CB1 cannabinoid receptorok megoszlásának vizsgálata a gerincvelő felületes hátsó szarvában. Készítette: Pálóczi János

Átírás

1 CB1 cannabinoid receptorok megoszlásának vizsgálata a gerincvelő felületes hátsó szarvában Készítette: Pálóczi János Debrecen 2013

2 Tartalom 1. ÁTTEKINTÉS A CB1 RECEPTOR TULAJDONSÁGAI A CB1 RECEPTOR LOKALIZÁCIÓJA A KÖZPONTI IDEGRENDSZERBEN ANYAG ÉS MÓDSZER ÁLLATOK RHIZOTOMIA FIXÁLÁS, METSZÉS IMMUNHISZTOKÉMIA DAB kromogén reakció (fénymikroszkópos vizsgálatokra) Immunfluoreszcens jelölés (konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz) Nanogold jelölés (elektronmikroszkópos vizsgálatokra) ELEKTRONMIKROSZKÓPIA KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA KVANTITATÍV ANALÍZIS EREDMÉNYEK A CB1 RECEPTOR MEGOSZLÁSA PATKÁNY GERINCVELŐ FELÜLETES HÁTSÓ SZARVÁBAN DAB KROMOGÉN REAKCIÓT KÖVETŐEN A CB1 RECEPTOR ÉS AZ AXONÁLIS MARKEREK KOLOKALIZÁCIÓJA A CB1 RECEPTOR SUBCELLULÁRIS LOKALIZÁCIÓJA DISZKUSSZIÓ FÜGGELÉK... HIBA! A KÖNYVJELZŐ NEM LÉTEZIK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE FELHASZNÁLT OLDATOK RECEPTÚRÁI... HIBA! A KÖNYVJELZŐ NEM LÉTEZIK. 6. IRODALOMJEGYZÉK

3 CB1 cannabinoid receptorok megoszlásának vizsgálata a gerincvelőfelületes hátsó szarvában 1. Áttekintés A vadkendert (Cannabis sativa), mint ismert kultúrnövénytaz antik Európábanigen széleskörűen használták fel, úgymint kötelek, erős vásznak, ruhadarabok készítéséhez alapanyagként. ACommentary of thebritish Pharmacopedia egyik 1848-ban kiadott áttekintésében az indiai kenderről, mint a keleti orvoslásban széleskörűen használt analgetikushatású, pszichotróp gyógyszerről ír. Ezt követően a kenderkivonatok kiterjedt vizsgálata indult meg Európában. Időközben a kender pszichoaktív komponensét sikerült azonosítani, amely egy terpenoid-származék: Δ 9 -tetrahidro-kannabiol (THC). (1. ábra) 1. ábra:aδ 9 -tetrahidro-kannabinol szerkezete. A THC pszichoaktív tulajdonságait igen hamar felismerték ugyan, de egyedi kémiai struktúrájából adódóan a hatásmechanizmusa nehezen követhető nyomon. Ezt a kérdést az 1950-es évek radioligand-jelöléses vizsgálatai tisztázták [21], amelyek acannabinoid-érzékeny kötőhelyek azonosításátlehetővé tették, eleinte csak a központi idegrendszerben (cannabinoid receptor1-cb1-r), későbbaz immunrendszer sejtes elemein [24], endothel sejteken, sőt a tüdőben, a herében és a placentában is [7,10] (CB2 receptor). 3

4 A CB1 recetor endogén agonistáinak keresése már az 1960-as évek elején megkezdődött,viszont az intenzív hatásmechanizmus-, és receptor-vizsgálatok ellenére csak a 90-es évek elejére sikerült azonosítani az első endogén ligandot, az anandamidot [2,3]. A CB1 receptor endogén agonistáit az endorfinok analógiájára endocannabinoidoknak nevezték el. A CB1 receptor (CB1-R) elsőként izolált endogén ligandja az anandamid (arachidonoil-etanolamin)[2,3,7,10].szerkezetét tekintve az eikozanoidok családjába tartozik (2. ábra bal oldala). Ez a vegyületcsalád mediátoraként ismert a gyulladásos folyamatokban, ill. szerepük van a nociceptív folyamatokban a neuronok közti kommunikációban [7]. 2. ábra: Az ábra bal oldalán az anandamid, jobb oldalán a 2-arachidonilglicerol szerkezete látható. Egy másik, jelentős endogén cannabinoid agonista a 2-arachidonilglicerol (2-AG). Jelenlétét 1995-ban mutatták ki [4,7,8,10].Szerkezetét tekintve egy monoacil-glicerol (2. ábra jobb oldala), amely bonyolult metabolizmus révén igen nagy mennyiségben termelődik a központi idegrendszerben (200-szorosa az anandamid koncentrációnak). Ismeretes további három endocannabinoid: virodhamin, noladin-éter és N- arachidonoil-dopamin(nada).jelentőségük még nem igazán nyert bizonyítást [7], mert az idegszövetben fiziológiás körülmények között igen kis mennyiségben vannak jelen és általában eléggé bomlékony vegyületek. Így nehezen vizsgálhatók, szerepük a retrográd jelátvitelben kérdéses A CB1 receptor tulajdonságai A CB1 receptor egy 7 transzmembrán-doménnel rendelkező, a sejtmembránba integrálódott fehérje (4. ábra) [1,7,10]. Immunhisztokémiai vizsgálataink szempontjából 4

5 fontos megjegyezni, hogy a receptor N-terminálisa extracelluláris, C-terminálisa pedig intracelluláris helyzetű. A receptor szignáltranszdukcióját illetően Gi-fehérje kapcsolt, tehát intracellulárisan gátolja az adenilát-cikláz enzimet, így a sejtben csökken a camp szint, csökken a PKA aktivitása, ill. mindezeken keresztül mérséklődnek a foszforilációs folyamatok a sejtben. Ezáltal a CB1 mediált jelátvitel általános anyagcsere-depressziót indít el a sejtben. Ezen túlmenően az endocannabinoidok kötődése a CB1 receptorhoz az N-, illetőleg P/Q-típusú feszültségfüggő Ca 2+ -csatornák záródását idézi elő, ami jelentősen csökkenti a szóban forgó idegsejt EPSP-jét, így gátolja a neurotranszmitterek felszabadulását [16]. 4. ábra: A CB1 receptor szerkezete. A közlemények többsége arról számol be, hogy a CB1 receptor preszinaptikus elhelyezkedésű [1,2,11,12,13]. Ez a helyzet egyedivé teszi az endocannabinoidok jelátvitelét és felveti a retrográd transzmisszió lehetőségét [11,12,13,16,18,19]. Hippocampus-beli piramissejteken tapasztalták először,hogy a depolarizált piramissejtek preszinaptikus, gátló GABAerg interneuronjainak neurotranszmitterfelszabadulása tranziensen csökkena posztszinaptikus sejt depolarizációja után [16].A jelenség a depolarization-induced suppressionof inhibition(dsi)[7,10,11,12,13]. Hátterében a posztszinaptikus sejtben a membránpotenciál változás hatására bekövetkező endocannabinoidtermelése játszik szerepet. A szintézisben számottevő szerep jut a Ca 2+ -ionoknak (5. ábra): a membrán-depolarizáció hatására ugrásszerűen megnő a posztszinaptikus sejtben a kalcium koncentráció, ami az endocannabinoidok szintézisében részt vevő enzimrendszer aktiválódását indítja el. 5

