HŐSOKKFEHÉRJÉK ELLENI ANTITESTEK SZEREPE KÜLÖNBÖZŐ AUTOIMMUN BETEGSÉGEKBEN

Átírás

1 HŐSOKKFEHÉRJÉK ELLENI ANTITESTEK SZEREPE KÜLÖNBÖZŐ AUTOIMMUN BETEGSÉGEKBEN Doktori értekezés Dr. Horváth Laura Témavezető: Prof. Dr. Füst György Semmelweis Egyetem, Budapest Tudományági Doktori Iskola: Molekuláris Orvostudományok

2 TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY BEVEZETÉS IRODALMI HÁTTÉR A hősokkfehérjék általános jellemzői Autoimmunitás Természetes autoimmunitás Pathogén autoimmunitás, autoimmun betegségek kialakulása Hősokkfehérjék elleni immunitás A hősokkfehérjék elleni immunitás fiziológiás szerepe A hősokkfehérjék elleni immunitás pathogén szerepe Hősokkfehérjék elleni immunreakcióra vonatkozó irodalmi adatok szisztémás autoimmun betegségekben Hősokkfehérjék elleni immunreakcióra vonatkozó irodalmi adatok 1-es típusú diabetes mellitusban C1q elleni antitestek autoimmun kórképekben C1q- és 60- illetve 65kD-s hősokkfehérjék elleni antitestek keresztreakciója Az 1-es típusú diabetes mellitus etiopathogenezise P kd-os hősokkfehérje peptid szerepe diabetes mellitusban CÉLKITŰZÉSEK MÓDSZEREK Betegek és kontrollok Felhasznált anyagok Vizsgálati módszerek Statisztikai analízis EREDMÉNYEK Hsp60-, hsp65- illetve C1q elleni antitestek előfordulása autoimmun kórképekben, korreláció a vizsgált antitestek szintje között Keresztreakció anti-c1q és anti-hsp60 antitestek között C1q ellenes antitestek kapcsolata egyéb vizsgált paraméterekkel szisztémás lupus erythematosusban Hősokkfehérjék elleni antitestek 1-es típusú diabetes mellitusban 49. 2

3 7.5. P277 elleni antitestek 1-es típusú diabetes mellitusban A hsp60 elleni antitestek epitópspecificitásának vizsgálata 1-es típusú diabetes mellitusban Egyéb diabetesre jellemző antitestek (ICA, GADA, IA-2At) vizsgálata MEGBESZÉLÉS A hősokkfehérjék és a C1q elleni antitestek vizsgálata autoimmun kórképekben A C1q antitestek és az SLE klinikai és laboratóriumi paraméterei közötti összefüggések vizsgálata A hősokkfehérjék és egyes epitópjai elleni antitestek vizsgálata frissen diagnosztizált 1-es típusú diabeteses gyermekekben Az értekezésben leírt legfontosabb eredmények összefoglalása RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 85. 3

4 1. ÖSSZEFOGLALÁS A hősokkfehérjék elleni antitestek szerepe különböző autoimmun betegségekben Dr. Horváth Laura Témavezető: Prof. Dr. Füst György Semmelweis Egyetem, Budapest, 2002 A doktori értekezésemben a hősokkfehérjék elleni humoralis immunválasz szerepének vizsgálata során kapott eredményeimet foglalom össze. Irodalmi adatok alapján feltételezhető, hogy bizonyos autoimmun betegségek pathogenezisében a hősokkfehérjék elleni immunreakciónak is szerepe lehet. Különböző autoimmun kórképekben (szisztémás lupus erythematosus, SLE; polymyositis/dermatoymositis, PM/DM; rheumatoid arthritis, RA; Raynaud szindróma, RS; nem differenciált kollagén betegség, NDC; szisztémás sclerosis, SSC; diabetes mellitus, DM) mértük meg a hsp elleni antitestek titerét, valamint egyéb jellegzetes, az egyes kórképekre specifikus autoantitesteket is meghatároztunk, és vizsgáltuk ezek kapcsolatát, korrelációját, esetleges keresztreakcióját a hsp elleni antitestekkel. A hsp60 és hsp65 elleni antitestek titere egyedül nem differenciált kollagén betegségben volt magasabb, és csak ebben a kórképben észleltünk korrelációt a C1q elleni antitest titerrel is, mindezek megerősítik ennek a betegcsoportnak külön klinikai entitásként való elfogadását, illetve utalnak a C1q elleni antitestek heterogenitására is. A C1q elleni antitestek, melyek SLE-ben jelentősebben gyakrabban voltak detektálhatóak mint egészségesekben, szorosan korreláltak a betegség aktivitásával, bizonyos akut fázis fehérjékkel, valamint a veseérintettséggel (nephritissel). 1-es típusú diabetesben a hsp elleni antitestek epitópspecificitását vizsgálva két olyan peptidszakaszt azonosítottunk hsp60 AA (p277) és AA illetve hsp65 AA és AA , amelyek ellen a diabeteses gyermekek magasabb antitest reaktivitást mutattak, mint az egészséges kontrollok. Mivel a p277 peptid terápiás és protektív hatása állatkísérleti modellekben már igazolódott, van remény arra, hogy megfelelő alkalmazásával a humán diabetesben zajló immunfolyamatokat is modulálni lehet majd. Eredményeink megerősítik, hogy a hősokkfehérjék egyes epitópjai elleni immunreakció szerepet játszhat bizonyos autoimmun betegségek pathogenezisében. Ezen immunfolyamatok pontosabb megismerése akár egészen új terápiás és prevenciós lehetőségek felé irányíthatja figyelmünket. 4

