KALCIUM-ÉRZÉKELŐ RECEPTOROK ÉS AKVAPORINOK AZ EMBERI HASNYÁLMIRIGYBEN

Átírás

1 KALCIUM-ÉRZÉKELŐ RECEPTOROK ÉS AKVAPORINOK AZ EMBERI HASNYÁLMIRIGYBEN Rácz Gábor Ph.D. értekezés témavezető: Varga Gábor, MTA doktora MTA KOKI, Budapest, Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai Ph.D. program Opponensek: Dr. Darvas Zsuzsanna és Dr. Czakó László Szigorlati bizottság: Prof. Zelles Tivadar, Prof. Pap Ákos és Váradi András, MTA doktora

2 TARTALOMJEGYZÉK Tartalomjegyzék... 2 Rövidítések jegyzéke... 5 Összefoglalás... 7 Summary... 8 Bevezetés és irodalmi áttekintés... 9 Az emésztőrendszer... 9 A hasnyálmirigy... 9 A hasnyálmirigy anatómiája... 9 A hasnyálmirigy duktuszok folyadék- és ionszekréciója A hasnyálmirigy duktuszok szekréciójának szabályozása: a G-protein kapcsolt receptorok szerepe A kalcium-érzékelő receptor A kalcium szerepe az élettani folyamatokban A kalcium-érzékelő receptor klónozása A CaR gén A CaR expressziója és szerepe a kalcium-homeosztázisban részt vevő szövetekben A CaR funkciója a kalcium-homeosztatikus rendszeren kívül A CaR-hoz kapcsolódó szignalizációs útvonalak A CaR mutációk révén bekövetkező betegségek Az akvaporinok A víz mozgása a szövetekben Az első akvaporin felfedezése Az akvaporin-1 szerkezete Akvaporin izoformák és élettani szerepük különböző szövetekben, köztük hasnyálmirigyben Akvagliceroporin izoformák és élettani szerepük a különböző szövetekben Az akvaporinok szerepe egyes betegségekben

3 A kalcium-érzékelő receptorok és az akvaporinok lehetséges szerepe a hasnyálmirigy folyadék- és ionhomeosztázisában Célkitűzések Anyagok és módszerek Szövetminták Sejttenyésztés RNS izolálása és reverz transzkripció Polimeráz láncreakció az AQP1, -3, -4 és -8 kimutatására AQP5 PCR CaR PCR A PCR-termékek vizsgálata A CaR teljes kódoló régiójának klónozása és szekvenálása Kontroll reakciók A CaR RT PCR kvantifikálása Antitestek Immunhisztokémia Az intracelluláris szabad kalciumion-koncentráció meghatározása A DNS-szintézis mérése Statisztikai módszerek Eredmények Kalcium-érzékelő receptorok az emberi hasnyálmirigyben A CaR mrns expressziója Az emberi hasnyálmirigy CaR cdns szekvenciájának meghatározása A CaR immunhisztokémiai kimutatása Az intracelluláris szabad kalciumszint változása Sejtosztódási vizsgálatok Kalcium-érzékelő receptorok az emberi hasnyálmirigyben: az eredmények összegzése Akvaporinok az emberi hasnyálmirigyben Az akvaporinok expressziójának mrns-szintű vizsgálata Az AQP1 lokalizációjának immunhisztokémiai vizsgálata Az AQP1 és a CFTR kolokalizációja interkaláris duktuszokban

4 AQP1 az emberi pankreász intra- és interlobuláris duktuszaiban AQP1 a patkány hasnyálmirigyben Az AQP5 immunhisztokémiai lokalizációja Az AQP5 és a CFTR kolokalizációja interkaláris duktuszokban AQP5 a mucinózus duktuszokban és mirigyekben Egyéb akvaporinok Akvaporin izoformák expressziója és lokalizációja emberi hasnyálmirigyben: az eredmények összegzése Megbeszélés A kalcium-érzékelő receptor többféle sejttípusban kifejeződik az emberi hasnyálmirigyben A CaR lehetséges élettani szerepe az emberi hasnyálmirigy külső elválasztású részének működésében A CaR expressziója nem-exokrin sejtekben A Capan-1 sejtvonal mint a normál emberi duktuszsejt működésének modellje CaR expresszió a rákos hasnyálmirigyben Az akvaporin izoformák és a CFTR lokalizációja az emberi hasnyálmirigy külső elválasztású részének különböző sejttípusaiban Az AQP1 eloszlása az exokrin hasnyálmirigyben és lehetséges szerepe a duktális folyadékelválasztásban Az AQP5 expressziója és kolokalizációja AQP1-gyel emberi hasnyálmirigyben. 60 Az AQP1 eloszlásának összehasonlítása emberi és patkány hasnyálmirigyben Az AQP3, AQP4 és AQP8 eloszlása az emberi hasnyálmirigyben Akvaporin expresszió emberi hasnyálmirigy rákban és daganatos sejtvonalakban62 Következtetések Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék Bibliográfia

5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ADH AE AM AQP ATCC ATP bp BSA Ca i camp CaR cdns CFTR CHIP crns CTAL DIDS DMEM dntp DTT ECD EIPA ERK FHH GABA G i, G q/11, G s Glp GPCR H 2 DIDS HBSS autoszómás domináns hipokalcémia anioncserélő acetoximetil észter akvaporin American Type Culture Collection adenozin-trifoszfát bázispár marha szérumalbumin a citoszól kalcium-koncentrációja ciklikus adenozin-monofoszfát kalcium-érzékelő receptor komplementer (mrns-ről visszaírt) dezoxi-ribonukleinsav cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor channel-like integral protein cdns-ről átírt RNS a disztális vesetubulus kortikális szakasza 4,4'-diizotiocianátsztilbén-2,2'-diszulfonsav Dulbecco s Modified Eagle s Medium dezoxinukleotid-trifoszfát ditiotreitol extracelluláris domén 5-(N-etil-N-izopropil)-amilorid extracellular signal regulated kinase familiális hipokalciuriás hiperkalcémia gamma-amino-vajsav GTP-kötő fehérje alosztályok gliceroporin G-protein kapcsolt receptor dihidro-4,4 -diizotiocianátsztilbén-2,2 -diszulfonsav Hank's buffered saline solution 5

6 Ig IMCD M mglur MIP mp mrns MTAL NBC NDI NHE NP NSHPT PBS PCR PKA PKC PLC PTH RT SEM UTP UTR VR immunglobulin a vese gyűjtőcső medulla belső részére eső szakasza mol/liter metabotróp glutamátreceptor major intrinsic protein másodperc hírvivő ribonukleinsav a disztális vesetubulus medulláris szakasza Na + -bikarbonát kotranszporter nefrogén diabetes insipidus Na + /H + cserélő normál pankreász neonatális súlyos hiperparatiroidizmus phosphate buffered saline polimeráz láncreakció protein kináz A protein kináz C foszfolipáz C paratiroid hormon reverz transzkripció standard error of means uridin-trifoszfát nem transzlálódó régió vomeronazális receptor 6

7 ÖSSZEFOGLALÁS A kalcium-érzékelő receptor (CaR) fontos szerepet játszik az extracelluláris tér kalciumszintjének szabályozásában, így szerte a kalcium-homeosztatikus rendszerben kifejeződik. Ugyanakkor a CaR előfordul egyéb szövetekben is, ahol szerepe változatos lehet. Patkány hasnyálmirigyben is leírták. Az exokrin hasnyálmirigy nagy mennyiségű izotóniás nedvet termel, amely főleg a vezetékrendszerből ered. Hogy e folyamatban milyen szerepet játszanak az akvaporinok, az nem ismert. A CaR és az akvaporinok expresszióját, valamint a CaR lehetséges élettani szerepét egészséges és kóros emberi pankreász mintákban, valamint hasnyálmirigy sejtvonalakban vizsgáltuk. Az emberi hasnyálmirigy több sejttípusában azonosítottunk kalcium-érzékelő receptorokat: duktuszokban, acinusokban, erekben, idegekben és szigetsejtekben. A receptoroknak szerepük lehet a mirigy működésében: részt vehetnek a duktális folyadékszekréció, a sejtosztódás, valamint a szerv vérátáramlásának szabályozásában. A Capan-1 sejtvonal használható modellrendszernek ígérkezik a kalcium-érzékelő receptor pankreász duktuszsejtekben betöltött élettani szerepének vizsgálatára. Az AQP1 és az AQP5 nagy mennyiségben mutatható ki emberi exokrin pankreász interkaláris duktuszaiban. Kolokalizálnak a duktális elektrolitszekréció markereként számontartott CFTR-rel, és az interkaláris duktuszoktól távolodva mindhárom fehérje expressziója csökken. Ez valószínűsíti, hogy emberi hasnyálmirigyben a folyadékszekréció a duktuszfa végső ágaiban összpontosul, az AQP1 és az AQP5 pedig fontos szerepet játszik a vízáramlás és az ionszekréció összekapcsolásában. Saját munkánk és mások eredményei alapján fölvázolhatunk egy modellt, amelyben az akvaporinok és a kalcium-érzékelő receptorok egy hasnyálmirigy duktuszokban működő homeosztatikus mechanizmus szereplői. Az acinusok szekréciós granulumainak exocitózisa révén lokálisan megnövekvő kalciumszint a duktuszok kezdeti szakaszán stimulálja a luminálisan elhelyezkedő kalcium-érzékelő receptorokat, amelyek aktiválódva a bikarbonát-ionok szekrécióját fokozó jelétviteli mechanizmusokat indítanak be. A lumenbe kerülő ionokat a víz az ozmotikus grádiens irányában passzívan követi, a duktális epitéliumon át történő gyors vízmozgást a duktuszsejteken bazolaterálisan és apikálisan kifejeződő vízcsatornák teszik lehetővé. 7

8 SUMMARY Calcium-sensing receptor (CaR) plays a key role in the regulaton of calcium homeostasis and is therefore expressed throughout the calcium homeostatic system. However, CaR is expressed outside the calcium homeostatic system as well, where it has several different roles. CaRs have been shown in rat pancreas. The exocrine pancreas secretes a copious amount of isotonic fluid, originating mainly from ducts. The role of aquaporins in this process is unknown. We studied the expression of CaR and aquaporins, and the possible physiological role of CaR in normal and diseased human pancreas, and human pancreatic cancer cell lines. We detected the CaR in in multiple cell types in human pancreas: ducts, acini, vessels, nerves and islets of Langerhans. The receptors may have multiple roles in the physiology of the gland: they may be involved in the regulation of ductal fluid secretion, cell proliferation and organ blood flow. The Capan-1 cell line is a promising model system for studying the physiological role of CaR in ductal pancreatic cells. AQP1 and AQP5 are abundantly expressed in the intercalated ducts of of human exocrine pancreas. They colocalize with CFTR, a marker of ductal electrolyte secretion. Along the ductal tree, each of the three proteins is decreasingly expressed with distance from intercalated ducts. This implies that, in human pancreas, the major site of fluid secretion is probably the terminal branches of the ductal tree and AQP1 and AQP5 play major roles in coupling fluid movement to ion secretion. Based on our work and the results of others, we can propose a model wherein aquaporins and calcium-sensing receptors play key roles in a homeostatic mechanism operating in pancreatic ducts. Local increases in calcium level arising from the exocytosis of secretory granules from acini stimulates luminal calcium-sensing receptors in the initial segments of ducts. Stimulated receptors in turn activate signalling mechanisms that eventually increase bicarbonate secretion, and ions secreted into the lumen are passively followed by water along the osmotic gradient. Rapid transepithelial water movement is mediated by aquaporins expressed on the basolateral and luminal membranes of human pancreatic ducts. 8

9 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az emésztőrendszer Emésztőrendszerünk az a szervrendszer, amely a környezetünkből fölvett táplálék fölaprítását, továbbítását, emésztését és a tápanyagok fölszívását végzi. Funkciója lényegében a táplálék makromolekuláinak (fehérjék, zsiradékok, keményítő) lebontása kismolekulákká (aminosavak, zsírsavak, egyszerű cukormolekulák), majd a tápanyagmolekulák fölszívása és vérkeringésbe juttatása. Az emésztőrendszert leegyszerűsítve egy szájnyílástól a végbélnyílásig terjedő csővezetékként képzelhetjük el, amelynek egyes részei az adott feladatok ellátására specializálódtak. Táplálékunkat szájunkon át vesszük magunkhoz, itt történik annak mechanikai aprítása, valamint megkezdődik emésztése a nyálmirigyek által termelt, szénhidrátbontó amilázt tartalmazó közel semleges vegyhatású nyál révén. A táplálék ezután a nyelőcsövön keresztül a gyomorba kerül, ahol ideiglenesen tárolódik és a savas (ph=2) közegben a pepszin révén folytatódik emésztése. A következő állomás a vékonybél első szakasza, a patkóbél. Ide ürül a máj által termelt epe és az enyhén lúgos hasnyál. Az epében található epesavak apró zsírcseppekre emulgeálják a zsiradékokat. A pankreász által termelt hasnyál pedig semlegesíti a gyomortartalom savas kémhatását, valamint az emésztésben kulcsszerepet játszó amilázt, lipázt, tripszint, kimotripszint és egyéb enzimeket tartalmazza. Ezek az enzimek alakítják a táplálék makromolekuláit fölvehető kismolekulákká, amelyek aztán a vékonybélben szívódnak föl. A hasnyálmirigy A hasnyálmirigy anatómiája A pankreász hosszúkás, rózsaszínes mirigy, amely a gyomor mögött, a patkóbéltől (duodenum) körülölelve található [133]. Termékét a duodenumba üríti. Vékony kötőszövetes tokja, a mirigyállományba szeptumokként benyúlva lebenykékre osztja azt. A mirigy működését tekintve két részre osztható. Az endokrin működésért a mirigyállományban elszórva található Langerhans-szigetek felelősek, amelyek a véráramba inzulint, glukagont és számos egyéb hormont választanak el. A hasnyálmirigy nagyobbik, exokrin része összetett tubuloacináris mirigy (1. ábra). 9