6 5. ábra.endocannabinoidok által mediált neurotranszmitter felszabadulás-gátlás. Erős depolarizáció hatására endocannabinoidok gyors és azonnali szintézise történik a posztszinaptikus sejtben, amely anyagok kidiffundálva a szinaptikus résbe retrográd módon kötődve preszinaptikus helyzetű receptorukon olyan intracelluláris szignáltranszdukciót indítanak el, ami gátolja a további neurotranszmitterek felszabadulását. (Kano M. et al, 2005) Hasonló hatás mutatható ki serkentő neuronokon. A megfigyelt jelenség a DSE (deporizationinduced supression of excitation). A posztszinaptikus sejtben megnövekvő intracelluláris Ca 2+ koncentráció hatására felszabadult endocannabinoid mediátor hatékonyan gátolja a serkentő neurotranszmitter felszabadulását, így az EPSP mértékét a posztszinaptikus membránon [10,13] A CB1 receptor lokalizációja a központi idegrendszerben A CB1 receptor széleskörűenexpresszálódik a központi idegrendszerben (6. ábra). 6. ábra. A CB1 előfordulása patkány agyában. Tríciummal jelzett CB1-R autoradiográfiás képe patkány agyának sagittalis metszetén. A szürkeskála reprezentatív a CB1-R különböző agyi területeken való relatív előfordulására nézve.(herkenham M. et al,1990.) 6

7 A CB1 receptor nagymértékben expresszálódik a nagyagykéregben, a substantia nigra területén, a hippocampusban,a globus pallidus területén,illetőleg jelentős mértékben jelenik meg továbbá a kisagyban is. Ezeken kívül az agytörzs kivételével szinte mindenhol megjelenik a CB1 receptor az agyban, még ha eltérő mértékben is[16,18,20,21,22]. Igen jelentős a CB1 gerincvelői, ill. hátsó gyöki ganglionáris előfordulása.összességében a hátsó gyöki ganglionsejtek közel fele CB1-receptort expresszál, ebből mindössze 1/4-ük nem nociceptív neuron [10,12,14]. A nociceptív primer afferens neuronokat két nagyobb szubpopulációra lehet bontani: ennek alapja, hogy milyen növekedési faktorra érzékenyek. Ilyenformán megkülönböztetünk neuronális növekedési faktorra (NGF), ill. gliális neutrofikus faktorra (GDNF) érzékeny nociceptív neuronokat. Előbbi neuron populációkülönböző neuropeptideket expresszál, mint például CGRP-t (calcitonin gene-related peptide), Substance-P-t, szomatosztatint, utóbbi pedig a nem peptiderg axonterminálisaok szubpopulációjaként a Bandeirea simplicifoliából izolált IB4-et (isolectin B4) köt. Korábbi tanulmányok alapján a II belső laminában GABAerg interneuronok szubpopulációjakifejezett CB1 immunreaktivitást mutat, amely nitrogén-monoxid szintáz (NOS) jelöléssel kolokalizál.egyes szerzők megfigyelték a CB1 X-es lamina-beli feltűnését is [14] (a gerincvelő canalis centralis környéki régiója). A legélénkebb immunhisztokémiai jelölés viszont a gerincvelő dorsolaterális funiculus területéntapasztalható [14]. Több szerző beszámolt arról, hogy patkányokon végzett dorzális rhizotomia, ill. hemisectio után végzett a gerincvelő hátsó szarvi CB1 jelölése alig vesztett intenzitásából[12]. Így arra a következtetésre jutottak, hogy a hátsó gyöki ganglionok centrális nyúlványai csakkis mértékben expresszálják a receptor típust [12] (azt inkább a gerincvelő felületes hátsó szarvában található interneuronok termelik). Mások viszont ennek az ellenkezőjéről is beszámoltak, tehát a primer afferensek CB1 expressziója kifejezett, a dorzálisrhizotomiaszámukat szignifikánsan csökkenti[15, 21]. Vizsgálataim központjában az endocannabinoid CB1 receptor lokalizációja állt patkány gerincvelőjének hátsó szarvában. Munkám során célul tűztem ki a CB1 receptorok megoszlásának vizsgálatát fény- és elektronmikroszkópos szinten egyaránt a gerincvelő felületes hátsó szarvában Tekintettel arra, hogy a primer afferensek centrális nyúlványainak szerepe a gerincvelő I-II. lamináinak CB1 expressziójában ellentmondásos, vizsgálataink egyik fő elemeként vizsgálni kívántuk a primer afferensek axonterminálisainak CB1 receptor expresszióját. 7

8 2. Anyag és módszer 2.1. Állatok A kísérletet felnőtt, nőstény Wistar-Kyoto patkányokon végeztük, g közti mérettartományban. Az állatokat a számukra megfelelő körülmények között tartottuk, 12 órás fény/sötét ciklusban. Az általunk felhasznált CB1 receptor elleni antitest specificitásának tesztelésére a CB1 receptor elleni immunreakciót vad típusú és CB1 receptor knock out egereken [23] egyaránt elvégeztük.míg a vad típusú egér felületes hátsó szarvában a patkányokéval mindenben megegyező immunfestődés volt megfigyelhető, addig a knock out egerek gerincvelőjéből készített metszetek semmiféle immunreakciót nem mutattak (9. ábra C és D részei) 2.2. Rhizotomia A CB1 receptor expressziójának vizsgálatára rhizotómiát is alkalmaztunk egyes állatokon. Az intraperitoneálisan adott Na-pentobarbitallal altatott állat lumbális gerincvelői szakaszán, a hátsó gyökereket metszettük el. A beavatkozás a lumbális gerincvelő L4-es szegmentumát, illetőleg ettől cranialisan és caudalisan 2-2 szegmentumnyi távolságban belépő gyökereket érintette. A rhizotómián átesett állatok gerincvelői a két hetes túlélés után lettek eltávolítva a perfúziót követően. A cél a rhizotómiával az volt, hogy ezen beavatkozást követő immunhisztokémiai vizsgálatokkal kiderítsük, vajon számottevő mértékben expresszálódik-e a CB1 receptor a primer afferensek centrális nyúlványain Fixálás, metszés A perfundálni kívánt állatot60mg/testsúlykg intraperitonálisan adott nátriumpentobarbitallalaltattuk. A transzkardiális perfúziót először frissen oxigenizált, előzetesen jégen tartott Tyrodeoldattal, majd a fixáló oldattalvégeztük. A fiziológiás oldattal történő átmosással megakadályoztuk a kapillárisok sejtes elemekkel történő elzáródását, továbbá a lehűtött, magas oxigén tartalmú oldat késleltette a sejtek autolízisét. Konfokális mikroszkóppal végzendő kolokalizációs vizsgálatokhoz fixáló oldatként 0.1M-os foszfát pufferben(pb) oldott (ph: 7,4), 4%-os paraformaldehidet (PFA, Sigma- Aldrich) használtunk. Az elektronmikroszkópos vizsgálatainkhoz feldolgozott minták 8

