitások (zöld) láthatók a vállrégióban (*). Dús szinaptofizin jelölt varikozitások (piros) figyelhetık meg a nucleus lateralisban (NL). CC = canalis centralis. Mérték: 50 µm 27. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. Enkephalin-pozitív axonvarikozitások (piros) haladnak a váll-régióban (*). ChAT immunreaktív rostok (zöld) figyelhetık meg a szürkeállomány területén. Nyilak mutatnak a filum terminalét kísérı mellsı gyökerekben lévı ChAT-pozitív idegrostokra. CC = canalis centralis. Mérték: 50 µm 30

32 Kolokalizációk, szoros kapcsolatok A nucleus lateralisban a szinaptofizin és a VGLUT2 immunpozitivitás szinte teljes kolokalizációt mutatott (25B ábra, betét). A váll-régióban a szerotonin pozitív varikozitás részben kolokalizált a ChAT pozitív jelöléssel (28. ábra). SP és enkephalin kettısen jelölt varikózus képleteket gyakran azonosítottunk a váll-régióban (29. ábra), és ritkábban a nucleus lateralisban. SP-vel jelölt varikózus struktúrák gyakran közvetlenül kapcsolódtak a NK-1r immunpozitív neuronok perikaryonjaihoz és dendritjeihez (30. ábra). Ezenkívül, GLYT2 immunpozitív, pontszerő képletek is kapcsolódtak a NK-1r immunpozitív neuronok perikaryonjaihoz (30. ábra, betét). 28. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. Szerotonin (piros) immunpozitiv rosthálózat kijelöli a váll-régiót. ChAT-pozitív rostrendszer (zöld) látható a nucleus dorsalisban (ND) és lateralisban (NL). Kettısen jelölt varikozitásokra nyilak mutatnak. Mérték: 50 µm 29. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. Az enkephalin (piros), és SP (zöld) immunpozitivitást mutató axonvarikozitások sőrőn kitöltik a váll-régiót (*). Számos varikozitás mindkét peptidet tartalmazza (sárga) Mérték: 10 µm 31

33 30. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. NK-1r jelölt perikaryonok és nyúlványrendszer láthatók (piros), SP tartalmú rosthálózattal (zöld). A nyilak az NK-1r jelölt perikaryonokhoz (P) és dendritekhez szorosan hozzáfekvı SP tartalmú varikozitásokra mutatnak. Három optikai metszet. Mérték: 10 µm. Betét jobbra lenn: A P1 jelzéső perikaryon felszínéhez GLYT2 immunjelölt axonvégzıdések kapcsolódnak (nyilak). Három optikai metszet. Mérték: 10 µm Quantitatív mérések eredményei A FT szürkeállományában a NeuN immunpozitivitással megjelölt neuronok három csoportban helyezkednek el. Az általunk nucleus dorsalisnak elnevezett terület a canalis centralis dorsalis peremén található, és fehérállomány hiányában ezen terület neuronjai elérik a gerincvelı felszínét. A canalis centralis két oldalán a nucleus lateralisok találhatók, melyekben a neuronok egy része a canalis centralist bélelı ependymasejtekkel közvetlenül érintkeznek. A dorsalis és lateralis magok között egy neuron-szegény, általunk váll-régiónak (shoulder region) nevezett terület található. A NeuN pozitív jelölést adó idegsejtek száma cranialisan a FT 1 µm-es vastagságú konfokális mikroszkópos keresztmetszeti képsorozatán db volt. Ugyanilyen szeletvastagságban a FT caudalis szakaszán már csak neuront számoltunk. A neuronalis perikaryonok mintegy 10%-a mindössze két, egymástól 4 µm távolságban lévı, optikai metszetben volt követhetı. A perikaryonok 53 %-a legalább három, 26%-uk legalább négy és 11%-uk legalább öt optikai metszetben volt követhetı. A Módszerek fejezetben leírt módon cranialisan a FT 5 mm hosszú szakaszában a neuronok számát közelítıleg nek becsültük. Distalisabb irányban haladva, hasonló szakaszra számolva, a neuronok száma re csökken. Az optikai analízis során azt találtuk, hogy a neuronoknak több mint a fele hosszanti irányban orientálódik. A FT tengelyével párhuzamos síkban metszett 32

