A kukorica ZmgstF4 génjének átvitele lúdfűbe (Arabidopsis thaliana)

Átírás

1 kukorica Zmgst4 génjének átvitele lúdfűbe (rabidopsis thaliana) Bittsánszky 1, yulai 2, zakó 3, ullner 1, árton 3, ilinszky 1, irály 1,2, őmíves 1 1 Ö Budapest; 2 Z B ödöllő; 3 University of outh arolina, ept. Biol., olumbia, U bittsanszky.andras@agrar.mta.hu; gyulai.gabor@mkk.szie.hu; czako@biol.sc.edu; gullner.gabor@agrar.mta.hu; marton@biol.sc.edu; pilinszky.katalin@agrar.mta.hu; iraly.ata.gnes@hallgato.szie.hu; komives.tamas@agrar.mta.hu 1. Összefoglalás kukorica UO--ZÁZ (Zmgst4, syn.: gst27, B: ) génjét vittük át lúdfűbe (rabidopsis thaliana) virágmerítéses módszerrel. transzformációs vektor (1. ábra) előállításához a standard rekombináns technikát alkalmaztuk. kukorica Zmgst4 (korábban gst27) gén c szekvenciáját pambia 1301 klónozó vektorba klónoztuk. regenerált transzgénikus növényeket higromicin tartalmú táptalajon szelektáltuk. árom generáció felnevelése után a homozigóta vonalakat kiszelektáltuk, és a továbbiakban ezeket vizsgáltuk. transzgén jelenlétét -rel, az expresszióját -q módszerrel bizonyítottuk. transzgénikus növényekben a beépült gén kópiaszámát kvantitatív módszerrel állapítottuk meg és a 3 növényeket funkcionálisan jellemeztük nehézfém és gyomirtó szer stresszben. 1. ábra Zmgst4 transzgén vektorkonstrukciója a génszakaszok hosszának ( bp) jelölésével. B és B: az grobacterium tumefaciens tumorindukáló i plazmidjának a transzgént közrezáró határoló szakaszai (eft/ight Border). 35: az átíródó 35-Zmgst4-m poli() szekvenciáját kódoló génszakasz a karfiol mozaikvírusból (a). hpt: a transzformánsok higromicin-rezisztenciáját kialakító higromicin-foszfotranszferáz szelekciós marker gén. p 35 és 35: karfiol mozaikvírus (a) 35 promótere dupla felerősítő (enhancer) szekvenciával. Zmgst4: a kukorica () gst4 génje. nos: z grobacterium nopalin szintáz génjének átírását lezáró (terminátor) szekvenciája. 2. áz enzimek szerepe UO--ZÁZ enzimek (ázok, , < 50 ka) kiemelkedő szerepet játszanak a biotikus és abiotikus stressz elleni védekezésben, növényekben és állatokban egyaránt (2a. ábra). áz-katalizált reakciókban a káros elektrofil xenobiotikumok kovalens kötésű konjugátumot képeznek a glutation tripeptiddel (), majd, ahogyan ez a herbicidek méregtelenítésében történik, a herbicid konjugátum (2b. ábra) a sejtüregbe (vakuolum) szállítódik az B-transzporterek ( binding casette) segítségével, és ezzel kikapcsolódik a sejt életéből. 1

2 2a. ábra glutation () alapú növényi detoxifikációs folyamatok molekuláris rendszere. z elektrofil xenobiotikumok (pl. kábítószerek, drogok, herbicidek stb.) olyan alacsony elektronsűrűségű reakciócentrummal rendelkező kémiai szennyezőanyagok, amelyek spontán reakcióba lépnek a nukleofil vegyületekkel, így a fehérjékkel és a nukleinsavakkal, ezzel károsítva a sejt metabolizmusát és genomját. áz klasszikus méregtelenítő funkciója a méreganyag- konjugátum kialakulásának katalízise. - konjugátum (μ) / gram friss tömeg / perc x x x x 10-6.canescens (1 %).canescens (2 %). nigra (1 %). nigra (2 %) 2b. ábra áz katalizálta - konjugátum kialakulásának mértéke in vitro paraquat herbicid (4x10-9 4x10-6 ) stresszben, két nyárfa (. nigra és. canescens) levélkorong-tenyészetében 1% és 2% cukorellátottság mellett. ázok felfedezése (1960) a humán drog-detoxifikációhoz fűződik. övényekben való szerepük a kukorica atrazin-tűrésének megfejtésekor derült ki az atrazin- konjugátum kimutatásával (1970), amely már nem mérgező a kukoricára. áz enzimek a növényekben nagy mennyiségben vannak jelen: a levelekben a vízoldható fehérjéknek közel 2%-át alkotják. ok esetben a áz enzimek a felelősek a növények herbicidrezisztenciájáért. -ázokat többgénes, nagy és diverz géncsaládok kódolják, amelyek, szekvenciájuk alapján ma már csoportba (géncsalád) sorolhatók, ezek az (alfa-), a prokarióta B (béta-), a (delta-), a mitokondriális (kappa-), valamint az (mu-), O (omega-), (phi-), (théta-), U (tau-), Z (zéta-), illetve a -szerű (lambda-) és a trimer (mikroszomális-) enzimek. gy további, az (sigma)- az állati prosztaglandin szintáz enzime. 2