9 fixálásához a fixáló oldat 0.1M-os PB-ben oldott 2.5% PFA-n kívül tartalmazott 0.5% glutáraldehidet(ga, Sigma-Aldrich), illetőlegmég 0.2%pikrinsavat(Fluka) is (a fixáló oldatok, illetőleg a pufferek receptúrája a mellékletben található). A perfúzió után közvetlenül eltávolítottuk a gerincvelő lumbális szakaszát. A 24 órás utófixálást követően az eltávolított lumbális gerincvelőt először0.1m-os PB-ben oldott 10%- os majd 20%-os szacharóz-oldatba tettük, amíg le nem süllyedtek.ennek célja a folyékony N 2 -ben történő feltárást megelőzőcryoprotekcio. A feltárás (freeze-thawing) után a lumbális gerincvelőt 8%-os agarba öntöttük, és vibrotómmal (Leica VT 1000 S) 50μm-es metszeteket készítettünk. A metszeteket 0.1 M-os PB-vel 3 15 percigmostuk. Ezek utána metszetek 0.01%-os H 2 O 2 oldatba kerültek az endogén peroxidázok aktivitásának kioltása céljából. Az újbóli mosás után a glutáraldehiddel fixált (elektronmikroszkópos feldolgozásra szánt) metszetek 1%-os NaBH(Sigma- Aldrich)oldatba kerültek az aldehid behatás után kialakult fehérje-keresztkötések felszakítása miatt.ezután ismét többszöri PB-s mosás következett, amit a konfokális mikroszkópos vizsgálatokra szánt, ill. a nanogold jelölést kapó metszetek esetében háromszori PBS-es, a diamino-benidinnel (DAB) jelölt metszetek esetében háromszori TPBS-es mosásváltott fel Immunhisztokémia DAB kromogén reakció (fénymikroszkópos vizsgálatokra) Az alaposan átmosott metszeteket 50 percre TPBS-ben oldott 10%-os normál szérumban (normal goat serum-ngs) inkubáltuk. Az NGS(Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA)csökkenti a metszetek nem specifikus kötőhelyeit. A blokkolás után mosás következett TPBS-ben oldott1%-os NGS-sel. Mindezek után került a metszetekre a CB1 receptor ellen termeltetett primer antitest megfelelően hígított oldata. Az általunk használt antitest (a Cayman cég által előállított, nyúlba termeltetett CB1 poliklonális antitest) a CB1 receptorintracellulárisc-terminálisának részletét felismerve kötődik a receptorhoz. Az anti-cb1-r 1%-os NGS-t tartalmazó TPBSben oldottuk fel 2000-szeres hígításban. A primer antitest minden esetben két éjszakán át, 4 C-on volt a metszeteken. Ezt követően háromszori, 1%-os normál szérum oldattal történő mosás, majd a szekunder antitest következett. A DAB alapú immunhisztokémia esetében ez biotinnal konjugált goat anti-rabbit immunglobulin G-t (Sigma) jelent, amely 12 órán át volt a metszeteken, 4 C-on. A későbbiekbenhozzáadott avidinnel a primer antitest kötődésének 9

10 megjelenítésére alkalmasreakció játszódik le.az avidin-biotin komplexben (ABC- Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA) ugyanis térhálós szerkezetű keresztkötések alakulnak ki, amelyek között az avidinhez konjugált tormaperoxidáz enzim segítségével, H 2 O 2 jelenlétében a diamino-benzidin könnyen precipitálódik, és barna csapadékként jelenik meg a metszeteken. A biotinilált szekunder után 1%-os NGS oldatban történő háromszorimosás, majd a fent említett ABC komplex applikálása következett egy éjszakán át. Ezt követően TPBS-es, majd 0.05M-os TRIS-esmosás követezett. A metszetekre ezek után került rá a diaminobenzidin (DAB) oldat, majd 20 perc eltelte után ennek előhívása következett 0.01%-os H 2 O 2 oldat segítségével a barna csapadék megjelenéséig. A vizualizáció után háromszori TRIS-es, majd 0.1 M-os PB-s mosás következett. A tárgylemezre történő felszedés után a metszeteket felszálló etanol-soron percig, majd xilolban percigvíztelenítettük. A metszeteket DPX fedőanyaggal (Fluka) fedtük le Immunfluoreszcens jelölés (konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz) Az Immunfluoreszcens vizsgálatokra szánt metszeteket a primer antitest előtt 10%-os, illetőleg 1%-os NGS-t tartalmazó PBS oldattal kezeltük. Előbbi esetben a nem specifikus kötőhelyek számának csökkentése történt50 percen át,utóbbi esetben pedig a blokkoló oldat kimosása volt a cél. Az 1% NGS-t tartalmazó PBS oldatban történt az anti-cb1- Rhígítása.Ugyanebben az oldatban történt kolokalizációs vizsgálatokban felhasználni kívánt markerekellen termeltetett primer ellenanyagok hígítása is.az alkalmazott markerekközül a peptiderg primer afferensek centrális nyúlványainak jelölésérekalcitonin gén relációs peptid (CGRP) ellen termeltetett antitestet alkalmaztunk, míg a nem peptidergek kimutatásáraegy lektinkötési reakciót, a Bandeirea simplicifoliából izoláltisolectinb4 (IB4) kötődését használtuk fel. A gátló intrinsic neuronok axonterminálisainak jelölését a γ-amino-vajsavat (GABA) szintetizáló enzim (GAD 65/67) elleni antitesttel (anti-gad65/67) végeztük, a serkentő interneuronok feltüntetésére pedig glutamaterg terminálisokbankimutatható vezikuláris glutamát transzporter (VGLUT2) ellen termeltetett antitestet alkalmaztunk.a kettős jelölés alapjául szolgáló primer antitestek 2 éjszakán át voltak a metszeteken. Ezután PBS-ben oldott 1%-os normál szérumos mosás következett háromszori ismétlésben. A szekunder antitesteket tartalmazó oldat ezek után került a metszetekre, 1000-szeres hígításban. A CB1 ellen termeltetett antitest megjelölésére goat anti-rabbit immunglobulin G (GAR-IgG) szekunder antitestet használtunk, amely Alexa-555 fluorokrómmal volt konjugálva(sigma-aldrich).az IB4-jelölt metszetekre streptavidin-alexa-647, a CGRP-ellen 10

