A gsh1-transzgénikus szürkenyár stresszindukciója cink és paraquat tesztben, és nyár szomaklónok mikroszatellita diverzitása

Átírás

1 Szent István Egyetem Gödöll A gsh1-transzgénikus szürkenyár stresszindukciója cink és paraquat tesztben, és nyár szomaklónok mikroszatellita diverzitása Doktori értekezés tézisei Bittsánszky András Gödöll 2006

2 A doktori iskola megnevezése: SZIE Növénytudományi Doktori Iskola tudományága: Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok vezet je: Dr. Virányi Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora Szent István Egyetem Növényvédelemtani Tanszék doktori program: Növénynemesítés Genetikai és Biotechnológiai Módszerekkel programvezet : Dr. Heszky László egyetemi tanár, az MTA tagja Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék témavezet : Dr. Gyulai Gábor egyetemi docens, a biológiai tudományok kandidátusa Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszék Dr. Virányi Ferenc Dr. Gyulai Gábor doktori iskola vezet je témavezet

3 3 1. A munka el zményei, a kit zött célok Glutation tartalomban megemelt transzgénikus szürkenyár (Populus canescens) klónok stresszt r képességét jellemeztük in vitro körülmények között. A glutation bioszintézise két, ATP-t igényl lépésben megy végbe (1. ábra). A nyárklónokba a -glutamil-cisztein szintáz ( -ECS) enzimet kódoló bakteriális gsh1 gént építették be, amely a glutation tripeptid (GSH) bioszintézisének a kulcsenzime. A transzgénikus nyárklónok több glutationt és -glutamilciszteint ( -EC) termeltek, mint a vad típusúak. A glutationtartalom a transzgénikus klónokban 2-4 volt nagyobb. Munkánk célja az volt, hogy a növények stresszt r képességét jellemezzük és a leginkább stressztoleráns klónt kiválasszuk, in situ fitoremediációs felhasználás végs lehet ségével. Egyes kísérleteknél kontrollként a feketenyár (P. nigra) N-SL klónját is a vizsgálatokba vontuk. Célunk volt továbbá, hogy a feketenyár (Populus nigra N-309, N-SL) szomaklónjaiban (1-47) meghatározzuk a mikroszatellita lókuszok variabilitásának mértékét. 1. ábra A glutation bioszintézisének két utolsó enzimatikus lépése a reakciót katalizáló enzimekkel.

4 4 2. Anyag és módszer Munkánk során két típusú transzformánst jellemeztünk: a 11ggs klónban a transzgén fehérjeterméke a citoszolban, a 6Lgl klónban pedig a kloroplasztban akkumulálódik. A transzgént a 2. ábrán látható konstrukciókkal juttatták be a növényekbe. Mikroszatellita elemzésehez portok eredet, szabadföldön nevelt feketenyár (P. nigra) szomaklónokat vontunk be a kísérletbe. Az általunk vizsgált összesen 37 szomatikus klón közül 29 az N-SL klónról származik, 6 klón pedig az N-309 klónról. 2. ábra A) A transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció a -ECS citoszolban való túltermeltetéséhez. LB: bal oldali határoló régió; P-p70: karfiolmozaik-vírus 35S promótere dupla feler sít (enhancer) szekvenciával; gsh1: a -ECS enzimet kódoló gén szekvenciája; T-35S: karfiolmozaik-vírus poli(a) szekvenciája; T-nos: nopalin szintáz promótere; nptii: neomycin foszfotranszferázt kódoló gén szekvenciája; P-nos nopalin szintáz terminátor szekvenciája; RB: jobb oldali határoló régió. B) A transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció a -ECS kloroplasztiszban való túltermeltetéséhez. rbcs: borsó RUBISCO enzim kis alegység tranzitpeptidjét kódoló része. A gshi-transzgén (E.coli, NCBI N o X03954) jelenlétének és expressziójának tanulmányozására génspecifikus próbákat alkalmaztunk (35S a: 5 -gct cct aca aat gcc atc a-3 ; gsh1 a: 5 -atc ccg gac gta tca cag g-3 ; gsh1 b: 5 -gat gca cca aac aga taa gg-3 ; pea rbcs a: 5 -cag aag tga gaa aaa tgg ct-3 ;