10 Az emésztőenzimeket szintetizáló és elválasztó sejtek acinusnak nevezett szőlőfürtszerű csoportokba rendeződnek, a nyálmirigyben látotthoz igen hasonló módon [89]. Az acinussejtek az emésztőenzimeket membránkötött szekretoros granulumokban tárolják. A granulumok tartalma exocitózissal jut az acinus lumenjébe. Az acinussejtekből származó enzimek egy faszerűen elágazó vezetékrendszeren keresztül végül a patkóbélbe ürülnek. A duktuszsejtek vizes, bikarbonátban gazdag nedvet választanak el, amely egyrészt az emésztőenzimeket szállítja a duktuszokon keresztül, másrészt a patkóbélbe érkező gyomortartalom savas kémhatását semlegesíti. 1. ábra: Az exokrin hasnyálmirigy felépítése. ID: interlobuláris duktusz; id: intralobuláris duktusz; d: interkaláris duktusz; ac: acinussejtek; ic: intercelluláris canaliculusok; C: centroacináris sejtek; Lu: az acinusok lumene; a: acinus Az ábra forrása: [89]. Méret és elhelyezkedés szerint négyféle duktuszt különböztetünk meg [42]. Az acinusok szekrétuma a lumenből közvetlenül az interkaláris duktuszokba kerül. Az interkaláris duktusz epitélium ellaposodó köbhámja egészen az acinus lumenébe felnyúlik, ezeket a sejteket centroacináris sejteknek nevezzük. Az intralobuláris duktuszok, ahogy nevük is mutatja, a lebenykéken belül helyezkednek el, klasszikus köbhám béleli őket, és az interkaláris duktuszok tartalmát szállítják tovább. Az interlobuláris duktuszok a kötőszövetes szeptumokban futnak, méretük meglehetősen változó. A kisebbeket köbhám, a nagyobbakat hengerhám béleli. Funkciójuk, hogy az intralobuláris duktuszok tartalmát továbbítják a fő hasnyálmirigy vezeték felé. A fő hasnyálmirigy vezeték (ductus pancreaticus major) a Vater-papillánál nyílik a patkóbélbe az epevezeték alatt vagy azzal együtt. A másik nagy kivezetőcső, a ductus pancreaticus accessorius, fölöttük torkollik a papilla duodeni minorba. A hasnyálmirigy duktuszait alaphártyán ülő, polarizált sejtekből álló egyrétegű epitélium béleli. A sejtek alaphártya felé néző részét bazolaterális oldalnak nevezzük, a lumen felőli részüket pedig apikális vagy luminális oldalnak. A sejtek junkcionális komplexszel kapcsolódnak egymáshoz, amely elválasztja egymástól az apikális és a 10

11 bazolaterális membránt. Így lehetővé válik a sejtek polaritása. A junkcionális komplexnek három alkotóeleme van: a zonula occludens (tight junction), a zonula adhaerens (intermediate junction), és a dezmoszóma. A zonula occludens szoros kapcsolatot biztosít a sejtek között, a nagy molekulákat egyáltalán nem engedi át, a kis molekulákat és az ionokat viszont az epitélium fajtájától függően engedi vagy nem engedi át. A szorosan záró epitélium megakadályozza, míg az áteresztő epitélium lehetővé teszi a kismolekulák, ionok paracelluláris, sejtek közötti transzportját. A hasnyálmirigyben áteresztő epitélium található. A hasnyálmirigy duktuszok folyadék- és ionszekréciója A duktuszfa nemcsak az acinusokból érkező enzimben gazdag nedvet vezeti el, hanem sejtjei nagy mennyiségű, közel izotóniás, bikarbonátban gazdag, enyhén lúgos kémhatású nedvet termelnek [21], amely az elválasztott hasnyál térfogatának döntő részét adja. A bikarbonátszekréció során a duktális epitélsejtek három feladatot hajtanak végre: a bazolaterális oldalról bikarbonátot vesznek föl, azt a lumen felé leadják, és onnan nem veszik föl újra [101]. A bazolaterális membránon át a duktuszsejtek kétféle módon veszik föl a bikarbonátot [71]. Egyrészt a sejtbe diffúzióval bejutó szén-dioxid szénsavanhidráz reakció révén szénsavvá alakul, majd az protonra és bikarbonátra disszociál: CO 2 + H 2 O = H 2 CO 3 = H + + HCO 3. A sejtből a proton a bazolaterális Na + /H + cserélőn (NHE1) keresztül távozik. Másrészt a bazolaterális Na + -HCO 3 kotranszporteren (NBC1) át közvetlenül lép bikarbonát a sejtbe [67, 68]. Az NHE amiloriddal vagy 5-(N-etil-N-izopropil)-amiloriddal (EIPA), az NBC 4,4'- diizotiocianátsztilbén-2,2'-diszulfonsavval (DIDS) vagy dihidro-4,4 - diizotiocianátsztilbén-2,2 -diszulfonsavval (H 2 DIDS) gátolható. E gátlószerek alkalmazásával kimutatták, hogy a stimulált duktuszok bikarbonátszekréciójáért nagyobbrészt az NBC-, és csak kisebb mértékben az NHE-függő mechanizmus felelős, hozzájárulásuk aránya 3:1 [71]. A bazolaterális oldalról bekerült bikarbonátot a sejt a lumen felé adja le. Ennek mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. Patkányokon végzett vizsgálatok eredményei alapján leírtak egy modellt [53, 100], ahol szekretin vagy egyéb stimuláció hatására kloridcsatornák nyílnak meg (cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor, CFTR) és klorid lép ki a sejtből a lumenbe. 11

12 A kloridionok ezután klorid/bikarbonát anioncserélőn keresztül visszakerülnak a sejtbe, cserében bikarbonát lép ki. A patkány duktuszok klorid- és bikarbonátionok elegyét választják el, a hasnyálban a bikarbonát koncentrációja 70 mm körül van [126]. Az előbbi modell kielégítő magyarázatot ad a patkány duktuszban tapasztalt 70 mm bikarbonátra, ám a tengerimalacban, macskában, sertésben és emberben mért mm koncentrációra [107] már nem. Kutatási eredményeik alapján Ishiguro és munkatársai [71] új modellt állítottak föl a tengerimalac duktuszok nyugalmi és stimulált szekréciójának magyarázatára. NBC és NHE a duktuszsejtekben csak a bazolaterális membránban található, míg anioncserélők mind bazolaterálisan, mind apikálisan. A bikarbonát felvétele bazolaterálisan nagyobbrészt NBC, kisebbrészt NHE révén történik. Bikarbonát efflux ugyanakkor mind bazolaterálisan, mind luminálisan történik a kloridfelvételért cserében, ám nyugalmi állapotban az anioncserélő aktivitás bazolaterálisan magasabb, mint luminálisan (2. ábra). Ez biztosítja a kloridionok felvételét a bazolaterális membránon át. Luminálisan kloridionok távoznak a sejtből egy anioncsatornán, valószínűleg a CFTR-en keresztül. E folyamatok kismértékű, spontán, kloridot és bikarbonátot is tartalmazó szekréciót eredményeznek. BAZOLATERÁLIS OLDAL Na + HCO 3 NBC HCO 3 LUMINÁLIS OLDAL AE Cl 2. ábra. Az anionok áramlása stimulálatlan tengerimalac pankreász duktuszban, ha a sejteket mindkét oldalon magas klorid- és alacsony bikarbonát-tartalmú folyadék veszi körül. Átrajzolva [71] alapján. Cl AE HCO 3 Cl CFTR Szekretinnel vagy forskolinnal történő stimuláció hatására, ha a bazolaterális és luminális kloridionkoncentráció magas, a kloridionok intracelluláris szintje megnő, ami azt jelzi, hogy a stimuláció következtében megnövekedett, CFTR-en át történő apikális klorid-effluxnál nagyobb mértékben nő a klorid-influx (3. ábra). Stimulációt követően a kloridionok felvétele döntően a luminális membránban található anioncserélőn át történik. Stimuláció hatására a duktuszsejt a bazolaterális kloridfelvétel által hajtott, kis mennyiségű, kevert szekréció helyett bőséges, döntően bikarbonátot tartalmazó nedv 12

13 elválasztására kapcsol át, melyhez az NBC révén történő bazolaterális bikarbonátfelvétel szolgáltatja a hajtóerőt. A camp serkenti az anioncserét a luminális membránon át, a bikarbonát a belépő kloridért cserében lép ki. Ehhez a folyamathoz a kloridionok utánpótlása főként a luminális folyadékból történik, hiszen a bazolaterális membránon át csekély a kloridfelvétel. Fiziológiás körülmények között azonban a luminális folyadék összetételét a sejtek szekréciós aktivitása határozza meg, ami azt jelenti, hogy idő elteltével és a duktuszfán a patkóbél felé haladva egyre több benne a bikarbonát. 70 mm luminális [HCO 3 ] fölött a luminális anioncserélőt hajtó [HCO 3 ]-grádiens megfordul. Ez megfordítaná az anioncserélőt, amely bikarbonátot venne föl, míg cserében kloridot adna le, ám ez nem következik be, mivel a lumen magas [HCO 3 ]-ja gátolja az anioncserélő működését [70]. Az intracelluláris [Cl ] csökken, mivel a luminális anioncserélő nem hoz kloridot a sejtbe (4. ábra). Ilyen körülmények között, 7,2-es ph-nál, ami 20 mm intracelluláris [HCO 3 ]-nak felel meg, a membránpotenciált 60 mv-nak mérték [70], ami még 125 mm luminális [HCO 3 ]-nál is azt jelenti, hogy bikarbonát effluxnak kedvező elektrokémiai grádiens áll fenn. A bikarbonát kiáramlásához mindössze megfelelően nagy bikarbonát-konduktanciára van szükség, amit biztosíthat a CFTR vagy egy másik anioncsatorna. BAZOLATERÁLIS OLDAL + Na + HCO 3 Cl NBC AE? HCO 3 SZEKRETIN HCO 3 + Cl + LUMINÁLIS OLDAL AE CFTR Cl BAZOLATERÁLIS OLDAL + Na + HCO 3 Cl NBC AE? HCO 3 SZEKRETIN LUMINÁLIS OLDAL HCO AE Cl HCO 3 CFTR HCO 3 3. ábra: Az anionok áramlása szekretinnel stimulált tengerimalac duktuszsejtben, amelyet mindkét oldalról magas klorid- és alacsony bikarbonát-tartalmú folyadék vesz körül. Átrajzolva [71] alapján. 4. ábra: Az anionok áramlása szekretinnel stimulált tengerimalac duktuszsejtben, amelyet mindkét oldalról magas bikarbonát- és alacsony klorid-tartalmú folyadék vesz körül. Átrajzolva [71] alapján. 13

14 A hasnyálmirigy duktuszok szekréciójának szabályozása: a G-protein kapcsolt receptorok szerepe A hasnyálmirigy szekréciós aktivitásának szabályozásában fontos szerepet játszanak a gasztrointesztinális reguláló peptidek (pl. szekretin, kolecisztokinin, bombezin-szerű peptidek), a nukleotidok (pl. ATP, UTP), valamint különböző ionok (pl. az extracelluláris kalcium). A példaként felsorolt anyagok kémiai természete igen különböző, ám van egy közös tulajdonságuk: G-protein kapcsolt receptorokon keresztül hatnak. A hasnyálelválasztás elsősorban hormonális szabályozás alatt áll [48]. A szekretin enzimekben szegény, bőséges, lúgos nedv elválasztását idézi elő [71]. Hatását a kis duktuszok bikarbonát-szekretáló epitélsejtjein fejti ki. A szekretin receptora Gs fehérjén keresztül hatva adenilát-ciklázt aktivál és emeli a camp szintjét; az ennek révén aktiválódott protein kináz A pedig aktiválja az apikálisan elhelyezkedő CFTR kloridcsatornát. Az így létrejövő kloridáram szükséges a bikarbonát-szekrécióhoz. A kolecisztokinin az acinusokon fokozza a zimogén granulumok ürülését, így enzimekben gazdag hasnyál elválasztását okozza. A kolecisztokinin tengerimalacban a duktuszok szekrécióját is serkenti [132]. A kolecisztokinin intracellulárisan mind a camp, mind a Ca 2+ szintjét képes növelni. Emberi pankreász duktuszsejtekben az intracelluláris kalcium a kalciumfüggő kloridcsatornát képes aktiválni, ami szintén kloridáramot és azon keresztül bikarbonát-szekréciót idéz elő [148]. A nukleotidok fontos szerepet játszhatnak a hasnyálmirigy acinusok és duktuszok szekréciós aktivitásának összehangolásában [102]. A patkány pankreász duktuszsejteken bazolaterálisan P2Y2 és P2Y4 G-protein kapcsolt purinoceptorok, luminálisan pedig P2X2 és P2X4 purinoceptor ioncsatornák vannak[58]. A bazolaterálisan ható UTP és ATP P2Y2 és P2Y4 receptorokon hatva intracelluláris Ca 2+ -felszabadulást és Ca 2+ -beáramlást okoz, ugyanakkor bezárja a bazolaterális K + - csatornákat, ami gátolja a nedvszekréciót. Ezt tengerimalacban igazolták [69]. A luminális P2X2 és P2X4 receptrorok stimulációja Ca 2+ - és Na + -beáramláshoz vezet [58], ami önmagában nem indítja be a szekréciót, viszont potenciálja a szekretin hatását. 14

15 A hasnyálmirigy acinusok kolinerg stimuláció hatására emésztőenzimeket és ATP-t választanak el [102]. Az így a duktuszokba került ATP a fent leírt mechanizmus révén modulálhatja a szekretin nedvelválasztásra gyakorolt hatását. További fontos szabályozója a pankreász exokrin működésének az extracelluláris kalciumszint. Patkány hasnyálmirigyben mind az acinusokban, mind a duktuszokban kimutatták a kalcium-érzékelő receptort [18]. A receptor részletes jellemzése későbbi fejezetekben található. A kalcium-érzékelő receptor A kalcium szerepe az élettani folyamatokban Az élőlények számos életműködéséhez szükségesek a kalciumionok. Intracellulárisan a kalciumionok fontos másodlagos hírvivők, valamint különböző enzimek kofaktoraiként szerepelnek [110]. A citoszól nyugalmi kalcium-koncentrációja (Ca i ) 100 nm körül van, ami stimuláció hatására 1 µm-ig emelkedhet az intracelluláris raktárakból történő Ca 2+ - felszabadulás vagy az extracelluláris Ca 2+ fölvétele révén [110]. Ezzel szemben az extracelluláris Ca 2+ -koncentráció mintegy tízezerszer magasabb, szintje nagyjából konstans, mintegy 1 mm [14]. A Ca 2+ fontos szerepet játszik a véralvadásban, a vázrendszer integritásának fenntartásában, a neuromuszkuláris excitabilitásban és egyéb folyamatokban [14], ezért az extracelluláris Ca 2+ szintjének stabilitása igen fontos az élőlények számára. Az extracelluláris Ca 2+ szintjét a kalcium-homeosztázis fenntartásában szereplő szervek sejtjei érzékelni képesek. A szervezet kalcium-háztartásának szabályozásában a mellékpajzsmirigy játssza a kulcsszerepet. A vér Ca 2+ -szintjének változása inverz módon befolyásolja a paratiroid hormon (PTH) elválasztását. A csökkenő Ca 2+ -szint hatására felszabaduló PTH rövid távon a vese proximális tubulusaiban csökkenti a foszfátionok, míg a disztális tubulusokban növeli a Ca 2+ -ok visszaszívását, a csontokban serkenti a kalcium mobilizációját. A PTH hosszabb távon a vese proximális tubulusaiban serkenti az 1,25- dihidroxi-d-vitamin keletkezését, ami viszont a bélben növeli a kalcium-foszfát felszívását [14]. Mindezen folyamatok a vér Ca 2+ -szintjének normalizálódását segítik elő. A kalciumszint emelkedése ugyanakkor gátolja a PTH elválasztását. 15