11 termeltetett antitest megjelölésére goat anti-guinea pig-alexa-488, a VGLUT2-jelölt metszetekre goat anti-guinea pig-alexa-488, a GAD 65/67 jelölt metszetekre pedig goat antimouse-alexa-488 jelzésű fluorokrómot tartalmazó szekunder antitest került (Sigma-Aldrich), amely 5 órán át volt a metszeteken.a fluoreszcens csoportot hordozó szekunder antitesttel kezelt metszetekre az immunreakciót követően előbb 1%-os NGS oldat, majd PBS, és végül 0.1 M-os PB oldat került háromszori cserével. Mindezek után a metszeteket speciális fedőanyaggal(vectashield-vector Laboratories Inc. Burlingame, CA)fedtük le Nanogold jelölés (elektronmikroszkópos vizsgálatokra) Nanogold jelölés esetében a primer antitest alkalmazása előtt 0.1 M-os PBS-t, illetőleg speciális blokkoló,majd inkubáló oldatot használtunk.mindezek után a metszetekre anti-cb1- R került inkubáló oldatban hígítva2 éjszakán át.a feleslegben levő, nem kötődött primer antitest eltávolítása inkubáló oldat segítségével történt háromszori 30 perc mosással. A szekunder antitestgoat anti-rabbit IgG kolloidális(~1nm-es)méretű aranyszemcsével volt konjugálva. A szekunder antitesteket tartalmazó oldat nanogoldos eljárás során egy éjszakán át voltak a metszeteken, 4 C-on. Ezután mosás következett: háromszori inkubáló oldat, majd háromszori PBS alkalmazása után még utófixálás következett 1%-os glutáraldehid oldat segítségével, amelyet újabb PBS-es, majd desztillált vizes mosás követett. Ezek után az ún. ezüst-intenzifikálás következett, amely során a szekunderhez kötött arany részecske felületére ezüst redukálódik(aurion R-GENT, EMS Washington, PA). Végeredményben a szemcse mérete az aranyfelületre kivált ezüst miatt nagyobb lesz, így elektronmikroszkóppal vizsgálható a CB1 pontos szubcelluláris lokalizációja. Az intenzifikálást a metszeteken, az ezüstre jellemző sárgás-barna színmegjelenéséig végeztük, ami után a rajtuk lévő oldatot desztillált vízre, majd pedig 0.1 M-os PB-recseréltük.A metszeteket végülfelszálló etanol-sorban, majd propilénoxidbanvíztelenítettük Elektronmikroszkópia A kolloid méretű aranyszemcsével, illetőleg az intenzifikálás során erre a szemcsére rárakódó ezüstteljelölt metszetekettranszmissziós elektronmikroszkóppalvizsgáltuk a CB1 szubcelluláris lokalizációjának vizsgálatára. A metszeteket 0.1 M-os PB-ben oldott, 0.5%-os ozmium-tetroxid oldatba helyeztük percre. Az ozmium nehézfémként a sejtek membránkomponenseihez, ezen belül is a foszfolipid összetevőkhöz igen nagy affinitással 11

12 kötődik. Így az ozmium fokozza a membránok denzitását, az intracelluláris képletek kontrasztját. A következő lépésbenhidrofób, epoxi alapú, négykomponensű gyantával (ARALDIT-gyanta; Durcupan ACM gyanta, Fluka) infiltráltuk a preparátumokat.ezt követően a gerincvelői metszeteket ebben a vékony gyantarétegben szedtük fel tárgylemezre ésfedtük le.ezt a polimerizáció követte, 56 C-on.Az ultrastukturális vizsgálatokhoz már csak a kimetszett felületes hátsó szarvi részt használtuk fel. Miután a megfelelő blokkba öntöttük a preparátumokat, ultramikrotómmal (Leica Ultracut UCT) nm-es vastagságú metszeteket készítettünk belőlük. A megfelelőnek ítélt metszeteket ún. gridekre, elektronmikroszkóphoz használt tárgytartókra helyeztük. A preparátumok kontrasztosabb megjelenítéseérdekében a grideken levő metszeteket előbb uranil-acetátot, majd ólom-nitrátot, illetőleg nátrium-citrátot (Reynolds oldat) tartalmazó oldatba merítettük. A két kontrasztozás között pedig 50%-os etanolos, majd desztillált vizes mosást alkalmaztunk. Mivel az elektronnyaláb hullámhossza jóval kisebb, mint a láthatófényé, így lényegesen nagyobb felbontásban vizsgálhatóak a biológiai minták elektronmikroszkóppal. Így tehát a patkányból származó gerincvelői metszetek dorzális szarvának ultrastruktúrális és a CB1 receptor subcelluláris lokalizációjánakvizsgálata ezzel az eszközzel folytatódott tovább(jeol 1010, 80kV, Japan) Konfokális mikroszkópia A pásztázó lézersugaras konfokális mikroszkópia lényege, hogy egy koherens lézernyaláb végigpásztázza a minta meghatározott részletét egy dichroikus tükörrendszer segítségével. A mintát pásztázó, fókuszált lézernyaláb gerjeszti az immunhisztokémiai eljárások során jelölt target molekulához kapcsoltfluorokróm molekularészt. A gerjesztett molekulacsoportok által emittált fény optikai tulajdonságait egy számítógéppel összekötött nagy felbontású digitális kamera rögzíti. A számítógép az időben elkülönülő fluoreszcens felvillanásokat feldolgozva alkot képet. Az optikai rendszerbe két apertúra-rekesz (pin hole) van beépítve, amelynek átmérője, ily módon a beérkező fény mennyisége szabályozható.nagy előnye a rendszernek, hogy a mintáról egy kb. 1µm-es optikai metszetről készít felvételt a koherens lézernyaláb pontos fókuszálása, illetőleg az apertúra-rekesz átmérőjének beállítása révén. 12