5 2. SUMMARY The role of antibodies against heat shock proteins in different autoimmun disesases Dr. Laura Horváth Programleader: Prof. Dr. George Füst Semmelweis University, Budapest, 2002 Experiments summarised in this work are focused on the role of humoral autoimmunity against heat shock proteins (hsps). There are a lot of evidence supporting that the immune reaction against heat shock proteins may have a role in the pathogenesis of certain autoimmune diseases. We measured the titer of hsp antibodies in patients suffering from SLE, PM/DM, SSc, RA, RS, NDC and DM. Some other characteristic, disese-specific antibodies were also examined, and we studied the correlation and possible cross reaction with the hsp antibodies. Antibodies against hsp60 and hsp65 were significantly higher in patients with non differenciated connective tissue diseases, and correlation between C1q and hsp antibodies could also be proved in this group of patients. These results support the acceptance of NDC as a separate disease entity, and indicate the heterogenity of C1q antibodies as well. The C1q antibodies, detected more often in SLE patients than in healthy controls, correlated strongly with the activity of the disease, with some acut phase proteins and renal involvement (nephritis). Studying the epitope specificity of hsp antibodies in type 1 diabetes mellitus we discovered two peptid region hsp60 AA (p277) and AA ; hsp65 AA and AA , against which the sera from diabetic children showed much stronger antibody-reactivity than did the controls. Since the protective and beneficial therapeutic effect of the p277 peptide was proved in animal experiments, there is a hope, that giving the peptide to human we can modulate the immune processes of human diabetes, too. Our results support that immune reaction agains certain epitopes of heat shock proteins may have a role in the pathogenesis of some autoimmune diseses. The clear understanding of these immune processes can turn our attention to very new therapeutic and preventive possibilities. 5

6 3. BEVEZETÉS Az autoimmun betegségek etiológiája, pontos pathogenezise ma sem tisztázott egyértelműen, és az oki kezelés hiányában igen korlátozottak a terápiás lehetőségek is. Számos kórképben ismertek olyan autoantigének, amelyek ellen a szervezet ismeretlen okból autoantitesteket és autoreaktív T sejteket termel, ugyanakkor általában egy-egy betegségben több feltételezett target antigén is szóba kerül. Nem ismert, hogy ezek közül melyik az az antigén, amelyik felelős a destruktiv immunfolyamat elindításáért, melyek azok, amelyek a folyamat fenntartásában vesznek részt, és melyek azok, amelyek esetleg csak szekunder módon, mintegy mellékleletként detektálhatóak, funkciójuk nem jelentős, és csak a célszerv pusztulásának fokát jelzik. Nem ismert az sem, hogy mennyiben vesz részt az immunrendszer celluláris illetve humorális ága a sejtek illetve szövetek károsításában. Az utóbbi években kerültek a figyelem középpontjába a hősokkfehérjék (hsp), mint minden sejtben kimutatható, immundomináns, konzervatív sejtalkotórészek. Az úgynevezett természetes autoimmunitás részeként mind humoralis, mind celluláris immunreakció kimutatható a hősokkfehérjék ellen egészséges egyénekben is, és úgy tűnik, hogy a hsp elleni antitestek és autoreaktív T sejtek egy bizonyos alacsony reaktivitású szintje szükséges lenne az immunhomeosztázis fenntartásához. A hősokkfehérjék elleni immunválasz tehát fiziológiás a normál immunhomeosztázisban, mindemellett számos kórképben feltételezhető a normálisnál fokozottabb, vagy éppen gyengébb hősokkfehérjék elleni immunreakció pathogenetikai szerepe, melynek oka a szabályozási mechanizmusok zavarában kereshető. Doktori munkám során a hősokkfehérjék elleni humorális immunválaszt vizsgáltam különböző autoimmun betegségekben, remélve, hogy ezáltal közelebb kerülhetünk az immun-mediált kórképek természetének megismeréséhez, a természetes autoimmunitás pontosabb megértéséhez, esetleg új, az eddiginél hatékonyabb terápiás lehetőségek felfedezéséhez. 6

7 4. IRODALMI HÁTTÉR 4.1. A hősokkfehérjék általános jellemzői A hősokkfehérjéket, mint hőmérsékletemelkedés hatására indukálódó sejtkomponenseket először Drosophilában írták le (1). Filogenetikailag, funkcionális és immunológiai szempontból rendkívül konzervált molekulák, melyek esszenciálisak a sejtek életműködéséhez. Megtalálhatóak a baktériumoktól a növényi és állati sejteken át az emberig minden élőlényben, funkciójuk igen hasonló, és egyes tagjai jelentős (több mint 50%-os) aminosav szekvencia homológiát mutatnak a különböző fajok között. Legfontosabb szerepük a fehérjeszintézisben van, a fehérjéket végigkísérik a nascens láncok szintetizálódásától multimer komplexek összeállásáig, ezért molekuláris chaperonoknak is nevezik őket (2). Konstitutív és indukált formájuk ismert, az előbbiek fiziológiás körülmények között vesznek részt a fehérjeszintézisben és transzportban, az utóbbiak pedig a sejteket érő stresszhatások (hyperthermia, anoxia-reoxigeizáció, reaktív oxigén gyökök akkumulációja, gyógyszerek, nehézfémek, etanol, vírus- és baktériumfertőzések) idején segítik a sejtek túlélését (3, 4). Fiziológiás körülmények között a hősokkfehérjék hozzákapcsolódnak a transzlokációra váró fehérjékhez, elősegítik az ehhez szükséges szerkezetváltozásokat (folding-unfolding), majd elkísérik a fehérjéket a rendeltetési helyükre és itt leválnak róluk. Stresszhatás esetén megkötik a denaturálódott saját fehérjéket ezzel megelőzve a cascade denaturatiót, illetve olyan morfológiai és anyagcsere változásokat idéznek elő, amelyek eredményeképpen a sejt a további stresszhatásokra rezisztenssé válik. Különböző vírus-, bakterialis- és parazita fertőzések során proteázként működnek, és ATP-áz aktivitásuk révén az idegen fehérjék denaturációjában is részt vesznek (2). A hősokkfehérjék expresszálódását fokozó különböző ágensek hatásának mechanizmusa hasonló: a sejtlégzés megzavarásával, következményes szabadgyök felhalmozódással oxidatív stressz útján okoznak hsp indukciót. A szabadgyökök nukleinsavakkal, lipidekkel és egyéb sejtkomponensekkel reakcióba lépve olyan denaturált vagy aberráns molekulák képződéséhez vezetnek, melyeknek felszaporodása a hsp gének aktiválódásához vezet (4). Molekulatömegük alapján alcsaládokra oszthatóak, ezek közül a legfontosabbak és legismertebbek a hsp60, hsp70 és hsp90 alcsaládok. További vizsgálatok folynak még a 20kD körüli, illetve a magas, 100kD körüli molekulatömegű hsp családok szerepe és jelentősége vonatkozásában. Az egyes családok fő tulajdonságait az 1. táblázat foglalja össze. 7

