GMO polémia. Konferencia összefoglaló. Keszthely, Pannon Egyetem, Georgikon Kar szeptember 28.

Átírás

1 GMO polémia Konferencia összefoglaló Keszthely, Pannon Egyetem, Georgikon Kar szeptember 28.

2 Tartalomjegyzék Előszó Balázs Ervin, MTA Mezőgazdasági Kutatóintézet, Martonvásár 2 1. GM technikák és praktikák Sági László, MTA Mezőgazdasági Kutatóintézet, Martonvásár 3 2. Géntechnológiai kutatás és fejlesztés a növények abiotikus stressztűrésének javítására Györgyey János, MTA Szegedi Biológiai Központ, Szeged GM növények gazdasági hatásai Popp József, Agrárgazdasági Kutató Intézet, Budapest A GM növények (és élelmiszerek) társadalmi elutasításának okai Venetianer Pál, MTA Szegedi Biológiai Központ, Szeged GM növények a fejlődő és fejlett országokban. Óvilág versus Újvilág Balázs Ervin, MTA Mezőgazdasági Kutatóintézet, Martonvásár 52 2

3 Előszó A molekuláris biológiai forradalomnak köszönhetően, elérkeztünk egy olyan korba, amikor a genetikai információ ismeretében egy tulajdonságot, örökítő kódot izolálni tudunk, szerkezetét meghatározni, és még más élőlénybe juttatva azt megnyilvánítani. Ezen géntechnológiai módosítás ma már szinte rutinszerűen végezhető el a molekuláris biológiai laboratóriumokban, eredményezve a genetikailag módosított élőlényeket, a GMOkat. Érdekes módon, míg a géntechnológiailag módosított mikrobák felhasználását sem az iparban (mosópor-gyártás), sem pedig a gyógyszeriparban a társadalmak jó része nem ellenzi, addig a mezőgazdasági alkalmazásaikat illetően megosztott a közvélemény. Kétségtelen, hogy az új technológia a társadalom nagy része számára vagy nem érthető, vagy ismeretanyag hiányában ütközik ellenérzésekbe. Még napjaink középkorú generációi sem ismerkedtek meg tanulmányaik során a molekuláris biológia eredményeivel, felfedezéseivel, így érthető az idegenkedés. Ezt még az elektronikus és nyomtatott sajtó bulvárosodása is erősíti. A média szinte minden területen a szenzációkra, egyes egyedi eseményekre koncentrálva általánosít, és sok esetben félretájékoztat. A sajtó álláspontját szellemesen jellemzi Venetianer Pál professzor egy interjúban említett hasonlata, melyet a következőkben foglalt össze: A média megkérdezi Könyves Kálmán királyunkat, a római pápát és az Amerikai Tudományos Akadémiát, hogy vannak-e boszorkányok? Mindhárom megkérdezett azt állítja, hogy boszorkányok pedig nincsenek. Ezzel szemben Lőrincz Emma néni a Ló utcából látott egyet, így a pártatlan közszolgálati szellemű újságíró nem tudja eldönteni a kérdést. E magatartásból világosan látható, hogy az átlag olvasó minden oldalról megkapta a tájékoztatást, és dönthet, mely álláspontot fogadja el. Közismert az is, hogy az újságokban megjelenő hírnek csak akkor van értéke, ha növeli a példányszámot, valódiságtartalma nem igazán fontos. Így kerülhetnek az újságok címoldalára azok a szenzációs bejelentések, miszerint osztrák tudósok megállapították, hogy a géntechnológiailag módosított kukoricával etetett patkányok szexuális potenciája csökken. Azt, hogy az e hír alapján tett osztrák kormányintézkedést vissza kellett vonni, mivel fény derült arra, hogy a szenzációs bejelentés tudományosan megalapozatlan, már nem érte el a sajtó ingerküszöbét, és még csak rövid hírben sem jelent meg. Ezzel az olvasóban és elsősorban a technológiát ellenzőkben az eredeti téves hír marad meg, amit aztán unos-untalan idéznek mint tényt. További hasonló hírekre számos példát lehetne sorolni. A tudomány felelőssége egyben az is, hogy korrekt, tényszerű tájékoztatást adjon a társadalomnak a kifejlesztett technológiával kapcsolatosan. Ezt hivatott szolgálni e rendezvényünk, hogy a GMO-kkal kapcsolatos polémiát megvilágítsuk. Az elhangzott előadások írásos formáját tartalmazza kiadványunk, mely reményeink szerint támpontot ad ahhoz, hogy szenzációk nélkül, érzelemmentesen fogadjuk és értékeljük a géntechnológia adta lehetőségeket, melyre véleményünk szerint a mezőgazdaságnak is szüksége van, hogy fenntartható fejlődését és az élelmiszerbiztonságot garantáljuk a jövő nemzedéke számára. Martonvásár, szeptember 28. Balázs Ervin Pannon Növény-Biotechnológiai Egyesület 3

4 1. GM technikák és praktikák Sági László MTA Mezőgazdasági Kutatóintézet Martonvásár 1. Bevezető Az élettudományok művelői gyakran hiszik azt, hogy kutatási témáik jelen esetben a genetikailag módosított (GM) növények előállításának technikai részletei önmagukban is annyira érdekesek, hogy elkerülhetetlenül meggyőzik a vonakodó vagy értetlen nyilvánosságot, és az emberek önként és dalolva válnak felfedezéseik híveivé. Esetünkben ez azt jelentené, hogy az emberek végül tömegesen vásárolják és fogyasztják a GM termékeket. Mi sem bizonyítja jobban, hogy ez az elképzelés inkább tévedés és ábránd semmint valóság, mint az EU számos országában jelenleg tapasztalható GM-ellenes hozzáállás, valamint határozott nem a GM növények termesztésére, feldolgozására és forgalmazására. Nincs ez másként Magyarországon (és néhány környező országban) sem, ami részben annak köszönhető, hogy az országos és helyi média nem teljesen semlegesen tálalja a GM témát (lásd a 4. fejezetet). Miközben a GM technológiával kapcsolatos tudományos információk terjesztése nem mondható igazán sikeresnek a közmédiában, addig a szakirányú felsőoktatásban, valamint a tapasztalt gazdálkodók és növénynemesítők (tovább)képzése terén igenis indokolt. Ebben a fejezetben tömören áttekintem (i) a GM növények előállítására jelenleg használt technikákat, és (ii) azokat az alapelveket és gyakorlatot, amelyekkel ezek a technikák még hatékonyabbá, ugyanakkor mind a szakma, mind a nyilvánosság számára elfogadhatóbbá tehetők. 4 Mivel jelen írás a genetikai módosítás technikai részleteivel foglalkozik, itt nem térek ki olyan témákra, mint a javítandó tulajdonságok (lásd a 2. fejezetet), a már létező GM termékek gazdasági értéke (lásd a 3. fejezetet), vagy a közvélemény tájékoztatása (lásd a 4. és 5. fejezeteket). 2. GM technikák és alapelvek Először is hadd mutassak rá, mennyire hasonló az a mechanizmus, amelyet a természet alakított ki, és amelyet a tudomány alkalmaz a genetikai változatosság fenntartására és növelésére a gének (re-) kombinációja révén. A természetben a csírázó pollen (hím gametofita) csatornát (pollentömlőt) fúr a bibébe, egészen a külső DNS befogadására természeténél fogva nyitott petesejt közelébe. A pollentömlőn keresztül a hím ivarsejt néhány pikogrammnyi DNS-t juttat a petesejtbe (1. ábra). Ez a DNS a sejtciklus során önmagát másolni képes csomagokra (kromoszómák) oszlik, melyek mindegyike néhány ezer gént tartalmaz az összesen több tízezerből. A kromoszómák hossza x 10 6 bázispár (Mbp) között változik. A genetikai módosítás folyamán a tudósok nagyjából ugyanezt az eljárást követik. Mivel a mélyen beágyazódott petesejt (1. ábra) nem áll kellő számban rendelkezésre, a kutatók a növények indukálható totipotenciáját, azaz megfordítható fejlődési programját használják ki. Ez a képesség lehetővé teszi, hogy számos (de nem mindegyik) növényi sejttípus teljes differenciált szervezetet hozzon újonnan létre adott és szabályozott (rendszerint in vitro)