3 (2) 4(3) U26 U Zm (2) U24 U23 U25 U U U20 69 U22 U U28 U5 U8 U7 U15 U16 U17 U13 U14 U18 U11 U Z2 Z1 U9. U9 U10 U4 U3 U2 U1 0.2 l-ase 3a. ábra lúdfű (rabidopsis thaliana) 51 klónozott t izoenzimének (-, -, U-, Z-enzimcsaládok) és a kukoricából klónozott Zm4 ( ) enzimének aminosav-szekvencia rokonsági kladogramja. ( - inimum volution módszer, 5, x0 ismétlés/bootstrap). z egyes géncsaládokat (,, U, Z) külön szín jelzi a relatív genetikai távolság (skála: aminosav-eltérések száma per mérce) megadásával. baktériumok prokariotikus enzimei a B (cb) (c scherichia coli) csoportba tartoznak. teljes rabidopsis genom szekvenciája alapján ismertté váltak a növényi enzimcsaládok, amelyek az -, Z-, -, és az U- csoportba tartoznak (3a, b, c. ábra; 1. táblázat). - és a Z--ok közösek az állatokban és a növényekben. z -, és - enzimek a klasszikus humán gyógyszer/drog metabolizmus részei, az ismert emberi (omo sapiens) enzim csoportokon belül, melyek a s-, s-, s-o, s-, és a s tt tt tt b. ábra lúdfű (rabidopsis thaliana) három tt1-3 enzimének aminosav-szekvencia illesztése (Biodit) alacsony fokú diverzitást mutat ellentétben az tu- és tf izoenzimekkel (ld. 3a. ábra). 3

4 4 3c. ábra lúdfű t4 (a) és a kukorica Zm4 (b) ezimek aminosav-összetételének összehasonlító spirálkerék diagrammjai (helical wheels). (kék - alifás-; piros - negatív töltésű; fekete - pozitív töltésű aminosavak). poláros, hidrofób oldalláncú aminosavak: (alanin), (fenilalanin), (glicin), (izoleucin), (leucin), (metionin), (prolin), (valin), (triptofán). oláros, töltéssel nem rendelkező aminosavak: (cisztein), (glicin), (aszparagin), (szerin), (glutamin), (treonin), (tirozin). avas oldalláncú (negatív töltésű) aminosavak: (aszparaginsav), (glutaminsav). Bázikus oldalláncú (pozitív töltésű) aminosavak: (hisztidin), (lizin), (arginin). 4a. ábra z rabidopsis (t), a kukorica (Zm) és a nyárfa (t) 4 proteinjeinek összehasonlító szekvenciaillesztése (Biodit) (jelzések: azonos/konszenzus aa ( ); hiányzó aa (-); eltérő aa: az aminosavak nevének egybetűs jelölésével) t4a t4b Zm t4 opulus t (a) (b)