8 Lokalizáció Fő funkciók Működés Lokalizáció Fő funkciók Működés Lokalizáció Fő funkciók Működés Hsp60 család mitokondrium, citoplazma, szekretoros granulumok, növényi kloroplaszt sejtkomponensek összeszerelése, fehérjék konformációjának kialakítása, oligomerek összeszerelése, a fehérjék membránba illesztése és proteolízishez való előkészítése homo-oligomerként aktívak ATP-áz aktivitással rendelkeznek, egy belső üregben kötik meg a fehérjéket, ahol lehetőséget adnak a megfelelő szerkezetváltozások kialakulásához, és a kész fehérje távozik, melyet ATP hidrolízis kísér Hsp70 család mitokondrium, citoplazma, endoplazmás retikulum nascens fehérjék fogadása, riboszomális összeszerelése, fehérje transzport, klatrin szétszerelés, fehérjék lizoszomába terelése, topoizomeráz védelme a sejtmagban, a sejt szerkezeti elemeihez kötődve (tubulin, kalmodulin, vimentin) a sejtfelépítésben való részvétel monomerként aktívak Nem ölelik körül az egész fehérjét, csak kis peptid szakaszt (3-4AS) képesek megkötni, gyakran két ponton is kötik a fehérjéket, így húzva szét őket a megfelelő állapotba. Főleg hidrofób felszíneket ismernek fel, ezekkel komplexet képezve védelmet nyújtanak az aggregáció ellen. Hsp90 család citoplazma fehérjékhez (pl. tirozin kinázok, szteroid hormon receptorok) kötődve azok konformációjának stabilizálása, aktiválása dimer formában asszociálva bizonyos proteinekkel aktívak 1. táblázat: A legismertebb hősokkfehéreje alcsaládok legfontosabb jellemzői A hsp molekulák gyakran egymással interakcióban, egymást kiegészítve vesznek részt fiziológiás körülmények között a fehérjék szintézisének, transzportjának bonyolult és többlépcsős folyamatában, valamint stressz szituációban a sejtek homeosztázisának fenntartásában (2, 3). 8

9 4.2 Autoimmunitás Természetes autoimmunitás Az immunrendszer fő funkciója a szervezet védelme a káros környezeti faktorokkal, fertőzésekkel és toxikus anyagokkal szemben. Elméletileg tehát potenciálisan elegendő lenne antitesteket és T sejteket termelnie a környezeti, exogén, idegen antigének ellen. Ennek ellenére, meglepő módon az immunrendszer saját antigénekkel reagáló immunsejteket és antitesteket is produkál, fiziológiás körülmények között is. Ezek az antitestek felismernek nemcsak keringő és sejtfelszíni antigéneket, de a sejtek belsejében lévő organellumok antigénjeit is. Az elsődleges immunválasz antitestjeihez hasonlítanak, IgM izotípusba tartoznak, kicsi az affinitásuk a saját antigénekhez, az auto- és idegen antigéneknek széles skálájához kötődnek, még csekély strukturális homológia esetén is. Megfigyelték, hogy leggyakrabban konzervatív, jelentős biológiai funkciójú antigénekkel reagálnak (hősokkfehérjék, enzimek, sejmembrán komponensek, citoplazmatikus fehérjék, sejtmag alkotóelemek, plazmafehérjék, citokinek, hormonok). A természetes autoimmunitás útján a szervezet immunrendszere az alapvetően fontos, nélkülözhetetlen biológiai rendszereket és molekulákat védi. Feltételezhetően ezeknek az autoantitesteknek a sejtek metabolikus folyamatai során keletkező degradációs termékek eltávolításában van szerepük, így hozzájárulnak az általános homeosztázis fenntartásához. A természetes autoimmun reakciónak védő szerepe lehet autoimmun betegségek kialakulásával szemben is, mivel azelőtt biztosítja a felszabadult autoantigének eltakarítását, illetve lefedését, mielőtt még valódi autoimmun betegség kialakulhatna (5) Pathogén autoimmunitás, autoimmun betegségek kialakulása Az autoantitestek egy másik típusának szerepe lehet bizonyos betegségek pathogenezisében. Ezek az autoantitestek IgG típusúak és magas affinitással kötődnek az antigénekhez. Nem szükségszerűen monospecifikusak, keresztreagálhatnak struktúrálisan homológ molekulákkal (5). Direkt pathogén szerepük többféleképpen bizonyítható, például a betegség indukálhatóságával az autoantitesteket egészséges egyéneknek adva vagy kísérleti állatokat immunizálva a kérdéses autoantigénekkel illetve annak részeivel. Szintén a pathogén szerep mellett szól, ha az antitesteket sikerül izolálni az érintett szervekből, vagy ha azok keringő formája korrelál betegség klinikai manifesztációival. 9

10 Arra vonatkozóan, hogy mikor, és miért fordul az immunrendszer a saját szervezet ellen olyan formában, hogy az autoimmun betegség kialakulásához vezet, számos hipotézis létezik. A legelfogadottabb teóriákat példákkal illusztrálva a 2. táblázat foglalja össze (6). Az autoimmunitásért felelős mechanizmus Az immunrendszertől elzártan fejlődő szervek sérülés vagy gyulladás következtében kapcsolatba kerülnek az immunrendszer sejtjeivel Molekuláris mimikri teória: Fertőzések során a bakteriális illetve virális antigének ellen képződött ellenanyagok keresztreagálnak a hasonló saját antigénekkel A saját antigén szerkezetének megváltozása mutáció vagy haptén kötődése révén Autoimmun betegség Szimpátiás ophtalmia Autoimmun encephalitis Diabetes mellitus Rheumatoid arthritis Graves-Basedow kór Gyógyszer indukálta autoimmun betegségek (SLE) 2. táblázat: Az autoimmun betegségek kialakulásának feltételezett fő mechanizmusai A különböző autoimmun betegségek pathogenezisének egy lehetséges magyarázata a molekuláris mimikri teória. A hipotézis alapja az az epidemiológiai, klinikai és experimentális megfigyelés, hogy külünböző fertőzések és autoimmun betegségek gyakran egyszerre fordulnak elő, és hogy keresztreaktivitást észleltek saját antigének és bizonyos mikrobiális antigén determinánsok között. Ezen determináns ellen irányuló immunválasz szövetspecifikus immunreakciót indíthat be, mely sejt- és szöveti destrukciót jelenthet, feltételezetten citotoxikus keresztreagáló effektor lymphocyták és antitestek útján, melyek felismerik a kritikus epitópokat a target sejteken. A keresztreakció indukciójának nem feltétele a kiváltó ágens jelenléte, az immunmodulált károsodás bekövetkezhet a kórokozó eliminálódása után is, ezt nevezik hit-and-run teóriának. Más szóval, a vírus vagy mikróba, mely eredetileg kiváltotta az autoimmun választ, nem biztos, hogy jelen van a betegség kialakulásakor is. Az is elképzelhető, hogy a fertőzés hatására létrejövő sejtkárosodás során olyan saját antigének szabadulnak fel, melyek autoimmun választ váltanak ki, és az így aktiválódó antitestek és T sejtek keresztreagálnak egyéb, hasonló antigénekkel is (7). 10