5 tenyésztési körülmények között. Ennek köszönhetően a génátvitel célsejtjeinek köre messze túlmutat a petesejten, amire szükség is van, mert a növények in vitro regenerációs gyakorisága relatíve alacsonyabb, mint a zigótából, azaz a megtermékenyített petesejtből. A szövettenyésztést, mint technológiát legszélesebb körben a dísz- és gyógynövények tömeges szaporítására, más néven mikroszaporítására alkalmazzák. 1. ábra: Az örökítő anyag átadása a növényekben a megtermékenyítés során (forrás: htm). A kutatók ezután különféle módszerekkel szintén egy belépési pontot hoznak létre a növényi sejtben a DNS számára, hogy azon keresztül átjusson a sejtfalon és az alatta elhelyezkedő membránon is. Ez a pont csakúgy, mint a természetben egy mikrocsatorna, mely létrehozható egy apró lövedékkel (mikrorészecskék belövése), molekuláris fúrótoronnyal (Agrobacterium), elektromos impulzussal (elektroporáció), vagy nagyon vékony tűvel (mikroinjektálás), hogy csak néhányat említsek a lehetőségek közül. Ezután egy másik, a kromoszómánál kisebb önreplikáló DNS-csomagot, egy plazmidot vagy annak egy részét, juttatják be a növényi genomba. A plazmidok általában csupán néhány jól meghatározott gént tartalmaznak, hosszuk x 10 3 bázispár (kbp) között mozog. Technikai szempontból a növényi gének sikeres átvitelének három fő komponense bontható ki a fent leírt folyamatokból: - regenerálódásra képes célszövet ( hová visszük be a gént ), - működőképes génkonstrukció ( mit viszünk be ), - hatékony génátviteli módszer ( hogyan visszük be a gént ). A génátvitel célpontjait (explantumok) tekintve, a növényi sejtek említett totipotenciája miatt a lehetőségek lényegében korlátlanok. A genetikai módosítást növényregenerációra képes bármilyen szövettípuson végre lehet hajtani, kezdve a protoplasztoktól, melyek enzimatikus úton lecsupaszított egyedi sejtek (2A ábra), a szuszpenzióban rázatott sejtaggregátumokon (2B ábra) és a preparált éretlen embriókon át (2C ábra), egészen a levélkorongokig (2D ábra). Nem csak különálló sejtek vagy szövetdarabok szolgálhatnak azonban a génátvitel célpontjaként, hanem néhány faj esetében akár teljes növények, vagy ezek szervei (pl. virágai) is. Az ilyen in planta transzformációs megközelítésnél nincs szükség költséges szövetkultúrákra, és a genetikai módosítás művelete a steril laboratóriumból ezáltal kikerül egy zárt térbe, például üvegházba (3. ábra). 5

6 2. ábra: A genetikai módosítás különféle célsejtjei és -szövetei. (A) Ciklámen embriogén sejttenyészetből frissen izolált protoplasztok (Prange et al. 2010), (B) banán embriogén szuszpenziós tenyészetben lévő sejtaggregátumok (vonal = 200 μm, Strosse et al. 2006), (C) frissen preparált éretlen kukorica embrió (vonal = 1 mm, Petrillo et al. 2008), (D) dohány levéllemezből kivágott korongdarabok (Stone 2002). 3. ábra: Az Arabidopsis thaliana (lúdfű) in planta transzformációja. A virágzó növényeket (A) megfordítva belemártják a transzformációs (Agrobacterium) szuszpenzióba (B), majd 1 napig műanyag fóliába tekerve inkubálják őket (C), végül 1 hónapig hagyják beérni (Zhang et al. 2006). A funkcionális génkonstrukciókat illetően itt csak a lényeget emelem ki. Ahhoz, hogy egy gén végrehajtsa funkcióját, két alkotóelemmel kell rendelkeznie. Az egyik a kódoló régió, mely az RNS átírásához (transzkripció) és adott esetben a fehérjemolekula szintéziséhez (transzláció) szükséges információt hordozza. A másik alkotórészt azok a szabályozó DNS-szekvenciák képezik, melyek az RNS átírásának indításáért, végrehajtásáért és befejezéséért, valamint az átírt RNS szerkesztéséért felelősek. Ezek a szabályozó (regulációs) szekvenciák általában a kódoló régió mellett helyezkednek el (ilyenek pl. a promóterek és a terminátor régiók), vagy magában a kódoló régióban találhatók (intronok). Egy funkcionális gén hossza megközelítőleg x 10 3 bázispár közötti. A gének szerkezete egy egyszerű áramkörre hasonlít: a kódoló régió a fényt szolgáltató lámpaizzónak felel meg, a promóter pedig az izzóhoz kötött kapcsolót képviseli (4. ábra). Bizonyos jelzőgének ( riporter gének) valóban képesek a fénykibocsátás kiváltására növényekben, ha a megfelelő genetikai kapcsolóhoz csatlakoztatják őket. Ennek igen látványos példája a szentjánosbogárból származó luciferáz (luc) gén (5A ábra) és a medúzaeredetű zöld fluoreszcens fehérje (gfp) gén (5B ábra), melyeket a transzgénikus növényi sejtek és szövetek könnyű és érzékeny kimutatására használnak. 6

7 A B 4. ábra: Az RNS-t (és a fehérjét) kódoló régióból ( lámpaizzó ) és molekuláris kapcsolóként működő szabályozó jelekből (promóter és terminátor régió) álló gén sematikus szerkezete. A promóter régió konzervált szakaszokat tartalmaz (sötétkék vonalak az ábrán), melyekhez a DNS funkcionális térbeli alakjának kialakításáért felelős DNS-kötő fehérjék (cisz aktivátor elemek) kötődnek. A B 5. ábra: Biolumineszcens és fluoreszcens riporter gének GM növényekben. (A) Szentjánosbogárból származó luciferáz gén kifejeződése (expressziója) fiatal Arabidopsis növények levélrózsa fejlődési stádiumában (Lopez-Huertas et al. 2000), (B) a zöld fluoreszcens fehérje génjének kifejeződési mintázata az Arabidopsis magokat tartalmazó becőtermésében (Stuitje et al. 2003). 7