16 A kalcium-érzékelő receptor klónozása Hogyan érzékelik a mellékpajzsmirigy sejtjei a kalciumszint emelkedését? Régóta megfigyelték, hogy az extracelluláris Ca 2+ -szint növekedése ugyanolyan Ca i - változásokat idéz elő, mint amikor egy hormon aktiválja a receptorát, ezért gyanították, hogy egy addig még ismeretlen receptor állhat az extracelluláris Ca 2+ -szint érzékelésének hátterében [14]. Marha mellékpajzsmirigy cdns-klónokról átírt mrns-t injektáltak afrikai karmosbéka petesejtekbe. A megfelelő klónról átírt mrns kalciummal és más polikationokkal stimulálhatóvá tette a petesejteket. Azonosították a pozitív cdns klónt, így 1993-ban megtalálták a keresett kalcium-érzékelő receptort (CaR) [15]. Azóta több fajban számos szövetből klónozták a receptort [16]. 5. ábra: Az emberi mellékpajzsmirigyből klónozott kalcium-érzékelő receptor topológiája. SP: szignálpeptid; HS: hidrofób szegmens. Az ábra forrása: [17]. konzervált cisztein savas glikoziláció PKC fo szforilác iós hely A CaR fehérje egy G-protein kapcsolt receptor, a polipeptidlánc három régióra osztható [17]: egy N-terminális, hatalmas, több, mint 600 aminosav alegységből álló extracelluláris doménre (ECD), egy központi, mintegy 250 aminosavból álló, hét transzmembrán hélixet tartalmazó szakaszra, valamint egy C-terminális, kb. 200 aminosav alegységet tartalmazó intracelluláris farokra (5. ábra). A Ca 2+ az ECD-hez kötődik, amely több glikozilációs helyet is tartalmaz. A fehérje intracelluláris része (a transzmembrán hélixek közötti hurkok közül az intracellulárisan elhelyezkedők, valamint a C-terminális farok) több konszenzus protein kináz C és A (PKC és PKA) foszforilációs helyet tartalmaz. 16

17 A CaR a G-protein kapcsolt receptorok (GPCR) szupergéncsaládján belül a C családba sorolható. Ebbe a családba, amelyre jellemző, hogy tagjai 20% homológiát mutatnak a hét hélixet tartalmazó transzmembrán doménjük aminosavsorrendjében [78], legalább három alcsalád tartozik (6. ábra). Az I. csoport a metabotróp glutamátreceptorokat tartalmazza (mglur 1 8). A II. csoportba tartozik a CaR és egy nemrégiben fölfedezett feromonreceptor alcsalád, a vomeronazális receptorok (VR) [85]. A III. csoportot a GABA B receptorok alcsaládja alkotja [74]. A C családba tartozó GPCR-ok extracelluláris ligandkötő doménje homológiát mutat a bakteriális periplazmatikus kötőfehérjével (periplasmic binding protein) [36]. A baktériumok periplazmatikus nutrienskötő fehérjéi szerves kismolekulákat, ill. szervetlen ionokat érzékelnek, amelyek a baktériumok számára tápanyagként szerepelhetnek vagy kemotaktikus választ váltanak ki. Valószínűnek tűnik, hogy a C családba tartozó GPCR-ok az evolúció során létrjött fúziós proteinek, amelyek egy ősi nutrienskötő fehérje N- terminális ECD-jét, valamint egy GPCR transzmembrán doménjét kódoló egy-egy génszakasz összeolvadásával keletkeztek [17]. II. csoport I. csoport III. csoport 6. ábra: A C családba tartozó ma ismert G-protein kapcsolt receptorok egymáshoz viszonyított homológiájának mértékét és a feltételezett evolúciós kapcsolatokat ábrázoló dendrogram. A törzsfa tövéhez minél közelebb ágazik el két receptor egymástól, annál távolabbi a rokonságuk. Az ábra forrása: [17]. A CaR gén A CaR gén emberben a 3. kromoszóma hosszú karján található (3q21 q24) [34] és legalább hét exont tartalmaz [109]. Az első hat exon a receptor ECD-jét és 5 nem transzlálódó régióját (5 UTR) kódolja, míg a hetedik a transzmembrán régiót és a C- terminust. A gén szabályozó régióit még nem jellemezték. Több splice variáns CaR mrns-t írtak le. Az egyik az ECD-ben tartalmaz egy 30 nukleotidnyi inzerciót [49]. Ez a 10 aminosavas inzerció nem befolyásolja a CaR 17

18 működését. Egy másik variáns jelenlétét emberi citotrofoblasztban és mellékpajzsmirigyben írták le, hiányzik belőle a 3. exon [12]. Erről az mrns-ről csonka, valószínűleg inaktív fehérje transzlálódik. Oda és munkatársai [104] keratinocitákban találtak egy alternatív mrns variánst, amelyből az 5. exon hiányzik. Bár a deléció nem tolja el a leolvasási keretet, a keletkező fehérje inaktív, sőt domináns negatívként a vele együtt kifejeződő normál fehérje funkcióját is gátolja. Leírták, hogy differenciációjuk során a keratinociták Ca 2+ -ra való válaszképessége csökken, és ez érdekes módon együtt jár a rövidebb variáns expressziójának megnövekedésével [104]. A CaR gén 5 nem transzlálódó régiójában is lehetségesek splice variánsok. Pl. az emberi mellékpajzsmirigyben többféle átirat fordul elő, melyekben különbözik az 5 UTR, ám a kódoló régió megegyezik [49]. A gén 5 szabályozó régióiban bekövetkező alternatív splicingnak szerepe lehet a szövetspecifikus expresszióban vagy a gén szabályozásában. A CaR expressziója és szerepe a kalcium-homeosztázisban részt vevő szövetekben A CaR magas szinten fejeződik ki mellékpajzsmirigyben [15], a pajzsmirigy C- sejtjeiben [50], a vese különböző sejttípusaiban [120], a vékony- és a vastagbél epitélsejtjeiben [26], valamint a csontképző oszteoblasztokban és a csontlebontó oszteoklasztokban [23, 60]. A paratiroid sejtek a fentebb már vázolt módon érzékelik az extracelluláris kalciumszint változásait, és annak megfelelően változatják inverz módon a PTH szekrécióját. A pajzsmirigy C-sejtjein ugyanolyan CaR-ok vannak, mint a mellékpajzsmirigyben. Ha megnő az extracelluláris kalciumszint, az megnöveli a C-sejtek kalcitoninszekrécióját [50], ami azután hipokalcémiás hatást fejt ki. A PTH és a kalcitonin szekrécióját tehát ugyanaz a receptor szabályozza, de ellentétes módon: a CaR aktiváció a PTH szekrécióját gátolja, míg a kalcitonin elválasztását serkenti. Vesében a CaR kulcsszerepet játszik a divalens kationok (Ca 2+, Mg 2+ ), egyéb elektrolitok (pl. Na +, K +, Cl ), valamint a víz forgalmának szabályozásában [44, 116, 120]. Felnőtt vesében a CaR majdnem a teljes nefron mentén kifejeződik: a proximális tubulus kanyarulatos és egyenes szakaszán apikálisan; a disztális tubulus medulláris (MTAL) és kortikális (CTAL) szakaszán, valamint a disztális kanyarulatos tubulusban a bazolaterális membránban; végül a gyűjtőcsőnek a medulla belső részére eső szakaszán (IMCD) luminálisan [121]. A bazolaterálisan elhelyezkedő CaR-nak a disztális 18

19 tubulusban az a szerepe, hogy érzékelve a magas peritubuláris kalcium- vagy magnéziumszintet, negatív visszacsatolással gátolja a divalens kationok paracelluláris visszaszívását. Az IMCD területén apikálisan elhelyezkedő CaR-ok szerepe pedig valószínűleg az, hogy érzékelve a vizelet magas kalciumszintjét, gátolják az AQP2 vazopresszin hatására bekövetkező transzlokációját az apikális membránba. Ez a homeosztatikus mechanizmus akadályozza meg, hogy dehidráció során a keringő vazopresszin magasabb szintje hatására túlzottan megemelkedjék a vizelet kalciumszintje, ami kalciumsók kicsapódásának és így vesekő kialakulásának veszélyével járna. A proximális tubulusban apikálisan elhelyezkedő CaR csökkenti a 25-hidroxi-D-vitamin átalakítását 1,25-dihidroxi-D-vitaminná a sejtekben [30]. A CaR expresszióját a bélben is leírták [26]. Kifejeződik a receptor a vékonybél villusaiban bazálisan és gyengébben apikálisan is; a vékonybél kriptákban bazálisan; a vastagbél Lieberkühn-kriptáiban pedig mind bazálisan, mind apikálisan. Megfigyelhető továbbá a CaR a vékony- és a vastagbél plexus myentericusában, valamint a Meissnerplexus régiójában a szubmukózában. A CaR szerepe a bélrendszerben még nem tisztázott. A bélidegrendszerben való jelenléte révén részt vehet a bélmotilitás szabályozásában, a villus epitélsejtjeiben pedig a kalciumfelvétel negatív visszacsatolásos szabályozásában [30]. A csontrendszer kulcsszerepet játszik a szervezet kalcium-homeosztázisában. A csontok folyamatos, dinamikus átépülésében az oszteoklasztok és az oszteoblasztok a meghatározó szereplők. Az oszteoklasztok bontják, az oszteoblasztok építik a csontokat. Mindkét sejten leírták a CaR-ok expresszióját. A magas extracelluláris Ca 2+ -szint szabályozza az oszteoblasztok kemotaxisát, proliferációját és differenciációját [117]. Oszteoklasztokban a külső Ca 2+ -szint emelkedése megváltoztatja a sejtek morfológiáját és gátolja a csontok reszorpcióját [122]. A CaR funkciója a kalcium-homeosztatikus rendszeren kívül A kalcium-érzékelő receptorokat megtalálták olyan szövetekben is, amelyek nem vesznek részt a szevezet kalcium-homeosztázisának szabályozásában. A CaR serkenti a Rat-1 fibroblaszt sejtek [87] és a petefészek epitélsejtek [86] osztódását, a keratinociták differenciációját [8], valamint a gyomor antrum G-sejtjeinek gasztrinszekrécióját [119]. Kimutatták, hogy a placenta citotrofoblasztban a CaR [12] szabályozhatja az anyai oldalról a magzatira irányuló kalciumtranszportot [80]. 19

20 A receptor az agyban is számos területen előfordul: a szubfornikális szervben, a szaglógumóban, a hippocampusban, a striatumban, a kisagyban, a cinguláris kéregben, az agykamrák ependimális területein, valamint az agyi artériákat körülvevő perivaszkuláris idegekben [30]. Elképzelhető, hogy a szubfornikális szervben a CaR részt vesz a szervezet folyadék- és elektrolit-háztartásának központi szabályozásában. A hippokampuszban a szinaptikus áreában fordul elő a receptor, eloszlása hasonló a metabotróp és az ionotróp glutamátreceptorokéhoz, szerepe egyelőre ismeretlen. A CaR az agy területén nemcsak az idegsejtekben fejeződik ki. Megtalálták oligodendroglia sejtekben [27], mikrogliában [28]és az U87 emberi asztrocitóma sejtvonalban [29]. A CaR agonistái stimulálták a Ca 2+ -aktiválta káliumcsatornákat mindhárom sejttípusban. Ezek a sejtek részt vesznek az agyban a lokális ionhomeosztázis szabályozásában, amiben a CaR fontos szerepet játszhat: mivel az extracelluláris kalciumszint neuronális aktivitás miatt bekövetkező csökkenése az extracelluláris káliumszint emelkedésével jár, az oligodendroglia-sejteken található CaR-ok csökkent működése valószínűleg a Ca 2+ -aktiválta káliumcsatornák működését is csökkenti, ami megakadályohatja az extracelluláris kalciumszint további növekedését [30]. Az emberi szemlencse epitélsejtjeiben is kifejeződik a receptor [25]. Mivel a hipokalcémiát összefüggésbe hozták a szürkehályog kialakulásával, elképzelhető, hogy a receptor szerepet játszik a lencse ionhomeosztázisában. Patkány hasnyálmirigyben is megtalálták a CaR-t [18], acinusokban, duktuszokban és szigetekben egyaránt. Leírták, hogy a duktuszokban luminálisan elhelyezkedő receptor agonistával történő stimuláció hatására serkenti a folyadék- és bikarbonátszekréciót. A CaR-hoz kapcsolódó szignalizációs útvonalak Mellékpajzsmirigy sejtekben a CaR agonisták foszfolipáz C-t, -A2-t és -D-t aktiválnak. Elsődleges tenyészetben 3 4 nap után ez a válaszképesség erőteljesen csökken, párhuzamosan azzal, ahogy a sejtekben a CaR expressziója is csökken [75]. Az intracelluláris kalciumszint CaR agonisták által kiváltott tranziens emelkedése valószínűleg a foszfolipáz C (PLC) aktivációjának, és így a keletkező inozitoltriszfoszfátnak köszönhető. A PLC aktiválása valószínűleg G q/11 -en keresztül történik, ezt erősíti meg az is, hogy a folyamat pertusszisz toxinnal nem gátolható. Mellékpajzsmirigy sejtekben a CaR a Ca i elhúzódó emelkedését is kiváltja Ca 2+ -influx 20

21 útvonalakon keresztül, nem-szelektív kationcsatornák kinyitása révén [143]. Szintén paratiroid sejtekben a CaR stimulálása pertusszisz toxinnal gátolható módon gátolja a camp akkumulációját, vagyis valószínűleg G i -függő módon [75]. Az emberi gyomor antrális G-sejtjeiben az extracelluláris Ca 2+ -szint növelése megemeli az intracelluláris Ca 2+ -szintet és dózisfüggő módon serkenti a gasztrin elválasztását [119]. Patkány gyomor parietális sejtekben a CaR agonisták szintén megemelik a sejten belüli Ca 2+ -szintet [33]. Milyen jelátviteli útvonalakon keresztül szabályozza a CaR a sejtosztódást és a differenciációt? A receptor a rat-1 fibroblasztokban a proliferációt a p42/p44 ERK mitogén-aktiválta protein kináz kaszkádon keresztül serkenti [87]. Ugyanakkor a CaR gátolja a mellékpajzsmirigy sejtek osztódását, ennek mechanizmusa viszont még nem ismert [30]. Az extracelluláris kalciumszint enelkedése, minden bizonnyal a CaR-on keresztül hatva, serkenti többféle sejttípus, így pl. a keratinociták differenciációját. Ennek a hatásnak a közvetítésében többféle szignáltranszdukciós útvonal is közreműködhet, így pl. az inozitolfoszfát-metabolizmusban bekövetkezett változások [104], valamint az intracelluláris kalciumszint megemelkedése sejten belüli raktárakból való felszabadulás, ill. nem-szelektív kationcsatornán át történő kalciumbeáramlás révén [143]. A CaR mutációk révén bekövetkező betegségek Számos, a kalcium-homeosztázist érintő örökletes betegség hátterében a CaR gén funkcióvesztéses vagy funkciónyeréses mutációja áll. Ilyen kórképek a familiális hipokalciuriás hiperkalcémia (FHH), a neonatális súlyos hiperparatiroidizmus (NSHPT), valamint az autoszómás domináns hipokalcémia (ADH). Az FHH autoszómás, dominánsan öröklődő betegség [24]. A CaR gén heterozigóta formában meglévő inaktiváló mutációjára vezethető vissza. Életen át tartó, enyhe vagy közepes, általában tünetmentes hiperkalcémiával jár. A beteg egyének hiperkalcémiásak, a PTH-szintjük ennek ellenére normális (nem szupprimált), vizeletükben kevés a kalcium. Mindezen tünetek oka az, hogy esetükben egyrészt túl magas szérum kalciumszint szükséges a PTH-szekréció gátlásához, másrészt a veséjükben túl magas a kalcium-visszaszívás, mivel a két szervben alacsony számban vannak jelen működő CaR-ok. A betegség általában enyhe lefolyású, mindössze fokozott megfigyelést tesz szükségessé. 21