34 preparátumokban látottak ( és 17. ábra) mindenben támogatták ezt a megfigyelést Ultrastruktúra A FT nucleus lateralisa elektronmikroszkópos szerkezetének áttekintı képét látjuk a 31. ábrán. Jobb oldalon az ependyma sejtek sorakoznak. Az ependyma rétegtıl lateralisan találjuk az apró idegsejtek perikaryonjait, majd az ábra bal széle már a myelinhüvelyes rostokból álló fehérállományt mutatja. (A további elektronmikroszkópos képek is a nucleus lateralisból valók.) 31. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Ependyma sejtek (Ep), neuronok perikaryonjai (N) és myelinhüvelyes idegrostok a fehérállományban. Gl = astrocyta. Mérték: 10 µm. Betét jobbra lenn: Ependyma sejtek (E) nagy nagyítású képe. Nyilak az ependyma sejteknek csillóira mutatnak, melyek kitöltik a canalis centralis lumenét. Mérték: 1 µm 33

35 32. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. A canalis centralist szegélyezı ependyma (Ep) sejtek között a lumen csak kis foltban látható (*). Neuronok perikaryonjai (N) a szürkeállományban, az ependyma sejtekkel érintkezve vagy nyúlványával az ependyma sejtek között (Nl = liquorkontakt neuron). Érátmetszet (Cap) látható a kép bal szélén a fehérállomány myelinhüvelyes idegrostjaitól körülfogva. Mérték: 20 µm Az ependyma sejtek sora között a canalis centralis lumene szők (32. ábra), a lument gyakran csak az ependyma sejtek szabad felszínérıl kiinduló csillók jelzik (31. ábra, betét). A fénymikroszkópos megfigyeléseket megerısítve, egy-egy neuron szorosan hozzáfekszik az ependyma sejtek basalis felszínéhez (32. ábra). Olyan neuront is találtunk, amelynek egy közepesen vastag nyúlványa két ependyma sejt között beért a canalis centralis lumenébe (liquorkontact neuron; 32. és 40. ábra). A FT 8-15 µm átmérıjő neuronjai keresztmetszeti képen, a fénymikroszkópos leírásoknak megfelelıen, kerek, vagy ahhoz közel álló átmetszeti képet mutattak (33A ábra). A szintén kerek átmetszető sejtmagban megtaláltuk az elektrodenz magvacskát. A maghártyán a neuronokra jellemzı befőzıdés látható. A sejtmagot keskeny cytoplazma szegély vette körül, a cytoplazmában az idegsejtekre jellemzı sejtalkotórészeket találtuk. Hosszmetszeti képen a neuronok nagy része ovális átmetszetet mutatott, az esetek többségében a sejtmag követte a perikaryon alakját (33B ábra). A perikaryonok közötti térben megtaláljuk a gliasejteket, a kapilláris átmetszeteket és a központi idegrendszer szerkezetére jellemzı neuropilt, amely a filum terminaléban is különbözı 34

36 mérető, alakú és szerkezető sejtnyúlványok halmazából áll (33A ábra). A neuropilban elsısorban a szinapszisokat tanulmányoztuk. 33A. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Keresztmetszeti képen a neuronok perikaryonjai (N) kör alakúak. Gl = astrocyták. Cap = kapillárisok. Mérték: 10 µm 33B ábra. Hosszmetszeti képen a neuronok perikaryonjainak nagy része elnyújtott, ovális képet mutat (N). Mindkét képen látható a sejtmag és magvacska neuronokra jellemzı elektronmikroszkópos képe. Mérték: 10 µm 35

37 Hagyományos módon csoportosítottuk a szinapszisokat egyrészt a posztszinaptikus komponens jellege (axo-szomatikus és axo-dendritikus szinapszisok), másrészt a preszinaptikus végzıdésben található szinaptikus vezikulák alakja alapján. Axo-szomatikus szinapszist keresni kellett, ritkán fordultak elı. A preszinaptikus végzıdésben az ovoid szinaptikus vezikulák a szinaptikus membránmegvastagodás közelében csoportosultak (34. ábra). Axo-dendritikus szinapszisokat keresés nélkül lehetett találni a szürkeállományban. 34. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Axo-szomatikus szinapszist (nyílhegy) ritkán lehetett találni. Az axonvégzıdések (Ax1, Ax2, Ax3) ultrastruktúrája különbözött a szinaptikus vezikulák formája és sőrősége alapján. Egy axo-denritikus szinapszisra nyíl mutat. D = dendrit. Mérték: 1 µm Az 1-2 µm mérető preszinaptikus végzıdések egyaránt kapcsolódtak a hasonló mérető és a sokkal kisebb mérető posztszinaptikus képletekhez (35. ábra). Mivel sem a fénymikroszkóppal, sem az elektronmikroszkóppal készült metszeteinkben nem találtunk dendritikus tüskékre utaló képet, így fel kell tételeznünk, hogy a 35. ábrán látható mindkét posztszinaptikus képlet dendrittörzs. Elképzelhetı, hogy a dendriteken gyöngyfüzérszerően vastagabb és vékonyabb szakaszok váltogatják egymást (erre utalhat a 23B ábrán bemutatott SP tartalmú neuron ágrendszerének hosszmetszeti képe), és a vékony szakaszokon is elıfordulnak szinapszisok. 36