13 A konfokális mikroszkópra feldolgozott metszeteket két szekunder antitesttel jelöltük, melyekhez 1-1különböző színű fluorokróm volt kapcsolva. Ezen színes csoportok más-más hullámhosszúságú fénnyel gerjeszthetők, és eltérő hullámhosszúságú fényt emittálnak.a külön-külön készített felvételek egymásra vetíthetőek, az emittált fénypontok együttes megjelenése keveredésük révén,egy harmadik, kevert szín megjelenését teszi lehetővé. Ez a jelenség az alapja a kolokalizációs vizsgálatoknak Kvantitatív analízis A konfokális mikroszkóppal készített képeken a fluoreszcens jeleket Adobe Photoshop CS3 szoftver segítségével számoltuk. Minden 1µm vastag optikai szeleten egy es, egyenként 4 µm-es élhosszúságú négyzetet vettünk fel a felületes hátsó szarv CB1 receptorra és a vizsgált marker előfordulására nézve releváns területén. Csak azokat az immunreaktív profilokat vettük figyelembe, amelyek a 4µm-es élhosszúságú négyzet vonalaira estek. A módszer jellegéből fakadóan statisztikailag reprezentatív és objektív adatok álltak rendelkezésünkre. 13

14 3. Eredmények 3.1. A CB1 receptor megoszlása patkány gerincvelő DAB kromogén reakciót követően felületes hátsó szarvában A CB1 receptor elleni immunreakció szembetűnő en jellegzetes eloszlást mutat a gerincvelő hátsó szarvában (9. ábra). A lumbális gerincvelő teljes rostrocaudaliss kiterjedésében két igen intenzíven immunfestett sáv figyelhető meg. A külső, CB1 receptorra erőteljesen immunpozitív sáv a gerincvelő I. laminájának felel meg, míg a belső a II. laminaa belsőő részével (IIi) esik egybe. Ezeket a területeket egy gyengébb immunreakciót mutató vékony sávszerűű zóna, a II. lamina külső része (IIo)választja el egymástól. 9. ábra. CB1 receptor elleni immunreakció megoszlása a gerincvelő felületes hátsó szarvában. a-b, CB1 immunfestődés vad típusú és CB1 knock out egérben. A CB1 immunfestődés megfigyelhető a vad típusú egér gerincvelőjének hátsó szarvában (a), míg a CB1 knock out egérből származó metszeten immunreakció nem látható (b) mutatva, hogy az kísérleteinkhez használt antitest specifikus. c-d, CB1 immunfestődés patkány gerincvelőjének hátsó szarvában az L2 (c) és L4 (d) szegmentum magasságában. Erőteljes CB1 immunreakció látható a gerincvelő I és IIi lamináiban, míg a IIo lamina gyenge immunfestődéstt mutat. Az L4 szegmentumban a IIi lamina mediális felének jelölődése sokkal gyengébb, mint az L2 szegmentum megfelelő területének immunfestődése. Lépték: 100 µm A vizsgálataink középpontjában álló negyedik lumbális szegmentumból készült metszeteken megfigyelhető, hogy a II. lamina belső részének immunreaktivitása csak a hátsó szarv laterális felén jelenik meg, míg mediálisan az immunfestődés kevésbé erőteljes (9. ábra 14

15 d része). Ez a jellegzetes eloszlás a lumbális gerincvelő további szegmentumaiban nem figyelhető meg, ott az immunreakció mind az I, mind a II. lamina belső részében a hátsó szarv teljes mediolaterális kiterjedésében közel azonos erősségű (9. ábra c része). Az általunk vizsgált metszetek egyikében sem sikerült immunfestett sejttestet vagy dendritet azonosítani, a jelölés mindig axonálisan, finom pettyek formájában jelentkezett. A CB1 receptor immunfestődését mindcb1 knockout egér gerincvelőjén,vad típusú egér [23] gerincvelőjénmegvizsgáltuk.a CB1 receptor knock out egér gerincvelőjében nem sikerült CB1 receptort kimutatni (9. ábra b része), míg a vad típusú egérben erőteljes immunfestődést tapasztaltunk (9. ábra a része), így az általunk alkalmazott antitest CB1 receptorra specifikusnak tekinthető. A vad típusú egerek lumbális gerincvelőjének felületes hátsó szarvában a CB1 immunfestődés megoszlása mintázata teljesen megegyezik a patkány gerincvelőjében tapasztalt eloszlással A CB1 receptor és az axonális markerek kolokalizációja CB1 receptor és nociceptív primer afferens markerek kolokalizációja. Általánosan elfogadott, hogy a nociceptív primer afferensek egy része a gerincvelő hátsó szarvában kizárólag glutamáttal valósítja meg az ingerületátvitelt, míg mások a glutamát mellett neuropeptideket is felszabadítanak. A peptiderg nociceptív primer afferensek döntő többsége calcitonin gén-relációs peptidet (CGRP) expresszál, a nem peptiderg primer afferensek sejtmembránja pedig egy speciális poliszacharidot tartalmaz, ami szelektíven képes kötni egy, a Bandeiraea simplicifoliából izolált lektint, az isolectin-b4-et. (IB4) Ezért a nociceptív primer afferensek axonterminálisainak CB1 receptor expresszióját a CB1 receptor immunfestődésének, illetve a CGRP ellenes immunreakciónak (10. ábra a-b-c része) vagy az IB4 kötésnek a kolokalizációja alapján vizsgáltuk (10. ábra d-e-f része). Korábbi vizsgálatokkal összhangban a CGRP ellenes immunreakció a hátsó szarv I. és és IIo laminájára korlátozódott. A CB1 receptor, illetve a CGRP immunfestődésének kolokalizációját vizsgálva, a CB1 immunpozitív profiloknak 22,8± SEM%-a mutatkozott CGRP-re is immunreaktívnak (12. ábra), miközben a CGRP pozitív axonterminálisoknak több mint a fele (54,42±SEM%) expresszált CB1 receptort (13. ábra). Az IB4 kötés alapján feltüntetett nem peptiderg primer afferensek axonterminálisai, korábbi leírásokkal megegyezően túlnyomórészt a IIi laminában helyezkedtek el. A CB1 receptorra pozitív profiloknak csaknem a harmada (30,59±SEM%) kolokalizált az IB4-t kötő 15

16 boutonokkal (12. ábra), amíg az IB4 kötésre nézve pozitív terminálisoknak 33,5±SEM%-a mutatott CB1 immunreakciót (13. ábra). 10. ábra. A gerincvelő felületes hátsó szarvából készített 1 µm vastag konfokális optikaii szelet a CB1 receptor és a CGRP immunfestődés (peptiderg primer afferens boutonok, zöld; b), illetve az IB4 kötés (nem peptiderg primer afferens terminálisok, zöld; e) ) kolokalizációjának bemutatására. Az egymásra vetített képen a keverék szín (sárga) megjelenése jelzi a kettősen jelölt terminálisokat. A kettősen jelölt terminálisokat nyílhegyek jelölik. CB1 receptor immunreaktivitás figyelhető meg mind a peptiderg, mind a nem peptiderg primer afferensek axonterminálisain. Lépték: 2 µm CB1 receptor és a gerincvelőii interneuronok markereinek kolokalizációja. Több kísérletes eredmény alapján a serkentő gerincvelői interneuronok axonterminálisainak markeréül a vezikuláris glutamát transzporter 2-t (VGLUT2) választottuk (11. ábra a-b-c része). Mások eredményeivel összhangban a VGLUT2 immunfestődéss homogén megoszlást mutatott az I-II. laminákban. A CB1 és a VGLUT2 koexpressziójának vizsgálatával a CB1 immunreaktív profiloknak 27,56±SEM%-át azonosítottuk serkentőő 16