8 A következő pontokban részletesen tárgyalom a fejezet fő témáját, a génátviteli technikákat. Bemutatom továbbá a géntranszfer egyéb lényeges elemeit, például a transzgénikus sejtek szelekcióját és a sikeres transzformáció egyértelmű bizonyítékait Génátviteli technikák A GM növényekkel kapcsolatos kutatás három évtizedes múltja során számos génátviteli módszert fejlesztettek vagy próbáltak ki. Ezek között rendszerint közvetlen és közvetett módszereket különböztetünk meg. A közvetlen génátvitel kifejezés azt jelenti, hogy a beépíteni szándékozott gén(eke)t tiszta DNS formájában juttatják be olyan fizikai vagy kémiai kezelések kíséretében, amelyek elősegítik a DNS bekerülését a növényi sejtekbe. A közvetlen géntranszfer eljárásai közé tartozik például a mikrorészecskék belövése, az elektroporáció, a mikroinjektálás, a szonikáció (ultrahangos kezelés), a szilikonkarbid szálakkal vagy polietilén-glikollal végzett kezelés. Ezzel szemben a közvetett génátvitel közvetítő organizmusokon alapszik, melyek egyfajta biológiai trójai falóként segítenek becsempészni a kívánt gént. Vektorszervezetként használható több baktériumfaj az Alphaproteobacteria osztályban található Rhizobiaceae családból (pl. Agrobacterium sp.), illetve számos vírus (többek között az árpa csíkos mozaik vírus, a rozsnok mozaik vírus, dohány rattle vírus, stb., tranziens génexpresszióra). Annak ellenére, hogy a transzformációs eszközök ilyen széles skálája áll rendelkezésre, a gyakorlatban a génátvitel a legtöbb növényfaj esetében csupán két fő technikára korlátozódik: a mikrorészecskék belövésére (közvetlen módszer) és az Agrobacterium-közvetítette génátvitelre (közvetett módszer), melyeket alább mutatom be. Az optimális génátviteli módszernek néhány alapvető feltételt kell teljesítenie: - sokoldalúság: több gén egyidejű bevitele kapcsolt (hosszú DNS szakaszok beépítése) vagy nem kapcsolt pozícióban (kotranszformáció utólagos szegregációval, lásd a 3.3 pontot), - egyszerű beépülési mintázat és stabil génkifejeződés a különböző vonalakban és utódjaikban, - szabályozott, helyspecifikus integráció (a gén célzott bejuttatása), - egyszerűség, költségtakarékosság és hatékonyság, - egyetemesség: faj- és genotípusfüggetlenség. A fent említett mindkét technika megfelel a feltételek nagy részének, kivéve a gének célzott bejuttatását. Ez azonban nem annyira a módszerek technikai hiányossága, mint inkább a magasabbrendű növényekben jelenlévő ellenállás a célzott génbeépítéssel szemben, ami a homológ rekombináció szokatlanul alacsony gyakoriságának tulajdonítható (Mikro)részecskék belövése ('biolisztikus' transzformáció, 'részecskeágyú', 'génágyú') A kifejezés az exogén DNS-sel (plazmid vagy PCR-termék) bevont mikrométernyi méretű nehézfémrészecskék nagynyomású gázzal történő felgyorsítására, és a növényi sejtekbe vagy szövetekbe ilyen módon történő bejuttatására utal. A bevont mikrorészecskék puskagolyóhoz hasonlóan áthatolnak a sejtfalon, és így viszik be a DNS-t a sejtek belsejébe, ahol egy nagyrészt ismeretlen mechanizmus révén a bejuttatott DNS beépül a sejtmag és/vagy sejtszervecskék genomjába. Eleinte, az 1980-as évek végén, a bevont mikrorészecskéket a szó szoros értelmében átalakított pisztolyokba vagy puskákba töltötték, majd később kifejlesztettek több kifinomult (6A ábra), illetve egyszerűsített, de hasonlóan hatékony (6B ábra) változatot is. A részecskék sebessége a művelet során elérheti a Mach 1 8

9 értéket (hangsebesség), és a gyorsulást részleges vákuum jelenlétében kibocsátott sűrített inert gáz általában hélium vagy nitrogén biztosítja. A szokásos biológiai tényezőkön (pl. a DNS vektorkonstrukción, a növényi explantumok életkorán és előkezelésén) kívül számos speciális paramétert is optimalizálni kell a módszerhez, úgymint: gáznyomás (5-80 bár tartományban a kialakítástól függően), repülési távolság (5-10 cm), a DNS mennyisége (1 μg nagyságrendben), a mikrorészecskék típusa és mérete (volfrám vagy arany, 1 μg nagyságrendben), részecske/dns arány, stb. Emellett a DNS-bevonatkészítés módszerének reprodukál-hatónak kell lenni, amit bármilyen egyszerű fluoreszcens festési eljárással ellenőrizni lehet (6C ábra). 6. ábra: Mikrorészecskék belövésével végrehajtott génátvitel. (A) A legelterjedtebb berendezés: Biolistic PDS-1000/He, (B) egy alternatív módszer sémája: egyedileg készített génpuska (Sági et al. 1995), (C) DNS-bevonat volfrám mikrorészecskéken Hoechst fluoreszcens festékkel láthatóvá téve (Sági et al., nem publikált), (D) a ß-glükuronidáz (GUS) riporter gén kifejeződése embriogén sejtekben a fenti egyedi génpuskával végzett mikrorészecske-belövés után (vonal = 300 μm, Sági et al. 1995). Noha a mikrorészecske-belövést a relatíve nagy költség (1000 dollár alatti értékről indulva jóval meghaladhatja a dollárt is), a közepes átmenőteljesítmény (napi belövés) valamint a növényi explantumokban okozott komoly károsodás nem teszi igazán vonzóvá, a viszonylagos faj- és genotípus-függetlenség miatt mégis különösen hasznosnak bizonyul egyes növényfajoknál és alkalmazásoknál (pl. plasztidtranszformáció, lásd a 3.1 pontot). Következésképpen, ez a módszer a továbbiakban is fontos szerepet fog játszani a növények transzformációjában Agrobacterium-közvetítette génátvitel A Rhizobiaceae családba tartozó néhány baktériumfaj híres természetes genetikai manipulátor, melyek a kompatibilis 9 gazdanövényeket képesek rávenni, hogy szimbiotikus (több Rhizobium sp.) vagy patogén (Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes, A. rubi és A. vitis) kölcsönhatást hozzanak létre. Ennek a jelenségnek jól ismert példái az agrobaktériumok, mivel végre tudják hajtani azt az egyedi mutatványt, hogy növényekbe (és gyakorlatilag sok más, sejtmaggal rendelkező szervezetbe) géneket és ezzel egyidejűleg fehérjéket juttatnak, amit öt fő lépésből álló, pontosan felépített folyamattal érnek el (7. ábra): (i) kemotaxis és kapcsolódás sérült növényi sejtekhez, (ii) a baktérium kétkomponensű érzékelő rendszerének aktivációja a transzfer-dns kivágásához, (iii) csalagút (pilus) építése a baktérium és növény közötti génátvitelhez,