5 5 pea rbcs b: 5 -cat gca ctt tac tct tcc ac-3 ). A kísérletekhez PCR és RT-PCR reakciókat alkalmaztunk 25 μl végtérfogatban PE9700 PCR készülékben. A klónok genetikai stabilitását faflp módszerrel (fluorescent amplified fragment length polymorphism) határoztuk meg. A fragmenteket 12 szelektív primer párral szaporítottunk föl EcoRI / MseI emésztést követ en. A klónok fitoextrakciós képességének jellemzésére 8 mm átmér j levélkorongokat inkubáltunk steril körülmények között 21 napig ZnSO 4 különböz koncentrációival (10-1 M 10-5 M) kiegészített WPM táptalajon. A klónok oxidatív stresszel szembeni érzékenységének tanulmányozására levélkorongokat vágtunk a vad típusú Populus canescens klónból és a két transzgénikus vonalból, amelyeket paraquat különböz koncentrációival terheltünk. A levélkorongokat WPM táptalajon tenyésztettük, amelyek 0,2% 1% illetve 2% szacharóz kiegészítést tartalmaztak. Az klorofiltartalmat jelz rbcs (ribulóz-1,5-biszfoszfát karboxiláz/oxigenáz kis alegység) és a stresszfügg gst (glutation S-transzferáz) gének expressziójának analízisét végeztük el szemikvantitatív RT-PCR reakcióval a 11ggs klónon. Az expresszió szintjét denzitométerrel határoztuk meg közvetlenül agaróz gélr l. Öt mikroszatellita markert alkalmaztunk a szomaklónok vizsgálatához (WPMS2, WPMS4, WPMS6, WPMS20, PTR4). Az SSR fragmentek elemzését ALF készülékkel végeztük (automated laser fluorometer). A fragmentek léte ill. nem léte alapján dendrogramot készítettünk SPSS11 programmal. 3. Eredmények A gshi transzgén jelenlétét (3. ábra) és expresszióját mindkét transzgénikus klónban (11ggs, 6Lgl) kimutattuk PCR ill. RT-PCR reakciókkal. Tehát a transzgén konstrukció az évek során nem eliminálódott, a klónokban stabilan jelen van és m ködik.

6 A) B) 6 3. ábra A) A transzgénikus nyárakba bevitt bináris vektor részleteinek kimutatása 35S a / gsh1 b primerpárral. szürkenyár (Populus canescens) transzgénikus 11ggs és 6Lgl, valamint a nem transzformált kontroll klónjaiban, DNS nélküli kontrollal (-). B) A transzgénikus 6Lgl klónba beépített borsó rbcs gén jelenlétének bizonyítása pea rbcs a / pea rbcs b primerpárral. Összesen 682 közös AFLP fragmentet detektáltunk 12 szelektív primerpárral. Ezek közül 4 fragment volt polimorf, amelyeket az Eco-AGT / Mse-CCC primerpárral szaporítottunk föl (4. ábra). Ez összesen 99,4%-os genetikai azonosságot jelent a P. canescens klónok között, tehát a genetikai polimorfizmus alacsony. (a) _43_AGT-CAT_C06_06.f sa 6 Green 11ggs _44_AGT-CAT_D06_08.f sa 8 Green 6Lgl _45_AGT-CAT_E06_10.f sa 10 Green kontroll (b) _54_AGT-CCC_F07_11.f sa 11 Green 1_55_AGT-CCC_G07_13.f sa 13 Green 11ggs 6Lgl _56_AGT-CCC_H07_15.f sa 15 Green kontroll ábra Példa a transzgénikus szürkenyár 11ggs és 6Lgl klónjainak és a nem transzformáns kontroll faflp fragment analízise során kapott monomorf (EcoAGT MseCAT) (a) és polimorf (EcoAGT MseCCC) (b) mintázatára. A nyilak a polimorf fragmenteket jelölik.