17 interneuronok axonterminálisain (12. ábra), a VGLUT2-re pozitív boutonoknak pedig 22,38±SEM%-a kolokalizált a CB1 receptorral (13. ábra). 11. ábra. A gerincvelő felületes hátsó szarvából készített 1 µm vastag konfokális optikaii szelet a CB1 receptor és a VGLUT2 (serkentő gerincvelői interneuronok, zöld; b), illetve a GAD65/67 immunfestődéss (gátló gerincvelői interneuronok, zöld; e) kolokalizációjának bemutatására. Az egymásra vetített képen a keverék szín (sárga) megjelenése jelzi a kettősen jelölt terminálisokat. A kettősen jelölt terminálisokat nyilak jelölik. CB1 receptorr immunreaktivitás figyelhető meg mind a serkentő, mind a gátló intrinsic neuronok axonterminálisain. Lépték: 2 µm Általánosan elfogadott tény, hogy a gerincvelői gátló, GABAerg interneuronok a szinaptikus transzmisszióhoz szükséges γ-amino vajsavat (GABA) glutaminsav-dekarboxiláz (GAD) segítségével szintetizálják, ezért a gátló interneuron nok CB1 receptor expressziójának vizsgálatához a GABAerg terminálisok feltüntetését GAD elleni immunreakció alapján végeztük (11. ábra d-e-f része). A GAD immunfestődés homogénnek, de erőteljesnek mutatkozott a felületes hátsó szarvban. A CB1 receptorokn nak 11,8±SEM%-át azonosítottuk GABAerg boutonon (12. ábra), illetve a GAD pozitív terminálisoknak 22,71±SEM%-a festődött CB1-re is (13. ábra). 17

18 12. ábra. Oszlopdiagram a CB1 receptor és az alkalmazottt axonális kolokalizációjának bemutatására a gerincvelő I-II. lamináiban. markerekk 18

19 13. ábra.oszlopdiagram az alkalmazott axonális markerek kolokalizációjának bemutatására a gerincvelő I-II. lamináiban. és a CB1 receptorr A rhizotomia utánilumbális gerincvelői szakasz, L4-es szegmensének ép (kontralaterális) felületes hátsó szarvában a CB1 receptor disztribúciója: az I-es laminábann mediolaterális, a II belső lamina laterális részének erőteljes CB1 receptor immunfestődésee volt megfigyelhető (14. ábra a része) ).A rhizotomia utáni állapotot mutatja be a része is. Viszont ez utóbbi felvétel a kezelt (ipsilaterális) oldalt demonstrálja. 14. ábra.cb1-rr immunfestődés patkány lumbális gerincvelő felületes hátsó rhizotomia után az ép oldalon (a) illetőleg a kezet oldalon (b). Lépték: 100µm 14. ábra b szarvában, Jól látható, hogy a különböző, peptiderg és nem peptiderg primer afferensek centrális nyúlványait jelölő markerekk nem okoznak immunfestődést csak az ép oldalon (15. ábra). A kontralaterális oldalon a zöld szín a peptiderg boutonok markere, vagyis a kalcitonin gén relálációs peptid (CGRP), a kék pedig a nem peptiderg axonterminálisokat jelöli, tehát az isolectin B4 (IB4) immunreaktivitásátt jelzi. A CB1 receptor immunfestődése viszont mind az ép, mind pedig a műtött oldalon hasonló A CB1 receptor subcelluláris lokalizációja A CB1 receptor és a különböző axonális markerek kolokalizációjának leírása mellettt célunk volt a CB1 receptorr ellenes immunreakció megoszlásának vizsgálata ultrastrukturáliss szinten is. A CB1 receptor jelölését preembedding immunarany jelöléssel végeztük ultravékony metszeteken. A CB1 receptort jelző ezüst partikulumokat kizárólag axonokon sikerült kimutatni, sem sejttesten, sem dendriten nem találtunk ezüströgöt. A CB1 pozitív terminálisok mind szimmetrikus, mind aszimmetrikus szinapszisok kialakításában részt vettek, melyek a serkentő, illetve gátló szinapszisok morfológiai megfelelői (17., 18., 19., ábra). Az 19

20 aszimmetrikus szinapszisok egy részében a serkentő terminálisok dense core vesiculákat is tartalmaztak, melyek jelenléte a peptiderg primerr afferensek terminálisaira jellemző (17., 18. ábra) ). 15. ábra. Dorzális rhizotomia után készült konfokális mikroszkópos felvétel patkány gerincvelőjének hátsó szarváról. Zöld szín jelzi a peptiderg primer afferensek terminálisait (CGRP, a,d), kék színnel a nem peptiderg primer afferensek láthatók (IB4 kötés, b,d). A rhizotomia sikerességét demonstrálja, hogy a gerincvelő intakt (jobb) oldalán mind a CGRP immunreaktivitás, mind az IB4 kötés megtartott, míg a műtött oldalon a primerr afferensek markerei eltűntek. Megfigyelhető, hogy CB1 immunfestődés (piros, c,d) az ép és a műtöttt oldalon is megjelenik, és a két oldal között nincs értékelhető különbség. Lépték: 100µm 20

21 17. ábra. CB1 receptor fehérje subcelluláris lokalizációja.mint minden elektronmikroszkóposs ábrán, így ezen is jól látható, hogy a CB1-R immunogold jelölés számos szinaptikus vesiculát tartalmazó axonterminális (at.) membránjához kötötten jelenik meg (nyilak). A nyílhegyek egy szimmetrikus (gátló) szinapszist jelölnek, amelynek csak részletei kerültekk a metszéss síkjába, így több szinaptikus résként látható. A csillag alakú jelölések dense core vesiculák mellett találhatóak. Ezek vesiculák neuropeptid transzmitterrel töltöttek. Lépték: 500 nm. Megfigyelhető továbbá, hogy a neuronok karakterétől függetlenül a CB1 receptort jelzőő partikulumok minden esetben a plazmamembránhoz asszociáltak. A jelölés specificitását jelzi, hogy az ezüströgök a plazmamembrán protoplazmatikus felszínéhez kötöttek annak megfelelően, hogy a CB1 receptor elleni antitest a receptor intracelluláris epitópjátt ismeri fel. Az általunk megfigyelt ezüst szemcsék minden esetben extraszinaptikusan helyezkedtek el. Mind periszinaptikusan lokalizált, mind a szinapszistól távol elhelyezkedő ezüströgökett sikerült kimutatni, azonbann a szinaptikus appozícióban nem találtunk jelölődést. 21

