Lehet!ségek gombabetegségeknek ellenálló GM búza el!állítására

Átírás

1 Lehet!ségek gombabetegségeknek ellenálló GM búza el!állítására Jenes Barnabás, Várallyay Éva, Tóth Gábor, Ivanics Milán, Giczey Gábor, Balogh Andrea, Oreifig S. Aid, Burgyán József Mez!gazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Növényi Sejtbiológia Csoport Növény Virológiai Csoport Gödöll!

2 Búza rozsda - levélrozsda (Puccinia recondita f. sp. tritici) és a szárrozsda (Puccinia graminis f. sp. tritici) Búza lisztharmat. Blumeria (Erysiphe) graminis f. sp. tritici

3 STRATÉGIA! Gombagátló hatással rendelkez! fehérje génjét rekombináns DNS technikák segítségével beépíteni búza genomba! A szelekciós gének ko-transzformációban történ! alkalmazása kés!bbi nemesít!i munka megkönnyítése érdekében! Trichoderma hamatum gombából származó ThamChigén egy 42 Kda méret" kitináz aktivitással renelkez! fehérjét kódol! Coniothyrium minitansból 1,3endoglükanáz gén 82,3KDa méret", glükanáz aktivitással rendelkez! fehérjét kódol! A gént és enzimet az MBK Mikológia csoportjában izolálták és írták le el!ször

4 Stratégia vörös vagy levél rozsda Puccinia rubigo-vera fekete- vagy szárrozsda Puccinia graminis Búza PR (Pathogenezis-related) proteinek Glükanázok, kitinázok Coniothiryum minnitans endoparazita gomba!-1,3 exo-glükanáz (83,2 kd) CMG1 gén

5 Célkit!zéseink Hatékonyan szabályozni konstitutív promoterrel a gombából származó sejtfalbontó enzimek génjeit egyszik" specifikus génkonstrukcióban. Gombarezisztencia létrehozása ezekkel a génekkel, els!sorban a levél és szárrozsda ellen. Amennyiben a tesztelt enzimek hatékonyak rezsiztencia kiváltására, akkor szövetspecifikus vagy indukálható promoterrel szabályozni a m"ködésüket búzában.

6 Transzgénikus búzanövények el!állítása Cmg1 gén klónozása és konstrukció készítés Géntranszfer Transzgénikus szövetek szelekciója Plazmid tisztítás Éretlen embriók, virágzatok izolálása és kalluszindukció Fertilis növények regenerálása A transzgénikus növények rozsdatesztje Élelmiszerbiztonsági vizsgálatok PCR teszt, genomikus DNS hibridizálás Western blot

7 A pubicmg plazmid - Coniothyrium minitans gomba 83,2 kd méret" 1,3-endoglükanáz fehérjéjét kódoló szekvencia (Cmg1) - 5 -vég: kukorica Polyubiquitine1 gén promotere - 3 -vég: nopaline synthase gén (NOS) terminátor Dr. Giczey Gábor Dr. Oreifig Aid

8 Genetikai transzformáció közvetlen géntranszferrel! Éretlen virágzatból kalluszindukció.! A pubicmg/pubichi és a pahc20(bar gén) plazmidok rögzítése mikrohordozók felületére a kotranszformáció érdekében! A plazmidok bejuttatása egymás után kétszeri bombázással. Nyomás:55-60 bar, vákuum: bar, sebesség: m/s

9 Feltételezetten transzgénikus egyedek PCR vizsgálata! Cmg-NOS,Cmg-NOSII. primerpár alkalmazása. Várt amplikon mérete:241 bp, 565 bp! Amplifikált régió: cmg1 gén 3 -vég utolsó 260 bázisa (NCBI Locus AF247649), gén és a terminátor régió közti kapcsoló rész(34bp), NOS terminator (NCBI Locus PBIN19TD) Zseb! Minta! ! Cmg 97.9! 2! Cmg 97.9! 4! Cmg 97.10! 6! Cmg 97.11! 8! Cmg 97.12! 10! H 2 O! 12! Dogankent (kontrol)! 14! pubicmg µg/µl! 16! "X174 DNA/Hae III fragments (ladder)!