11 A pathogenetikai jelentőséggel bíró autoantitestek és a természetes antitestek tulajdonságaiban és természetében lévő nyilvánvaló különbségek ellenére számos adat szól amellett, hogy ezek szoros kapcsolatban állnak és keresztreagálnak egymással, sokszor a határvonal az antitestek e két populációja között egyáltalán nem éles Hősokkfehérjék elleni immunitás A hősokkfehérjék elleni immunitás fiziológiás szerepe A természetes autoimmunitás részjelenségeként mind humoralis, mind celluláris immunreakció kimutatható a hősokkfehérjék, mint konzervatív és immundomináns fehérjék ellen egészséges egyénekben is, és úgy tűnik, hogy a hsp elleni antitestek és autoreaktív T sejtek egy bizonyos alacsony szintje szükséges és protektív lenne. A hősokkfehérjék elleni immunválasz tehát fiziológiás a normál immunhomeosztázisban. Fontos szerepe van különböző infekciók során a szervezet védelmében. A szervezetet érő különböző fertőzések hatására a kórokozók eliminálása céljából aktiválódó immunválaszt vizsgálva kiderült, hogy annak fontos része a mikrobialis hősokkfehérjék elleni reakció, és a hsp-k erősen immundomináns antigénként viselkednek a fertőzések során. Először Mycobacterium tuberculosis és M. leprae fertőzések esetén bizonyították, hogy a fertőzött egyénekben a kórokozó hatására indukálódó T sejtek/antitestek egy része hősokkfehérjék ellen irányul (8, 9). Később számos egyéb fertőzésben sikerült kimutatni a kórokozó hősokkfehérjéi elleni antitesteket és T sejteket, pl. Onchocerca (10), Plasmodium (11), Trypanososma (12), Schistosoma (13) fertőzésekben. Jelentős keresztreaktivitást észleltek a különböző pathogénekből származó hősokkfehérjék között és az aminosav analízis kiterjedt szekvencia-homológiát igazolt (14). Ugyanakkor mycobacterialis hsp65-tel reagáló proliferációra képes és citotoxikus T sejt klónokat egészséges kontrollokból is sikerült izolálni (15). Valószínűleg a hősokkfehérjék immundominánsak mind egészséges, mind fertőzött egyénekben, mivel széles körben jelen vannak és expresszálódnak nemcsak a pathogén, de az ártalmatlan mikroorganizmusokban is. Különösen kedvezőtlen körülmények között, melyek egy gazdaszervezetben adottak a kórokozó számára (16). A hősokkfehérjék elleni immunválasz szerepe infekciók esetén kettős lehet. Egyrészt része lehet a pathogén microorganizmus eliminálásában. A reakció gyorsasága miatt ez a védekezés első vonalát jelentené, megelőzve a lassúbb kórokozó-specifikus immunválasz kifejlődését. (16) Nemrég fedezték fel, hogy a T sejtek egy része úgynevezett T sejt, melyek a hsp-ket MHC nélkül is képesek felismerni. Feltételezik, 11

12 hogy ezek a sejtek felismerik mind a gazdaszervezet stresszelt sejtjeinek, mind a fertőző ágensnek fokozottan expresszált hősokkfehérjéit. Elképzelhető, hogy ezek a T sejtek egy ún. protektív ablak periódust jelentenének a gazdaszervezet számára a microorganizmusokkal szemben mindaddig, ameddig beindulnak az MHC prezentálást igénylő T sejtek aktiválódását jelentő pathogén-specifikus immunreakciók (17). A különböző élőlények hősokkfehérjéi között fennálló magas szekvenciahomológia lehetővé teszi, hogy a T sejtek a fertőző microorganizmusok és károsodott sejtek széles skáláját felismerjék és eliminálják. Ezen elmélet mellett szól a a T sejtek lokalizációja is, az immunvédekezés első vonalában, a bőr- és a gastrointestinalis nyálkahártya felszíni rétegeiben helyezkednek el. Ebben a tekintetben tehát a hősokkfehérjék elleni immunválasz jól működő immunrendszer esetén kifejezetten hasznos lenne, és eddig ismeretlen tényezők hatására fordul a szervezet saját sejtjei ellen (17). A saját hsp epitópok ellen irányuló immunválasznak ugyanakkor szerepe lehet az infekció illetve egyéb stresszhatások közben transzformált, stressznek kitett saját sejtek eliminálásában is, mivel ezek a sejtek feltételezés szerint a normál sejteknél több felszíni hsp molekulát expresszálnak (16) A hősokkfehérjék elleni immunitás pathogén szerepe Számos kórképben feltételezik a hősokkfehérjék elleni immunreakció pathogenetikai szerepét, melynek oka a szabályozási mechanizmusok zavarában kereshető. Néhány bizonyíték, mely a hősokkfehérjék autoimmun betegségek kialakulásában való részvétele mellett szól: 1. Állatkísérleti modellekben hősokkfehérjék vagy peptidjeik kívülről történő adagolásával befolyásolni lehet bizonyos autoimmun betegséget, az adagolás módjától és időpontjától függően betegséget indukálva vagy éppen ellenkezőleg, szupresszálva. Erre legismertebb példák a patkányok adjuváns arthritise illetve a NOD egerek diabetese. Ezekben a modellekben beteg állatokból vett hsp60 reaktív T sejtekkel átoltható volt a betegség (18, 19) 2. Hsp reaktív T sejteket sikerült izolálni bizonyos autoimmun betegségben: rheumatoid arthritisben synovialis folyadékból (20), nyulak atheroscleroticus lézióiból (21). 12