10 (iv) DNS-fehérje komplex képzése és bejuttatása a növényi sejtbe, (v) a komplex beszállítása a sejtmagba, és a DNS beépülése a növényi genomba. Az A. tumefaciens genomja négy fő elemből, két kromoszómatípusból (cirkuláris és lineáris) és két cirkuláris plazmidból épül fel. Jelenleg nem ismerünk több olyan fajt, mely ilyen különleges genetikai állománnyal rendelkezik. A kromoszómális gének főként a mozgásban, az érzékelésben és az alkalmazkodásban játszanak szerepet, míg a plazmidokon lévő gének a fertőzésért és a DNS átviteléért felelősek. Érdekes és a mi szempontunkból alapvető tényező az egyik plazmidon (Ti) megfigyelhető feladat-megosztás: a transzfer (T)-DNS régió fizikailag is elkülönül a virulencia (vir) génektől, amelyek a T-DNS szintézisét, összeállítását és átvitelét irányítják. 7. ábra: A természetes Agrobacterium transzformációs folyamat főbb szakaszai. A kék sejtek a flagellummal mozgó vagy a növényi sejthez (zöld hatszög) kapcsolódó agrobaktériumnak felelnek meg, mely kromoszómális DNS-t és cirkuláris tumorképző (Ti) plazmidot tartalmaz. A növényi sejtmag (sárga kör) tartalmazza a genomi DNS-t, ahova a bakteriális T-DNS (piros szakasz) a piluson keresztül (kék folt) beszállítódik és beépül (Pérez Hernández és Sági, nem publikált). A fenti folyamattal az agrobaktérium célja, hogy megtelepedjen az arra érzékeny növényi sejteken, és olyan gyárakká alakítsa azokat, amelyek szén- és nitrogénforrásokat állítanak elő módosított (kondenzált, másodlagos) aminosavak, az úgynevezett opinok formájában. A T-DNS szegmensen ezért olyan speciális enzimeket kódoló gének helyezkednek el, amelyek egyrészt a növényi sejtek hormonális metabolizmusát programozzák át, hogy korlátlanul osztódjanak, másrészt pedig az opinok bioszintézisét katalizálják a módosított sejtekben. Előbbi eredményeként a fogékony növények földfelszín közeli és földfelszín alatti részein nagyméretű tumorok, gyökérgolyvák alakulnak ki, ami komoly gondot okoz a mezőgazdaságban, különösen a dísznövénytermesztés és a szőlészet ágazatokban (8. ábra). 10

11 levéldarabkákat) a táptalajt és aktivált baktériumokat tartalmazó szuszpenzióba, majd a szárazra törölt explantumokat 1-2 napig a baktériummal együtt tenyészteni, hogy végbemehessen a génátvitel és -beépülés. Ezután az explantumokat antibiotikummal kezelik, hogy elöljék a baktériumokat, melyekre miután teljesítették feladatukat már nincs többé szükség; végül megtörténik a transzgénikus sejtek szelekciója (lásd a 2.2 pontot) és a növények regenerációja (9. ábra). 8. ábra: Agrobacterium-fertőzés által kiváltott jellegzetes golyvaképződés rózsanövény gyökérzetén (Mullen és Hagan, 1995). Az Agrobacterium-rejtély évtizedes intenzív kutatása után a tudósok rájöttek, hogyan lehet ezt a természetes folyamatot az emberiség szolgálatába állítani. A siker kulcsa az a felismerés volt, hogy a T-DNS szekvencia önmagában nem befolyásolja a génátvitelt, hanem a T-DNS-en kívüli szekvenciák (pl. a vir gének), valamint a T-DNS-t közrefogó régiók (az úgynevezett határszekvenciák) játsszák a folyamatban a főszerepet. Ez azt jelenti, hogy: (i) a hormontermelést katalizáló enzimeket kódoló géneket el lehet távolítani, így megszűnik a tumorképződés, és (ii) az opinok bioszintéziséért felelős géneket ki lehet cserélni bármilyen más gén(ek)re, amelyeknek aztán végbemegy az átvitele, amennyiben azok nem expresszálódnak és toxikusak a baktérium számára. Maga a transzformációs eljárás technikailag rendkívül egyszerű, még egy általános iskolás is végre tudja hajtani. Nem kell hozzá mást tenni, csak belemeríteni a növényi explantumokat (pl. 11 Noha a folyamat biológiailag elég összetett, néhány specifikus paraméter optimalizálása nagyon hatékonnyá teszi ezt a módszert a laboratóriumban is. Az optimalizálandó tényezők közé tartozik többek között a vir gének hatékony aktivációját biztosító táptalaj összetétele, a növény-baktérium együttes tenyésztésének időtartama és hőmérséklete, valamint a baktériumtörzs és a növényi genotípus kombinációja. 9. ábra: Agrobacterium-közvetítette genetikai módosítás lépéseinek sematikus folyamatábrája. Az Agrobacterium felhasználásával végzett génátvitel legfőbb előnye, hogy egyszerű, nem költséges, és több mint száz növényfaj esetében hatékony. Legnagyobb hátrányának, elsősorban a szabályozás és a közvélemény szempontjából, a nem T-DNS plazmidszekvenciák gyakori átvitele tekinthető. Nem köztudott, hogy az Agrobacterium képes kromoszómális DNS-ének egy részét is bejuttatni a növénybe: jóllehet erre egyelőre csak kis gyakorisággal kerül sor (kb. a

12 T-DNS-sel transzformált növények 1%-ában), ez gyökeresen új transzformációs eljárások majdani kifejlesztését alapozhatja meg A transzgénikus sejtek szelekciója A rekombináns DNS növényekbe juttatása nem igazán hatékony: csupán a sejtek körülbelül 1%- ában, azaz ből megközelítőleg 100 sejtbe épül be a bevitt DNS, és marad fenn a regenerált növényekben, valamint azok utódaiban. Ezért a számtalan, nem transzformált sejt közül kiválogatni azokat, amelyekbe pontosan beépült a rekombináns DNS, éppen olyan nehéz feladat lenne, mint megtalálni egy tűt a szénakazalban. Annak érdekében, hogy a transzgénikus sejteket azonosítani és azokból növényt regenerálni lehessen, egy segédgént is bevisznek, mely lehetővé teszi a gént expresszáló sejtek szelekcióját. Ezek a marker gének általában rezisztenssé teszik a sejteket egy adott antibiotikumra, például kanamycinre (nptii gén) vagy hygromycinre (hph), vagy egy adott herbicidre, például glüfozinátra (bar vagy pat) és glifozátra (epsps), melyek hatékonyan elpusztítják a nem transzformált sejteket vagy növényeket (10. ábra). 10. ábra: Transzgénikus sejtek és GM növények szelekciója. (A) In vitro szelekció antibiotikummal: elhalt, nem transzformált sejtek által körbevett intenzíven növekedő transzgénikus sejtcsoportok (Sági et al., nem publikált), (B) szántóföldi szelekció herbiciddel: rezisztens GM növények a glüfozinátra érzékeny, nem transzformált (kontrol) parcellák mellett (Miroshnichenko et al. 2007). A növénynemesítőknek már eddig is alapvető eszköze volt a szelekció mint az evolúció hosszú távú és alapvető mechanizmusa. Elmondható, hogy a nemesítési folyamat hatékonysága hasonlóan alacsony mértékű, mint a genetikai módosításé: a kezdetben előállított kombinációknak csupán kis része jut el az előrehaladott (C vagy D) törzskísérletekbe, és még ennél is kevesebb kerül végül bejegyzésre és köztermesztésbe. A maradék anyagot kiselejtezik, és manuálisan vagy mechanikai úton megsemmisítik. Ugyanígy, a laboratóriumban is a sejteknek csak kis hányada bizonyul transzgénikusnak, mely tartalmazza a kívánt tulajdonságot, viszont a szelekciót automatizálni lehet a nem transzformált sejtek kémiai kezelésekkel történő elpusztításával vagy elnyomásával (kondicionális pozitív szelekció). Az ehhez hasonló mechanikus szelekciós eljárásokat a növénynemesítők is széles körben alkalmazzák, például a citoplazmásan hímsteril kukoricánál, ami az anyanövények címereinek kézi eltávolítását hivatott helyettesíteni a 12