10 Fast Visual Assay for Chitinase Activity

11 Fluorometric Assay for Chitinase Activity

12 CMG-transzgénikus búza növények ellen!rzése dot-blot DNS hibridizálással 1 pubicmg plazmid, 2 CMG16 T0búza DNS kivonat, 3 CMG21, 4 CMG23, 5 CMG76/16 T1 búza DNS kivonat, 6 CMG76/17, 7 CMG90, 8 CMG97/1, 9 CMG97/2, 10 CMG97/4, 11 CMG97/5, 12 CMG97/7, 13 CMG97/9, 14 puffer, 15 CY-45 búza (vad típus) DNS kivonat. Próba CmgNosII, 565 bp hosszú, a Cmg1 kódoló szekvencia utolsó szakasza és a Nos terminátor. A próbát DIG jelöl!kittel készítettük (Roche).

13 Southern Hybridisation 1: Cmg97.1.2/3; 2:Cmg97.2.2/1; 3: Cmg97.2.2/7; 4: Dogankent (nem transzformált); 5: Cmg97.2.2/21; 6: Cmg97.2.2/32; 7: Cmg97.2.2/8; 8: Cmg97.2.2/31 9: #-Hind Eco Ladder

14 1.3-beta-endoglükonáz cmg1 géntermék expressziójának igazolása specifikus nyúl IgG ellenanyaggal! A transzformált vonalakból izolált fehéje extraktum! SDS-PAGE (Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel, Csertex) szeparálás 83 kda ! blottolás PVDF membránra! cmg1 peptidre kifejlesztett ellenanyaggal identifikálás (Invitrogen Western Breeze Chromogenic Detection Kit Csertex nyúl IgG szérummal) 1.cmg1-1 peptid; 2. Multimark Mt.standard.; 3. cmg /3; 4. CY-45 kontrol; 5. cmg /18; 6. cmg /12; 7. cmg /9; 8. cmg /14; 9. cmg /12; 10. cmg /5; 11. cmg 16.7/6; 12. cmg /17

15 19 CMG vonal biotesztje Levélrozsda rasszkeverék Tesztelt növények száma Fajta Vonal CY-45 CMg 16 3 X X X X CMg 82 X CMg e CMg CMg 88 ;3 ; CMg ;1-3 ;1-3 CMg CMg Dagenkent CMg 29 X CMg CMg CMg 97 ;1-N ;1-N ;1-N ;1-N CMg 105 ;1 ; ;1-N ;2 ;23 CMg 107 ;1 3 3 ;1-N34 4 CMg Délibáb CMg 76 ; CMg ;1-4 CMg CMg 79 4 ;

16 A Cmg1 transzgént expresszáló transzgénikus búzavonalak élelmiszer-biztonsági vizsgálata. Csoportallergén specifikus IgE keresztaktivitás vizsgálata WGA-, amiláz/tripszin inhibitor gliadin és gombára specifikus szelektált hiperimmun szérumokkal Jelentéktelen reaktivitás A potenciális allergén fehérjék tápcsatorna rezisztenciáját reprezentáló in vitro pepszines emésztés Az eddig elvégzett vizsgálatok alapján potenciális allergén aktivitás kockázatával nem kell számolnunk, mivel tápcsatornában maradéktalanul elbontható.

17 CMG eredmények! Sikeresen transzformáltunk búzát a Cmg1 génnel kotranszformáció segítségével, ahol a szelekciós marker a pff19k plazmid által hordozott nptii gén, vagy a pahc20 plazmid bar génje volt. Összesen 179 putatív transzgénikus vonalat állítottunk el! szelektív körülmények között.! Elvégeztük a szükséges molekuláris és a rozsda rezisztencia bioteszt vizsgálatokat a transzgénikus jelleg bizonyítására. A regenerált vonalakból 78-at vizsgálva 27 esetében találtuk meg a cmg1 gént, ezek közül 20 vonal mutatott több-kevesebb rezisztenciát a biotesztek során.! A bizonyítottan transzgénikus vonalakon élelmiszer biztonsági vizsgálatokat végeztünk.! A génexpressziós fehérje termékre fókuszált eddigi vizsgálatok alapján nem jelentenek élelmiszer-biztonsági kockázatot.! Elkészítettük a zöldszövet-specifikus promoterrel irányított CMG konstrukciót és megszületett az els! 9 feltételezetten transzgénikus növény ezzel a konstrukcióval.