13 3. Perifériás, keringésben lévő hsp reaktív T sejteket mutattak ki rheumatoid arthritisben (22) 4. Számos autoimmun betegségben írtak le hősokkfehérje elleni antitesteket (pl. SLE, diabetes mellitus, sclerosis multiplex, szisztémás sclerosis). 5. Emelkedett hsp expressziót írtak le több autoimmun betegség gyulladásos léziójában (arthritisek, SM, SLE, 1-es típusú diabetes mellitus, atherosclerosis, Grave s betegség, krónikus gastritis, psoriasis) (23) Ezeket az adatokat azonban kellő óvatossággal kell értékelni, mivel hsp specifikus antitestek és T sejtek egészséges emberekben is kimutathatóak, puszta jelenlétük tehát nem magyarázza az autoimmun betegség kialakulását. Gyulladásos laesiókban illetve az érintett és károsított szervekben való fokozott expressziójuk sem bizonyít feltétlenül oki kapcsolatot a betegség kialakulásával, részben mert csak egyes esetekben (SM oligodendrocyták, krónikus gastritis gyomor epithelium) sikerült a hsp-k felszíni expresszióját is kimutatni, másrészt pedig a fokozott expresszió magyarázható lehet a sejteket érő stresszhatással is, így inkább következmény, mint ok lehet (23). A fentebb elmített, infekciók során kialakult hősokkfehérjék elleni immunreakció is fordulhat kóros irányba akkor, ha a szabályozási mechanizmusokban valami hiba történik (16). A bakteriális és humán hsp-k közötti magas szekvencia-homológia a fertőzések hatására indukálódó és stimulálódó T lymphocyták keresztreagálnak a saját hsp molekulákkal (melyek a stresszhatás miatt egyébként fokozottan expresszállt állapotban vannak). A közös epitópok infekció alatti kiterjedt prezentációja miatt a saját molekulák irányában fennálló tolerancia csökkenhet, így autoimmun betegség alakulhat ki (23). A normál autoimmunitásnak pathogén irányba történő progressziójáért a fertőzést követő gyulladás során termelődő különböző cytokinek egyensúlyában bekövetkezett zavart tartják fontosnak, számos autoimmun betegségben jellegzetesen proinflammatorikus cytokinek termelődését mutatták ki (IFN-gamma, IL-1). Az infekciók során termelődő citokinek profiljának tanulmányozása segítheti a postinfekciós autoimmun rekciók káros következményeinek megelőzését (24). Mindemellett a hsp molekulák széles elterjedtségét ismerve (minden sejtben megtalálhatóak) nehezen magyarázható az egyes autoimmun betegségekben észlelhető szerv- illetve szövetspecificitás. Egyes magyarázatok szerint molekuláris mimikri állna fenn különböző hsp molekulák és bizonyos szerv- illetve szövet-specifikus antigének között. Jones és munkatársai a humán hsp60 molekula szekvenciájában számos olyan peptid szakaszt írtak le, amelyek magas homológiát mutatnak bizonyos 13

14 autoantigénekkel. Ezen szövetspecifikus proteinek illetve hsp60 epitópok közötti keresztreaktivitás az autoimmun reakció magyarázatául szolgálhatna. Néhány gyakoribb autoimmun betegséget és a feltételezett autoantigént, illetve a hsp60-nal homológ aminosavszakaszokat a 3. táblázatban foglalom össze. Ismert autoantigén AA Autoimmun betegség Hsp60 aminosav régió glutaminsav dekarboxiláz es típusú diabetes mellitus thyreoglobulin Hashimoto thyreoiditis myeloperoxidáz glomerulonephritis 1-17 KU autoimmun antigén scleroderma bullosus pemphigoid Ag pemphigoid citokeratin rheumatoid arthritis myelin-asszociált protein sclerosis multiplex citokróm p krónikus aktív hepatitis 7-21 piruvát dehidrogenáz primer biliaris cirrhosis hidroxiláz Addison kór táblázat: Autoimmun betegségek, melyekben a feltételezett autoantigének egy-egy peptidszakasza magas szekvenciahomológiát mutat a hsp60 egy-egy epitópjának aminosavszekvenciájával. A molekuláris mimikri teória szerint a hsp elleni antitestek keresztreagálnak a hasonló szekvenciájú szövetspecifikus antigénekkel, és ez a reakció szerepet játszhat különböző szervspecifikus autoimmun betegségek pathogenezisében. Az egyes egyének MHC II. molekuláiban megjelenő individuális különbözőségből eredően egy-egy infekció során más-más hsp epitóp kerülhet prezentálásra, ennek megfelelően más-más target antigén és autoimmun betegség manifesztálódhat (25). Ugyanakkor az is elképzelhető, hogy a hsp reaktív T sejtek és antitestek nem a primer immunfolyamat elindítói, hanem csak a már folyamatban lévő és előrehaladó autoimmun destrukció fokozói lennének. A gyulladás helyén lévő sejtek ugyanis a stresszhatások miatt fokozottan expresszálnak hősokkfehérjéket, azok pedig az immunrendszer targetjeivé válnak (23). 14