38 35. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Axo-dendritikus szinapszisok eltérı formái. Bal oldalon lenn a posztszinaptikus dendrit (D) nagy mérető, míg jobbra fenn (nyíl) a posztszinaptikus dendrit alig 0,2 µm átmérıjő. Ax = axon. Mérték: 0,5 µm Jellemzı szinaptikus elrendezıdésként találtuk a több (2-4) preszinaptikus végzıdésbıl álló axodendritikus szinaptikus együttest, amit koszorú szinapszisnak neveztünk (36. ábra). A preszinaptikus végzıdésekben különbözı alakú szinaptikus vezikulák is 36.ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Axo-dendritikus koszorú szinapszisok. Egyegy dendritet (D) több, különbözı szerkezető, szinaptizáló axonvégzıdés (Ax) vesz körül. Mérték: 1 µm elıfordulhatnak, az axonvégzıdések között axo-axonális kapcsolatokat nem találtunk. 37

39 A FT hosszmetszetein az axo-dendritikus szinapszisok a fénymikroszkópos eredmények által diktált elvárásoknak megfelelıen a hosszában orientált dendritekhez szakaszosan érkezı preszinaptikus végzıdések formájában mutatkoztak (37. ábra). 37. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Hosszmetszetben a posztszinaptikus dendrit (D) orsó alakú kiszélesedésével szinaptizál két, eltérı szinaptikus vezikula tartalmú axonvégzıdés (Ax). Mérték: 1 µm Ritkán lehetett szinaptikus kapcsolatot találni a nucleus dorsalisban. Erre a területre a myelinhüvely nélküli, rendkívül vékony rostok tömege jellemzı, amelyek a FT hossztengelye mentén orientáltak (38. ábra). A FT szélén elhelyezkedı fehérállomány különbözı mérető myelinhüvelyes axonokból áll, amelyek a FT hossztengelyének irányába orientáltak. Az idegrostok átmérıje 0,2 µm és 3,0 µm között változik. A FT felszínén gliasejtek nyúlványai képezik a központi idegrendszerre jellemzı borítást (membrana superficialis gliae). Ugyanitt gyakran találtunk kapilláris érátmetszeteket is (39. ábra). 38

40 38. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. A nucleus dorsalira jellemzı vékony, keresztbe metszett idegrostok (*) nagy tömege látható. Mérték: 0,5 µm 39. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. A fehérállományt különbözı vastagságú myelinhüvelyes idegrostok (*) töltik ki. A FT felszínét borító pia matert nyíl jelzi. Cap = kapilláris, Gl = astrocyta. Mérték: 1 µm 39

41 Az elektronmikroszkópos vizsgálatok különlegességei közé sorolhatjuk a liquorkontakt neuronokat és a canalis centralis lumenében talált axonvégzıdés csoportot. A liquorkontakt neuronnak a canalis centralisba furakodó dendrit nyúlványának szabad felszínét az ependyma sejtek csillói veszik körül. A fejszerően kiszélesedı nyúlványt a szomszédos ependyma sejtekhez zonula adherens jellegő membránspecializációk kapcsolják (40. ábra). 40. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Neuron bunkó alakú dendritje (D) az ependyma sejtek között liquorkontakt neuron. A canalis centralis lumenét az ependyma sejtek csillói (nyilak) töltik ki. A 32. ábrán bemutatott neuron nyúlványának nagyított képe. Mérték: 1 µm Meglepetésszerően találtunk a canalis centralisban több, egymáshoz szorosan kapcsolt, de az ependyma sejtekkel nem szükségszerően érintkezı axonvégzıdést (41. ábra). Az axonvégzıdések szokatlan elhelyezkedése mellett a legfeltőnıbb a sőrőn elhelyezkedı, nm átmérıjő vezikulák jelenléte volt (42A ábra). A vezikulák mérete és formája alapján arra következtetünk, hogy a vezikulák noradrenerg transzmittert tartalmaznak. 40