7 7 Cink csak magas koncentrációnál volt fitotoxikus ( M) a P. canescens vonalakban, azonban a P. nigra klón érzékenyebbnek bizonyult. A transzgénikus nyárak nehézfémtartalma magasabb volt a nem transzgénikus klónokhoz képest. A Zn 2+ kezelés jelent sen indukálta a glutation S-transzferáz enzim aktivitását a nem transzformált klónokban míg a transzgénikus vonalakban az indukció jóval kisebb mérték volt. Az eredményeink alapján arra következtethetünk, hogy a transzgénikus nyárklónok stresszt r képessége valamint cink-fitoextrakciós kapacitása jobb a vad típusú klónokénál. A paraquat 0,2% szacharóz kiegészítés mellett koncentrációfügg csökkenést okozott a glutation S-transzferáz enzim (GST) aktivitásában. Magasabb szacharóz kiegészítés (1%, 2%) mellett viszont a paraquat jelent s GST aktivitást indukált. A GST indukció fényfüggést is mutatott (5. ábra). A fluoreszcencia mérések kimutatták, hogy magas paraquat koncentráció (4 x x 10-6 M) gátolta a fotoszintetikus apparátus hatékonyságát az összes nyárklónban. Ez a gátlás nem bizonyult fényfügg nek, a fotoszintézis hatékonysága (F v /F m ) a sötétben inkubált levélkorongoknál is azonos mérték volt paraquat jelenlétében. A transzgénikus klónok nagyobb GSH tartalma nem okozott különbséget a paraquat okozta stressz t résében. 5. ábra A glutation S-transzferáz (GST) enzim aktivitása a transzgénikus P. canescens 11ggs és 6Lgl, valamint a nem transzformált kontroll klónjaiból vágott levélkorongokban különböz koncentrációjú paraquat kezelés hatására. A tenyészeteket 16 h fény / 8 h sötét fotoperiódusban inkubáltuk három különböz szacharóz-kiegészítés mellett. Jelölések: - - 0,2% szacharóz fényben; - - 1,0% szacharóz fényben; - - 2,0% szacharóz fényben; - - 1,0% szacharóz sötétben; - - 2,0% szacharóz sötétben. Az átlagértékek és a szórás jelölve (n=3).

8 8 A kísérleteink és az irodalomban leírtak alapján megállapítható, hogy legjobb stresszt r és nehézfémakkumulációs képességgel a 11ggs klón rendelkezik, ezért ez a klón javasolható szabadföldi fitoextrakciós alkalmazásra nehézfémekkel szennyezett talajokon. A transzgénikus Populus canescens 11ggs klónjának génexpressziós analízisét végeztük el szemikvantitatív RT-PCR reakcióban. Az rbcs gén expressziója paraquat hatására lecsökkent, míg a gst gén expressziója nem változott igazolva, hogy a GST nem transzkripcionális szinten szabályozódik Az N-SL és N-309 feketenyár klónokból származó szomaklónok genetikai polimorfizmusának elemzését végeztük el öt SSR primerrel. Összesen 20 allélt tudtunk detektálni. A primerenkénti allélszám 1 és 6 között volt: WPMS-02 (5 allél), WPMS-04 (6 allél), WPMS-06 (2 allél), WPMS-20 (6 allél) és PTR-04 (1 allél). A dendrogram alapján elkülönültek az N-SL illetve N-309 klónokból származó szomaklónok. A polimorf WPMS-02 (5 allél), WPMS-04 (6 allél) és a WPMS-20 (6 allél) markerekkel detektáltunk különbséget a szomaklónok között. A hét N-309 klón között 3 klóntípus különült el, a 30 N-SL klón között 5 klóntípus. A huszonhárom N-SL szomaklón kontrollal való egyez sége a feketenyár genetikai stabilitására utal, de az új SSR klónok variabilitási forrásként vehet k számba Új tudományos eredmények 1. Igazoltam gsh1 génspecifikus PCR próbák tervezésével és alkalmazásával, hogy a 7-8 éve in vitro kultúrában mikroszaporítással fenntartott gsh1- transzgénikus szürkenyár klónokban (11ggs, 6Lgl) a transzgén konstrukció stabilan jelen van, a transzgén nem szegregálódott. 2. Megállapítottam (AFLP), hogy az évek óta mikroszaporítással fenntartott gsh1-transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és kontroll szürkenyár klónok