13 heterózis hatást kiaknázó keresztezési programokban. A GM növények kutatása és fejlesztése során fontos tényezővé váltak a szelekciós marker gének. Mivel az antibiotikum- vagy herbicidrezisztenciára általában nincs szükség a kifejlett növényekben, különösen ha azokat szántóföldi termesztésre szánják, ezért számos alternatív stratégiát fejlesztettek ki és teszteltek ezeknek a géneknek a GM növényekből történő későbbi eltávolítására (lásd a 3.3 pontot) A genetikai módosítás bizonyítása A növénynemesítők munkája nem ér véget a sikeres keresztezések végrehajtásával és az ígéretes vonalak kiválasztásával, hanem részletesen jellemezniük is kell ezeket a vonalakat, és igazolniuk kell értékes tulajdonságaikat. Például, több patogén törzzsel végzett kísérleti fertőzéssel kell kideríteni, hogy a fajtajelöltekben mely rezisztenciagének aktívak. Hasonlóképpen, a növénybiotechno-lógusoknak is egyértelműen bizonyítaniuk kell, hogy a GM növényekben valóban benne vannak és működnek a kérdéses gén(ek), azaz a GM növényben megjelenik a kívánt tulajdonság, és utódaiban is stabilan fennmarad. A sikeres génátvitel igazolásához az alábbi megbízható és többszörös bizonyítékokra van szükség: - integráció (DNS-szintű bizonyíték), - expresszió (RNS-szintű bizonyíték), - aktivitás (fehérjeszintű bizonyíték). A GM növényeket DNS-szinten gyakran tesztelik polimeráz-láncreakcióval (PCR), mely kimutatható mennyiségűre sokszoroz egy adott célszekvenciát (11A ábra). Fontos azonban kiemelni, hogy a klasszikus PCR a szóban forgó szekvencia fizikai beépülését a kromoszómában nem bizonyítja, csupán annak jelenlétét mutatja ki a mintában, ami például előfordulhat a növényekben túlélő agrobaktériumok miatt is. A fizikai integráció igazolására Southern hibridizációt és/vagy módosított PCR reakciót kell végezni. A Southern hibridizáció egy fluoreszcens, immunológiai vagy radioaktív módon megjelölt, a GM növény immobilizált és denaturált genomi DNS-éhez fizikailag kötődő génszakasz (próba) kimutatásával bizonyítja a gén beépülését. A detektált fragmentumok száma azt jelzi, hogy az exogén DNS hány pozícióban épült be a GM növény genomjába (11B ábra). A módosított PCR módszerek (pl. anchor PCR, inverz PCR vagy TAIL-PCR) a beépült gén egy részével együtt felszaporítják a szomszédos (ismeretlen) kromoszómarégiót is, és a gén fizikai beépülését az ilyen hibrid szekvenciák jelenléte igazolja (Pérez Hernández et al. 2006). A beépített gén expressziójának első lépését, az RNS-transzkripciót a fentiekhez hasonló módszerekkel lehet kimutatni: PCR technikával vagy hibridizációval. A különbség a DNS-hez képest az, hogy tisztított összes (vagy hírvivő) RNS-sel fordított transzkripciót hajtanak végre cdns szintéziséhez, melyet azután PCRtemplátként használnak (RT-PCR), vagy pedig egy jelölt, génspecifikus próbához való kötődésre használják az RNS-t (Northern hibridizáció, 11C ábra). 13

14 11. ábra: A GM növények sikeres génátvitelének molekuláris bizonyítékai. (A) PCR: a hph antibiotikum-rezisztencia gén jelenléte GM (1-6) és nem transzformált kontroll (-) banán növényekben, és a pozitív kontroll (+) plazmidban (Sági et al. 1995), (B) Southern hibridizáció: a GUS riporter gén beépülési mintázata nem transzformált kontroll (-) és génbelövéssel előállított GM (1-5) banán növényekben, valamint a pozitív kontroll (+) plazmidban (Sági et al., nem publikált), (C) Northern hibridizáció: egy gombaellenes növényi defenzin gén (változó) expressziója kontroll (-) és GM (1-6) banán növényekben (Remy 2000), (D) Western hibridizáció: a GFP fehérje jelenléte GM (1-4) cukornád növényekben (Schenk et al. 2001). Fehérjeszinten a transzlációs géntermék jelenlétét általában a célfehérjére specifikus jelölt antitestek immunodetektálása révén bizonyítják (Western hibridizáció, 11D ábra). Biokémiai vizsgálattal (pl. enzimaktivitás mérésével) és/vagy funkcionális elemzéssel (pl. új fenotípus, betegségrezisztencia-vizsgálatok) döntik el, hogy a fehérje felveszi-e a helyes háromdimenziós szerkezetet és aktív-e. A fenti lépések a GM növények szisztematikus jellemzésének rutin eljárását képezik, amennyiben a cél a génfunkció (vagy a promóter) azonosítása zárt környezetben. A szántóföldi kibocsátáshoz és a kereskedelmi felhasználáshoz ennél lényegesen szigorúbb és költségesebb ellenőrzés szükséges, melyek toxicitási és allergenitási vizsgálatokat, valamint komplex környezeti hatás-tanulmányokat és kockázatelemzést foglalnak magukba. Összefoglalva: noha a jelenleg alkalmazott génátviteli eljárások még nem tökéletesen kifinomultak, de már jól működnek, reprodukálhatók és elég hatékonyak a GM növények tömeges előállítására rutin laboratóriumi vagy akár kereskedelmi szinten is. Ugyanígy, egyetlen jelenlegi nemesítési rendszer sem képes a stressztűrés vagy az általános betegségrezisztencia szempontjából ideális fajtákat előállítani, de mégis alkalmazzák azokat javított növényfajták köztermesztésére és forgalmazására. Mindazonáltal, számottevő az igény a növényi génátvitel további módszertani fejlesztésére, hiszen még mindig fennállnak jelentős akadályok, mint például a szelekciós marker gének eltávolítása vagy elfogadhatóbb alternatívákra cserélése, a célgén(ek) helyspecifikus integrációja, stb. A következő szakaszban ezekből a kutatási témákból emelek ki néhányat. 3. GM praktikák a technika fejlesztésére 3.1. Rövid terminológiai összefoglaló A transzgénikus növény történetileg, olyan genetikailag módosított növényt jelent, melynek nukleáris (sejtmagi) genomja bármely más fajból átvitt gén(eke)t is tartalmaz. A technológia fejlődésével azonban olyan új GM növénytípusokat hoztak létre, melyek a terminológia tisztázását és új definíciók megalkotását tették szükségessé. 14