42 41. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Az ependyma sejtek (Ep) között, a canalis centralis lumenében ayonvégzıdések (Ax) csoportja látható. Mérték: 2 µm 42. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. A: a 41. ábrán bemutatott axonvégzıdések nagyított képe. A végzıdésekben nm átmérıjő vezikulák találhatók a szabályos mérető szinaptikus vezikulákkal együtt. Mérték: 0,5 µm. B: A bal oldali ábrán bemutatott axonvégzıdéssel megegyezı végzıdést lehetett találni a szürkeállományban is. Mérték: 1 µm A 42B ábrán bemutatott elemi vezikulákat tartalmazó axonvégzıdéseket találtunk a nucleus lateralisban és FT peremén, a fehérállomány myelinhüvelyes 41

43 idegrostjai között is. Valószínőleg nem valódi végzıdés, hanem varikozitás az axon mentén, mert egy esetben sem találtunk a végzıdéshez kapcsolódó szinapszist. 4.3 A filum terminale szerkezete macskában Kölyök macska gerincvelıjében a CM-FT átmenet hasonlít a patkányban találtakhoz. Caudalis irányba haladva eltőnnek a motoneuronok, majd a motoros szarv is (43A ábra). A canalis centralis felsı végénél az oldalköteg fehérállománya egyre inkább elválasztja a hátsó szarvat a zona intermediától. A hátsó szarv egyre kisebb lesz, majd aszimmetrikusan eltőnik, a szürkeállomány csak a canalis centralis két oldalán marad meg, és folytatódik a filum terminaléban. (43B ábra). 43. ábra. A CM-FT átmenet macskában. Félvékony, ozmiumozott metszetek. A: A canalis centralis mindkét oldalán elhelyezkedı szürkeállomány megfelel a zona intermediának (ZI). Bal oldalon nyilak mutatnak két motoneuronra. A hátsó szarv lefőzıdése az intermedier zónáról már megkezdıdött. B: A canalis centralis szabálytalan alakú, mindkét oldalról szürkeállomány veszi körül. A hátsó szarvak eltőnése aszimmetrikus, bal oldalon már csak nyomokban látható. Mérték: 500 µm Toluidinkékkel festett félvékony metszeteken jól látható az ependyma sejtek rétege, a patkány filum terminaléban látott különbség a szürke- és fehérállomány között azonban macskában csak jelzetten látszik, ugyanis macskában, a FT külsı rétegében myelinhüvelyes rostok csak elvétve fordulnak elı (44A ábra). Az ependyma sejtek szabad felszínérıl finom, szabálytalan nyúlványok indulnak a canalis centralis lumene felé, patkány filum terminaléban ilyen nyúlványokat, fénymikroszkópos metszeteken, nem láttunk. A filum terminaléban található neuronok 42

44 macskában is apró neuronok, de ritkábban fordulnak elı, mint patkányban (44B és C ábra). 44A ábra. Macska FT, félvékony metszet, toluidinkék festés. A canalis centralist (CC) ependyma sejtek szegélyezik. A szürke- és fehérállomány között csak jelzett a határ. Mérték: 100 µm 44B ábra. Macska FT, félvékony metszet, tolouidinkék festés, részlet az A ábrából. A szürke- és a fehérál-lomány közti határt szaggatott vonal jelzi. Mérték: 10 µm. 44C ábra. Macska FT, félvékony metszet, toluidinkék festés, részlet az A ábrából. A neuronokat nyilak jelzik. Mérték: 10 µm Immunhisztokémiai vizsgálataink során lényeges eltérés találtunk patkány és macska filum terminaléban a GFAP pozitív glia sejtek és nyúlványaik elhelyezkedésében. Szemben a patkányban látott haránt és hosszanti hálózattal, macska filum terminaléban a sőrő GFAP pozitív rosthálózat átszıtte a FT teljes szélességét. Vékony, GFAP pozitív nyúlványokat találtunk az ependyma sejtek rétegében, feltehetıleg az ependyma sejtek között (45A ábra). 43