9 9 genetikailag azonosak, a szaporítás során a klónok átlagosan mindössze 0,6%-os mértékben különböztek AFLP fragmentumokban. 3. Kimutattam RT-PCR elemzéssel, hogy a gsh1-transzgénikus szürkenyár klónokban (11ggs, 6Lgl) az E. coli eredet gsh1 transzgén expresszálódik. 4. Meghatároztam a Zn 2+ fajfügg fitotoxikus koncentrációját a gsh1- transzgénikus (11ggs, 6Lgl) és nem transzgénikus kontroll szürkenyár (Populus canescens) klónjaiban ( M), valamint az érzékenyebbnek bizonyult feketenyár (P. nigra, N-SL) klónokban (10-3 M). Igazoltam a genetikailag módosított szürkenyár klónok (11ggs, 6Lgl) extrém fitoextrakciós kapacitását (11ggs 331,9%-os Cu-felvétel; 6Lgl 122,7% Cu felvétel 10-2 M ZnSO 4 stresszben), kimutatva ezzel egy nagymérték ZnSO 4 -aktivált Cu akkumulációt nyár levélkorongok tenyészetben. Kimutattam továbbá, hogy Zn 2+ -stresszben, a megn tt glutation-kapcsolt stresszt r képesség következtében a gsh1- transzformánsokban kisebb mértékben aktiválódik a stressz-indikátor glutation S-transzferáz enzim (11ggs 20,6%; 6Lgl 49,2% a 10-3 M ZnSO 4 stresszben). Bizonyítottam, hogy a 11ggs transzformáns szürkenyár a legígéretesebb fitoextrakciós célú felhasználásra cinkkel szennyezett talajok esetén. 5. Bizonyítottam, hogy az elemzett gsh1-transzgénikus (11ggs, 6Lgl) szürkenyár (Populus canescens) klónok paraquat-toleranciája nem múlja felül a kontroll klónok toleranciáját, mert a 4-szeres (400%) glutationtartalom növekedés nem bizonyult elegend nek az 5-6-szoros glutationtartalom biztosította paraquat-t r képességhez. Kimutattam a paraquat-stimulált glutation S-transzferáz enzim (GST) aktivitásának

10 10 függését eltér szacharóz ellátottság mellett: alacsony (0,2%) szacharóz tartalom mellett a GST aktivitása csökkent, viszont nagyobb (1%, 2%) szacharóz ellátottság mellett a paraquat jelent s GST enzimaktivitás növekedést okozott. Kimutattam, hogy GST csak fényben volt indukálható paraquat stresszben. 6. Meghatároztam (cdns - RT-PCR) a paraquat (4x10-7 M) stressz-indukált transzgénikus (11ggs) szürkenyár (Populus canescens) klón stressz-függ gst (glutation S-transzferáz enzim) és rbcs (ribulóz-1,5-biszfoszfát karboxiláz kis alegység) génjének expresszióját szemikvantitatív RT-PCR reakcióban. Bizonyítottam, hogy az rbcs gén expressziója paraquat hatására lecsökkent, míg a gst gén expressziója nem csökkent igazolva, hogy a GST nem transzkripcionális szinten szabályozódik. 7. Kimutattam, hogy a feketenyár (P. nigra) portok-tenyészet során új genotípusok indukálódnak, mert N-309 jel klónok 33%-a, valamint az N- SL klónok 26%-a mutatott új mikroszatellita-típusú genom szervez dést. 4. Következtetések és javaslatok Az eredményeink és az irodalomban leírtak alapján levonhatjuk a következtetést, hogy a glutation túltermel gsh1 transzgénikus növények stresszt r képessége jobb, mint a vad típusú növényeké. A kísérleteink alapján a 11ggs klón fitoextrakciós hatékonysága cinkstresszben 10-40%-al volt jobb a kontrollhoz képest. Kadmium esetén 20-40% javulást írtak le. Viszont paraquat stressz esetében nincsen különbség, vagyis a klónok oxidatív stresszt r képessége ezzel a transzgén konstrukcióval nem javult. A jobb nehézfémt r képességet a fitokelatinok magasabb szintje okozhatja. Szabadföldi fitoextrakciós eljárásokra a 11ggs klón felhasználása a fitokelatinképz dést indukáló és a fiatal levelekbe transzlokálódó