18 Szövetspecifikus transzgén szabályozás " Ribulóz-1,5-biszfoszfát karboxiláz/ oxigenáz enzim (RuBisCO) " Zöldszövet specifikus " Az idegen fehérje a takarmány és élelmiszeripari szempontból jelent!s szövetekben nincs jelen.

19 A transzformációs rendszer Növénynevelés Kalász primordium izolálás T0 transzgenikus növény Szövettenyésztés és Növényregenerálás Géntranszfer kotranszformáció

20 Biotest. Sorszám Név Bonitálási érték 1 3A/1/1 0; A/1/2 0;1 3 3A/1/3 0;1-4 3A/1/4 0; A/1/5 0;1 6 3A/1/6 0; 7 3A/1/7 0;1 8 3A/1/8 0 0;1 9 3A/1/9 0; A/1/10 0; A/1/11 0;2 12 3A/1/12 0; A/1/13 0; A/1/14 0; A/1/15 0; A/1/16 0; A/1/23 0; A/1/24 0;1-19 3A/1/25 0; A/1/26 0;1 21 3A/1/27 0 0; A/1/28 0 0; Bonitálás Stackmann alapján Bonitálási Sorszám Név érték 23 3A/1/29 0; 24 3A/1/30 0; A/1/31 0 0; A/1/32 0 0; A/1/33 0 0;1 28 3A/1/34 0 0;1 29 3A/1/35 0 0; A/1/36 0 0; A/1/37 0 0; A/1/38 0 0;2 33 3A/1/39 0; A/1/40 0 0; A/1/41 0; A/1/42 0 0; A/1/43 0 0; A/1/44 0; A/1/45 0 0; A/1/46 0 0; A/1/47 0 0;-1 K1 CY-45 0;2-3 K2 Délibáb 4 (S) K3 Dogankent 0:X

21 PCR teszt RuBisCO promoter-cmg1 gén Fragment: 356bp Hasadás 41 mintából 32db transzformáns a cmg1 génre 9db PCR alapján negatív 32 : 9 3 : 1 Minta Bioteszt PCR 3A/1/2 0;1 3A/1/3 0;1-3A/1/5 0;1 3A/1/6 0; 3A/1/7 0;1 3A/1/8 0 0;1 3A/1/24 0;1-0;1 3A/1/26 0 0; 3A/1/28 0; 3A/1/29 0 0;1 3A/1/33 0 0;1 3A/1/34 0 0;-1 3A/1/43 3A/1/47 0 0;-1 3A/1/9 0;0-2 3A/1/10 0;1-2 3A/1/11 0;2 3A/1/14 0;1-2? 3A/1/15 0;1-2? Minta Bioteszt PCR 3A/1/16 0;1-2? 3A/1/25 0;1 2 3A/1/27 0 0; 2-3 3A/1/30 0;2-3 negativ 3A/1/31 0 0; 2-3 3A/1/32 0 0; A/1/35 0 0;1-2 3A/1/36 0 0;1 2 3A/1/37 0 0;1-2 3A/1/38 0 0;1-2 3A/1/40 0 0;2 3A/1/42 0 0;1-2 3A/1/45 0 0; 2-3 3A/1/46 0 0;2-3 3A/1/1 0;1-3 negativ 3A/1/4 0;1-3? negativ 3A/1/12 0;1 2-3? negativ 3A/1/13 0;2-3? negativ 3A/1/23 0;1 2-3 negativ 3A/1/39 0;1 2-3 negativ 3A/1/41 0;2-3 negativ 3A/1/44 0;2-3 negativ

