4.1. A bélidegrendszer nitrerg neuronjainak vizsgálata fejlődő csirkeembrióban

Átírás

1 4. Eredmények 4.1. A bélidegrendszer nitrerg neuronjainak vizsgálata fejlődő csirkeembrióban Kvalitatív vizsgálataink azt mutatták, hogy a PM-ben a ganglionok és internodális ágak a 12. embrionális napon a kifejlett állatéhoz hasonlóak (3. ábra). A NADPH-dpozitív sejtek perikarionja sötét volt, a sejtmag nem festődött (4. ábra). A dendritek szintén megfestődtek, de a nyúlványok finom elágazódásai már nem látszottak. A nitrerg sejtek többsége a ganglionokban volt, csak néhány neuron helyezkedett el az internodális szegmensekben. A 12. és 19. embrionális nap között a PM jól látható morfológiai változáson ment keresztül. A 12. napon a ganglionok közel helyezkedtek el egymáshoz és rövid internodális szegmensekkel összekötve sűrű szövedéket alkottak. A 19 napos embriókban a PM-ben a ganglionok eltávolodtak egymástól, az összekötő szálak megnyúltak és a fonadék fellazult (5. ábra). A vékonybél proximalis szakaszán és a vastagbélben ezek a változások a 13. embrionális napon már jól látszottak, míg a vékonybél distalis részén csak a 14. embrionális napon észleltük az említett morfológiai változásokat. Nemcsak a PM morfológiája változott meg a vizsgált időszak alatt, de az egyes nitrerg neuronok alakja, festődési intenzitása és mérete is (6. ábra). Kvantitatív vizsgálatainkban a ganglionok és nitrerg neuronok denzitását, valamint az egy ganglionra eső nitrerg neuronok számát tanulmányoztuk (3. táblázat, 7. ábra). Ennek során azt találtuk, hogy a ganglionok területegységre (1 ) vonatkozó száma (denzitása) különböző mértékben csökkent a három vizsgált bélszakaszban (3. táblázat, 7.A ábra). A vastagbél területén a ganglionok denzitása a napok között csökkent szignifikánsan, míg a proximalis és distalis vékonybélben a napok közt történt szignifikáns csökkenés. A ganglionok denzitása nemcsak az egyes életkorokban 26

2 mutatott regionális különbségeket, hanem egy adott életkorban is voltak különbségek a bélszakaszok között. A 19. embrionális napra a ganglionok denzitása a 12. napon számolt értéknek egyötöde volt. A 19. napon a ganglionok denzitása szignifikánsan különbözött a három vizsgált bélszakaszon. A NADPH-d-pozitív sejtek denzitása az embrionális kor előrehaladtával szignifikánsan (p<0,001) csökkent, de ennek a számbeli csökkenésnek a dinamizmusa az egyes bélszakaszokban eltérő volt (3. táblázat, 7.B ábra). A vékonybél proximalis szakaszában a nitrerg sejtek denzitása szignifikáns csökkenést mutatott a vizsgált időszakban. A distalis vékonybélben és a vastagbélben a nitrerg sejtek denzitása először a embrionális nap között mutatott szignifikáns csökkenést. A 14. napig a három bélszakaszt összehasonlítva, a NADPH-d-pozitív sejtek denzitása között szignifikáns különbség nem volt. 3. ábra A 12 napos csirkeembrió beléből készített wholemount preparátum NADPH-d festés után. A különböző méretű ganglionokat (nyíl) rövid internodális szegmentumok (nyílhegy) kötik össze. A PM a hosszanti izomzat felszínén sűrű hálozatot alkot (x240). 4. ábra A 3. ábrán látható PM részlete. A közel azonos méretű neuronok (nyíl) főleg a ganglionokban találhatók, de előfordulnak az internodális szegmensekben is. A sejtek citoplazmája sötétre festődött, a sejtmagok nem festődtek (x670). 27