15 Elvben, a transzgén (az átvitt gén, lásd még a 4. ábrát) különböző elemei korlátlan evolúciós távolságra lévő bármilyen szervezetből származhatnak, kezdve a vírusoktól, a baktériumokon és gombákon át egészen az állatokig és a rokon növényekig, sőt akár magából az aktuális célfajból is. Az evolúciós távolság szerint ma már a GM növények alábbi osztályait különböztetjük meg (Nielsen 2003): - xenogénikus, a szintetikus/mesterséges gént laboratóriumban építik különböző forrásokból, - transzgénikus, a gén fejlődéstörténetileg távoli fajból, például vírusból, baktériumból vagy rovarból származik, - linegénikus, a gén fejlődéstörténetileg közelebbi fajból származik, például egy szaporodási szempontból inkompatibilis másik osztályból, - famigénikus, a gén ugyanabban a családban található rokon fajból származik, - intragénikus, a gén ugyanabból a (keresztezhető) fajból származik. A ciszgenezis koncepciója azóta vált széles körben ismertté (Schouten et al. 2006): a ciszgénikus növények, akárcsak az intragénikusak, kizárólag az eredeti (egyben cél-) fajból tartalmaznak géneket, de ez az elgondolás jóval szigorúbb az intragenezisnél. A különbség abban rejlik, hogy míg a ciszgénikus növényeknél intakt funkcionális géneket visznek át a fajon belül (pl. a saját promótere és regulátor szekvenciái által szabályozott búza betegségrezisztencia-gént egészében visznek át egy rezisztens búza fajtából egy fogékony fajtába), addig az intragénikus megközelítés engedélyezi a genetikai elemek szabad keverését új funkcionális gének előállítására azzal a megszorítással, hogy a kombinált elemek forrása ugyanazon fajon belül marad (pl. az imént említett rezisztenciagén kódoló régióját egy másik búzagén promóterével kombinálják, hogy a betegségrezisztencia csak a gyökerekben fejeződjön ki). A cisz- és intragenezis támogatói természetesen azt állítják, hogy ezeknek a növényeknek a 15 genetikai felépítése nem különbözik alapvetően a klasszikus nemesítéssel kialakított fajtákétól, és így ezekben az esetekben a kétféle termék lényegi egyenértékűsége tökéletesen teljesül. A fenti összes GM növénytípusnál a transzgén sejtmagba épülését feltételezik. Ez azonban nem mindig igaz, mert az exogén DNS a különféle plasztiszokba, leginkább a kloroplasztiszokba is beépülhet. A kloroplasztiszba történő génátvitel általános technikája a mikrorészecske belövés (minthogy az Agrobacterium T-DNS-e a sejtmagot célozza meg), melynek eredményeként transzplasztomikus növények jönnek létre. Mivel egy sejtben kloroplasztisz található, és egy kloroplasztiszban a genom nagyjából 100 példányban van jelen, összesen akár genom példány is előfordulhat egyetlen növényi sejtben. Ennek megfelelően, ha egyetlen idegen gén épül be egyetlen kloroplasztisz genomba, nagyon kitartó szelekcióra van szükség, míg az összes kloroplasztisz genomban (homoplazmikusan) megtalálható lesz a bevitt gén (12. ábra). Noha a transzplasztomikus gazdasági növények rutinszerű előállítása során még nehézséget jelent ez a hosszadalmas szelekciós folyamat, a technológia számos előnyt kínál. Mivel a kloroplasztiszok sok (de nem minden) növénynél elsősorban vagy kizárólag az anyai szülőtől származnak, a transzgén(ek) pollennel történő kiszabadulásának valószínűsége elenyésző vagy teljesen kizárt. A magas kópiaszámnak köszönhetően a bejuttatott gének expressziója a kloroplasztiszban általában igen erőteljes, gyakran több százalékot is kitesz az összes oldható levélfehérje mennyiségéből. Ráadásul a génkifejeződés stabilitását biztosítja, hogy a kloroplasztiszokban igen alacsony a rekombináció, így a transzplasztomikus növényekben nem megy végbe a bejuttatott gének szerkezeti átrendeződése. A kloroplasztiszokban a (transz)gén expressziójának csendesítése sem történik meg, hiszen a növényi plasztiszok bakteriális (prokarióta) eredete miatt hiányzik az RNSinterferenciáért felelős mechanizmus.

16 12. ábra: A homoplazmikus transzplasztomikus növények előállítása. Mikrorészecske-belövéssel bejuttatják az idegen gén(ek) egy példányát egyetlen kloroplasztiszba (felső négyzet), mely az integrálódás után a sejt teljes kloroplasztisz genomjának csupán töredékében (körülbelül 0,01%-ában) van jelen (második négyzet). A marker génre végzett folyamatos szelekció feldúsulást eredményez, ami a heteroplazmikus állapothoz vezet (harmadik négyzet), végül az összes kloroplasztisz genom tartalmazza a bevitt gént (alsó négyzet) Szabályozott génexpresszió A génátviteli technológiákban fontos előrelépést jelent a transzgének pontosabb kifejeződése. Az első generációs GM növényekben a transzgén expresszióját rendszerint kevésbé összetett organizmusokból, például növényi vírusokból izolált erős promóterek szabályozták. Ezeknek a szervezeteknek az elsődleges funkciója a néhány génből álló genetikai állományuk gyors és erőteljes expressziója mindenféle növényi sejtben, így az ezeket szabályozó promótereket konstitutív promótereknek nevezzük. Ez a konstitutív típusú szabályozás azonban közel sem optimális a legtöbb (transz)gén számára a GM növényekben. Például egy leveleket megtámadó gombabetegség elleni rezisztenciagénnek nem kell intenzíven kifejeződnie a vetőmagban, ha a kórokozó nem fertőzi a magot. Néhány esetben a túlzott expresszió egyenesen ellenjavallt, például amikor egy opportunista kórokozónak így nagyobb esélye van immunitást kifejlesztenie az adott betegségrezisztencia-mechanizmusra. A legtöbb natív növényi gén expressziója a fejlődés során finoman szabályozott, és ezért a sikeres transzgénnek (különösen a jövő cisz- vagy intragénikus növényeiben) hasonlóan pontosan szabályozott expresszióval kell rendelkeznie.a kutatók ennek megfelelően folyamatosan tökéletesítik az újabb növényi promóterek és egyéb szabályozó szekvenciák azonosítására és pontos jellemzésére szolgáló technikákat, például a promóter és aktivációs csapdázást (promoter tagging, activation tagging). Ennek eredményeképpen mostanra nagy számú promóter áll rendelkezésre (melyek száma napról napra növekszik) a célgének szövetspecifikus, sőt akár sejttípus-specifikus expressziójához GM növényekben (13. ábra). Ezeknek az új promótereknek egy része tesztelés alatt áll, vagy már el is érte a kereskedelmi felhasználás stádiumát a GM termékek következő generációjánál. A A D 16