22 18. ábra.cb1 receptorfehérje subcelluláris lokalizációja (nyilak).lényeges különbség az előzőő ábrához képest a szinapszis funkciójában van: a kérdéses axonvég (at.) gátló szinapszist (nyílhegy) létesít a szomszédos dendrittel (d.). A CB1 immunreaktivitás az axonterminális (at.) membránjához asszociáltan fordul elő, periszinaptikusan. A csillag jelölés itt is egy densee core vesiculát mutat. Jól látható még az aszimmetrikus szinapszis (nyílhegy), posztszinaptikuss része a dendritben (d.) amely mint posztszinaptikus denzitás mutatkozik. A képen egy neuronn sejtmagja (n.) és citoplazmája (c.) is látszik. Az a. jelzés egy myelin hüvellyel rendelkezőő axont jelöl. Lépték: 500 nm. 19. ábra.cb1 receptorfehérje subcelluláris lokalizációja (nyilak). Az ábrán egy dendrittüskével (dt.) szinaptizáló axonterminális (at.) látható. A CB1 megjelenését a nyilak jelölik: jól látható ezen a képen is, hogy a CB1 preszinaptikus, ill. periszinaptikuss elhelyezkedésű. Az aszimmetrikus szinapszist a nyílhegy jelöli. Lépték: 250 nm 22

23 4. Diszkusszió A CB1 receptor expressziójának felfedezése centrális és perifériális neuronokon már a 90-es években felvetette annak lehetőségét, miszerint a CB1 receptor mediált jelátvitel a fájdalomfeldolgozó folyamatok szabályzásában is részt vehet [25,26], majd az első endogén cannabinoid ligandok leírása egyre inkább valószínűsítette, hogy az endocannabinoid rendszer egyik fő feladata a fájdalom modulálása [3]. Számos kísérletes eredmény támasztja alá, hogy a cannabinoidok mérséklik a fájdalmas ingerekre adott magatartási választ mind mechanikai, mind pedig termális, vagy viscerális fájdalom esetén[27,28,29]. Ezen túlmenően több elektrofiziológiai és neurokémiai eredmény bizonyítja, hogy a cannabinoidok hatékonyan csökkentik a gerincvelői neuronok fájdalom-indukált aktivitását [30,31,32]. Ezt a hatást legalább részben a primer afferensek centrális nyúlványain expresszálódó preszinaptikus CB1 receptorok válthatják ki [12], amelyek aktivációja csökkenti a primer afferensek glutamát felszabadulását [33]. Bár mind a primer afferensek centrális axonterminálisainak, mind pedig a hátsó gyöki ganglionsejtek CB1 receptor expressziója egyértelműen bizonyított [34,35], fontos megjegyezni, hogy korábbi elektrofiziológiai vizsgálatok alapján a C és Aδ rostokkal monoszinaptikusan kiváltható posztszinaptikus potenciálokat az anandamid csak a gerincvelői interneuronok egyharmadában, illetőleg kétharmadában csökkentette, ezzel azt jelezve, hogy a primer afferensek egy csoportja nem reagál cannabinoid felszabadulásra [33]. Konfokális mikroszkópos felvételeken végzett kvantitatív elemzéseink alapján a peptiderg primer afferens terminálisoknak több mint a fele, a nem peptidergeknek pedig harmada CB1 receptort expresszál. Ez jó egyezést mutat a korábbi elektrofiziológiai vizsgálatok eredményeivel. Eredményeink alapján azonban figyelembe kell venni, hogy a peptiderg primer afferensek centrális boutonjainak csaknem a felén, a nem peptidergeknek közel kétharmadán nem sikerült CB1 receptort kimutatni jelezve, hogy a nociceptív érző információknak csak egy részét modulálja az endocannabinoid rendszer. Korábbi (neonatális capsaicin injekciót követően) autoradiográfiás [36] és (gerincvelő hemisectióját követő) immunhisztokémiai vizsgálatok [15] szerint a CB1 receptorok egy részét gerincvelői interneuronok expresszálják. Ezt a megállapítást erősíti több elektrofiziológiai vizsgálat, amelyek az endocannabinoid transzmisszióra jellemző preszinaptikus gátlást mind GABAerg [37], mind pedig glutamaterg [12] gerincvelői interneuronok terminálisain bemutatták. Saját leleteink jó egyezést mutatnak az említett morfológiai és funkcionális megfigyelésekkel egyaránt Eredményeink alapján a gerincvelő I- 23

24 II lamináiban kimutatható CB1 receptoroknak 11%-t GABAerg, 27%-át glutamaterg interneuronok expresszálják. Azonban a primer afferensekhez hasonlóan az intrinsic gerincvelői neuronoknak csak egy részében sikerült CB1 receptort kimutatni. Úgy találtuk, hogy a GABAerg boutonoknak 10%-a, a glutamaterg terminálisoknak 28%-a expresszál CB1 receptort. A gerincvelői interneuronoknak tehát nagyobbik hányadának működésére a CB1 receptor mediált jelátvitel nincsen hatással. A CB 1 receptor ultrastruktúrális megoszlására vonatkozó vizsgálatok többsége a receptort nem csak axonálisan, hanem a neuronok sejttestjén és dendritjén is leírja. Ezzel szemben a cannabinoidokalkalmazása a gerincvelőben speciális fiziológiai válaszokat vált ki, melyek a receptor preszinaptikus megjelenését támasztják alá [12,37]. Eredményeink és az elektrofiziológiai leírások jól korrelálnak egymással. Immunarany jelöléses vizsgálatainkban a CB 1 receptort jelző ezüstszemcséket kizárólag axonterminálisokon detektáltuk, jelölt sejttestet, vagy dendritet nem sikerült kimutatni. Eredményeink alapján a gerincvelő felületes hátsó szarvában kimutatható CB1 receptorok mind primer afferensek, mind gátló és serkentő gerincvelői interneuronok axonterminálisain jelentős mértékben expresszálódnak. Korábbi elektrofiziológiai vizsgálatokkal összhangban [12,15,] ezek az eredmények azt sugallják, hogy az endocannabinoidok a gerincvelői szintű fájdalom-feldolgozást primer afferenseken és intrinsic neuronokon egyaránt hatva képesek modulálni. Fontos hangsúlyozni azonban, hogy vizsgálataink alapján a gerincvelő I-II lamináiban expresszálódó CB1 receptoroknak körülbelül a 90%-át tudtuk az általunk vizsgált neuronális elemekhez rendelni jelezve, hogy a CB1 receptoroknak fennmaradó közel 10%-a általunk nem vizsgált neuronok axonterminálisain, vagy a gerincvelő gliális elemein expresszálódnak. 24