22 A neonatális súlyos hiperparatiroidizmusban (NSHPT) szenvedő újszülötteknél súlyos hiperkalcémia és a szérum PTH abnormálisan magas szintje tapasztalható [111]. Ha nem történik meg a paratiroidektómia a születés után pár héten belül, az akár végzetes is lehet ezekben az újszülöttekben [24]. A magas halálozási arány oka a súlyos hiperkalcémia és a hiperparatiroidizmus, ami a csont demineralzációjához és csonttörésekhez vezethet. Ennek a súlyos kórképnek az oka a CaR gén mutációja homozigóta vagy compound heterozigóta formában; esetleg az egyik allél normális, de a mutáns domináns negatív hatása érvényesül. Az aktiváló CaR mutációk autoszómás domináns hipokalcémiát (ADH) vagy egy bizonyos fajta sporadikus hipokalcémiát okoznak, amelyek a hipoparatiroidizmusra emlékeztetnek. ADH-ban a hiperkalciuria általában nagyobb mérvű, mint hipoparatiroidizmusban [112]. Ez a betegség arra vezethető vissza, hogy mutáció folytán a CaR érzékenyebb lesz a kalciumra, ezért már alacsony szérum kalciumszint mellett is gátolja a mellékpajzsmirigy sejtek PTH-szekrécióját. Az akvaporinok A víz mozgása a szövetekben Számos olyan epitélium van a szervezetben, amelyen keresztül működése során rendkívül nagy mennyiségű folyadék áramlása figyelhető meg. Ezen szervek közé tartozik a vese, vagy a gasztrointesztinális rendszeren belül a nyálmirigy, a gyomor, a hasnyálmirigy (szekréciós epitélium), ill. a bél (abszorpciós epitélium). A hámokon keresztül transzportálódó folyadékok vízből és benne oldott sókból állnak. Általános alapelv, hogy az ionok aktív vagy passzív transzporttal jutnak át a membránokon, majd azokat követi a víz az ozmotikus grádiens vagy a hidrosztatikai nyomás esésének irányában. A különböző ionok transzportjáért felelős csatornafehérjék, pumpák régóta ismertek. Mivel a víz diffúzióval átjut a sejtmembránokon, ill. nem túl szorosan záródó epitéliumok esetén paracellulárisan is, eleinte azt gondolták, hogy az ionokétól eltérően mozgásához nincs szükség transzportmolekulá(k)ra. Ám világossá vált, hogy intenzív folyadékmozgáshoz nagy vízáteresztő-képességű membrán szükséges [130], a diffúzió pedig önmagában nem magyarázza egyes membránok ezen sajátosságát. Nem meglepő 22

23 tehát, hogy a nagy áteresztő-képességű epitéliumokban a víz gyors transzcelluláris áramlását vízcsatornák, akvaporinok teszik lehetővé. Az első akvaporin felfedezése Az első akvaporin felfedezése a véletlennek köszönhető. Az Rh vércsoportfehérje 32 kda-os polipeptid komponensét próbálták tisztítani, melynek során egy 28 kda nagyságú szennyező fehérjét különítettek el [2]. A fehérje rosszul oldódik az N- lauroilszarkozin detergensben, e tulajdonságának köszönhetően sikerült nagy mennyiségben tisztítani. A 28 kda-os fehérjéről kimutatták, hogy magas szinten fejeződik ki vörösvértestekben és vese proximális tubulusokban [40], melyekről köztudomású, hogy igen nagy a vízpermeábilitásuk. A fehérjéről kimutatták, hogy tetramer integráns membránproteinként fordul elő: ez a szerkezet számos membráncsatornára jellemző [128]. Az N-terminális aminosavszekvencia alapján klónoztak egy 269 aminosavat kódoló cdns-t [113], az erről transzlálódó fehérjét CHIP28-nak (28-kDa channel-like integral protein) nevezték el. A fehérjét a Wright és munkatársai [139] által kifejlesztett technika alkalmazásával afrikai karmosbéka (Xenopus laevis) petesejtjében fejezték ki CHIP28 crns (cdns-ről átírt RNS) mikroinjekciójával (a karmosbéka petesejtjének membránja alig ereszti át a vizet). A következmény az lett, hogy a petesejtek hipotóniás közegben rohamos gyorsasággal durrantak ki, míg a kontrollként vízzel injektált petesejtek vízpermeábilitása egy nagyságrenddel alacsonyabb volt [113]. Kitűnt tehát, hogy a vizsgált fehérje egy vízcsatorna. Utalva funkciójára, át is nevezték a fehérjét, és CHIP28-ból akvaporin-1 (AQP1) lett [3]. Az akvaporin-1 szerkezete Az AQP1 fehérje legnagyobbrészt a lipid kettősrétegben helyezkedik el [113]. Az AQP1 molekula N- és C-terminális fele egymással homológ, mindkettő tartalmazza az Asn-Pro-Ala (NPA) motívumot [138]. A molekula hat hidrofób transzmembrán hélixszel rendelkezik (7. ábra), köztük hurkokkal. A molekula két felét a C hurok köti össze. A hurkok közül kettő hidrofób (az ábrán B-vel és E-vel jelölve), e két hurok alkotja a vízáteresztő pórust [73]. A pórus szerkezete olyan, hogy vízre kitűnő szelektivitást és nagy áteresztőképességet biztosít, azon már egy protonált vízmolekula 23

24 (oxónium-ion) és egyéb töltött részecskék sem képesek áthaladni. Ez magyarázza pl., hogyan képes a vese naponta hektoliteres mennyiségben vizet visszaszívni, míg közben a savat kiválasztja. Az AQP1 működése higanyvegyületekkel gátolható, ennek támadáspontja az E hurkon található [114]. Az AQP1 molekula szerkezetét a molekula alakjára utaló, ún. homokóra-modellel írták le ([73], 7. ábra). Az AQP1 membránokban tetramerként fordul elő (8. ábra). Ám az ioncsatornáktól eltérően, ahol négy monomer vesz körül egyetlen pórust, az AQP1 mind a négy alegysége saját pórussal rendelkezik [5]. 7. ábra: Az AQP1 homokóra-modellje. Fent: Egy AQP alegység hat transzmembrán hélixet tartalmaz. Az 1 3. és a 4 6. hélixet, valamint egy-egy NPA motívumot tartalmazó régió homológ, egy ősi génduplikáció eredménye. Lent: A C hurok mentén a molekula meghajlik, az NPA motívumok egymás mellé kerülnek, és létrehozzák a vízáteresztő pórust. Az ábra forrása: [99]. 8. ábra: Az AQP1 tetramerként fordul elő a sejtmembránban. Minden monomernek megvan a saját pórusa. A négyből egy monomerhez glikánmolekula kapcsolódik. Az ábra forrása: [99]. Akvaporin izoformák és élettani szerepük különböző szövetekben, köztük hasnyálmirigyben Az AQP1 felfedezését követően még tíz másik akvaporin izoformát írtak le különböző emlős szövetekben, ahol a víztranszport fontos szerepet játszik ([4], 9. ábra). Az AQP2-t patkány vese gyűjtőcsőből klónozták [47]. Az AQP2 is megnövelte a karmosbéka petesejt vízpermeabilitását, működését pedig higanyvegyületekkel gátolni 24

25 lehetett. A fehérjét a gyűjtőcső fősejtjein mutatták ki, és leírták, hogy expressziója éhező patkányokban megemelkedik [94]. További vizsgálatokban [96] meghatározták az AQP2 elhelyezkedését és funkcióját a gyűjtőcsőben. Izolált, perfundált patkány gyűjtőcsövekben mid a víztranszportot, mind az AQP2 lokalizációját vizsgálták vazopresszinnel történő kezelés előtt, közben és után. Kezeletlen preparátumokban az AQP2 intracelluláris vezikulumokban található. Vazopresszin hatására az AQP2 az apikális membránba transzlokálódik, ami a vízpermeabilitás ötszörös emelkedését hozza. A kezelés megszüntetése után az AQP2 visszakerül a vezikulumokba, a gyűjtőcsövek vízáteresztő képessége pedig visszatér az alapértékre. Később kimutatták, hogy az AQP2 exocitózisát receptorfüggő módon a protein kináz A szabályozza C- terminális szerinfoszforiláción keresztül [35]. Akvaporinok 9. ábra: A csak vizet áteresztő akvaporinok, valamint a vizet és glicerint áteresztő akvagliceroporinok. Az AQP10-et még csak mrns szinten azonosították. Az E. coli AQP homológok is fel vannak tüntetve (AqpZ és GlpF). Alul a vonal a genetikai távolságot jelöli a homológok között. Az ábra forrása: [5]. Akvagliceroporinok Az AQP6-ot patkány vese gyűjtőcső savszekretáló alfa-interkaláris sejtjeiben írták le, ahol kimutatták, hogy intracelluláris vezikulumokban a H + -ATPázzal kolokalizálódik, a plazmamembránban pedig nem található meg [141, 142]. Az AQP6 igen érdekes akvaporin, mivel a karmosbéka petesejt vízpermeabilitását alig növeli meg. Ugyanakkor ez a hatás higany-kloriddal nem gátolható, sőt kis dózisban serkenthető [141]. Az AQP6 lokalizációja azt sugallja, hogy a fehérje a gyűjtőcső savszekretáló alfa-interkaláris sejtjeinek működésében tölthet be fontos szerepet. Még az akvaporinok felfedezése előtt azonosítottak szemlencsében egy csak ott kifejeződő, ismeretlen funkciójú proteint, amit akkor major intrinsic proteinnek (MIP) 25

26 neveztek el [52, 145]. Aztán az akvaporinok felfedezése után rájöttek, hogy a MIP ezekkel a fehérjékkel homológ. A MIP-et is kifejezték karmosbéka petesejtben, ahol enyhe, higanyvegyületekkel nem gátolható emelkedést idézett elő a vízpermeabilitásban, ezért AQP0-nak nevezték el [90]. Az AQP0 szerepe a szemlencsében valószínűleg a víz eltávolítása. Ugyanakkor az is elképzelhető, hogy a fehérjének sejt-sejt adhéziós molekulaként lehet szerepe [43]. Az AQP4-et patkány agyból klónozták [72], ahol nagy mennyiségben fordul elő. Ez az akvaporin nem gátolható higanyvegyületekkel [57], de az AQP1-hez hasonlóan konstitutívan aktív. Az AQP4 az asztroglia-sejtekben perivaszkulárisan helyezkedik el, szerepe valószínűleg a fölösleges víz eltávolítása, ami különösen agyödémában lehet kulcskérdés [98]. Az AQP4 szintén megtalálható az ozmoszenzoros agyterületeken (pl. nucleus supraopticus) a vazopresszin-szekretáló neuronokat körülvevő gliasejtrétegekben, ahol valószínűleg ozmoreceptorként működik [98], valamint előfordul a cerebrospinális folyadékkal töltött üregeket körülvevő ependima-sejtekben is [45]. Retinában és látóidegben különösen sok az AQP4 az üvegtesttel szomszédos Müller-sejtek végtalpaiban és az ér endotéliumban [92]. Az AQP4 a vese gyűjtőcsövek fősejtjeinek bazolaterális membránjában is előfordul [99]. Az AQP5-öt patkány nyálmirigyből klónozták [118]. Expressziója az apikális membránban figyelhető meg alveoláris pneumocitákban, nyálmirigyben és könnymirigyben. Valószínűleg fontos a szerepe a légutak nedvesítésében, valamint a nyál- és könnyelválasztásban [97]. Az AQP8 cdns-t patkány heréből [65], valamint patkány hasnyálmirigyből és májból [81] izolálták. Patkány hasnyálmirigyben az acinusok apikális membránján található, szerepe hasonló lehet az AQP5 nyálmirigyben betöltött szerepéhez: a vízáramlás fő útját jelentheti az apikális membránon át történő izotóniás, kloridban gazdag nedv szekréciója során [63]. Az AQP8 mrns-t kimutatták vastagbélben, nyálmirigyben és egyéb szövetekben is [10]. Akvagliceroporin izoformák és élettani szerepük a különböző szövetekben Eddig olyan akvaporinokról esett szó, amelyek szelektíven kizárólag vizet eresztenek át. Az akvaporin család bizonyos tagjai glicerint, ureát, egyéb kismolekulájú anyagokat is átereszthetnek, ezek az akvagliceroporinok ([10], 7. ábra). Az első klónozott akvagliceroporin az AQP3 volt. Leírták vesében [41], légutakban [97], bőrben [93] és 26

27 szemben [55]. A vesében a gyűjtőcsövek fősejtjeinek bazolaterális membránjában fordul elő, a vízvisszaszívásban játszik szerepet. Az apikális membránon található AQP2-vel alkotja együttesen a transzcelluláris útvonalat, amelyen keresztül a víz a vese gyűjtőcső lumenjéből az intersticiumba távozik. Az AQP7-et zsírszövetben találták meg és kimutatták, hogy vizet és glicerint képes átereszteni [64, 76]. A zsírsejtekben található AQP7 a trigliceridek lebontásakor keletkezett glicerin számára biztosíthat kiutat a sejtből [5]. Az AQP9-et fehérvérsejtekből klónozták [66], májban is kimutatták [136]. Vizet, glicerint és több egyéb kismolekulájú anyagot is szállít. Az AQP9 biztosíthatja a belépési lehetőséget a glicerin számára a hepatocitákba, ahol a glükoneogenezis történik [5]. Az akvaporinok szerepe egyes betegségekben Találtak olyan embereket, akikben mindkét AQP1 allél hibás, vagyis AQP1 null fenotípust mutatnak [115]. Meglepő módon a mindennapi életben ezek az emberek teljesen tünetmentesek. Részletes klinikai vizsgálatokban ugyanakkor kimutatták, hogy ezek a páciensek vizeletkoncentráló képessége csökkent, ami dehidráció esetén fokozott veszélybe sodorhatja őket. Ennek oka a Henle-kacs leszálló ágának, valamint a vasa rectának csökkent víztranszportja, ami miatt nem lehetséges a medulláris hiperozmolaritás és ezzel a hatékony ellenáramú koncentráló mechanizmus kialakulása. A nefrogén diabetes insipidus (NDI) olyan betegség, amelyről korábban kimutatták, hogy V2 vazopresszin-receptor génjében bekövetkezett mutáció okozza [7]. Ám más kutatók találtak olyan NDI pácienseket, akiknek nem volt V2 mutációjuk. Róluk kiderítették, hogy az AQP2 génjük transzmembrán és pórus régiójában vannak mutációk [39], amelyek hatására a fehérje abnormális feltekeredése miatt az endoplazmatikus retikulumban marad. Az AQP2 expressziója a vazopresszin-hiány miatt kialakuló klasszikus diabetes insipidusban is alacsony [5]. Az AQP5 fontos élettani szerepet játszik az emberi szemben. Kifejeződik a szaruhártya epitéliumban a szem felszínén [55], ahol valószínűleg hozzájárul az epitélium hidrációjához és átlátszóságához, valamint szerepet játszhat a sebgyógyulásban. Megfigyelték, hogy Sjögren-szindrómás betegek könnymirigyeiben a fehérje sejten belüli transzportja abnormális [135]: Sjögren-szindrómás betegek acinussejtjeiben apikális helyett citoplazmatikus lokalizációt mutat. Ennek pontos jelentősége egyelőre 27