15 Hősokkfehérjék elleni immunreakcióra vonatkozó irodalmi adatok szisztémás autoimmun betegségekben Számos állatkísérleti eredmény és humán vizsgálat utal arra, hogy a hősokkfehérjék elleni immunreakciónak szerepe lehet bizonyos autoimmun betegségek pathogenezisében. Ezek közül a szisztémás autoimmun kórképekre koncentrálva emelek ki néhányat: M. bovis hsp65 reaktív T sejtekkel sikerült irradiált, naív patkányokban adjuváns arthritist indukálni (26). Krónikus arthritisben szenvedő betegek synovialis folyadékából származó lymphocyták között kimutattak hsp65 reaktívakat is (27). A hsp65 kulcs epitópjaként egy 9 aminosavból álló peptid szakaszt sikerült izolálni ( ) a M. bovis hsp65 szekvenciájában (28). Meglepő módon ez a szakasz a molekulának nem konzervált része, nem találtak szekvencia hasonlóságot a mycobacterialis és emlős változatok között (29). Megfelelően a mycobacteriális peptid és a humán porc elleni T sejtek között észlelt keresztreaktivitásnak homológia volt viszont a peptidszakasz és porcszöveti proteoglikán egy szakasza között (30). Danieli és mtsai immunreaktivitást mutattak ki a mycobacterialis hsp65 és peptidje ellen juvenilis rheumatoid arthritisben szenvedő betegekben, ugyanezen betegségben szenvedő felnőttekben viszont nem. Ez a juvenilis és felnőttkori variáns különböző etiológiáját bizonyíthatja (31). Krónikus arthritisben szenvedő betegekben megfigyeltek magas anti-hsp65 antitest szintet is (32). Szintén emelkedett anti-hsp65 titert írtak le rheumatoid arthritisben illetve emelkedett anti-hsp70 és 90 szérumszinteket spondylosis ankylopoeticában és SLE-ben (33, 34). Tsoulfa és mtai is hasonló eredményeket kaptak: szignifikánsan magasabb IgG és IgA anti-m. bovis hsp65 szinteket detektálatak rheumatoid arthritises betegek szérumában összehasonlítva egészségesekben, SLE-ben, tuberculosisban, spondylosis ankylopoeticában és Crohn betegségben szenvedő betegekkel (35). Vannak viszont olyan tanulmányok is, melyekben ellenkező eredményeket kaptak: nem észleltek szignifikáns különbséget az anti-hsp65 és70 szintekben rheumatoid arthritises, SLE-s és egészséges egyének között (36, 37). Experimentális arthritis modellekeben (kollagén II. arthritis, adjuváns arthritis, olaj indukálta arthritis) írták le, hogy a hsp65 elleni humorális immunválasz kialakulásához a normál bakterialis bélflóra épsége szükséges. Ugyanezen modellekben germ free állatokban is észleltek súlyos arthritises választ humoralis immunreakció nélkül, ebből arra következtethetünk, hogy a hsp65 elleni humoralis immunitásnak nincs szerepe a betegség kialakulásában (38). Panchapakesan és mtsai rheumatoid 15

16 arthritises betegekben emelkedett anti-hsp65 IgM és anti-hsp70 IgG szintet, SLE-s betegekben pedig emelkedett anti-hsp65 IgM szintet írtak le (39). Az Escherichia coli hsp60 elleni antitest titert is magasabbnak írták le rheumatoid arthritisben és néhány egyéb kötőszöveti betegségben, és feltételezték hogy ez a betegek bélmicroorganizmusokkal való fertőzöttségének köszönhető (40). Gruber és mtsai szignifikánsan magasabb M. bovis hsp65 elleni antitest szintet mértek vasculititses és arteriosclerosisos betegekben egészséges kontrollokénál. SLE-ben szintén magasabb volt az antitest titer, de a különbség nem volt szignifikáns (41). Latchman és mtsai quantitatív ELISA módszerrel SLE-s betegek 26%-ában írtak le emelkedett hsp90 elleni IgM antitest szintet és 35%-ban IgG típusút. Ezeket az antitesteket nem tudták detektálni egészséges kontrollokban, rheumatoid arthritisben és sclerodermában szenvedő betegekben. A hsp70 elleni antitest szintben nem észleltek különbséget a vizsgált csoportokban, ezt kapcsolatba hozták azzal a megfigyeléssel, hogy SLE-s betegekből származó lymphocytákon és monocytákon a hsp90 molekula fokozott felszíni expresszióját észlelték, ugyanez nem volt megfigyelhető a hsp70 és 60- molekulákra vonatkozóan (42). Arora és mtsai rekombináns Leishmania donovani hsp70 elleni antitestek előfordulásának gyakoriságát mérték SLE-s betegekben és nem találtak lényegi eltérést a kontroll és beteg egyének között, így feltételezik, hogy ennek az antitestnek nincs szerepe a betegség pathogenezisében (43). Emelkedett IgG antitest szintet észleltek a konstitutív bovin 73kD-os hősokkfehérje ellen rheumatoid arthritises, sclerodermás és kevert kötőszöveti betegségben (MCTD) szenvedő betegek szérumában. Az antitestek felismerték a humán konstitutív hsp73-t is, de az indukálható hsp72-t nem. Kiemelkedően magas antitestszinteket észleltek MCTD-ben, és felvetették, hogy ebben a kórképben az anti-hsp73 antitest akár új diagnosztikus markerként is használható lenne (44) Hősokkfehérjék elleni immunreakcióra vonatkozó irodalmi adatok 1-es típusú diabetes mellitusban A hősokkfehérjék elleni humorális immunválaszt diabetes mellitusban eddig kevesen vizsgálták, az eredmények ellentmondásosak. Tun és mtsai emelkedett M. bovis hsp65 elleni antitest szintet mértek néhány pre-diabeteses ikerben illetve frissen diagnosztizált 1-es típusú diabeteses betegben, de az antitest szintek medián értéke nem különbözött szignifikánsan a kontroll egészségesekétől (45). Atkinson és mtsai nem találtak arra utaló jelet, hogy a hősokkfehérjék (hsp65, 70 és 90) elleni humorális immunreakciónak 16