17 13. ábra: Specifikus promóterek által szabályozott transzgén-expresszió GM növényekben. (A) GFP expressziója D rizs szemtermésében, de nem a csíranövényben ( (B) gyökérspecifikus ß- glükuronidáz (GUS) génexpresszió Arabidopsis-ban egy glikoziltranszferáz gén promóterével (Vijaybhaskar et al. 2008), (C) GUS expresszió Arabidopsis leveleiben a borsó topoizomeráz génjének promóterével (Hettiarachchi et al. 2003), (D) GFP expresszió Arabidopsis pollen generatív (nyílfej) és vegetatív (nyíl) sejtmagjában (Brownfield et al. 2009) Haladás a szelekciós marker gének terén Az antibiotikum- és herbicidrezisztencia GM növényekbe történő beépítésére vonatkozó társadalmi aggályok és a környezetvédők tiltakozása a szelekciós marker gének kiválasztásával kapcsolatos stratégiák átgondolásához vezettek, különösen a kereskedelmi forgalomba kerülő GM termékek fejlesztésének terén. Az ilyen marker gének széleskörű alkalmazásának káros egészségügyi és biobiztonsági következményeire vonatkozó legtöbb félelem alaptalannak tekinthető, és azokat a megfelelően ellenőrzött, komoly kísérletek nem támasztják alá. A kutatók ennek ellenére keresik az alternatív megoldásokat. Már több új megközelítés is sikeresnek bizonyult mind laboratóriumi, mind szántóföldi körülmények között. Az első megoldás a GM növények szelektálására használható újabb gének felfedezése volt. Elvben bármilyen olyan gén szelekciós markerré válhat, amely szelekciós előnyt biztosít az adott gént expresszáló sejteknek, tehát ezek a gének nem korlátozódnak az antibiotikumokra vagy herbicidekre rezisztenciát biztosítókra. Számos olyan cukor és cukoranalóg (pl. mannóz, xilóz, arabit, dezoxiglükóz) valamint aminosavszármazék (pl. metil-triptofán, aminoetilcisztein) ismert, melyek toxikusak vagy nem metabolizálhatók a legtöbb növényi sejt számára. Néhány növényi és bakteriális enzim (főként izomerázok, és hexokináz vagy dekarboxiláz) azonban képes ezeket a vegyületeket átalakítani olyan formává (pl. a xilózt xilulózzá), amelyet azután az illető gént expresszáló sejtek hasznosítani tudnak. Ennek eredményeként a transzgénikus növények képesek lesznek növekedni és fejlődni, míg a nem transzformált sejtek elpusztulnak a toxikus szubsztrátok miatt, vagy visszaszorulnak (éheznek) a nem toxikus metabolitok jelenlétében (14. ábra). A szelekció alapelve tehát ugyanaz marad (lásd a 2.2 pontot), de lényeges különbség, hogy nem kell antibiotikum- vagy herbicid-rezisztenciát biztosító gént használni. Ráadásul a szóban forgó enzimek egy részét (pl. a xilóz izomerázt) az élelmiszeripar már széles körben használja, tehát a törvényi szabályozás is biztonságosnak ítéli meg. 17

18 14. ábra: Alternatív szelekciós marker gének. (A) Nem transzformált banán sejtek növekedése in vitro tenyészetben szacharózt tartalmazó táptalajon (balra) és xilóz jelenlétében gátolva (jobbra), (B) a xilóz izomeráz (xyla) gént expresszáló transzgénikus banán sejtcsoportok aktívan növekednek xilóz-tartalmú táptalajon (Sági et al., nem publikált). Még az alternatív marker gének alkalmazásánál is előnyösebb, ha a marker gént teljesen el lehet távolítani a GM növényekből, hiszen így a biztonsági elemzés alacsonyabb költséggel végrehajtható, ráadásul a szabályozó hatóságok is azt támogatják, hogy a GM növényekben ne legyen semmilyen többlet DNS. Valószínűleg a legegyszerűbb markermentes stratégia a nem kapcsolt gének együttes vagy kotranszformációja és utólagos kihasadása (szegregációja). A kotranszformáció során a célgént (vagy célgéneket) és a szelekciós marker gént a növényi genomba egymástól jól elkülöníthető helyekre, nem kapcsolt módon viszik be egyidejűleg. A vizsgálatok során többféle génkonstrukciót próbáltak ki: (i) különböző transzformációs vektorok vagy tiszta génszekvenciák egyszerű keverése a mikrorészecskékre való kicsapatás és a belövés előtt, (ii) két különböző Agrobacterium törzs együttes tenyésztése, ahol az egyik törzs a szelekciós marker gén vektorát, a másik a célgén vektorát tartalmazza, (iii) mindkét gén egy-egy vektorát magában foglaló egyetlen baktériumtörzs alkalmazása, és (iv) egyetlen vektort hordozó baktériumtörzs használata, ahol a két gén két független (nem kapcsolt) T-DNS szakaszon található. A kotranszformáció előnye, hogy nem igényli a meglévő vektorok és transzformációs protokollok jelentős módosítását, és a következő generációkban bekövetkező hasadásnak köszönhetően az 18 utódok egy része már csak a transzgént fogja hordozni, a marker gént nem. Mivel a kotranszformációs gyakoriság (a két gén ugyanabban a sejtben történő beépülésének és expressziójának előfordulása) megfelelően magas (akár 80-85%), ezt a módszert számos gazdaságilag fontos növény esetében sikerrel lehet alkalmazni a szelekciós marker gének eltávolítására. Nem használható azonban a vegetatív úton szaporított növényeknél, mivel a gének hasadásának előfeltétele az ivaros szaporodás, de még az ivarosan szaporodó növényeknél is munkaigényes lehet a kívánt utódok kiválogatása (pl. alacsony szintű megtermékenyülésnél). A markermentes GM növények előállításának harmadik módszere a helyspecifikus rekombináz enzimekkel való eltávolítás. Ennek végrehajtásához a szelekciós marker gént beillesztik két rövid DNS-szekvencia (határszekvencia) közé, amit felismerve az enzim kivágja a köztes marker gént. A kihasító enzim génjét kotranszformációval külön beépítik (vagy bekeresztezik) a növénybe, és expresszióját konstitutív (vagy pollen- vagy magspecifikus) vagy indukálható promóter szabályozza. Az aktív enzim termelésekor megtörténik a szelekciós marker gén eltávolítása (15. ábra) a pollenből/vetőmagból, vagy az egész növényből, vagy amikor a promótert indukálják. Ráadásul, ha a rekombináz enzim

19 génjét a szelekciós marker gén mellé építik be, akkor a keletkezett enzim önmaga génjét is eltávolítja (vagy a keresztezés vagy kotranszformáció után kihasad), így nem marad hátra nem kívánt DNS-szekvencia. Az egyetlen nyom, ami az egész eljárás után marad, az a határszekvencia egyetlen (helyreállított) példánya (15. ábra). 15. ábra: A szelekciós marker gének eltávolítása helyspecifikus rekombinációval. A P1 bakteriofág Cre/loxP rendszere a Cre rekombináz enzimből áll, mely két loxp szekvencia (zölddel jelölve) közötti kivágási reakciót katalizál a köztük lévő DNS-szekvencia (sárga-kékkel jelölve) eltávolításának céljával ( A helyspecifikus rekombinázok ugyanolyan hatékonyan működnek a plasztisz genomban, mint a sejtmagban, így alkalmasak markermentes transzplasztomikus növények előállítására is. Az LY038 transzformációs esemény jó példája a technológiai előrelépésnek a szelekciós marker gének terén. Ebben a megnövelt lizintartalmú GM kukoricában a kanamycin-rezisztencia génjét (nptii) a fenti Cre/loxP rendszerrel távolították el a nukleáris genomból, és köztermesztését már engedélyezték Kanadában, Japánban és az Egyesült Államokban, valamint élelmiszer- és takarmányipari felhasználását Ausztráliában, Mexikóban, a Fülöp-szigeteken és Tajvanon. Természetesen további fejlesztések is folyamatban vannak: a kutatók leírták a rekombinációs helyen visszamaradó határszekvencia eltávolításának módszerét, és beszámoltak már a gének célzott bejuttatásán és a homológ rekombináción alapuló új markermentes stratégiákról is. Ígéretesek a cinkujj-nukleázok használatával, valamint ezek transzgén-eltávolítási és célzott génbeépítési alkalmazásaival kapcsolatos előrelépések. Ezek a fejlesztések lehetővé teszik, hogy az antibiotikum- és herbicid-rezisztencia génekkel kapcsolatos aggodalmakat a nem is olyan távoli jövőben (tárgyaikkal egyetemben) el lehessen oszlatni. 19