28 nem ismert. Az AQP5 hozzájárulhat a hiper- vagy hipohidrózis bizonyos formáihoz, mivel AQP5 -/- egerekben drámaian csökkent a működő verejtékmirigyek száma [93]. A kalcium-érzékelő receptorok és az akvaporinok lehetséges szerepe a hasnyálmirigy folyadék- és ionhomeosztázisában A hasnyálmirigy acinussejtjeinek szekretoros granulumaiból az emésztőenzimekkel együtt jelentős mennyiségű kalcium ürül az acinusok lumenébe. Az acinusokból a duktuszokba kerülő folyadéknak ezért lokálisan igen magas lehet a kalciumszintje, ami magában hordozza a kalciumsók kicsapódásának veszélyét. A duktuszok által termelt bőséges folyadék kulcsszerepet játszik nemcsak az emésztőenzimek szállításában, hanem térfogata révén a kalcium kihígításában is. Leírták, hogy patkányban a hasnyálmirigy duktuszokban luminálisan elhelyezkedő kalcium-érzékelő receptor agonistával történő stimuláció hatására serkenti a folyadékés bikarbonátszekréciót [18]. Ez egy homeosztatikus mechanizmus jelenlétére utal. Akvaporinokat is találtak a patkány hasnyálmirigy duktuszaiban [46, 63, 77]. E vízcsatornák az epitéliumon keresztül történő vízmozgást teszik lehetővé, így fontos szerepet játszanak a CaR-ok aktivációja által beindított folyadékszekrécióban. Amennyiben sikerülne emberi hasnyálmirigyben is kimutatni mind a kalcium-érzékelő receptorok, mind az akvaporinok jelenlétét a duktuszokon, az valószínűsítené, hogy emberben is hasonló homeosztatikus rendszer működik, mint patkányban. 28

29 CÉLKITŰZÉSEK Céljaink az alábbiak voltak: 1. A kalcium-érzékelő receptor mrns és fehérje expressziójának és lokalizációjának vizsgálata egészséges és daganatos emberi hasnyálmirigymintákban, pankreász adenokarcinóma sejtvonalban, valamint emberi exokrin hasnyálmirigy sejtek primér tenyészeteiben; 2. A receptorok működésének és proliferációra gyakorolt hatásának tanulmányozása; 3. Az akvaporin izoformák expressziójának és lokalizációjának tanulmányozása emberi hasnyálmirigyben, valamint az emberi és a rágcsáló hasnyálmirigy összehasonlítása; 4. Az akvaporinok és a CFTR kolokalizációjának meghatározása révén azonosítani a duktuszfa azon szegmenseit, amelyek elsődleges szerepet játszanak a folyadékszekrécióban. Vizsgálataink révén mélyebb betekintést reméltünk a hasnyálmirigy duktális működésének szabályozásába, valamint az ion- és folyadékhomeosztázis kulcsfontosságú folyamataiba. 29

30 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Szövetminták A kóros hasnyálmirigy szövetminták daganat vagy krónikus pankreátitisz, az agyminták epilepszia miatt operált betegekből származnak. Egészséges hasnyálmirigy mintákhoz szervdonoroktól vagy trauma miatt részleges mirigyeltávolításon átesett egyénektől jutottunk hozzá. A nyálmirigy minták egészséges önkéntesektől származnak. Élő páciens esetén tájékoztatást követően annak előzetes írásos beleegyezésével, minden esetben megfelelő etikai engedély birtokában történt a mintavétel. Az RNS-preparálásra szánt mintákat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd a feldolgozásig 70 C-on tároltuk. A később immunhisztokémiával vizsgált mintákat formalinban fixáltuk, majd paraffinba beágyaztuk. Sejttenyésztés A sejtvonalakat az American Type Culture Collection -től (ATCC) szereztük be. A Capan-1 és a Capan-2 jól differenciált sejtvonalak, egy 40 és egy 56 éves europid férfiből származnak. A differenciálatlan MiaPaCa-2 egy 65 éves, a gyengén differenciált Panc-1 egy 56 éves europid férfiból származik. Az HPAF jól differenciálódott, ám heterogén sejtvonal. A sejteket 10% fötális borjú szérumot, 100 U/ml penicillint és 100 µg/ml streptomicint tartalmazó RPMI 1640 (Sigma, Egyesült Államok) tápfolyadékban (Capan-1, Capan-2), illetve Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM; Sigma, Egyesült Államok) tápfolyadékban (HPAF, MiaPaCa-2 és Panc-1) tenyésztettük. A kultúrákat tenyésztő palackokban tartottuk fenn és 37 C-on 100% relatív páratartalom mellett, 5% CO2-dal dúsított levegővel ellátott termosztátban inkubáltuk. A tápfolyadékot 3 naponként cseréltük. Az összes műveletet steril körülmények között végeztük. RNS izolálása és reverz transzkripció Az emberi szövetmintákból és a sejtvonalakból a teljes RNS-t a TRI Reagens (Sigma, Budapest) segítségével izoláltuk a gyártó útmutatásai alapján. A normális emberi 30

31 exokrin hasnyálmirigy sejtek tenyészeteiből, valamint az azok immortalizálásával előállított M540 sejtvonalból preparált RNS Dr. Francisco Real (Institut Municipal d Investigacio Medica, Barcelona, Spanyolország) ajándéka. A reverz transzkripciót (RT) 5 µg teljes RNS-ből végeztük SuperScriptII reverz transzkriptáz (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) segítségével a gyártó utasítása alapján. A 20 µl végtérfogatú reakcióelegy 1 5 µg RNS-t, 0,5 µg oligo(dt) t, 50 mm Tris-HCl-t (ph=8,3), 75 mm KCl-ot, 3 mm MgCl 2 -ot, 10 mm DTT-t, a négyfajta dezoxinukleotid trifoszfátból egyenként 0,5 mm-t, valamint 200 egység (U) SuperSriptII-t tartalmazott. A vízzel hígított RNS-t 70 C-on 15 percig denaturáltuk, majd jégen lehűtöttük. Ezután 2 percig 42 C-on inkubáltuk az oldatot, majd a reverz transzkriptáz bemérése után 50 perc következett 42 C-on, végül 10 perc 70 C-on. Polimeráz láncreakció az AQP1, -3, -4 és -8 kimutatására A reakcióelegy 20 µl végtérfogatban 0,5 U TaKaRa ExTaq polimerázt (Takara, Shiga, Japán), 10 mm TrisHCl-t, 50 mm KCl-ot, 1,5 mm MgCl 2 -ot, minden dntp-ből 0,2 mm-t tartalmazott, valamint 500 nm koncentrációban a primereket (AQP1: 5 -GTC TTC ATC AGC ATC GGT TC-3' (sense), 5 -GTC GGC ATC CAG GTC ATA CT-3' (anti-sense), termékméret: 701 bp; AQP3: 5 -CCT TTG GCT TTG CTG TCA CTC-3' (sense) 5 -ACG GGG TTG TTG TAA GGG TCA-3' (anti-sense), termékméret: 373 bp; AQP4: 5 -TCC CTT TGC TTT GGA CTC AG-3' (sense) 5 -TTC CCC TTC TTC TCC TCT CC-3' (anti-sense), termékméret: 719 bp; AQP8: 5 -GGT ACG AAC GGT TTG TGC AG-3' (sense), 5 -CCA TCT CCA ATG AAG CAC CT-3' (anti-sense), termékméret: 667 bp). 94 C-on történő 3 perc kezdeti denaturáció után 30 ciklust végeztünk a következő hőmérsékleti profillal: 94 C, 30 mp; 63 C, 45 mp; 72 C, 60 mp AQP1, -4 és -8-ra; 94 C, 30 mp; 65 C, 45 mp; 72 C, 60 mp AQP3-ra. Az amplifikációt 10 perces inkubáció zárta 72 C-on. AQP5 PCR 0,5 U Promega Taq polimerázt (Promega, Madison, Wisconsin, USA) használtunk 0,3 U Pfu polimerázzal (Promega) együtt 20 mm Tris HCl (ph 8,8), 10 mm KCl, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 2 mm MgSO 4, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml nukleázmentes marha 31

32 szérumalbumin (BSA), 0,2 mm dntp, valamint mindkét primerből (5 -CTT CCT CAA GGC CGT GTT C-3' (sense), 5 -GCT GGA AGG TCA GAA TCA GC-3' (anti-sense), termékméret: 398 bp) 500 nm jelenlétében. A 94 C-on történő 3 perces kezdeti denaturáció utáni 30 ciklus hőmérsékleti profilja: 94 C, 30 mp; 63 C, 30 mp; 72 C, 120 mp. Az amplifikációt 10 perces inkubáció zárta 72 C-on. CaR PCR A reakcióelegy 25 µl végtérfogatban a cdns mellett 0,5 U Taq és 0,3 U Pfu polimerázt (Promega, Madison, Wisconsin, USA), 20 mm Tris HCl-t (ph 8,8), 10 mm KCl-t, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4 -ot, 2 mm MgSO 4 -ot, 0,1% Triton X-100-at, 0,1 mg/ml nukleázmentes BSA-t, 0,2 mm dntp-t tartalmazott, valamint 200 nm koncentrációban a két primert: CaR864-21F (5'-GGT CAG TTA TGC CTC CTC CAG-3'), sense primer a 3. exonból, il. CaR R (5'-TTG TTA CAG GCA CTG GCA TCT G-3'), anti-sense primer a 7. exonból). 95 C-on 2 percig denaturáltuk a mintákat, majd amplifikáció következett 30 cikluson keresztül: 96 C 10 mp (denaturáció), primer kötődés, majd 72 C-on 1 perc/1000 bp amplikon hossz (szintézis). Az első 5 ciklus alatt a primerek kötődése 58 C-on 20 mp-ig történt. A következő 10 ciklus során a kötődés hőmérséklete 58 C-ról indult, majd ciklusonként 0,8 C-kal csökkent. A kötődés időtartama 20 mp-ről indult, majd ciklusonként 2 mp-cel nőtt. Az utolsó 15 ciklus folyamán a kötődési lépés 50 Con 40 mp-ig tartott. A 30 ciklus végeztével a mintákat 72 C-on inkubáltuk 5 percig. A PCR-termékek vizsgálata Az amplifikációs reakciók termékeit méretüknek megfelelő töménységű, etidiumbromidot tartalmazó agaróz gélen futtatuk meg. Utána egyrészt lúgos blottolással nejlon membránra vittük őket, majd radioaktívan jelölt specifikus próbával történő hibridizációval azonosítottuk őket. Másrészt a megfelelő méretű csíkokat kivágtuk, és specifitásukat restrikciós hasítással vagy szekvenálással ellenőriztük, amelyhez a PRISM BigDye Terminator v3.0 szekvenáló kitet (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) használtuk. 32

33 A CaR teljes kódoló régiójának klónozása és szekvenálása Egészséges emberi hasnyálmirigyből származó RNS-ről reverz transzkripcióval cdns-t írtunk át, majd erről amplifikáltuk az mrns teljes fehérjekódoló régiójának megfelelő cdns szakaszt a fentebb leírt körülmények alkalmazásával: a reakcióelegy 25 µl végtérfogatban a cdns mellett 0,5 U Taq és 0,3 U Pfu polimerázt, 20 mm Tris HCl-t (ph 8,8), 10 mm KCl-t, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4 -ot, 2 mm MgSO 4 -ot, 0,1% Triton X-100-at, 0,1 mg/ml nukleázmentes BSA-t, 0,2 mm dntp-t tartalmazott, valamint a két primert 200 nm koncentrációban. A primereket az emberi mellékpajzsmirigyben leírt szekvencia [49] alapján terveztük, 5 szakaszukra a klónozás megkönnyítésére restrikciós enzimek hasítóhelyeit iktattuk be. A következő két oligonukleotidot használtuk: HindIII SalI CaR179-22F (5'-TAT CAA GCT TCC GTC GAC GAC CAC CCA CAT TAC AAG TCT G-3') és XbaI NotI CaR R (5'-CAT GTC TAG AGC GGC CGC CTA GCC CAG TCT TCT CCT TCC-3'). A hőmérsékleti profil ugyanaz volt, mint amit a CaR PCR-ben alkalmaztunk, mindössze a ciklusok 72 C-os extenziós lépésének hosszát növeltük meg 3 és fél percre a nagyobb termékméretnek megfelelően. A PCR-ben a várt hosszúságú (3455 bp) terméket kaptuk, ezt elektroforézist követően az agarózból kivágtuk, megtisztítottuk, NotI és SalI enzimekkel megemésztettük, majd pbluescriptii KS vektorban (Stratagene, La Jolla, California, USA) klónoztuk. A kapott pbluescriptii KS hpcar klónokat kék-fehér szelekcióval izoláltuk, majd génspecifikus és vektorspecifikus szekvenáló primerek segítségével nukleotidsorrendjüket meghatároztuk. Kontroll reakciók A vizsgálatok során az XS13 savas riboszomális foszfoprotein cdns-ét amplifikáltuk belső kontrollként, a bevitt cdns mennyiségének és minőségének ellenőrzésére. Az XS13-ról kimutatták, hogy azonos szinten fejeződik ki normál, rákos és gyulladt hasnyálmirigyben, valamint emberi hasnyálmirigy daganatos sejtvonalakban [137]. Az általánosan referenciaként alkalmazott gének körül a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenázról [125] és a béta-aktinról [106] kimutatták, hogy expressziójuk az egészséges szövethez képest hasnyálmirigy daganatban megváltozik. Az XS13 amplifikációjára alkalmazott primerek: 5 -CTG GCT AAG TTG GTT GCT TT-3' 33