11 11 nehézfémekkel szennyezett területeken javasolható. A kísérletek további irányaként a 11ggs klón szabadföldi kipróbálása jelölhet meg cinkkel illetve nehézfémekkel szennyezett területeken. Azonban jó stresszt r képességb l nem következik automatikusan a jó fitoextrakciós képesség. A nyár stresszt r képességének javítására a glutation túltermeltetésén kívül alternatív megközelítések is célravezet k lehetnek: 1. Gazdasági és környezetvédelmi szempontok miatt mérlegelend a karfiolmozaik vírus 35S promóterének a cseréje. 2. A glutation S-transzferáz enzim túltermeltetésével gyomirtószerrezisztencia alakítható ki. Ez a megoldás nyárban is célravezet lehet. 3. A fitoremediáció sikerét növényt l független tényez k is befolyásolják, mint pl. éghajlat, mikorrhiza kapcsolat, agronómiai el készítés stb. A klónok nemesítésénél és alkalmazásánál ezekre is tekintettel kell lennünk. 4. A szomaklonális variabilitásra alapozva paraquat rezisztens nyárklónok szelektálhatóak in vitro. Az irodalmi adatok szerint a paraquat rezisztens klónok multirezisztenciával rendelkeznének. Ennek a megközelítésnek másik el nye, hogy a a szelekcióval létrehozott genotípusok el nyt élveznek a géntechnológiával módosított klónokkal szemben. 5. Publikációk 5.1. Az értekezés témakörében megjelent publikációk Tudományos cikkek 1. Gullner G., Gyulai G., Bittsánszky A., Kiss J., Heszky L., K míves T. (2005) Enhanced inducibility of glutathione S-transferase activity by paraquat in poplar leaf discs in the presence of sucrose. Phyton 45: Bittsánszky A., Gyulai G., Kiss J., Gullner G., Csintalan Z., Szabó Z., Lágler R., K míves T. (2005) Stress tolerance and in vitro phytoremediation of poplar (Populus sp.). Hungarian Agricultural Research 14/1: Bittsánszky A., K míves T., Gullner G., Gyulai G., Kiss J., Heszky L., Radimszky L., Rennenberg H. (2005) Ability of transgenic poplars with elevated glutathione content to tolerate zinc (2+) stress. Environment International 31:

12 12 4. Gyulai G., Humphreys M., Bittsánszky A., Skøt K., Kiss J., Skøt L., Gullner G., Heywood S., Szabó Z., Lovatt A., Radimszky L., Roderick H., Abberton M., Rennenberg H., K míves T., Heszky L. (2005) AFLP analysis and improved phytoextraction capacity of transgenic gshi-poplar clones (Populus canescens L.) in vitro. Zeitschrift für Naturforschung C 60: Kiss J., Törjék O., Bittsánszky A., Gyulai G., Mázik-T kei K., Kiss E., Heszky L. (2003) Analysis of the phenotypic and molecular characteristics of anther culture derived poplar trees. Bulletin of the Szent István University, Gödöll p Bittsánszky A., Gyulai G., Humphreys M., Gullner G., Csintalan Z., Kiss J., Szabó Z., Lágler R., Tóth Z., Rennenberg H., Heszky L., K míves T. (2006) RT- PCR analysis and stress response capacity of transgenic gshi-poplar clones (Populus x canescens) in response to paraquat exposure. Zeitschrift für Naturforschung C (in press) Referált konferencia kötetek 1. Bittsánszky A., Gyulai G., Humphreys M., Kiss J., Csintalan Z., Lágler R., Szabó Z., Gullner G., Rennenberg H., K míves T., Heszky L. (2004) Stress capacity and RT-PCR analysis of transgenic gshi poplar clones (P. canescens) in response to paraquat exposure. In: J Vollmann, H. Grausgruber, P. Ruckenbauer (eds) Genetic variation for plant breeding, pp The 17th Eucarpia General Meeting, 8-11, September, Tulln, Austria, ISBN Bittsánszky A., K míves T., Gullner G., Gyulai G., Kiss J., Heszky L., Radimszky L., Rennenberg H. (2003) Ability of transgenic poplars with elevated glutathione content to tolerate zinc(2+) stress. Proceedings of the Second European Bioremediation Conference, Chania, Crete, Greece, p Bittsánszky A., Gyulai G., Kiss J., Gullner G., Szabó Z., Radimszky L., K míves T., Heszky L. (2003) In vitro fitoextrakció gsh-1 transzgénikus nyárfaklónokkal. EU konform mez gazdaság és élelmiszerbiztonság (ed. Szemán L, Jávor A), Gödöll, p ISBN Konferencia absztraktok 1. Bittsánszky A., Gyulai G., Kiss J., Gullner G., Szabó Z., Lágler R., K míves T., Heszky L. (2005) Molecular instability of poplar somatic clones (Populus nigra) at SSR loci. XVII International Botanical Congress, July, Vienna Austria, p Bittsánszky A., Gyulai G., Szabó Z., Gullner G., Kiss J., Csintalan Z., Lágler R., K míves T., Heszky L. (2005) Elektronakceptor elleni stresszt rés transzgénikus nyárfában XI. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p Gyulai G., Humphreys H., Bittsánszky A., Skøt K., Szabó Z., Heywood S., Kiss J., Gullner G., Skøt L., Radimszky L., Lovatt A., Lágler L., Abberton M., Roderick H., Rennenberg H., K míves T., Heszky L. (2004) Cut clone stability and improved phytoextraction capacity of transgenic gshi poplar clones (Populus canescens) in vitro Phytoremediation: Environmental and Molecular Biological Aspects September Mátraháza, Hungary p Bittsanszky A., Gyulai G., Humphreys M., Szabó Z., Kiss J., Gullner G., Csintalan Z., Lágler L., Rennenberg H., K míves T., Heszky L. (2004)