3 5. ábra A 19 napos csirkeembrió beléből készített wholemount preparátum NADPH-d festés után. A ganglionok (nyíl) jól elhatárolódtak egymástól, az internodális szegmentumok (nyílhegy) hosszúak. A hosszanti izomzat felszínén a PM laza hálózatot képez (x240). 6. ábra Az 5. ábrán látható PM részlete. A NADPH-d-pozitív sejtek (nyíl) alakja, mérete és festődési intenzitása változatos. Néhány sejten a dendritek (kettős nyílhegy) is megfigyelhetők (x670). Inkubációs napok Proximalis vékonybél Distalis vékonybél Vastagbél Ggl./ E12 77,56± 20,5 E13 64,84± 12,99 E14 33,64± 0,99 E19 13,07± 3,08 neuron/ 1168,45± 159,12 912,07± 217,04 467,28± 70,87 257,6± 38,22 neuron/ ggl. 15,065± 1,5 14,067± 1,72 13,898± 0,99 19,707± 1,98 Ggl./ 105,27± 8,87 99,35± 17,46 72,51± 9,73 20,02± 7,48 neuron/ 1170,2± 199, ,69± 53,11 463,62± 40,77 432,24± 80,85 neuron/ ggl. 6,667± 1,01 6,198± 0,56 6,48± 0,67 15,067 ±1,5 Ggl./ 98,47± 9,18 72,33± 3,7 71,1± 5,93 10,8± 1,58 neuron/ 1006± 82,42 998,3± 62,79 750,3± 68,77 151,2± 57,83 neuron/ ggl. 10,218± 0,87 13,869± 0,99 10,55± 0,8 14± 1,67 3. táblázat A ganglionok denzitása (ganglion/ ), a NADPH-d-pozitív neuronok denzitása (nitrerg neuron/ ) és a nitrerg neuron/ganglion arány a 12., 13., 14. és 19. embrionális napon csirke PM-ben. Az adatok mint átlag szerepelnek a táblázatban. A 14. napon a vastagbélben több nitrerg neuront találtunk, mint a másik két szegmensben. A 19. inkubációs napon a három vizsgált bélszakaszban a nitrerg neuronok denzitása szignifikánsan különbözött egymástól. 28

4 Ganglion/négyzetmilliméter A neuron/négyzetmilliméter B neuronok száma/ganglion p ro x im a lis v é k o n y b é l d is ta lis v é k o n y b é l v a s ta g b é l 0 C E 1 2 E 1 3 E 1 4 E 1 9 E m b rio n á lis k o r (n a p ) 7. ábra A ganglionszám (A), a NADPH-d-pozitív sejtszám (B) és a nitrerg neuron/ganglion arány (C) változásait bemutató oszlopdiagramok 12, 13, 14 és 19 napos csirkeembrióban. Az adatok mint átlag szerepelnek az ábrán. A 14. naptól a ganglionszámban és a nitrerg sejtszámban szignifikáns (p<0,001) különbség mutatkozott a vizsgált bélszakaszok között. A nitrerg neuron/ganglion arány a 19. inkubációs napra szignifikánsan (p<0,001) megnőtt mindhárom vizsgált bélszakaszban, a distalis vékonybél szakaszban megkétszereződött. 29

5 A inkubációs napok során a nitrerg sejt/ganglion arány, vagyis az egy ganglionra eső nitrerg neuronok száma, hullámformájú mintázatot mutatott a bélcső hossztengelye mentén (3. táblázat, 7.C ábra). Ebben az időszakban a NADPH-d-pozitív sejtek száma a proximalis vékonybélben és a vastagbélben gangliononként 10-14, míg a distalis vékonybélben csupán 6-7 volt. A 19. embrionális napra ez a mintázat megváltozott, a proximalis szakaszon 20 nitrerg neuron volt egy-egy ganglionban, ezzel szemben a distalis vékonybélben és a vastagbélben átlagosan embrionális nap 19. embrionális nap Bélszakaszok Ganglion/ neuron/ neuron/ganglion Ganglion/ Duodenum 64,84 912,07 12,26 13,07 ±2,59 ±45,72 ±1,58 ±1,58 Jejunum 99, ,69 9,46 18,47 ±7,85 ±62,48 ±1,22 ±2,12 Jejunum 40,61 575,34 12,35 18,47 ±4,77 ±64,7 ±1,34 ±1,48 Ileum 77,39 937,52 10,56 17,78 ±7,76 ±93,15 ±0,57 ±1,92 Ileum 82, ,89 10,67 16,56 ±6,43 ±144,82 ±1,66 ±1,52 Ileum 106, ,1 8,7 16,73 ±6,80 ±61,03 ±1,57 ±2,19 Colon 96, ,58 17,08 ±8,12 ±37,23 ±1,57 ±1,92 Colon 10,81 ±1,3 neuron/ 257,6 ±45,97 408,71 ±50,78 333,59 ±10,6 349,11 ±37,25 392,68 ±43,66 351,2 ±32, ±53,94 151,29 ±39,34 neuron/ganglion 17,17 ±1,73 20,39 ±1,38 19,4 ±1,39 17,17 ±1,18 20,67 ±1,11 18,29 ±0,66 17,09 ±1,11 12,2 ±1,24 4. táblázat A ganglionok denzitása (ganglion/ ), a NADPH-d-pozitív neuronok denzitása (nitrerg neuron/ ) és a nitrerg neuron/ganglion arány a 13. és 19. embrionális napon a csirke PM-ben, a bélcső teljes hosszában. Az adatok mint átlag szerepelnek a táblázatban. A 13 és 19 napos embriók esetében a kvantitatív vizsgálatokat a bél teljes hosszára kiterjesztettük (4. táblázat, 8. ábra). A 13. embrionális napon a ganglionok denzitása változatos eloszlást mutatott a bél hossztengelye mentén (4. táblázat, 8.A ábra). Az ileum kivételével minden bélszakasz között szignifikáns különbség volt a ganglionális denzitásban. Kiugróan magas denzitást találtunk a jejunum oralis szakaszán és az ileum 30