34 (sense) és 5 -GCA GCT GAT CAA GAC TGG A-3' (anti-sense), a termékméret: 500 bp. Körülmények: 94 C 30 mp; 58 C 60 mp; 72 C 120 mp, 19 ciklus. A korábbi amplifikációkból származó, szennyezésként a reakciókba bevitt PCRtermékek amplifikációjának elkerülését úgy demonstráltuk, hogy beiktattunk olyan kontroll reakciókat, amikor cdns helyett vizet vittünk templátként a reakciókba. Az RNS preparátumok gyakran genomi DNS-sel szennyezettek. Ez lehetőséget ad fals pozitív eredményekre, amit úgy küszöböltünk ki, hogy egyrészt primerjeinket úgy terveztük, hogy a primerpár két tagja ne ugyanarra az exonra essék, így a genomi termék hosszabb és így jobban elkülöníthető legyen, másrészt RT-negatív kontroll reakciókat végeztünk, ahol a reakcióelegyből kihagytuk a reverz transzkriptázt. A CaR RT PCR kvantifikálása Kétféle módon hasonlítottuk össze a vizsgált mintákban a CaR mrns mennyiségét. Egyrészt ugyanabból a mintából, ugyanannyi cdns bemérésével, XS13 és CaR PCR-t egyaránt végeztünk. A csíkok intenzitását denzitometriásan meghatároztuk és a CaR denzitásokat XS13-ra normalizáltuk, majd az egyes minták normalizált értékeit hasonlítottuk össze. Másrészt duplex reakcióban koamplifikáltuk a CaR-t és az XS13-at. A CaR PCR-re optimalizált körülmények XS13-ra is megfelelőnek bizonyultak, az XS13 primereket pedig csak az utolsó 19 ciklusra mértük be a reakcióba. Futtatás után a gélt blottoltuk, a csíkok intenzitását hibridizációt követő autoradiográfiát követően határoztuk meg. Ebben az esetben a CaR amplifikációjára a következő primereket használtuk: CaR F (5'-CTG CTT TGA GTG TGT GGA GTG TC-3') a 6. exonból és CaR R (5'-AGC CAC CTT GAA AGC GTG AG-3') a 7. exonból. Antitestek A következő elsődleges antitesteket használtuk: nyúl poliklonális anti-aqp1 (specifitás: egér, patkány, ember, marha; az epitóp semmilyen más ismert eukarióta fehérjével nem homológ) (Alpha Diagnostic International); nyúl anti-patkány AQP3, LL178AP21 [41]; nyúl anti-patkány AQP4, LL182AP22 [134]; nyúl anti-patkány AQP5 (az epitóp 80% homológiát mutat az emberi fehérje megfelelő szakaszával, ám más homológia, keresztreaktivitás nem ismert) (Alpha Diagnostic International, San Antonio, Texas, 34

35 USA); nyúl anti-humán AQP5 (Peter Agre és Landon King ajándéka, Johns Hopkins University Medical School) [93]; nyúl anti-humán AQP8, 2669AP, házi ekőállítású antitest; monoklonális egér anti-humán CFTR (egyéb keresztreaktivitás nem ismert) (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). A preimmun IgG és a preimmun nyúl szérum a Dako-tól (Glostrup, Dánia) származott. A CaR kimutatására a patkány receptorban a pozícióban található aminosavakból álló peptid ellen nyúlban termelt poliklonális antitestet használtunk (az antitestnek egyéb keresztreaktivitása nem ismert) (Affinity Bioreagents, Golden, Colorado, USA). Immunhisztokémia Az AQP izoformák kimutatására a paraffinba ágyazott emberi hasnyálmirigy blokkok az Aarhusi Egyetemi Kórház Patológiai Osztályáról származtak. A 2 µm vastag metszeteket éjszakán át xilolban deparaffináltuk. 99%-os etanolban háromszor 10 percen, majd 96%-os etanolban kétszer 10 percen át rehidráltuk a metszeteket. 30 percen át 0,5% hidrogén-peroxidot tartalmazó abszolút metanolban blokkoltuk az endogén peroxidázokat, majd 70%-os etanolban további 10 percen át rehidráltuk a metszeteket. A metszeteket 0,5 mm EGTÁ-t és 1 mm Tris-t (ph 9,00) tartalmazó oldatban 10 percen át mikrohullámú sütőben forraltuk, majd lehűtöttük. 50 mm NH 4 Cl-ot tartalmazó 0,01 M PBS-ben (ph 7,4) 30 percig inkubáltuk a metszeteket, majd az aspecifikus antitestkötőhelyek blokkolására háromszor 10 percen át 1% BSA-t, 0,05% szaponint és 0,2% zselatint tartalmazó PBS-ben mostuk őket. Utána 0,1% BSA-t és 0,3% Triton-X100-at tartalmazó PBS-ben hígított elsődleges ellenanyagokkal éjszakán át 4 C-on inkubáltunk a metszeteket. A következő hígításokat alkalmaztuk: patkány AQP1 1:800, patkány AQP3 1:800, patkány AQP4 1:10, ember AQP4 1:10, és ember AQP5 1:1600. Másnap háromszor 10 percen át 0,1% BSA-t, 0,05% szaponint és 0,2% zselatint tartalmazó PBS-ben mostuk a metszeteket, majd 1:100 hígítású, torma-peroxidázzal jelölt kecske másodlagos antitesttel (Dako) inkubáltuk egy órán át szobahőmérsékleten. Utána háromszor 10 perc mosás következett ugyanolyan összetételű oldattal, mint amilyet az elsődleges ellenanyag utáni mosáshoz használtunk. A festődést 1 µg/ml diaminobenzidint tartalmazó 30%-os hidrogén-peroxidban jelenítettük meg. Utána a metszeteket 35

36 háromszor 10 percig PBS-ben mostuk, majd Mayer-féle hematoxilinnel is festettük, s ezt követően 20 percen át folyó csapvízzel mostuk. Végül a metszeteket 70%-os, 96%- os, majd 99%-os etanolban dehidráltuk, xilollal mostuk. A felhúzást Eukitt mounting medium alkalmazásával végeztük. Fluoreszcens mikroszkópiára Alexa Fluor 488-cal jelölt kecske anti-nyúl IgG-t (Molecular Probes) használtunk (AQP1-hez és -5-höz), valamint Alexa Fluor 546-tal jelölt kecske anti-egér IgG-t (CFTR-hez). A metszeteket Leica SP2 konfokális lézer mikroszkóppal vizsgáltuk. A szövetmintákat fagyasztásos szubsztitúcióval készítettük elő az elektronmikroszkópos vizsgálatokra, korábban részletezett módszer szerint [63]. A 60 nm-es ultravékony metszeteket nyúl anti-patkány AQP1 ellenanyaggal inkubáltuk éjszakán át. Másodlagos ellenanyagként kolloid arannyal jelölt kecske anti-nyúl IgG-t alkalmaztunk (BioCell Research Laboratories, Cardiff, NBr.). A kontroll metszeteket immunizálás nélkül nyert IgG-vel (hígítás: 0,2 µg/ml) inkubáltuk. A metszeteket uranil-acetáttal festettük 10 percen át és Philips CM100 elektronmikroszkópon vizsgáltuk. A CaR kimutatására az egészséges és rákos emberi hasnyálmirigyből készült kriosztátos metszeteket Dr. Francisco X. Real biztosította (Institut Municipal d Investigacio Medica, Barcelona, Spanyolország). Az 5 µm vastag kriosztátos metszeteket szárítottuk, majd 20 C-on 10 percen át acetonban fixáltuk. PBS-ben történő mosásokat követően 30 percen át 5% sovány tejport tartalmazó PBS-ben blokkoltuk az aspecifikus kötőhelyeket. Ezután éjszakán át 4ºC-on blokkolóban 1:200 arányban hígított elsődleges CaR ellenanyaggal inkubáltuk a metszeteket. Mosást követően blokkolóban 1:100 arányban hígított, torma-peroxidázzal jelölt másodlagos ellenanyag került a sejtekre, majd a festődést az ABC metodikát alkalmazva diamino-benzidinnel (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, California, USA) vagy a Vector VIP szubsztráttal (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, California, USA) jelenítettük meg, a gyártó utasításait követve. A metszeteket hematoxilinnel is festettük. A képeket Nikon digitális kamerával, Nikon mikroszkópon, 40-szeres nagyítású objektívvel készítettük. Elektronmikroszkópos immuncitokémiához a Capan-1 sejteket PBS-ben mostuk, majd 30 percen át szobahőmérsékleten 4% paraformaldehidet tartalmazó PBS-ben fixáltuk. Az aspecifikus kötőhelyeket 5% sovány tejport tartalmazó PBS-ben blokkoltuk 30 percen át. Blokkolóban 1:200 hígításban oldttuk az elsődleges CaR ellenanyagot, abban inkubáltuk a sejteket 4ºC-on éjszakán át. Mosást, másodlagos antitesttel történő 36

37 inkubációt, majd ismételt mosást követően ABC-reakcióval, diamino-benzidin szubsztráttal (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, California, USA) hívtuk elő a reakciót a gyártó útmutatásai alapján. A sejteket ozmium-tetroxid (Taab, Aldermaston, Berkshire, NBr.) 1%-os vizes oldatában posztfixáltuk 30 percen át; dehidráltuk, uranilacetáttal festettük, majd TAAB812-be (Taab) ágyaztuk őket. Ultravékony metszeteket vizsgáltunk Hitachi 2001 transzmisszós elektronmikroszkóppal. Az intracelluláris szabad kalciumion-koncentráció meghatározása Az intracelluláris kalcium-koncentráció változás méréséhez a Capan-1 sejteket 24x40 mm-es fedőlemezekre ültettük ki. A letapadt sejteket pufferelt Hepes oldattal (HBSS: 136,7 mm NaCl, 5 mm KCl, 2 mm CaCl2, 2 mm MgCl2, 0,34 mm Na2HPO4, 0,44 mm KH2PO4, 4 mm NaHCO3, 5,55 mm glükóz és 20 mm Hepes (ph=7,4)) mostuk. Ezt követően a sejteket 10 µm fura-2 AM (metoxi-acetát-észter; Teflabs, Egyesült Államok) fluoreszcens kalcium-indikátorral töltöttük fel 37 o C-on, széndioxid termosztátban, 45 percen keresztül. A sejt észteráz aktivitása révén a vegyület sejtbe kerülése után rövid időn belül megtörténik a metoxi-észter hidrolízise. Az így keletkező fura-2 szabad sav a sejtmembránon keresztül már nem tud kidiffundálni, ezért a sejten belül tartós kalcium-kelátorként működik. A fura-2 kalciumhoz kötött formája 340 nmen, a szabad forma 380 nm-en mutat emissziós maximumot. Töltés után a sejteket szuperfúziós rendszerben újra mostuk a HBSS oldattal egy 37ºC-ra termosztált kamrában. A feltöltött sejteken az intracelluláris szabad kalciumszint változását Nikon TDM Diaphot inverz epifluoreszcens mikroszkóp (40-szeres fluor objektív; NA:0.85, Nikon, Japan) segítségével, mikrospektro-fluorometriával (D-104 Microscope Photometer, PTI, Egyesült Államok) mértük. Az agonistát (4 mm Ca 2+, ill. 1 mm Gd 3+ ) a mosást követően perfúziós pumpával 5 percen keresztül juttattuk el a kamrába. A töltött sejtekből kibocsátott fluoreszcens fény intenzitását fotosokszorozóval 340 és 380 nm gerjesztőfény alkalmazása mellett 520 nm-en detektáltuk. A kalcium citoplazmatikus koncentrációjának változását a 340 és 380 nanométer hullámhosszon gerjesztett emisszió-értékek hányadosaként adtuk meg. 37

38 A DNS-szintézis mérése A CaR aktivációjának sejtosztódásra gyakorolt hatását vizsgáltuk Capan-1 sejteken. A változásokat a DNS-szintézis során a láncba beépülő [ 3 H]-timidin kontrollhoz viszonyított értékével, százalékban adtuk meg. A kísérleti időpontot 24 órával megelőzően a tápfolyadékot szérummentes médiumra cseréltük. Így a sejteket szinkronizáltuk. A CaR agonistákat (4 mm Ca 2+, ill. 1 mm Gd 3+ a tápfolyadékban) a tápfolyadék cseréjével adtuk a sejtekhez. A sejteket 24 órán át kezeltük. A DNSszintézis mértékét a következő módon határoztuk meg: a 24 órás kezelést követően tápfolyadékban oldva 1 µci/ml [ 3 H]-timidint mértünk a sejtekre. 1 óra múlva a sejteket jéghideg foszfátpufferrel (ph=7,2) kétszer mostuk, 10%-os triklórecetsavval kicsaptuk, majd szobahőmérsékleten megszárítottuk (10 perc). A csapadékot 400 µl 1M NaOHban oldottuk, melyből µl-t 3 ml szcintilláló koktéllal (Opti Phase HeSafe II, Pharmacia, Németország) kevertünk össze. A mintákba beépült trícium radioaktivitását Wallac 1409 típusú folyadékszcintillátorral mértük meg. A timidin beépülés mértékét minden esetben a kezelést nem kapott kontroll százalékában adtuk meg (átlag ± SEM). Statisztikai módszerek Az egészséges és rákos emberi hasnyálmirigy szövetminták CaR mrns expresszióját kétmintás t-próbával hasonlítottuk össze. A Ca 2+ és a Gd 3+ CaR agonisták DNS-szintézisre gyakorolt hatását szóráselemzéssel vizsgáltuk, majd Dunnett-próba segítségével egyenként a kontrollhoz hasonlítottuk. Három független kísérletet végeztünk, az összes elemszám a kontrollra 19, a Ca 2+ -ra és a Gd 3+ -ra pedig

39 EREDMÉNYEK Kalcium-érzékelő receptorok az emberi hasnyálmirigyben A CaR mrns expressziója A CaR mrns expresszióját egészséges, daganatos és idült hasnyálmirigy-gyulladásból származó emberi szövetmintákból egyaránt kimutattuk RT PCR-rel. Agaróz gélelektroforézissel vizsgálva a termékeket, a hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalak közül csupán a Capan-1-ben figyeltük meg a CaR mrns expresszióját, Panc-1-ben, Capan-2-ben és HPAF-ban nem (10. ábra). MiaPaca-2 sejteken végzett amplifikációt követően csak radioaktívan jelölt szondával végzett hibridizáció segítségével sikerült kimutatni a CaR-ra jellemző PCR-terméket (az adatokat nem mutatjuk be). A 10. ábrán bemutatott reprezentatív vizsgálatban az HPAF sejtekből (a 3. minta az adenokarcinóma sejtvonalak közül) kevesebb XS13 terméket kaptunk. Ez kétségbe vonhatja, hogy a sejtvonalban valóban nincs CaR mrns expresszió, ám további vizsgálatok során még reamplifikációt követő radioaktív hibridizációval sem sikerült HPAF sejtekben CaR mrns-t kimutatni (az adatokat nem mutatjuk be). Egészséges emberi exokrin hasnyálmirigy sejtek elsődleges tenyészeteiben is kimutattuk a CaR mrns-t, ám annak szintje a kiültetés napjától kezdve az ötödik tenyésztési napig fokozatosan csökkent, emberi exokrin hasnyálmirigy sejtek elsődleges tenyészetéből immortalizálással előállított M540 sejtvonalban pedig nem volt kimutatható (10. ábra). Az RT PCR-ben kapott csíkok denzitometriája után mintánként a CaR denzitásokat a megfelelő XS13 denzitásokkal elosztva a következő eredményeket kaptuk: normál hasnyálmirigy: 3,5; tenyészet 1. napja: 1,9; 2. nap: 1,3; 3. nap: 0,9; M540: 0. A CaR mrns kifejeződésében hasonló csökkenés figyelhető meg marha mellékpajzsmirigy sejtek elsődleges tenyészeteiben, ami a CaR stimulációra való válaszképesség drámai csökkenését okozza [88]. A kezdeti RT PCR vizsgálatokban nem mutatkozott jelentős különbség a rákos és egészséges hasnyálmirigy minták között a CaR mrns szintjében, ám az erőteljesen csökkent vagy el is tűnt a pankreász adenocarcinoma sejtvonalakban. Korábban kimutatták, hogy más G protein-kapcsolt receptorok pl. az SST2 szomatosztatinreceptor szintje hasnyálmirigy rákban csökken [20]. Ezért egészséges és rákos emberi 39