13 13 Phytoremediation capacity of transgenic gshi poplar clones (P. canescens) in response to paraquat exposure in vitro. Phytoremediation: Environmental and Molecular Biological Aspects September Mátraháza, Hungary p Bittsánszky A., Gyulai G., Kiss J., Szabó Z., Csepelényi M., Gullner G., Lehoczky P., Márta P., Radimszky L., K míves T., Heszky L. (2004) Effect of heavy metals and herbicides on GST and LOX enzyme activity of transgenic and somaclone poplars. Innováció, tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában, Április 16, p Debrecen, ISBN Bittsánszky A., Gyulai G., Kiss J., Szabó Z., Csepelényi M., Gullner G., Lehoczky P., Márta P., Radimszky L., K míves T., Heszky L. (2004) A nehézfém és gyomirtószer hatása a gsh1-transzgénikus (P. canescens) és szelektált (P. nigra) nyárfaklónok GST- és LOX- enzimaktivitására. Innováció, tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában, Április 16, p.131. Debrecen, ISBN Bittsánszky A., Gyulai G., Szabó Z., Kiss J., Künstler A., Csepelényi M., Gullner G., Lehoczky P., Márta P., K míves T., Heszky L. (2004) Paraquat tolerancia a gsh-1 transzgénikus (Populus canescens) és szomaklón (Populus nigra) nyárfában X. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p Bittsánszky A., Gyulai G., Kiss J., Gullner G., Szabó Z., Radimszky L., K míves T., Heszky L. (2003) Transzformáns (gsh-1) nyárfaklónok fitoextrakciója in vitro. V. Magyar Genetikai Kongresszus, Siófok p Bittsánszky A., Gyulai G., Szabó Z., Kiss J., Gullner G., K míves T., Heszky L. (2003) A gsh-1 génnel transzformált nyárfaklónok alkalmazhatóságának vizsgálata a fitoremediációban. IX. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p Egyéb publikációk Tudományos cikkek 1. Szabó Z., Gyulai G., Horváth L., Bittsánszky A., Szani Sz., Lágler R., Kiss J., Gyulai F., Holly L. Heszky L. (2005) Genetic diversity of Hungarian melon landraces (C. melo) compared to an extinct sample from the Middle Ages. Hungarian Agricultural Research 14/2: Lágler R., Gyulai G., Humphreys M., Szabó Z., Bittsánszky A., Horváth L., Gyulai F., Heszky L. (2005) Morphological and molecular analysis of common millet (P. miliaceum) cultivars compared to an adna sample from the 15th century (Hungary). Euphytica 146: Szabó Z., Gyulai G., Humphreys M., Lágler R., Bittsánszky A., Horváth L., Gyulai F., Holly L., Heszky L. (2005) Genetic variation of melon (C. melo) compared to an extinct landrace from the Middle Ages (Hungary). Euphytica 146: Bittsánszky A, Gyulai G,, Gajdos L., Szabó Z., Gémesné JA.,Kiss J., Lágler R., Heszky L. (2006) Genotype identification of onion (Allium cepa L) cultivars. Acta Horticulturae (in press)