6 analis végén, míg a jejunum aboralis területén kevés gangliont figyeltünk meg. A 19. embrionális napra a ganglionok denzitása csökkent a 13. naphoz képest. Ekkor a ganglionok eloszlása egyenletes volt az egész bélben. A duodenum és a vastagbél területén szignifikánsan kevesebb gangliont találtunk, mint az azokkal szomszédos területeken Ganglion/négyzetmilliméter A neuron/négyzetmilliméter B 2 4 neuron/ganglion e m b r i o n á l i s n a p 1 9. e m b r i o n á l i s n a p 8 6 C d u o d e n u m j e j u n u m j e j u n u m i l e u m i l e u m i l e u m c o l o n c o l o n B é l s z a k a s z o k 8. ábra A grafikonok a ganglionok denzitását (A), a nitrerg neuronok denzitását (B) és a nitrerg neuron/ganglion arányt (C) ábrázolják a bél teljes hosszában 13 és 19 napos csirkeembriókban. A ganglionok és a nitrerg neuronok eloszlása a 13 napos embriókban szignifikáns különbségeket mutatott, míg a 19. napon a ganglionok területi eloszlása egyenletes volt. Az egy ganglionra eső nitrerg neuronok száma a 19. inkubációs napra minden bélszakaszban szignifikánsan megnőtt, az oralis jejunumban és az analis ileumban megkétszereződött. 31

7 A 13. embrionális napon a nitrerg neuronok denzitása hasonló mintázatot mutatott a ganglionok denzitás mintázatával (4. táblázat, 8.B ábra). A distalisabb jejunum területén a ganglionok alacsony denzitásának megfelelően a nitrerg neuronok denzitása is alacsony volt. Szignifikáns különbségek csak a jejunum és a jejunummal szomszédos szakaszok közt mutatkoztak. A nitrerg sejtek eloszlási különbségei az egyes bélszakaszok között a 19. embrionális napra kiegyenlítődtek. Szignifikáns különbséget ekkor csak a duodenum és a duodenumtól aboralisan elhelyezkedő terület között, illetve a vastagbél és a vastagbéltől oralisan található terület között láttunk. A nitrerg sejtek denzitásának csökkenése a teljes bélen végzett vizsgálatban is tapasztalható volt. A nitrerg neuron/ganglion arány mind az egyes bélszakaszokban, mind az egyes életkorokban jelentős változást mutatott (4. táblázat, 8.C ábra). A 13. embrionális napon a duodenumban, a jejunumban és a vastagbélben magasabb, míg a jejunum oralis részén és az ileumban alacsonyabb volt a nitrerg neuron/ganglion arány. A 19. embrionális napra a jejunum oralis részén és az ileumban magas nitreg neuron/ganglion arányt számoltunk, míg a vastagbélben az arány megegyezett a 13. embrionális napon számolt értékkel. 32