40 hasnyálmirigy szövetben meghatároztuk a CaR mrns szintjét. Erre kvantitatív RT PCR-t alkalmaztunk: a CaR és belső standardként a konstitutívan kifejeződő XS13 savas riboszomális foszfoprotein cdns-ét koamplifikáltuk közös reakcióban, majd Southern hibridizációval detektáltuk a termékeket (11. ábra). E mérések azt mutatták, hogy nincs expressziós különbség a normál és rákos minták között (kétmintás t-próba, n=5, p=0,75). normál pankreász hasny.m. daganat idült h. gyulladás adenokarcinóma sejtvonalak primér hasny.m. tenyészet 10. ábra: A kalcium-érzékelő receptor (CaR) mrns kimutatása RT PCR-rel emberi pankreászból, tenyésztett emberi pankreász exokrin sejtekből, valamint humán hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalakból (a szerző munkája). (A) CaR mrns expresszió normál hasnyálmirigyben, pankreász rákban, idült hasnyálmirigy-gyulladásban és a Capan-1 (1), Panc-1 (2), HPAF (3), MiaPaca-2 (4), és Capan-2 (5) sejtvonalakban. M: 100 bp DNS marker; : negatív kontroll; +: pozitív kontroll (CaR plazmid). A felső nyíl az 1259 bp CaR terméket jelöli, az alsó a konstitutívan kifejeződő XS13 génnek megfelelő terméket. (B) A CaR mrns kimutatása normál emberi pankreász exokrin sejtek primer tenyészeteiben. NP: normál pankreász; 1, 2, 5: tenyészetben töltött napok a feldolgozás előtt; M540: tenyésztett hasnyálmirigy exokrin sejtek SV40 vírussal történő immortalizálásából származó sejtvonal; M: 1 kb DNS marker. Gél normál marker tumor CaR/XS13 arány 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 normál normál n. sz. tumor tumor 11. ábra: A CaR expresszió összehasonlítása normál és rákos emberi pankreászban kvantitatív RT PCR-rel (a szerző munkája). (A) Fent ( Gél ): duplex CaR-XS13 PCR normál és rákos mintából, lent ( Blot ): a gélből készült Southern hibridizáció (reprezentatív képek 5 kísérletből). (B) Az egyes mintákból kapott CaR és XS13 csíkok intenzitásaiból képezett hányadosok átlaga ± SEM 5 5 egészséges és rákos emberi hasnyálmirigy szövetmintából. n. sz. : nem szignifikáns. 40

41 Az emberi hasnyálmirigy CaR cdns szekvenciájának meghatározása Mellékpajzsmirigyben, citotrofoblasztban és keratinocitákban a CaR különböző splice variánsait figyelték meg [49, 12, 104]. Annak vizsgálatára, hogy emberi hasnyálmirigyben található-e valamilyen splice variáns, az Anyagok és módszerek c. fejezetben leírt módon klónoztuk a CaR cdns teljes fehérjekódoló szakaszát, majd meghatároztuk nukleotidsorrendjét, amelyről kiderült, hogy megegyezik az emberi mellékpajzsmirigyben leírt szekvenciával [49], splice variánst tehát nem találtunk. A CaR immunhisztokémiai kimutatása Immunhisztokémiával tanulmányoztuk a CaR fehérje lokalizációját egészséges és daganatos emberi hasnyálmirigy szövetmintákban. Normál hasnyálmirigy vizsgálatakor exokrin, endokrin szövetekben, valamint idegekben is kimutattuk a CaR fehérjét (12. ábra C, D). A duktuszokban erős, az acinusokban halványabb, de egyértelmű festődést észleltünk. A rákos szövet sem a duktuszok, sem az acinusok festődésében nem mutatott lényeges különbséget. Patkány hasnyálmirigyben kapott korábbi eredményekhez hasonlóan [18], a szigetekben szintén erőteljes CaR festődést tapasztaltunk. A hasnyálmirigyben futó erekben is kimutattuk a CaR-t. A simaizomsejteken erőteljes, az endotél sejteken gyengébb festődést tapasztaltunk (12. ábra C). Végül a pankreászban futó idegek is erős CaR festődést mutattak. Patkány hasnyálmirigyben kapott korábbi eredményekkel összhangban [18], mind az acinus, mind a duktusz sejtekben észleltünk CaR festődést a citoplazmában. Patkány hasnyálmirigyben a duktusz sejtek apikális membránján is kimutatható a CaR [18]. Nagyobb nagyítással vizsgálva a duktuszokat emberi pankreász szövetből készült kriosztátos metszeteken, a duktusz sejtek apikális felszínén látható festődés (12. ábra C, F). Ám, mivel a festődés a duktusz sejtek teljes citoplazmájára kiterjedt, teljes biztonsággal nem állítható, hogy a CaR egyértelműen az apikális membránra lokalizálódik. Capan-1 sejtekben is kimutattuk a CaR fehérjét fénymikroszkópos immuncitokémiával (12. ábra I). Elektronmikroszkóppal vizsgálva a CaR-ok membrán lokalizációt mutattak (13. ábra). Ugyanakkor eredményeink semmit nem árulnak el arról, hogy a receptor az 41

42 apikális vagy a bazolaterális membránon található-e, mivel a vizsgálatokhoz használt sejteket nem polarizált epitéliumként tenyésztettük, hanem üveglemezen. 12. ábra: A kalcium-érzékelő receptor (CaR) kimutatása egészséges emberi hasnyálmirigyben, duktális pankreász adenokarcinómában és Capan-1 sejtekben immunhisztokémiával (Dr. Kittel Ágnes munkája). Emberi hasnyálmirigyből származó, 5 µm vastag kriosztátos mintákat elsődleges nyúl anti-car, majd anti-nyúl másodlagos ellenanyaggal inkubáltunk. A festődést diaminobenzidinnnel (A, D I), ill. Vector VIP szubsztráttal (B, C) vizualizáltuk. A vonalak 200 µm-t (A, D és F H) vagy 50 µm-t (B, C, E) jelölnek. (A) Elsődleges antitest nélkül végzett kontroll festés (összehasonlítható pl. a D ábrával). (B) Preabszorpciós kontroll (a C ábrával hasonlítandó össze). (C, D, F) Egészséges emberi pankreászból készült metszetek ("D"=pankreász duktusz, "A"=acinus, "V"=ér). (G, H) Humán pankreász adenokarcinóma szövetből készült metszetek ("D"=abundáns duktális struktúrák, "I"=sziget, "N"=ideg). A vonalak 200 µm-t jelölnek. (E) A G ábrán mutatott adenokarcinóma részletének nagyítása a duktális struktúrák erőteljes festődésének szemléltetésére. (I) A CaR fehérje kimutatása Capan-1 sejtekben immuncitokémiával. A vonal 10 µm-t jelöl. 13. ábra: Elektronmikroszkópos immuncitokémia a kalcium-érzékelő receptorok (CaR) kimutatására Capan-1 sejtek felszínén (Dr. Kittel Ágnes munkája). Diaminobenzidin csapadék (folyamatos nyíl) mutatja a CaR immunreaktivitást (A). Ha az elsődleges antitestet kihagytuk a reakcióból, nem kaptunk festődést (szaggatott nyíl, B). A vonalak 0,15 µm-t jelölnek. 42

43 Az intracelluláris szabad kalciumszint változása Funkcionális CaR-ok jelenlétének kimutatására receptor agonistáival történő stimulációt követően mértük a sejten belüli szabad kalciumszint változását fura-2 fluorofórral feltöltött Capan-1 sejtekben. Agonistaként Ca 2+ -ot és Gd 3+ -ot alkalmaztunk; utóbbi a CaR specifikus agonistája, és megvan az az előnye, hogy kalciumcsatornákon keresztül nem lép be a sejtekbe. Mind 4 mm Ca 2+, mind 1 mm Gd 3+ az intracelluláris szabad kalciumszint gyors, átmeneti enelkedését okozta (14. ábra). Ez összhangban áll más, a CaR-t natívan kifejező vagy azzal transzfektált sejtvonalakban kapott eredményekkel, és azt valószínűsíti, hogy az emberi hasnyálmirigyben a receptor Gq fehérjéken keresztül foszfolipáz Cβ-t aktivál. arány arány idő (mp) idő (mp) 14. ábra: 1 mm Gd 3+ (A) és 4 mm extracelluláris Ca 2+ (B) hatása az intracelluláris szabad kalciumszintre ([Ca 2+ ] i ) 10 darab Capan-1 sejtben egyetlen látótérben (Barabás Kornélia munkája). Fedőlemezen tenyésztett Capan-1 sejteket 10 µm fura-2 acetoxi-metilészterrel töltöttünk föl. A kalcium-érzékelő receptor agonistákat a perfúziós folyadék tartalmazta. A kezelt sejtekből emittált fura-2 fluoreszcenciát 520 nm-en mértük 340 és 380 nm-en váltakozva történő gerjesztés során. A [Ca 2+ ] i változásait 340 és 380 nm-en mért fluoreszcenciák hányadosában bekövetkezett változás szemlélteti. Sejtosztódási vizsgálatok Az extracelluláris kalciumszint változása számos sejttípusban hatást gyakorol a sejtproliferációra [62, 87, 140], amely hatásokról kimutatták, hogy a CaR közvetíti őket. Ezért a [ 3 H]-timidininkorporáció mérésével vizsgáltuk, hogy CaR agonisták milyen hatást gyakorolnak a Capan-1 sejtek osztódására. Mind 1 mm Gd 3+, mind 4 mm Ca 2+ szignifikánsan, de csak csekély, 20% körüli mértékben gátolta a DNS-szintézist Capan- 1 sejtekben (15. ábra). (A [ 3 H]-timidininkorporáció átlag ± SEM értékei kontroll 43

44 sejtekben: 100 ± 4%, n=19; Gd 3+ -mal kezelt sejtekben: 81 ± 4%, n=17, p<0,05; Ca 2+ - mal kezelt sejtekben: 75 ± 7%, n=17, p<0,05; ANOVA, majd Dunnett-próba.) a kontroll %-a kontroll * * 15. ábra: CaR agonisták hatása a Capan-1 sejtek osztódására (Barabás Kornélia munkája). A sejteket szérummentes, alacsony [Ca 2+ ]-jú médiumban tartottuk 24 órán át, majd üres médiummal (kontroll), 4 mm Ca 2+ -mal, vagy 1 mm Gd 3+ -mal kezeltük őket 24 órán át. 1 órás, [ 3 H]-timidinnel történő pulzusjelölés után folyadékszcintillációs módszerrel mértük a beépült radioaktivitást. Az eredményeket a kontroll sejtek timidinbeépülésének %-ában ± SEM adjuk meg. *p<0,05. Kalcium-érzékelő receptorok az emberi hasnyálmirigyben: az eredmények összegzése Összegzésül elmondhatjuk, hogy egészséges, daganatos és idülten gyulladt emberi hasnyálmirigyben, exokrin sejtek elsődleges tenyészeteiben, valamint a Capan-1 pankreász adenokarcinóma sejtvonalban egyaránt kimutattuk a kalcium-érzékelő receptor mrns expresszióját. Primer tenyészetben az mrns szintje a tenyészetben eltöltött idővel arányosan csökken. A CaR fehérje kifejeződik erekben, idegekben, szigetsejtekben, acinusokban, valamint duktuszokban is. Capan-1 sejtekben a CaR fehérje membrán lokalizációt mutat, a receptor stimulálása emeli a sejten belüli szabad kalciumszintet és gátolja a sejtek osztódását. 44

45 Akvaporinok az emberi hasnyálmirigyben Az akvaporinok expressziójának mrns-szintű vizsgálata Az akvaporin izoformák mrns-szintű expressziójának vizsgálatát reverz transzkriptáz polimeráz láncreakcióval végeztük, erre a célra tervezett specifikus primerek felhasználásával, emberi hasnyálmirigy cdns-ekből. Az XS13 savas riboszomális foszfoprotein [137] cdns-ét amplifikáltuk belső kontrollként. Egészséges emberi pankreászból AQP1, -3, -4, -5, és -8 izoformákra specifikus primerek használatával a várt méretű PCR-termékeket kaptunk (16. ábra). Az összes kapott termék nukleotidsorrendje legalább 98%-ban megegyezett az egyes emberi izoformákból nyert cdns-ek megfelelő szakaszainak publikált szekvenciájával. A kifejeződés szintje az egyes mintákban változó volt (16. ábra). Az AQP1 mrns kimutatható volt normál és rákos emberi hasnyálmirigyben, ám Capan-1, Capan-2 és HPAF sejtvonalban nem. Az AQP3 és -4 mrns expressziója normál és rákos emberi pankreászban magas volt, míg a sejtvonalakban alacsony. Az AQP5 mrns az összes vizsgált mintában csak alacsony szinten volt kimutatható, ezért az XS13 konstitutív génre kapott eredmények alapján meghatározott cdns mennyiség háromszorosát mértük be. Az AQP8 egészséges emberi hasnyálmirigyben és a vizsgált két rákos minta egyikében kifejeződik, ám a sejtvonalakban nem. Az AQP1 lokalizációjának immunhisztokémiai vizsgálata Az AQP1-et egészséges emberi hasnyálmirigyek paraffinos metszeteiből imunperoxidáz jelöléssel mutattuk ki, specifikus elsődleges antitest felhasználásával (17.A ábra). Ha az elsődleges antitestet a felhasználás előtt az immunizáláshoz használt peptiddel inkubáltuk, a jelölődés teljesen eltűnt, mutatva a felhasznált antitest specifitását (17.B ábra). A 17.A ábrán AQP1-re jelölődött sejtek láthatók csoportosulva, helyenként pedig magukban, a lobuláris exokrin szövet acinusai között. Az acinusokban található szekretoros sejtek közül, amelyek az apikális pólusuknál található zimogén granulumok alapján azonosíthatók, egyik sem festődött. A számos acinus közepében található, és néhol az acinusok határáig terjedő centroacináris sejtek membránján ugyanakkor erős festődés látható (17.C F). 45