22 Rt-PCR!"#$%&'()*,*-'./012.'34,' '!"#$'56)7*',*78*9*:' -74;*7*33*<' ' '

23 Fehérjekimutatás I. 20 aminosav hosszúságú oligopeptid Ellenanyag el!állítása nyúlban Poliklonáris IgG ellenanyag tisztítása dialízissel Kalibrációs görbe beállítása kompetitív indirekt ELISA módszerre Western-blot el!kísérlet kontroll mintákon Esetleges keresztaktivitás kimutatása Abszorbancia (490/630 nm) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Cmg1-1 kalibrációs görbe 0 0,001 0,01 0, cmg1-1 koncentráció (µg/ml)

24 B*C,*7)'?<D:'EFG'3D),7D<<'H4I)JAKKK' A gomba nehezen tenyészthet! EXO-!-1,3-GLUKANÁZ FEHÉRJE EXPRESSZIÓJA HETEROLÓG RENDSZERBEN Champion pet Directional TOPO Expression Kit ptopo (blunt-end PCR termék) pet system: pet-19b His-Tag &' L (745A;4M'NO%=P'Q'MRSTNO%=P'"'' L /4C9U,IC' L V?W'XYZ'[C9,ACI5\'@*H67]*'

25 Fehérjekimutatás III. Szövetspecifitás bizonyítása Különböz" szöveti eredet# minták teljes fehérjeizolátuma Szövetek: liszt) Gyökér Szár Levél Éretlen mag (viaszérés) Érett mag (labortiszta

26 összegzés Minta Bioteszt PCR Rt PCR Western blot 3A/1/2 0;1 Rt 1. 3A/1/3 0;1- Rt 2. 3A/1/5 0;1 Rt 1. 3A/1/6 0; Rt 1. 3A/1/7 0;1 Rt 1. 3A/1/8 0 0;1 Rt 1. 3A/1/24 0;1- Rt 2. 0;1 3A/1/26 Rt ; 3A/1/28 Rt 1. 0; 3A/1/29 Rt ;1 3A/1/33 Rt ;1 3A/1/34 Rt ;-1 3A/1/43 Rt 1. 3A/1/47 0 0;-1 Rt 1. 3A/1/9 0; A/1/10 0; A/1/11 0;2 2. 3A/1/14 0;1-2? 2. 3A/1/15 0;1-2? Rt 2. Minta Bioteszt PCR Rt PCR Western blot 3A/1/16 0;1-2? Rt 2. 3A/1/25 0; A/1/27 0 0; A/1/30 0;2-3 negativ negativ 3A/1/31 0 0; A/1/32 0 0; A/1/35 0 0; A/1/36 0 0; A/1/37 0 0;1-2 Rt 2. 3A/1/38 0 0; A/1/40 0 0;2 2. 3A/1/42 0 0; A/1/45 0 0; A/1/46 0 0; A/1/1 0;1-3 negativ negativ 3A/1/4 0;1-3? negativ Rt - negativ 3A/1/12 0;1 2-3? negativ Rt - negativ 3A/1/13 0;2-3? negativ Rt - negativ 3A/1/23 0;1 2-3 negativ negativ 3A/1/39 0;1 2-3 negativ negativ 3A/1/41 0;2-3 negativ negativ 3A/1/44 0;2-3 negativ negativ

27 Eredmények összefoglalása Transzformációs vektor RuBisCO kisalegység promóterrel Kotranszformáns GM vonalak el"állítása közvetlen géntranszfer módszerrel GM vonalak PCR analízis Mesterséges fert"zési tesztek módosítása, optimalizálása Hexaploid búza Szövetspecifikus szabályzás Jó eredmény provokációs tesztben Provokációs teszt kevertspórás levélrozsda patotípusokkal Rt-PCR!-1,3 exo-glükanáz specifikus nyúl IgG ellenanyag kontroll fehérje termeltetése, tisztítása Western-blot

28 További célok QPCR Kópiaszám megállapítása Folyamatban: el!zetes eredmények 4 vagy 8 detektálható a PCR pozitív növények mintáiban Publikálás Folyamatban USA Minneapolis: UG99

29 Lisztharmat rezisztencia kialakítása búzában