8 4.2. Az összneuronszám változásai a kikelés előtti csirkeembrióban és frissen kikelt csirkében Mind a kuprolin kék, mind a neurofilament immunfestés nagy specificitással jelölte a myentericus neuronokat (9-11. ábra). A kuprolin kék elsősorban a neuronalis sejttesteket festette, míg a neuronális nyúlványok és a bélfal egyéb szövetelemei, úgy mint a gliasejtek, simaizomzat vagy erek festetlenek maradtak (9. ábra). A kuprolin kék festés homogén neuronalis jelölést eredményezett, így lehetővé tette korrekt kvantitatív vizsgálatok végzését. 9. ábra A 4 napos csirke belének distalis vékonybél szegmenséből készített wholemount preparátum kuprolin kék hisztokémiai festés után. A neuronalis sejttestek jól jelölődtek és a körvonalaik könnyen kivehetők (nyíl). A neuropil régió (csillag) nem festődött (x670). Az NF által megjelölt populáció morfológiailag változatosnak bizonyult és a neuronalis nyúlványok intenzív jelölődése miatt nehéz volt az egyes neuronokat elkülöníteni egymástól (10. ábra). Az NF festés elsősorban uniaxonalis, multidendriticus neuronokat, néhány esetben pedig adendriticus neuronokat is jelölt. A 33

9 sejtméret alapján az NF-pozitív idegsejtek két csoportot képeztek. A nagyobb sejttesttel rendelkezők perikarion területe átlagosan 350 µm 2, a kisebbeké 170 µm 2 volt. 10.A ábra A 7 napos csirke belének középső vékonybél szegmenséből készített wholemount preparátum neurofilament immuncitokémiai festés után. A festés kisebb (nyílhegy) és nagyobb méretű neuronokat (nyíl) is jelölt (x670). 10.B ábra Sötéten festődött sima felszínű és több hosszú nyúlvánnyal (A) rendelkező idegsejt (x1150). A két markerrel végzett kettősjelölés során láthatóvá vált, hogy a ganglionokon belül a neuronoknak nagy hányada csak kuprolin kékkel festődött (11. ábra). A kettősfestésből származó adatok nem voltak homogének, így ANOVA elvégzése nem volt lehetséges. Szemikvantitatív vizsgálataink kiderítették, hogy a myentericus neuronoknak csupán mintegy 30-35%-a volt kettősen jelölt, a neuronoknak 65-70%-a kizárólag kuprolin kékkel jelölődött. A kvantitatív analízis során a ganglionok denzitását, a neuronok denzitását és az egy ganglionra eső összneuronszámot vizsgáltuk (5. táblázat, 12. ábra). Az analízis során kiderült, hogy a 19. embrionális napon a ganglionok denzitása a vékonybél 34

10 középső és distalis részében nagyobb, mint a vékonybél proximalis részében vagy a vastagbélben (12.A ábra, 5. táblázat). A ganglionok denzitása a kikelést követő első hét során minden vizsgált szegmensben szignifikánsan (p<0,001) csökkent, kivéve a kikelés utáni 2-4. nap közti időszakot. A kikelés utáni 7. napon a különböző bélszakaszok ganglionális denzitásában nem volt szignifikáns különbség. 11.A ábra A 7 napos csirke belének distalis vékonybél szegmenséből készített wholemount preparátum kuprolin kék hisztokémiai és neurofilament immuncitokémiai kettős festés után. A neurofilament immunfestés intenzíven jelölt nagy méretű neuronokat (kettős nyílhegy). Néhány neuron mindkét markerrel jelölődött (nyílhegy). Számos neuront csak a kuprolin kék festés jelölt meg (nyíl) (x670). 11.B ábra Egy hosszú (A) és több rövid nyúlvánnyal (O) rendelkező nagy méretű immunjelölt neuron (x1150). A neuronok denzitása a 19. embrionális nap és a kikelést követő 1. valamint a 4. és 7. nap között szignifikánsan csökkent (p<0,001) (5. táblázat, 12.B ábra). A kikelést követő 1-2. és 2-4. nap között a neuronok denzitásának csökkenése nem volt szignifikáns. 35