20 4. Összegzés Fontos megértenünk, hogy a GM növények döntő többségét kutatólaboratóriumokban állítják elő, és csak kis hányadukat szánják kereskedelmi termékek fejlesztésére. Az alapkutatási programok célja igen sokféle lehet: egy génfunkció feltárása, új promóterek azonosítása, anyagcsereutak vagy génkölcsönhatások jellemzése, a környezet által szabályozott fejlődési folyamatok (pl. a virágzás indukciójának) megértése, vagy megfelelőbb transzformációs vektorok és tökéletesített génátviteli technológiák fejlesztése, stb. A genomok egyre alaposabb ismeretének ( posztgenomika ) korában ezek az információk közvetlen előnyt jelentenek az élvonalbeli növénynemesítési programok számára is, például a génalapú szelekció (GAS) alkalmazásával. A génátvitelhez jelenleg alkalmazott technikák és alapelvek rövid összefoglalásával ezen áttekintés célja az volt, hogy bemutassa: ezek a módszerek teljesen okszerűek, reprodukálhatók és különféle alkalmazásokhoz ma már rutin eljárásként használhatók a növények széles körénél. Természetesen (a szó legeredetibb értelmében) mindig van lehetőség további fejlődésre, és amíg tudomány létezik, a kutatás nem áll le. Maga a technológia már eléggé kiforrott, de a kérdés továbbra is az: mi elég érettek vagyunk-e ahhoz, hogy intelligens és szelektív módon alkalmazzuk? Irodalomjegyzék Brownfield L, Hafidh S, Durbarry A, Khatab H, Sidorova A, Doerner P, Twell D (2009) Arabidopsis DUO POLLEN3 is a key regulator of male germline development and embryogenesis. Plant Cell 21: Hettiarachchi GHCM, Yadav V, Reddy MK, Chattopadhyay S, Sopory SK (2003) Light-mediated regulation defines a minimal promoter region of TOP2. Nucleic Acids Res 31: Lopez-Huertas E, Charlton WL, Johnson B, Graham IA, Baker A (2000) Stress induces peroxisome biogenesis genes. EMBO J 19: Miroshnichenko D, Filippov M, Dolgov S (2007) Genetic transformation of Russian wheat cultivars. Biotechnol & Biotechnol Eq 21: Mullen J, Hagan A (1995) Crown Gall of Ornamentals. Alabama Cooperative Extension System, Auburn University, Disease Note ANR-944. Nielsen KM (2003) Transgenic organisms: time for conceptual diversification? Nature Biotechnol 21: Pérez Hernández JB, Swennen R, Sági L (2006) Number and accuracy of T-DNA insertions in transgenic banana (Musa spp.) plants characterized by an improved anchored PCR technique. Transgenic Res 15: Petrillo CP, Carneiro NP, Purcino AAC, Carvalho CHS, Alves JD, Carneiro AA (2008) Optimization of particle bombardment parameters for the genetic transformation of Brazilian maize inbred lines. Pesq Agropec Bras 43: Prange ANS, Serek M, Bartsch M, Winkelmann T (2010) Efficient and stable regeneration from protoplasts of Cyclamen coum Miller via somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss Organ Cult 101: Remy S (2000) Genetic transformation of banana (Musa spp.) for disease resistance by expression of antimicrobial proteins. PhD thesis No. 420, Katholieke Universiteit Leuven, Belgium, 341 p. Sági L, Panis B, Remy S, Schoofs H, De Smet K, Swennen R, Cammue BPA (1995) Genetic transformation of banana and plantain (Musa spp.) via particle bombardment. Nature Biotechnol 13: Schenk PM, Remans T, Sági L, Elliott AR, Dietzgen RG, Swennen R, Ebert P, Grof CPL, Manners JM (2001) Promoters for pregenomic RNA of banana streak badnavirus are active for transgene expression in monocot and dicot plants. Plant Mol Biol 47: Schouten HJ, Krens FA, Jacobsen E (2006) Cisgenic plants are similar to traditionally bred plants. EMBO Rep 7: 1-3 Stone GD (2002) Both sides now: Fallacies in the genetic-modification wars, implications for developing 20

21 countries, and anthropological perspectives. Current Anthropol 43: Strosse H, Schoofs H, Panis B, Andre E, Reyniers K, Swennen R (2006) Development of embryogenic cell suspensions from shoot meristematic tissue in bananas and plantains (Musa spp.). Plant Sci 170: Stuitje AR, Verbree EC, van der Linden KH, Mietkiewska EM, Nap J-P, Kneppers TAJ (2003) Seedexpressed fluorescent proteins as versatile tools for easy (co)transformation and high-throughput functional genomics in Arabidopsis. Plant Biotechnol J 1: Vijaybhaskar V, Subbiah V, Kaur J, Vijayakumar P, Siddiqi I (2008) Identification of a root-specific glycosyltransferase from Arabidopsis and characterization of its promoter. J Biosci 33: Zhang XR, Henriques R, Lin SS, Niu QW, Chua NH (2006) Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols 1:

22 2. Géntechnológiai kutatás és fejlesztés a növények abiotikus stressz-rezisztenciájának javítására Györgyey János MTA Szegedi Biológiai Központ Szeged Bevezetés A múltban a hagyományos nemesítési módszerek jelentős mértékben javították növényeink termőképességét, de meg kellett tanulnunk, hogy ezen módszereknek erős korlátai is vannak. Hasznos tulajdonságok átvitele távoli fajokból, vagy szelekció genetikailag szorosan kapcsolt tulajdonságok szétválasztására a klasszikus genetikai keresztezésekben nehéz, vagy gyakorlatilag lehetetlen. A gének felfedezése és a géntechnológia azonban sok esetben segíthet megkerülni ezeket a korlátokat 1. ábra. Annak a folyamatnak az egyszerű sémája, ahogyan az alapkutatás elvezethet a mezőgazdaságban használható új gazdasági növényekhez. Laboratóriumunk számos különböző génfelfedezési megközelítést alkalmaz arra, hogy a gabonafélék abiotikus stressz toleranciájának javítására használható géneket azonosítson. Napjainkban az egyik kihívás, aminek meg kell felelni, hogy fokozzuk a terméshozam stabilitását korlátozott vízellátási feltételek mellett is. Ez lényeges szerepet játszik a globális klímaváltozás gazdasági és társadalmi következményeinek csökkentésében. A molekuláris élettan és a genetika friss eredményei is új eszközöket és forrásokat jelentenek ezeknek a nemesítési erőfeszítéseknek a támogatásához. A növények számos védekezési stratégiát fejlesztettek ki mind a sejtjeik, mind az egész szervezetük funkcionális integritásának megőrzésére a korlátozott vízellátás során. A gyorsan szintetizált abszcizinsav koordinálja a gyors reakciók zömét, míg a hosszú távú alkalmazkodásban számít a fokozottabb 22