45 Immunhisztokémiai módszerrel is (NeuN jelölés) láthatóvá tudtuk tenni a neuronokat, amelyek elıszeretettel helyezkedtek el az ependyma sejtek közelében. SP pozitív varikózus idegrostokat elsısorban a FT dorsalis területén csoportosultak (45B ábra). Az immunhisztokémiai vizsgálatok megerısítették, hogy a macska filum terminaléban lényegesen ritkábban fordulnak elı neuronok, mint a patkányéban. 45. ábra. Macska FT, hármas immunfluoreszcens jelölés. A: GFAP immunpoztív astrocyta nyúlványok átszövik a filum terminale teljes szélességét, és finom nyúlványokat küldenek az ependyma sejtek közé. Az ependyma sejtek nem jelölıdtek. B: NeuN (piros) neuronális perikaryonok nagyrészt az ependyma sejtek közelében helyezkednek el. SP tartalmú idegrostok (kék) a filum terminale dorsalis részében koncentrálódnak. CC = canalis centralis. Mérték: 100 µm A FT elektronmikroszkópos képén néhány myelinhüvelyes idegrost és számos, nagyon vékony, myelinhüvely nélküli idegrost keresztmetszete látszik (46. ábra). Hasonló idegrost szerkezetet patkányban csak a nucleus dorsalis területén lehetett látni (38. ábra). Megtaláltuk a kismérető, keresztmetszeti képen kör alakú perikaryonokat (47. ábra). Axo-szomatikus szinapszist ritkán láttunk, axo-dendritikus szinapszisokat keresés nélkül lehetett találni. A patkányhoz hasonlóan, macskában is elıfordult a nagy axonvégzıdések és az aránytalanul kis dendritátmetszet közti szinaptikus kapcsolat (47. 44

46 ábra). Feltőnı különbség volt a patkányban megfigyeltekkel szemben, hogy az astrocyta nyúlványok sőrőn egymás mellé préselt fibrillumokat tartalmaztak (47. ábra). 46. ábra. Lupe nagyítású elektronmikroszkópos felvétel a macska FT területérıl. Néhány myelinhüvelyes idegrost körül számos, nagyon vékony myelinhvely nélküli idegrost (*) tölti ki a képet. Mérték: 1 µm 47. ábra. Macska FT ultrastruktúrája. Szinaptizáló axonvégzıdések (Ax). A patkányban leírtakhoz hasonlóan, macskában is elıfordulnak apró dendritátmetszetek, mint posztszinaptikus képletek. Az astrocyták nyúlványai (Gl) - a patkányban találtakkal ellentétben - finom fibrillumokkal vannak kitöltve. Mérték: 1 µm. Betét: kerek, kismérető neuron perikaryonja. Mérték: 0.1 µm 45

47 4.4 A filum terminale szerkezete majomban A majom CM-FT átmenet fıbb jellemzıi megegyeztek a patkányban és a macskában találtakkal. A motoros szarv eltőnése után a hátsó szarvak eltőnése ebben az állatban is aszimmetrikus (48A, B és C ábra). A filum terminaléban folytatódik a canalis centralis és annak két oldalán a szürkeállománynak az intermedier zóna része. 48. ábra. Ozmimummal kezelt Vibratóm metszetek a majom CM cranialis (A), középsı (B) és caudalis részébıl (C). A szürkeállomány részei: hátsó szarv (HSz), zona intermedia (ZI) és mellsı szarv (MSz). A középsı metszetben a mellsı szarv nagyrészt eltőnt. A caudalis metszeten a hátsó szarv elvált a zona intermediától. Mérték: 1 mm A FT felépítése cranialis szakaszán jól látszanak a perifériás elhelyezkedéső myelinhüvelyes idegrostok keresztmetszetei. Caudalisabban az idegszövet µm átmérıjő gömbökbe rendezett (49. ábra), amelyek látszólag lazán kapcsolódnak az ependyma sejtek basalis felszínéhez. A canalis centralist ependyma sejtek bélelik (49. ábra). Az ependyma sejtek szabad felszínén csillókat és finom nyúlványokat találtunk, a sejteket egymáshoz zonula adherens jellegő membránspecializációk rögzítik (50. ábra). 49. ábra. Majom FT keresztmetszeti képe, toluidinkék festés. A kép jobb felsı részében ( * ) idegszövet látható, ami megfelel a filum terminale cranialis részének. Az idegszövet µm széles csíkban veszi körül a canalis centralist (CC). Caudalisabban az idegszövet µm átmérıjő gömbökbe rendezett. Mérték: 100 µm 46