11 Ggl./ ± SE E19 25,42 ± 3,6 P1 13,62 ± 3,2 P2 9,08 ± 1,9 P4 7,95 ± 2,5 P7 4,54 ± 1,5 Proximalis vékonybél Neuron/ ± SE 767,68 ± 374,6 721,86 ± 375,3 549,34 ± 355,2 496,88 ± 259,7 384,54 ± 331,4 Neuron/ ggl. ± SE 30,2 ± 11,6 53 ± 31,6 60,5 ± 38,5 62,5 ± 30,8 84,7 ± 44,5 Ggl./ ± SE 46,54 ± 10,4 15,44 ± 3,5 12,71 ± 2,2 8,63 ± 1,8 5,9 ± 1,9 Középső vékonybél Neuron/ ± SE 1079,73 ± 573,2 489,45 ± 168,1 566,87 ± 349,9 415,1 ± ,13 ± 77,7 Neuron/ ggl. ± SE 23,2 ± 11,6 31,7 ± 12,9 44,6 ± 21,7 48,1 ± 40,8 40,7 ± 7,6 Ggl./ ± SE E19 46,08 ± 7,7 P1 17,03 ± 5,3 P2 15,89 ± 3,4 P4 12,71 ± 4,8 P7 5,9 ± 1,2 Distalis vékonybél Neuron/ ± SE 1115,14 ± 507,5 653,95 ± 377,7 684,75 ± 352,2 474,51 ± ,84 ± 186,2 Neuron/ ggl. ± SE 24,2 ± 9,9 38,4 ± 21,3 36,8 ± 24,2 37,9 ± 19,4 47,6 ± 25,9 Ggl./ ± SE 26,11 ± 5,5 14,98 ± 4,6 5,45 ± 1,2 14,98 ± 2,4 4,09 ± 1 Vastagbél Neuron/ ± SE 731,08 ± ,98 ± 167,8 219,64 ± 71,2 702,56 ± 497,3 208,99 ± 154 Neuron/ ggl. ± SE 28 ± 6,9 26,1 ± 8,8 40,3 ± 15,5 46,9 ± 28,9 51,1 ± 31,6 5. táblázat A ganglionok denzitása, neuronok denzitása és az egy ganglionban található neuronok száma a 19 napos és az 1, 2, 4 és 7 napos csirke proximalis, középső és distalis vékonybelében valamint vastagbelében. Az adatok mint átlag±se szerepelnek. Az egy ganglionra eső átlagos neuronszám mindvégig növekedő tendenciát mutatott. A 19. inkubációs nap és a kikelést követő 2. nap között minden szegmensben szignifikánsan (p<0,001) megnőtt (5. táblázat, 12.C ábra). A kikelést követő 1. nap után a proximalis vékonybélben a neuron/ganglion arány szignifikánsan nagyobb volt, mint a többi három szegmensben. 36

12 60 50 Ganglion/négyzetmilliméter A Neuron/négyzetmilliméter B proximalis vékonybél középszakasz distalis vékonybél vastagbél 120 Neuron/ganglion arány C E 19 P1 P2 P4 P7 Fejlődés (nap) 12. ábra A ganglionok denzitása (A), neuronok denzitása (B) és az egy ganglionra eső neuronszámot (C) ábrázoló oszlopdiagramok a proximalis, középső és distalis vékonybélben valamint a vastagbélben 19 napos csirkeembrió és frissen kikelt 1, 2, 4 és 7 napos csirke PM-ben. Az adatok mint átlag±se szerepelnek. 37

13 4.3. A fejlődő humán bélidegrendszer glutamáterg rendszerének vizsgálata Az anti-glutamát antitest specifikusan jelölt számos myentericus neuront a humán magzati PM-ben (13. ábra). A festés intenzíven jelölte mind a neuronalis sejttesteket, mind a neuronok nyúlványait, ami lehetővé tette a glutamáterg neuronok morfológiai osztályozását. Szemikvantitatív vizsgálataink azt mutatták, hogy a glutamáterg neuronok többsége, mintegy 80%-a nagyobb sejttesttel és lamelláris dendritekkel rendelkezett, míg a neuronok 20%-a kisebb sejttestű és sima felszínű volt (6. táblázat). 13.A ábra Glutamát-immunreaktív neuronok és nyúlványaik egy humán magzati myentericus ganglionban. A glutamáterg neuronok kis hányada sima felszínű (csillag) (x670). 13.B ábra Számos lamelláris dendrittel (nyílhegy) és egy axoneredéssel (nyíl) rendelkező glutamáterg myentericus neuron (x1150). 38