5 1. táblázat. lúdfű (rabidopsis thaliana) t1-51 (-, -, U-, Z ) és a kukoricából klónozott () transzgénikus Zm4 fehérjék aminosav-összetételéből szerkesztett evolúciós divergenciamátrixa (5) a legmagasabb értékek (2.0 aa változás/lokusz) jelölésével. - [ 1] 2; [ 2] 3; [ 3] 4; [ 4] 4(2); [ 5] 4(3); [ 6] Zm4; [ 7] 5; [ 8] 6; [ 9] 7; [10] 8; [11] 9; [12] 9(2); [13] 10; [14] 11; [15] 12; [16] 13; [17] 14; - [18] 1; [19] 2; [20] 3; [21] l-ase; - [22] U1; [23] U2; [24] U3; [25] U4; [26] ; U5; [27] U6; [28] U7; [29] U8; [30] U9; [31] U9.; [32] U10; [33] U11; [34] U12; [35] U13; [36] U14; [37] U15; [38] U16; [39] U17; [40] U18; [41] U19; [42] U20; [43] U21; [44] U22; [45] U23; [46] U24; [47] U25; [48] U26; [49] U27; [50] U28; - [51] Z1; [52] Z2. [ ] [ 1] [ 2] 0.1 [ 3] [ 4] [ 5] [ 6] [ 7] [ 8] [ 9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52]

6 gst gének nagy száma és a kromoszómán való csoportosulásuk (klasztereik) evolúciós génsokszorozódás következményei. rabidopsisban 51 gst gén található (3a. ábra), a kukoricában 42 (12 -, 28 -, és 2 Z-gst) (4a, b. ábra), a szójában 25 (20 -, 4 -, és 1 Z-gst). - enzimcsalád enzimei emlősökben hasznos evolúciós markerek (4c. ára). ordeum vulgare subsp vulgare ordeum vulgare subsp vulgare ordeum vulgare subsp vulgare riticum aestivum riticum aestivum ordeum vulgare subsp vulgare orghum bicolor Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa ndica roup Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa ndica roup Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa Japonica roup athaya argyrophylla Oryza sativa Japonica roup ordeum vulgare subsp vulgare riticum aestivum icea sitchensis Oryza sativa ndica roup icea sitchensis icinus communis orghum bicolor ordeum vulgare subsp vulgare orghum bicolor orghum bicolor opulus trichocarpa opulus trichocarpa opulus trichocarpa opulus trichocarpa itis vinifera itis vinifera lycine max lycine max Oryza sativa ndica roup Oryza sativa Japonica roup lycine max orghum bicolor orghum bicolor ordeum vulgare subsp vulgare ordeum vulgare subsp vulgare riticum aestivum riticum aestivum lopecurus myosuroides lopecurus myosuroides lopecurus myosuroides lopecurus myosuroides Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa Japonica roup orghum bicolor orghum bicolor Oryza sativa ndica roup Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa Japonica roup orghum bicolor asypyrum villosum ordeum vulgare subsp vulgare riticum aestivum nanas comosus synthetic construct orghum bicolor ennisetum glaucum hragmites australis ordeum vulgare subsp vulgare riticum aestivum riticum aestivum ordeum vulgare subsp vulgare ynodon dactylon Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa ndica roup Oryza sativa ndica roup Oryza sativa ndica roup Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa Japonica roup Oryza sativa ndica roup 4b. ábra kukorica () Zm4 (223 aa, B # _ ) evolúciós rokonsági dendrogramja és diverzitása a kukorica () különböző mintáinak genomjaiban az ősi kapcsolatot mutató nyitvatermőkig (J eighbour Joining B; 5, x 0 ismétlés/bootstrap). z egyszikű fajokon (zöld) belül a kukorica izoenzimeit (piros), a kétszikűekét (kék) és a nyitvatermő fajokét (lila) eltérő színek jelzik, a genetikai rokonságot skála (0,35) jelzi. enzimek dimer felépítésűek (homo- és heterodimerek), ezért valószínű, hogy génduplikációval jöttek létre az evolúció során. dimer mindkét aminosav (aa) láncának aminocsoport végén (-terminális) található a konzervatív aa-szekvenciájú -kötő szakasz (-domén), a karboxilcsoport végén pedig (terminális) a hidrofób szubsztrát-kötő -domén. két szakasz között rövid (10-15 aa) kapcsoló szakasz található. homodimer k (az -, és a -) két alegységét, értelemszerűen, ugyanaz a gén, míg a heterodimerekét két különböző gén kódolja. szabad heterodimer kombinációk tovább növelték (elsősorban a növényekben) a enzimek funkcionális diverzitását, és ezzel a növények evolúciós alkalmazkodó képességét, melyben a gyomirtó szerek megjelenésének indukciós hatása is feltételezhető. l. a kukorica --je a Zm 1-1 homodimer (az 1-1 jelzés mutatja). erbicid ellen védő kezelés után azonban kimutatható a heterodimer Zm 1-2 is. gst gének expressziója szövetspecifikus, de az - és az U-gst gének stresszinduktívak is; pl. a kukorica Zm2 génje csak a gyökérben működik, de herbicidkezelésre a levélben is expresszálódik. U-gst gének hormon által indukálhatóak is (auxinokkal és citokininekkel). 6