17 szerepe lenne diabetes mellitusban (46). Ozawa és mtsai írták le, hogy japán populációban 1-es típusú diabetes mellitusban a hsp60 elleni atitestek előfordulása és átlag értéke szignifikánsan magasabb volt az egészséges kontrollokban mértnél (47). Child és mtasi viszont alacsonyabb hsp65 szintet mértek 1-es típusú diabetes betegekben mint egészségesekben, az esetszámuk azonban elég alacsony volt (48). Figuerdo és mtsai írták le, hogy diabetesesekben az IgG és IgM típusú anti-hsp70 szintek nem különböztek a kontrollokétól, viszont az IgA típusúak szignifikánsan magasabbak voltak 1-es és 2-es típusú diabetesesekben is (49). Számos kórképben írták tehát le a hősokkfehérjék elleni humorális illetve celluláris immunreakció jelenlétét, mindezen viszgálatok azonban inkább csak leíró-megfigyelő jellegűek. Arra vonatkozóan, hogy lézió helyén vagy a keringésben lévő hsp reaktív T sejtek vagy antitestek pathogének, protektívek vagy éppen hatás nélküliek-e, csak elméletek illetve spekulációk léteznek. Egyértelmű az is, hogy egészséges emberekben is megfigyelhetőek mind autoreaktív T sejtek mind hsp elleni antitestek. Csak találgatni lehet, hogy a normál immunválasz mikor, milyen tényezők hatására fordul át kóros autoimmunitásba, de bizonyára az MHC haplotípusnak, a potenciális autoantigén jelenlétének és környezeti faktoroknak szerepe lehet ebben (50) C1q elleni antitestek autoimmun kórképekben A C1q a komplement rendszer klasszikus reakcióútjának első komponense. Erősen kationos 460kD molekulatömegű glikoprotein, egy N terminális kollagénszerű farokból és egy karboxil végen elhelyezkedő nyitott virágcsokor szerű fejből áll, ez utóbbi az antitest-kötőhely. Kötődik az immunkomplexekhez, megakadályozza aggregációjukat és solubilis formában tartja őket. A C1q receptor a kollagénszerű faroknál köti meg a C1q molekulát. C1q elleni antitestek jelenlétét először 1984-ben írták le (51) SLE-s betegek szérumában. Az antitest csak a szilárd fázishoz kötött C1q-val reagál, így jön ugyanis létre az a konformációváltozás, melynek eredményeképpen a kötő epitóp megjelenik. Felmerült a kérdés, hogy mi lehet az oka a C1q elleni antitestek keletkezésének. A legelfogadottabb elképzelés szerint a perzisztens vagy rekurráló komplement aktiváció eredménye lenne. A komplementrendszer aktiválódása során C1q kötődik az immunkomplexekhez, melyet C1r 2 C1s 2 kötődés követ, ez utóbbi lépés C1 inhibitor által kontrollált folyamat. A C1r 2 C1s 2 disszociációja után a C1q továbbra is kötve marad, a 17

18 molekula kollagénszerű farka konformációváltozás miatt szabaddá válik. Fogékony egyénekben secunder humoralis immunválasz lép működésbe és antitestek termelődése indul meg a molekula ellen (52). A C1q antitestek első leírása óta az SLE mellett számos kórképben igazolták emelkedett szintjét, sőt egészséges egyének egy részében is jelen van. Azokat a kórképeket, amelyekben emelkedett C1q antitest szintet írtak le, a 4. táblázatban foglalom össze (52-54). Ezek közé elsősorban olyan szisztémás betegségek tartoznak, ahol keringő immunkomplexek nagy mennyiségben vannak jelen a keringésben, és ezeknek a betegségek pathogenezisében is jelentőséget tulajdonítanak. Az immunkomplexek lerakódásának leggyakoribb helyei a bőr és a glomerulusok mikrovaszkulatúrája, így ezekeben a kórképekben bőr- és veseérintettséggel gyakran találkozunk. A C1q elleni antitestek pathogenetikai szerepére vonatkozóan több elmélet létezik. Mind a keringésben mind lokálisan amplifikálják az immunkomplexek kialakulását, megnövelik méretüket, és a fokozott komplementaktiváció gyulladáshoz vezet. Az antitestek befolyásolhatják a teljes C1 komplex működését, vannak adatok mind a komplex aktivitásának csökkenése, mind növekedése mellett. Egyes szerzők nem észleltek változást a komplex működésében az antitestek jelenlétével összefüggésben. Az antitestek jelenléte befolyásolhatja a C1q-C1q receptor kötődést is, befolyásolva ezzel a C1q hatásait. Egyes elképzelések szerint nem vethető el a kollagén II molekulával adott keresztreakció lehetősége sem, bár ezt kevés adat támasztja alá (53, 54). 18

19 Betegcsoportok anti-c1q IgG (%) anti-c1q IgA (%) Hypocomplementaemiás urticariás vasculitis szindróma Membranoproliferativ glomerulonephritis MCTD Felty szindróma Szisztémás lupus erythematosus Rheumatoid vasculitis Polyarteritis nodosa Sjögren szindróma Spondylosis ankylopoetica Rheumatoid arthritis Szisztémás sclerosis IgA nephropathia Membranosus glomerulopathia Wegener granulomatosis Egészséges kontrollok táblázat: C1q elleni antiestek előfordulása különböző autoimmun- és vesebetegségekben 19

20 SLE-s betegekben a C1q elleni antitesteknek számos különböző klinikai és laboratóriumi paraméterrel vizsgálták a kapcsolatát. Pozitív korrelációt észleltek a nephritissel, dermatitissel, hypocomplementaemiával, anti-dsdna antitest szinttel, a keringő immunkomplexek mennyiségével és a vörösvértest süllyedéssel. Negatív korrelációt írnak le a C1q szinttel, C3 és C4 szintekkel és a központi idegrendszeri tünetekkel. Nem észleltek korrelációt a hemoglobin szinttel, fehérvérsejt számmal, thrombocyta számmal, bőr-, ízületi- és serosa érintettséggel. Ellentmondásosak az eredmények a szérum kreatinin szintet illetően, egyesek negatív korrelációt írtak le, mások nem észleltek összefüggést (55, 56). A veseérintettség és a C1q ellenes antitestek szintjének kapcsolatára vonatkozóan szintén ellentmondásos eredményeket közöltek. Magas C1q antitest titert írtak le aktív lupus nephritisben (55), és a magas antitest szint előrejelezte a lupus nephritis relapsusát (56, 57). Trendelenburg és mtsai eredményei szerint a C1q antitest pozitivitás SLE-ben 100%-os negatív prediktív értékű, C1q negatív SLE-s betegekben nem fordult elő nephritis (58). Ugyanakkor két különböző munkacsoport is beszámolt arról, hogy nem találtak korrelációt sem a C1q antitestek jelenléte, sem titere és az SLE szervi manifesztációi között, beleértve a nephritist is. Vizsgálták az IgG típusú C1q elleni antitestek alosztályspecificitását is, az eredmények ellentmondásosak. Egyes eredmények szerint különböző kórképekben az eloszlás megegyezett a normál szérumban észlelttel, míg mások SLE-ben az IgG2, membranoproliferatív glomerulonephritisben IgG3 alosztályú antitestek dominanciáját írták le C1q- és 60- illetve 65kD-s hősokkfehérjék elleni antitestek keresztreakciója Korábban Prohászka Z. és mtsai szoros pozitív korrelációt mutattak ki HIV fertőzött betegek szérumában található C1q és hsp60- (p<0.0001) illetve C1q- és hsp65 elleni antitestek (p=0.0023) szintje között (59). Összehasonlítva ugyanezen betegekben a C1q antitest pozitív illetve negatív csoportokat, a C1qAt pozitívakban szignifikánsan magasabb volt mindkét hősokkfehérje elleni antitest titere. Megvizsgálták, hogy a poliklonális anti-c1q antitestek mutatnak-e keresztreakciót 60kD-s hősokkfehérjékkel. ELISA kísérleti rendszerben szilárd fázishoz kötött hsp60 és hsp65 molekulákhoz dózisfüggően kötődött a kecskében termelt anti-humán C1q antitest, míg a kontrollként használt egyéb komplementfehérjék (C4b, C1-inhibitor) ellen termelt antitestek nem mutattak kötődést. Ezután epitóp-analízist végeztek: a M. bovis hsp65 molekula 9 feltételezetten epitópként funkcionáló szakaszát választották ki és polietilén tűk hegyén 20