14 14 Referált konferencia kötetek 1. Szabó Z., Gyulai G., Humphreys M., Bittsánszky A., Gyulai F., Lágler R., Kiss J., Horváth L., Heszky L. (2004) adna analysis of cantaloupe (Cucumis melo L) from the Middle Ages compared to modern varieties. In: J Vollmann, H. Grausgruber, P. Ruckenbauer (Eds) Genetic variation for plant breeding, pp The 17th Eucarpia General Meeting, 8-11, September, Tulln, Austria, ISBN Szabó Z, Humphreys M., Gyulai G., Kiss J., Lovatt A., Skøt L., Heywood S., Abberton M., Skøt K., Bittsánszky A., H Roderick, Gyulai F., Heszky L. (2004) DNA recovery and AFLP analysis of two ancient samples of common millet (Panicum miliaceum L.) from the 4th and 14th centuries. Annual Symposium of Plant Science Wales. Aberystwyth December Szabó Z, Gyulai G, Gyulai F., Kiss J, Bittsánszky A., Heszky L (2003) Mai sárgadinnye (Cucumis melo L.) fajták és egy középkori lelet molekuláris összehasonlítása. EU konform mez gazdaság és élelmiszerbiztonság (ed. Szemán L, Jávor A), Gödöll, p ISBN Bittsánszky A., Gyulai G, Kászonyi G, Kiss J, Gémesné Juhász A, Gajdos L, Heszky L (2002) Hazai és külföldi vöröshagymafajták (Allium cepa) molekuláris típusazonosítása RAPD módszerrel. Innováció, a tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában (ed Jávor A, Pepó P), Debrecen, p ISBN Konferencia absztraktok 1. Szabó Z., Gyulai G., Lágler R., Bittsánszky A., Kiss J., Horváth L., Heszky L. (2005) Genetic variation and SNP analysis of modern melons compared to a medieval sample. XVII International Botanical Congress, July, Vienna Austria, p Lágler R., Gyulai G., Humphreys M., Szabó Z., Sándor J., Bittsánszky A., Kiss J., Horváth L., Heszky L. (2005) CAP analysis of common millet cultivars compared to 15th century sample. XVII International Botanical Congress, July, Vienna Austria, p Lágler R., Szabó Z., Gyulai G., Bittsánszky A., Kiss J., Gyulai F., Horváth L., Heszky L. (2005) Középkori köles molekuláris rekonstrukciója. XI. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p Szabó Z., Gyulai G., Lágler R., Bittsánszky A., Kiss J., Gyulai F., Horváth L., Heszky L (2004) Középkori sárgadinnye molekuláris rekonstrukciója. XI. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p Szabó Z., Gyulai G., Humphreys M., Bittsánszky A., Gyulai F., Kiss J., Horváth L., Heszky L. (2004) Organellar and nuclear DNA analysis of cantaloupe (Cucumis melo L) from the Middle Ages (2004). The 7th International Conference on Ancient DNA and Associated Biomolecules. Brisbane, July, Queensland, Australia.