7 u2 omo sapiens u2 ongo abelii BB acaca fuscata u2 acaca mulatta 58 X u2 avia porcellus X u4 an troglodytes X u quus caballus X u1 anis lupus familiaris u3 us musculus 5 4c. ábra z emlősök - enzimcsaládjának rokonsági (maximum parsimony) dendrogramja (5; x 0 ismétlés/bootstrap). genetikai rokonságot skála (5 aa eltérés/mérce) jelzi. 3. Zmgst4 transzformáns lúdfű (rabidopsis thaliana) funkcionális jellemzése gyomirtó szer (metolaklór) és nehézfém (d, Zn) stresszben transzgénikus vonalak funkcionális igazolására biotesztet végeztünk gyomirtó szer és nehézfém stresszben. (b) (a) O Zmgst4 OZmgst4 5. ábra etolaklór herbicid teszt. természetes () lúdfű (rabidopsis thaliana) klónja (ol-gl1) és a Zmgst4 génnel transzformált lúdfű (O) 3 regeneránsai csírázási tesztben 200 µ metolaklór tartalmú ½ táptalajon (a) és tőzegkockában (b) 3 nap hidegkezelést követően 20 nap után, 16/8 fény/sötét fotoperiódus alatt nevelve, 22 -on). metolaklórral átitatott szűrőpapíron csíráztatott transzgénikus 3 rabidopsis növények magvai, valamint levelei a metolaklór gyomirtó szer permetezése után minden kezelésben nagyfokú rezisztenciát mutattak (5. ábra). -emzimaktivitás szignifikánsan magasabb volt a 3 Zmgst4 növényekben kadmiumstresszben, viszont a cinkstressz nem indukált szignifikáns -aktivitásváltozást még extrém magas koncentrációban (1500 μ) sem (6. ábra). 7

8 6. ábra -aktivitás do 4 és ZnO 4 stresszben. Zmgst4 kukoricagénnel transzformált lúdfű (rabidopsis thaliana) UO--ZÁZ (áz) aktivitása (az 1-klór-2,4-dinitrobenzol B- konjugátum képződésének mértéke alapján) a ( ) kadmium d- (a) és ( ) cink Zn- (b) stresszben összehasonlítva a ( ) lúdfűvel. stabil homozigóta transzgénikus Zmgst4 lúdfűvonalak kiváló modellként szolgálhatnak különböző xenobiotikumok fitoremediációs folyamatainak vizsgálatához, és készen állnak keresztes virágúakba (ruciferae) történő átvitelre keresztezéssel. rodalom: Bittsánszky, yulai, őmíves (2010) rabidopsis thaliana overexpressing glutathione -transferase: modelling an effective phytoremediation. J Biotechnology 150, upplement 1: 486. zakó, X eng, e, iang, árton (2006) ransgenic partina alterniflora for phytoremediation. nvironmental eochemistry and ealth (2006) 28: ullner, yulai, Bittsánszky, J iss, eszky, őmíves (2005) nhanced inducibility of glutathione -transferase activity by paraquat in poplar leaf discs in the presence of sucrose. hyton 45: yulai, Bittsánszky, ullner, y eltai, ilinszky, olnár, őmíves (2012) ene reactivation induced by demethylation in ild ype and 35-gsh-rbc transgenic poplars (opulus x canescens). ovel plant sources for phytoremediation. J hemical cience and echnology 1: őmíves, ullner (2005) hase xenobiotic metabolic systems in plants. Z aturforsch 60c: árton,, J ullems, olendijk, chilperoort (1979) n vitro transformation of cultured cells from icotiana tabacum by grobacterium tumefaciens. ature 277: ilinszky, Bittsánszky, yulai, őmíves (2012) esponse of rabidopsis thaliana to stress by zinc and cadmium. övénytermelés O: /övényterm uppl. 5: vizsgálatokat az O és az O pályázat támogatta. 8