25 5.1. Rövidítések jegyzéke BrSt:agytörzs Cer: cerebellum; Col: colliculi; Cx:agykéreg CP: caudato-putamen; GP: globus pallidus; EP: entopedunclaris mag; Hi: hippocampus; SNr: substantia nigra pars reticulata; Th: thalamus 25

26 6. Irodalomjegyzék 1. Matsuda L. A. Lolait S. J., Brownstein M.J. Young A. C.és Bonner: Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cdna. Nature 346, (1990). 2. Devane W. A. et al.: Isolation and structure of a brain constituentthat binds to the cannabinoid receptor. Science 358, (1992). 3. Di Marzo V. et al.: Formation and inactivation of endogenous cannabinoidanandamide in centralneurons. Nature 372, (1994). 4. Sugira T. et al.: 2-Arachidonoylglycerol: a possible endogenous canabinoid receptor ligand in brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 215, (1995). 5. Mechoulam R. et al.: Identificationof an endogenous 2-monoglyceride, present in carine gut, that binds to cannabinoid receptor. Biochem. Pharmacol. 50, (1995). 6. Hanus L.et al.: 2-Arachidonyl-glycerol ether, an endogenous agonist of the cannabinoid CB1 receptor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98, (2001). 7. Piomelli D.: The molecular logic of endocannabinoid signaling. Nature Reviews/ Neuroscience, vol , (2003). 8. Stella N., Schweitzer P. és Piomelli D.: A second endogenous cannabinoid that modulates long-termpotentiation.nature 388, (1997). 9. Porter A. et al.: Characterization of a novel endocannabinoid, virodhamin with antagonist activity at the CB1 receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 301, (2002). 10. Freund T. F., Katona I. és Piomelli D.: Role of endogenous cannabinoids in synaptic signaing. Physol. Rev. 83, (2003). 11. Ohno-Shosaku T., Hashimotodani Y., Maejima T., Kano M.:Calcium signaling and synpatic modulation: Regulation of endocannabinoid-mediated synaptic modulation by calcium. Cell Calcium 38, (2005). 12. Morisset V., Ahluwalia J., Nagy I., Urban L.: Possible mechanisms of cannabinoidinduced antinociception in spinal cord. European Journal of Pharmacology 429, (2001) 13. Ohno-Shosaku T., Maejima T., Kano M.: Endogenous cannabinoids mediate retrogradesignals from depolarized postsynaptic neurons to presynaptic terminals. Neuron, vol. 29, (2001). 14. Salio C. et al.: Pre- and postsynaptic loalization of the CB1 cannabinoid receptor in the dorsal horn of the rat spinal cord. Neuroscience 110, (2002). 26

27 15. Farquhar-Smith W. P., et al.: Cannabinoid CB1 receptor expression in rat spinal cord. Mol. Cell. Neurocsi. 15, (2000). 16. WilsonR. I., Kunos G., Nicoll R. A.: Presinaptic specificity of endocannabinoid signalling in the hippocampus. Neuron 31, 1-20 (2001). 17. Daniel H.et al.: Control of Ca 2+ influx bycannabinoid and metabotropic glutamate receptors in rat cerebellar cortex requires K + chanels. J. Physiol. 537, (2000). 18. Robbe D., et al.: Localization and mechanisms of action of cannabinoid receptorsat the glutamatergic synapes of the mouse nucleus accumbens. J. Neurosci. 21, (2001). 19. Wilson R. I., Nisoll R. A.: Endocannabinoid signalling in the brain. Science 296, (2002). 20. Carlson G., Wang Y., Alger B. E.: Endocannabinoids facilitate the induction of LTP in the hippocampus. Nature Neurosci. 5, (2002). 21. Herkenham M, et al.: Cannabinoid receptorlocalization in brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, (1990). 22. Ong W.Y., Mackie K.: A light and electron microscopic study of the CB1 cannabinoid receptor in primate brain. Neuroscience 92, (1999). 23. Ledent C., et al: Unresponsiveness to cannabinoids and reduced addictive effect of opiates in CB1 receptor knockout mice.science 283, (5004) (1999). 24. Munro S. et al.: Molecular characterization of a pheripheral receptor for cannabinoids. Nature 365, (1993). 25. Herkenham M., Lynn AB., Johnson MR., Melvin LS., de Costa BR., Rice KC.: Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a quantitative in vitro study. J. Neurosci. 11, (1991). 26. Tsou K., Brown S., Sanudo-Pena MC., Mackie K., Wlker JM.: Immunhistochemical distribution of cannabinoid CB1 receptors in the rat central mervous system. Neuroscience 83, (1998). 27. Buxbaum DM.: Analgesic activity of 9-tetrahidrocannabinol in the rat and mouse. Psychopharmacologia 25, (1972). 28. Welburb PJ., Starmer GA., Cheter GB., Jackson DM.: Effect of cannabinoids on the abdominal constroction response in mice: within cannabinoid interactions. Pychopharmacologia 46, (1976). 29. Richardson JD., Anonsen L., HargreavesKM.: Antihyperalgesic effect of spinal cannabinoids. Eur. J. Pharmacol. 345, (1998). 27

28 30. Meng ID., Manning BH., Martin WJ., Fields HL.: An analgesic circuit activated by cannabinoids. Nature 395, (1998). 31. Harris J., Drew LJ., Chapman V.: Spinal anandamide inhibits nociceptive transmission via cannabinoid receptor activation in vivo. Neuroreport. 11, (2000). 32. PertweeRG.: Cannabinoid receptors and pain. Prog. Neurobiol.63, (2001). 33. Luo C., Kumamoto E., Furue H., Chen J., Yoshimura M.: Anandamide inhibits excitatory transmission to rat substantia gelatinosa neuron sin manner different from that of capsaicin. Neurosci. Lett. 321, (2002). 34. Hohmann AG., Herkenham H.: Localization of central cannabinoid CB1 receptor messenger RNA in neuronal subpopulations of rat dorsal root ganglia: double-label in situ hybridisation study. Neurosci. 90, (1999). 35. Bridges D., Rice AS., Egertová M., Elphick MR., Winter J., Michael GJ.: Localization of cannabinoid receptor 1 in rat dorsal root ganglion using in situ hybridisation and immunhistochemistry. Neurosci. 119, (2003). 36. Hohmann AG., Herkenham H.: Regulation of cannabinoid and mu opioid receptor binding sites following neonatal capsaicin treatment. Neurosci. Lett. 252, (1998). 37. Jennings EA., Vaughan CW., Christine MJ.: Cannabinoid action on rat superficial medullary dorsal horn neuron sin vitro. J. Physiol. 534, (2001). 28