46 Az interkaláris duktuszok szintén erősen festődtek (17.A ábra). Ezek megnyúlt és néhol elágazó sejtcsoportokként látszódnak hosszanti metszetben (17.G ábra), ill. szekérkerékszerű struktúrákként keresztmetszetben (17.E, F ábra). Az apikális és a bazolaterális plazmamembrán egyaránt jelölődött AQP1-re, és némi diffúz festődést a citoplazma is mutatott. A nem festődő acinussejtekből az erősen jelölődő interkaláris duktuszsejtekbe való hirtelen átmenet különösen szembeszökő (17.G ábra). Az AQP1 kimutatható volt a hajszálerekben és egyéb kisméretű vérerekben, ám a nagyobb erekben és a Langerhans-szigetek belső elválasztású sejtjeiben nem fordult elő (18.B ábra). 16. ábra: RT PCR az akvaporinok (AQP) kimutatására emberi hasnyálmirigyben, pankreász tumorokban és duktális sejtvonalakban (a szerző munkája). Etidium-bromiddal festett agaróz géleken mutatjuk be az emberi szövetmintákból és a sejtvonalakból preparált RNSből kapott termékeket XS13-ra, AQP1-re, -3-ra, -4-re, -5-re és - 8-ra. Az AQP5 esetében háromszoros mennyiségű cdnst vittünk be a PCR reakcióba. A nyilak a publikált cdnsszekvenciák alapján várt termékméreteket jelölik. PN: egészséges pankreász; PT: hasnyálmirigy daganat; Capan-1, Capan- 2, HPAF: sejtvonalak; S: parotis nyálmirigy; M: marker; B: pozitív kontrollként használt emberi agyszövet (hippocampus) 46

47 17. ábra: Az akvaporin 1 (AQP1) immunlokalizációja centroacináris és interkaláris duktuszsejtekben emberi hasnyálmirigyben (Dr. Burghardt Bea munkája). A G: Emberi pankreászból készült 2 µm vastag paraffinos metszeten alkalmazott immunperoxidázos jelölés AQP1-re. A: Kis nagyítású áttekintő kép jelölt sejtek elszórt csoportjaival, melyek némelyike egyértelműen interkaláris vagy intralobuláris duktuszként azonosítható kereszt- (nyílhegy) vagy hosszmetszeti (nyíl) nézetben. B: Hasonló metszeten, az immunizáló peptiddel preabszorbeált első antitest felhasználásával kapott kép. C E: A centroacináris sejtek (ca) jelölődése. Némelyikük a szomszédos acinussejtek között egészen az acinus pereméig elnyúlik (nyilak). Laterális felszínükön erős festődés látható. Mások kiterjedten elágazó morfológiát mutatnak, több acinussejt közé betüremkedő interdigitációkkal (D). F, G: Apikális és bazolaterális festődést mutató interkaláris duktuszsejtek (ic) keresztmetszetben (F) és hosszmetszetben (G). Az interkaláris duktuszok kis átmérőjük (<20 µm), a körülvevő sejtek kis száma (keresztmetszetben jellemzően 3 7 sejtmag), és az igen szűk luminális tér alapján azonosíthatók. Az F ábrán AQP1 festődést mutató centroacináris sejtek láncolata húzódik egy tubuláris szerkezetű acinus ürege mentén. H J: Immunfluoreszcens jelölés normál emberi pankreász paraffinos metszeten. H: Az interkaláris duktuszsejtek apikális és bazolaterális AQP1 jelölődése (zöld), I: apikális festődés cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (CFTR) fehérjére (piros), J: a H és I ábrák szuperpozíciójával sárgán látható az AQP1 CFTR kolokalizáció az apikális membránon. Az interkaláris duktuszok lumenjének igen kis átmérője miatt a CFTR festődés többnyire izolált pontokként látható a keresztben elmetszett duktuszokban, és csak helyenként hosszanti profilban. 47

48 18. ábra: Az AQP1 immunlokalizációja emberi (A H) és patkány (I J) pankreász intra- és interlobuláris duktuszaiban (Dr. Burghardt Bea munkája). A, B: Az intralobuláris duktuszok (id) apikális és bazolaterális membránjainak immunperoxidázos festése hosszmetszetben (A) és keresztmetszetben (B). Az intralobuláris duktuszok az interkalárisoknál nagyobbak, jól látható lumenjük van, amit keresztmetszetben szemlélve 8 14 kicsi, kuboidális sejt vesz körül. A Langerhans-szigetek (L) nem jelölődnek (B ábra). C E: Intralobuláris duktuszok (id) immunfluoreszcens jelölése AQP1 antitesttel (C, zöld) és CFTR-rel (D, piros), valamint a két kép szuperpozíciója (E, sárga pontok). Míg az AQP1 festődés egyenletes az apikális és bazolaterális membránok mentén (C), a CFTR jel az apikális membránon foltokban jelentkezik (nyílhegyek, D). F H AQP1 immunperoxidáz jelölés interlobuláris és fő duktuszokon. A jel főként az apikális membránon látható a kisebb interlobuláris duktuszokban (nyilak, F), viszont a nagyobb interlobuláris duktuszokból (G) és a fő pankreászvezetékből (md, H) gyakorlatilag hiányzik. A hajszálerek (c, G) és a centroacináris sejtek (ca, H) erősen festődnek, így belső kontrollként alkalmazhatók. I, J: AQP1 immunperoxidázos jelölés patkány hasnyálmirigyben. A lebenykéken belül (I) festődés látható a kapillárisokban (c), venulákban (v), és intralobuláris duktuszokban (id). A duktuszfán belül a festődés az interlobuláris duktuszokra korlátozódik (ID, J) és az epitélsejtek apikális és laterális felszínein némileg erősebb, mint bazálisan. Az AQP1 és a CFTR kolokalizációja interkaláris duktuszokban Fölvetődött a kérdés, hogy az AQP1 oda lokalizálódik-e, ahol a duktális folyadékszekréció történik. Ezért immunfluoreszcens kettős jelöléssel vizsgáltuk az AQP1, valamint a duktális folyadékszekréció funkcionális markereként a CFTR 48

49 kolokalizációját. A 17.H ábrán látható a zölden jelölt AQP1 lokalizációja, ez egyértelműen ugyanazt a mintázatot követi, mint a 17.A ábrán. A 17.I ábrán a pirossal jelölt CFTR kevésbé kiterjedt eloszlása látható ugyanazon a metszeten. A CFTR az interkaláris duktuszok apikális membránján, valamint az acinussejteken figyelhető meg. A két képet egymásra helyezve (17.J ábra) egyértelmű az AQP1 és a CFTR kolokalizációja az interkaláris duktuszokban apikálisan. A CFTR jelölés (piros) egy-két helyen pontszerűen nem esik egybe az AQP1-gyel a 17.J ábrán, ez az acinussejtek apikális membránján jelölődő CFTR. Azok a nagyobb területek pedig (zöld), ahol nem esik egybe az AQP1 jelölés a CFTR-rel, egyértelműen az interkaláris duktuszok bazolaterális membránrégiói, ahol a CFTR hiányzik, ám az AQP1 megtalálható. AQP1 az emberi pankreász intra- és interlobuláris duktuszaiban Bár az interkaláris duktuszoknál kisebb számban, de helyenként intralobuláris duktuszokat is megfigyelhettünk a lebenykéken belül az acinusok között. Ezek festődtek AQP1 antitesttel mind az apikális, mind a bazolaterális membránjukon, bár bazolaterálisan gyengébben (18.A, B ábra). A 18.C E ábrákon bemutatott immunfluoreszcens képek egy öt intralobuláris duktuszból álló csoportot mutatnak, valószínűleg közel összefutásuk pontjához, ahol kilépnek a lebenyke hilusából. Mindegyikükön látható AQP1 festődés az apikális és bazolaterális membránokon (18.C ábra). Az apikális plazmamembrán domének CFTR festődése (18.D ábra) itt sokkal gyengébb, mint az interkaláris duktuszokban, amelyek a metszet többi részén láthatók. A nagyobb, a lebenykék közti kötőszövetes szeptumokban elhelyezkedő interlobuláris duktuszok sokkal gyengébb AQP1 festődést mutattak (18.F H ábra). A kicsi és közepes méretű interlobuláris duktuszokban az AQP1-et az apikális membránokon észleltük, míg a bazolaterális membránokon ritkán (18.F, G ábra). A nagyobb interlobuláris duktuszokban (18.H ábra) a duktusz epitél nem mutatott AQP1 jelölődést. AQP1 a patkány hasnyálmirigyben Gyenge AQP1 festődést mutattunk ki patkány hasnyálmirigy interlobuláris duktuszaiban (18.J ábra). A mirigy lebenykéin belül ugyanakkor AQP1 expresszió csak 49

50 a vérér endotélen volt kimutatható, míg acinusokban és intralobuláris duktuszokban egyáltalán nem (18.I ábra). Az AQP5 immunhisztokémiai lokalizációja Immunperoxidázos festéssel kimutattuk, hogy az AQP5 az interkaláris duktuszsejtek apikális membránján található (19. ábra). A centroacináris sejtek nem festődtek AQP5- re. Bár hosszmetszetben az interkaláris duktuszok igen szűk lumenje csak néhol látható, a 19.A ábra két acinus felől konvergáló egy-egy interkaláris duktuszt mutat, amelyek apikális membránjukon erősen festődnek AQP5-re. Ugyanezen a metszeten látható keresztmetszetben egy csoport acinussejt és interkaláris duktuszsejt egy közös lumen körül, valamint egy további keskeny interkaláris duktusz. Mindkét struktúra erőteljes apikális AQP5 festődést mutat. A 19.B ábrán további pozitívan jelölődő interkaláris duktuszok láthatók. Az AQP5 az intralobuláris duktuszok apikális membránján is megfigyelhető (19.I ábra), ám az interlobuláris duktuszokból hiányzik (19.J ábra). 50

51 19. ábra: az AQP5 immunlokalizációja emberi hasnyálmirigy interkaláris és intralobuláris duktuszaiban (Dr. Burghardt Bea munkája). A, B: AQP5 immunperoxidáz jelölés az interkaláris duktuszok (ic) apikális membránján hosszmetszetben (nyilak) és keresztmetszetben (nyílhegyek). Patkány és ember AQP5 ellen termeltetett ellenanyagokkal ugyanazt a festődési mintázatot kaptuk. Az A ábrán szereplő látótér a 2G ábrának felel meg, amely egy konszekutív metszetben AQP1 festést mutat. C: Immunfluoreszcens AQP5 jelölés (zöld) látható az interkaláris duktuszok apikális membránján. D: Ugyanazon a metszeten a CFTR jel (piros) hasonló lokalizációt mutat (nyilak), valamint az acinusok lumenjében is megfigyelhető (nyílhegyek). E: Az AQP5-re és a CFTR-re kapott képek szuperpozíciója kolokalizációjukat mutatja az interkaláris duktuszok apikális membránján (sárga). F: Az AQP5 (zöld) és a CFTR (piros) kolokalizációja egy acinusból kiinduló interkaláris duktusz (ic) lumenében. Az acinussejtek (a) apikális membránjában megfigyelhető a CFTR, ám AQP5 nem látható. G: Emberi szubmandibuláris nyálmirigy acinussejtekben apikális membrán és szekretoros canaliculusok AQP5 festése az antitest specifitásának ellenőrzésére. H: Emberi pankreász metszet immunizáláshoz használt peptiddel preabszorbeált antitesttel festve. I: AQP5 immunperoxidázos jelölés intralobuláris sejtek apikális membránján, a duktuszok hosszmetszeti képe látható. J: Az interlobuláris duktuszok (ID) nem festődnek AQP5-re. Ugyanazon a metszeten az interkaláris és intralobuláris duktuszok (nyilak) erős jelölődést mutatnak. 51

52 Az AQP5 és a CFTR kolokalizációja interkaláris duktuszokban Ismét kettős fluoreszcens jelölést alkalmaztunk az AQP5 és a CFTR festődési mintázatának összehasonlítására. Az AQP5 jelölés az interkaláris duktuszsejtek apikális membránjára korlátozódott (19.C ábra), ahol kolokalizációt mutatott a CFTR-rel (19.D, E ábra). Az acinusok közepében mutatkozó CFTR jelölés nem társult AQP5 jelöléssel. Ez a 19.F ábrán is látszik, ahol egy acinusba torkolló interkaláris duktusz látható. A CFTR festődés jól láthatóan tovább nyúlik az acinusba, mint az AQP5. AQP5 a mucinózus duktuszokban és mirigyekben Az emberi pankreász metszetekben néhol mucinózus mirigyeket is azonosítottunk (20.A ábra). E mirigyek szekretoros sejtjei lapos, bazálisan elhelyezkedő magokkal rendelkeznek, valamint megnövekedett apikális régióval. Amint a 20.A ábrán látszik, a luminális membránon erős AQP5 festődés figyelhető meg. Egy konszekutív metszeten ezek a sejtek nem mutatnak AQP1 festődést (20.B ábra). Néhány nagyobb duktusz, amelyet hasonló sejtek határolnak, szintén határozott apikális jelölődést mutatott AQP5- re (20.C ábra), míg AQP1-re nem (20.D ábra). Egyéb akvaporinok Az AQP3 és AQP4-re RT PCR-rel kapott pozitív eredmények ellenére expressziójukat immunhisztokémiával nem sikerült kimutatni. Egy nyálmirigyben korábban pozitív eredményt adó [54] AQP3 antitestet alkalmazva emberi hasnyálmirigyben nem kaptunk plazmamembrán festődést. AQP4 antitesttel szintén negatív eredményt kaptunk (az adatokat nem mutatjuk be). Emberi AQP8 elleni antitesttel egyértelmű festődést tapasztaltunk az acinussejtek apikális membránján a zimogén granulumok szomszédságában (20.E ábra). Az expressziós mintázat hasonló volt a korábban patkány pankreászban kapotthoz [63], intracellulárisan vagy más sejttípusokon pedig nem észleltünk jelölődést. A specifikus immunfelismerés kontrolljaként immunizálatlan állatból származó szérummal vagy abból tisztított IgG-vel végzett festések negatív eredményt adtak (20.F ábra). 52

53 20. ábra: A D: Az AQP5 és az AQP1 immunlokalizációja duktusz-asszociált mucinózus mirigyekben; E: AQP8 lokalizáció emberi hasnyálmirigy acinussejtjeiben; F: immunizálás nélkül nyert IgG felhasználásával készült kontroll jelölés emberi hasnyálmirigyben (Dr. Burghardt Bea munkája). A, C: AQP5 immunperoxidáz festés egy mucinózus mirigy (A) és egy nagy mucinózus duktusz (C) glikoproteint szekretáló sejtjein (nyilak). B, D: A konszekutív metszeten a mucinózus sejtek nem festődnek AQP1-re. Jellemző azonban a B ábrán látható erős AQP1 jelölődés a mucinózus miriggyel asszociált interkaláris duktuszban (ic). A mucinózus duktusz epitélium (C, D) morfológiája eléggé különböző volt az interlobuláris duktuszokra jellemző hengeres epitélium (A3G, A3H ábra) morfológiájától. E: AQP8 immunperoxidáz festés (nyilak) az acinussejtek apikális pólusán emberi hasnyálmirigyben. F: Immunizálás nélkül nyert IgG-vel végzett immunreakció emberi pankreász metszeten. Nem kaptunk festődést, a nyilak az acinussejteket jelölik. 53