14 Immunreaktivitás Immunreaktív sejtek száma/ Glutamát 320 Glu - nagy perikarion 256 Glu - kis perikarion 64 NR1 alegység 160 VIP táblázat A bélfal egy -ére eső immunreaktív sejtek száma. A glutamáterg neuronok nagy többsége (80%) nagy perikarionnal, míg kisebb része (20%) kis, sima felszínű perikarionnal rendelkezett. A glutamáterg neuronokhoz képest az NR1- és VIP-pozitív neuronokból sokkal kevesebb található a fejlődő humán PM-ben. 14. ábra NMDA receptor NR1 alegység-immunpozitív neuronok a humán magzati vékonybél egy myentericus ganglionjában. Az immunreaktív szemcsék elsősorban a sejtfelszínen (nyíl) és a neuronalis nyúlványokon (nyílhegy) helyezkednek el. Néhány sejtben az immunreaktív szemcsék a citoplazmában koncentrálódnak (csillag) (x670). Az NMDA receptor NR1 alegységének C-terminális része ellen termelt antitest szintén nagy szelektivitással jelölt myentericus neuronokat (14. ábra). Az NR1 immunreaktivitás szemcsés képet mutatott, főleg sejtfelszíni lokalizációval, azonban a szemcsék néha citoplazmatikusan is megfigyelhetők voltak. Az NR2B-immunpozitív 39

15 granulumok gyakran láthatóak voltak a myentericus neuronok citoplazmájában és felszínén is (15. ábra), ugyanakkor az NR2A alegység C-terminális része ellen termelt antitest kizárólag citoplazmikus festést eredményezett (16. ábra). Az NR2A festés nemcsak neuronokat, hanem számos kisebb, a Cajal-féle interstitialis sejtekre emlékeztető sejtet is festett (16.ábra). 15. ábra Humán magzati vékonybélből készített paraffinmetszet az NMDA receptor NR2B alegységre végzett immunfestés után. A myentericus ganglionra (MG) diffúz festődés jellemző. A diffúz festődés mellett sejtfelszínen lokalizált jelölés (nyíl) is megtalálható. A csillag egy entericus neuron sejtmagját jelöli (x670). 16. ábra Humán magzati vékonybélből készített paraffinmetszet az NMDA receptor NR2A alegységre végzett immunfestés után. Nemcsak myentericus neuronok (csillag), de Cajal-féle interstitialis sejtekre emlékeztető sejtek (nyíl) is megfestődtek (x670). 40

16 17. ábra VIP-immunpozitív myentericus neuron. Mind a sejttest (csillag), mind a nyúlványok (nyílhegy) intenzív VIP-pozitivitást mutatnak (x670). 18. ábra A 17. ábrán látható neuron NMDA receptor NR1 alegység-immunjelölés után. A sejttest (csillag) NMDA NR1 alegységre pozitív, míg a nyúlványok festetlenek maradtak (x670). 19. ábra NOS/NMDA receptor NR1 alegység kettős fluoreszcens immunfestés humán magzati vékonybélből készített wholemount preparátumon. Az NR1-pozitív szemcsés jelölés (nyíl) szétszóródva helyezkedik el NOS-pozitív (X) és nem NOS-immunpozitív sejtek (O) körül. Bizonyos NOS-pozitív neuronok (csillag) nem rendelkeznek NMDA NR1 alegység-pozitivitással (x400). 41

17 20. ábra VIP/NOS/NMDA receptor NR1 alegység hármas fluoreszcens immunfestés humán magzati vékonybélből készített wholemount preparátumon. Az NR1-immunpozitivitás elsősorban VIP-pozitív neuronalis sejttestek (X) körül látható. A tisztán NOS-pozitív neuronok (O) körül VIP-pozitív varikozitások (nyílhegy) figyelhetők meg. A NOS-pozitív neuronok ritkán rendelkeznek NR1 pozitivitással. A NOS/VIP kettősjelölt neuronok (csillag) körül NR1-pozitív szemcsék is megfigyelhetők (x240). A myentericus neuronok egy kis csoportja VIP-immunpozitivitást mutatott (17. és 20. ábra, 6. táblázat). A VIP-pozitív neuronok kis hányada NMDA NR1 alegység (17. és 18. ábra) és NOS-immunreaktivitást is mutatott (20. ábra). A NOS-immunpozitív neuronok gazdag glutamáterg (19. ábra) és VIPerg innervációval rendelkeztek (20. ábra). A tisztán NOS-pozitív neuronok csak ritkán expresszáltak NMDA NR1 alegységet, míg a VIP/NOS kettősjelölt myentericus idegsejtek körül gyakran találhatók NMDA receptorok. 42