48 50. ábra. Ependyma sejtek kamrai felszíne majom filum terminaléban. A sejtekbıl csillók indulnak a canalis centralis lumene felé (CC). A sejtek között membránspecializáció. Mérték: 0,5 µm A szövetgömbökben találunk idegsejt perikaryonokat, gliasejteket, és számos myelinhüvelyes idegrostot (51. ábra). 51. ábra. Majom FT ultrastruktúrája. Az ependyma sejtekhez (Ep) kapcsolódóan az idegszövet gömb alakú területen található. A gömbben találunk neuron perikaryonokat (N), astrocytákat (Gl) és különbözı átmérıjő myelinhüvelyes idegrostokat. Mérték: 10 µm 52. ábra. Majom filum terminale ultrastruktúrája. Egymás közelében két neuront találunk (N) Mérték: 10 µm A perikaryonok mérete és szerkezete (52. ábra) megegyezik a patkányban leírtakkal. Gyakran találtunk koszorú alakú szinapszist, ahol egy vastagabb dendritet számos szinaptizáló axonvégzıdés vett körül (53. ábra). 47

49 53. ábra. Majom filum FT ultrastruktúrája. Vastagabb dendrit (D) körül számos 0,5 µm mérető szinaptizáló axonvégzıdés (Ax) sorakozik (koszorú szinapszis). Mérték: 1 µm 4.5 A filum terminale kapcsolatai (elızetes eredmények) A FT rostösszeköttetéseit a gerincvelı caudalis területére beadott BDA injekciók segítségével kívántuk vizsgálni. Mivel semmiféle támpont nem állt rendelkezésünkre sem a FT felé induló idegrostok eredetére, sem a filum terminaléból érkezı idegrostok végzıdésére, ezért minél nagyobb injekciókat igyekeztünk elhelyezni a caudalis gerincvelı szürkeállományának különbözı területein. A BDA injekciók beadási helyérıl készített felvételen (54. ábra) látszik, hogy a beadás centruma a zona intermediában volt. A beadás környezetében megtaláltuk a jelzett sejteket hosszú dendritszakaszokkal, valamint intenzív idegrost festıdést elsısorban a funiculus anteriorban (55. ábra). Retrográd jelzett perikaryont az eddigi vizsgálatok során csak elvétve, a conus medullarisban találtunk (56. ábra). A FT keresztmetszeti képen apró pontokként láttuk a BDA immunjelzett képleteket. Mivel 15-20, egymástól 1 µm távolságra lévı optikai metszeten (maximum 27) is követni tudtuk a megfigyelt képletet, abból arra következtettünk, hogy egy jelzett, vékony idegrostot követünk. Az ilyen módon azonosított, vékony, cranio-caudalisan húzódó BDA jelzett idegrostokat találtunk mind a canalis centralis mentén (57. ábra), mind attól távolabb, részben a fehérállományban (58. ábra). 48

50 54. ábra. BDA injekció beadási helye; patkány gerincvelı S2 szelvény. A nyilak az injekció helyére mutatnak. Mérték: 1mm 55. ábra. BDA-val jelzett neuronok (nyilak) és axonnyaláb. Patkány gerincvelı, a BDA injekció beadásával szomszédos szelvény. Mérték: 150 µm 56. ábra. Patkány CM, kettıs immunjelölés. Neuronok sejtmagját NeuN immunreakcióval jelöltük (piros). BDA jelölés (zöld) a nyíllal jelzett idegsejt cytoplazmájában és a neuronok között (apró nyilak). Kilenc optikai szint összegzése. Mérték: 100 µm 57. ábra. Patkány FT, kettıs immunfestés. BDA jelzett vékony, varikózus idegrostok (zöld; apró nyilak) húzódnak a canalis centralis (CC) mindkét oldalán. A neuronok perikaryonjait NeuN jelöléssel ábrázoltuk. Tizenhét optikai szint összegzése Mérték: 100 µm 49

51 ábra. Patkány FT, kettıs immunfestés. BDA jelzett vékony, varikózus idegrostok (zöld; apró nyilak) húzódnak a fehérállomány-ban. CC = canalis centralis. A neuronok perikaryonjait NeuN jelöléssel ábrázoltuk. Huszonhét optikai szint öszszegzése. Mérték: 100 µm