15 15 6. Szabó Z., Gyulai G., Humphreys M., Bittsánszky A., Horváth L., Kiss J., Gyulai F., Lágler R., Holly L., Heszky L. (2004) Comparison of modern cantaloupe varieties (Cucumis melo L) to a sample from the Middle Ages. In Vitro Culture and Horticultural Breeding, Biotechnology as Theory and Practice in Horticulture. p th IVCHB Symposium, September Debrecen. 7. Gyulai G., Humphreys M., Szabó Z., Skøt L., Heywood S., Kiss J., Lovatt A., Gyulai F., Skøt K., Horváth L., Abberton M., Bittsánszky A., H Roderick., Heszky L. (2004) AFLP fragment analysis and sequencing of aged DNA of common millet (Panicum miliaceum L.) from the 4th and 15th centuries. The 7th International Conference on Ancient DNA and Associated Biomolecules. Brisbane, Queensland, July, Australia. 8. Szabó Z., Gyulai G., Gyulai F., Humphreys M., Bittsánszky A., Horváth L., Kiss J., Heszky L. (2004) DNA recovery and RAPD, SSR ITS analysis of cantalupe (Cucumis melo L) from the Middle Ages. p th IWPG, Symposium of the International Work Group for Paleoethnobotany, May, Girona, Spain 9. Gyulai G., Humphreys M., Gyulai F., Szabó Z., Skøt L., Heywood S., Kiss J., Lovatt A., Skøt K., Horváth L., Abberton M., Bittsánszky A., Roderick H., Heszky L. (2004) Ancient DNA analysis of c. millet (Panicum miliaceum L.) from the 4th and 15th centuries. p th IWPG, Symposium of the International Work Group for Paleoethnobotany, May, Girona, Spain. 10. Szabó Z., Gyulai G., Bittsánszky A., Gyulai F., Lágler R., Kiss J., Horváth L., Heszky L. (2004) Microsatellite fragment analysis of cantaloupe (Cucumis melo) seed remains excavated from the middle ages. Innováció, tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában, Április 16, p.86-87, Debrecen, ISBN Szabó Z., Gyulai G., Bittsánszky A., Gyulai F., Lágler R., Kiss J., Horváth L., Heszky L. (2004) Fragmentum izolálás és DNS szekvencia-elemzés középkori sárgadinnye (Cucumis melo) mintában. Innováció, tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában, Április 16, p.86, Debrecen, ISBN Lágler R., Gyulai G., Szabó Z., Bittsánszky A., Kiss J., Gyulai F., Horváth L., Heszky L. (2004) Molecular analysis of millet (Panicum miliaceum L.) from the 4th and 15th centuries. Innováció, tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában, Április 16, p.84, Debrecen, ISBN Lágler R., Gyulai G., Szabó Z., Bittsánszky A., Kiss J., Gyulai F., Horváth L., Heszky L. (2004) Archaeogenetikai vizsgálatok 4. és 15. századi köles mintákban (Panicum miliaceum L.). Innováció, tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában, Április 16, p.83, Debrecen, ISBN Heywood S., Gyulai G., Szabó Z., Sándor J., Humphreys M., Kiss J., Lovatt A., Skøt K., Abberton M., Bittsánszky A., Roderick H., Gyulai F., Horváth L., Heszky L. (2004) AFLP- f ABI fragmentum- és szekvenciaelemzés a 4.- és 14. századi kölesmagvak (Panicum miliaceum) DNS mintáiban X. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p Szabó Z., Gyulai G., Bittsánszky A., Gyulai F., Kiss J., Horvát L., Heszky L. (2004) Mikroszatellita- és ITS-analízis középkori sárgadinnyemagvak (Cucumis melo L.) DNS mintáiban X. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p.155.

16 Szabó Z., Gyulai G., Gyulai F., Bittsánszky A., Kiss J., Heszky L. (2003) Középkori sárgadinnye (Cucumis melo L.) magvak DNSének molekuláris elemzése. V. Magyar Genetikai Kongresszus, Siófok p Szabó Z., Gyulai G., Bittsánszky A., Gyulai F., Kiss J., Heszky L. (2003) Régészeti maradványok és a mai fajták genetikai összehasonlítása sárgadinnyében (Cucumis melo L.). IX. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p Bittsánszky A., Gyulai G., Kászonyi G., Gémesné JA., Gajdos L., Heszky L. (2002) Hazai és külföldi vöröshagyma- (Allium cepa L.) fajtatípusok genetikai azonosítása. VIII. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p Petus M., Gyulai G., Gémesné JA., Gajdos L., Bittsánszky A., Kászonyi G. (2000) SPAR PCR characterisation of Hungarian onion (Allium cepa L.) cultivars selected from special hungarian landtypes. Abstract, 3 rd Int. Symp. on Edible Alliaceae. October 29-November 3, Athens, USA. Dolgozatok 1. Bittsánszky A. (2006) A gsh1-transzgénikus szürkenyár stresszindukciója cink és paraquat tesztben, és nyár szomaklónok mikroszatellita diverzitása PhD dolgozat SZIE Növénytudományi Doktori Iskola, Gödöll 2. Bittsánszky A. (2002) Hazai és külföldi vöröshagymafajták (Allium cepa L.) molekuláris típusazonosítása RAPD módszerrel. Diploma dolgozat SZIE-MKK Genetika és Növénynemesítés Tanszék, Gödöll 3. Bittsánszky A, Kászonyi G. (2001) Vöröshagyma (Allium cepa L.) vonalak és fajták RAPD-PCR alapú molekuláris jellemzése TDK dolgozat SZIE-MKK Genetika és Növénynemesítés Tanszék, Gödöll