21 szilárd fázisú peptidszintézissel 5 aminosavanként átfedő peptidsorozatokat hoztak létre. Pin ELISA módszerrel a kilenc lefedett hsp65 szakasz közül három esetében találtak C1q antitestekkel reakciót mutató peptideket. A kötődés specifikus volt, mivel tisztított C1q molekulával gátolni tudták. A keresztreakció jelentősége még nem teljesen egyértelmű, magyarázatára további kísérletek vannak folyamatban (59) Az 1-es típusú diabetes mellitus etiopathogenezise Az autoimmun eredetű 1-es típusú diabetes mellitus kialakulásának négy stádiumát különböztetjük meg. Az első stádium a genetikai fogékonyság állapota. A második stádium a triggertényezők behatása, mely többnyire ismeretlen, mai ismereteint szerint lehet valamely vírusfertőzés (coxsackie, mumps, rubeola), vagy a korai tehéntejtáplálás bevezetése. Ezt követi a harmadik stádium, az immunológiai abnormalitások időszaka, melynek során a béta sejtek tömege az autoimmun destrukció miatt fokozatosan csökken. Erre a stádiumra jellemző a szigetsejt specifikus citotoxicus T sejtes reakció, az insulitis. Ebben az időszakban számos szigetsejt ellenes antitest is kimutatható (ICAislet cell antibody, GADA-glutamic acid decarboxylase antibody, IA-2 azaz 2-es számú szigetantigén- tirozin foszfatáz ellenes antitest, insulin ellenes antitestek, glikolipidek elleni antitestek, carboxypeptidase H elleni antitest), a feltételezett autoantigének száma egyre növekszik, ezek közé sorolhatóak a hősokkfehérjék is. A szigetsejtek direkt pusztításáért valószínűleg inkább a celluláris immunreakció tehető felelőssé. Az antitestek szerepe mindezidáig nem tisztázott, prediktív értékük viszont bizonyított. Az antitest pozitív, de még egészséges személyekben bizonyítottan gyakrabban alakul ki diabetes, mint az antitest negatívakban. Ebben az időszakban már kimutatható a szigetsejtek inzulintermelő kapacitásának csökkenése, az első fázisú inzulinfelszabadulás kiesése, különböző fokú szénhidrát-anyagcsere-zavar kialakulása. Ha a béta-sejtek kb %-a elpusztul, akkor beszélhetünk a negyedik stádiumról, a manifeszt 1-es típusú cukorbetegség kialakulásáról. Az 1-es típusú diabetes mellitus pathogenezisét az 1. ábra foglalja össze. 21

22 1. stádium: genetikai fogékonyság (HLA DR3, DR4, DQ2, DQ8) 2. stádium: trigger tényező (vírus, korai tehéntej táplálás) 3. stádium: immunológiai abnormalitások (szigetsejt elleni antitestek és citotoxikus T sejtek, insulitis) 4. stádium: diabetes manifesztálódása 100% 10-20% 0% Működő szigetsejtek mennyisége 1. ábra: Az 1-es típusú diabetes mellitus kialakulásának stádiumai 4.7. P kd-os hősokkfehérje peptid szerepe diabetes mellitusban A p277 nevű 60 kd-os hsp peptidet Cohen és mtsai írták le 1991 ben (60). Állatkísérleti adatok alapján úgy tűnik, hogy az 1-es típusú, autoimmun pathomechanizmusú diabetes kialakulásában e peptidnek pathogenetikai jelentősége van. A p277 egy 24 aminosavból álló peptid, a hsp60 molekulának aminosavig tartó peptidszakasza. A peptid maga biológiailag instabil, oxidációra, aggregációra illetve egyéb kémiai folyamatokra érzékeny illetve hajlamos, oldatban 1-2 hónap alatt elveszíti biológiai aktivitását még -20 C-n tartva is. A 6. és 11. pozícióban lévő cysteinek valinnal történő helyettesítése az immunogenitást nem befolyásolva jelentősen növeli a stabilitást, így a kísérleti modellekben ezt használják. Az egér és a humán variáns 1 aminosavban különbözik, de immunológiailag teljes keresztreaktivitás áll fenn, állatkísérletekben is általában a humán peptiddel dolgoznak (61). A p277 peptidnek a diabetes mellitus pathogenezisében játszott szerepét illetve esetleges preventív és terápiás használhatóságát ezidáig főleg állatkísérleti modellekben vizsgálták. Az egyik modell állat az ún. NOD (non obes diabetic) egér, mely a humán 22

23 diabetessel kapcsolatos kísérletek leggyakrabban használt állatkísérleti modellje. Ezekben az állatokban spontán diabetes alakul ki. 4 hetes korban már kimutatható a kezdődő, enyhe insulitis, mely nőnemű egerekben progresszív folyamat, a szigeteket egyre több gyulladásos sejt infiltrálja, és hetes korban kialakul a manifeszt diabetes. 32 hetes korban nőnemű egerekben a diabetes incidenciája több mint 80%-os, hímneműekben valamivel kevesebb. A folyamat inzulin kezelés nélkül az egerek halálához vezet (62). A modellben számos saját antigén ellen mutattak ki mind humoralis, mind celluláris immunreaktivitást, a direkt károsodásért inkább a T sejteket tartják felelősnek, az antitesteknek a predikció szempontjából tulajdonítanak jelentőséget, pontos szerepük nem ismert. A legtöbb adat az insulin, GAD, hsp60 elleni autoimmun reakció pathogenetikai szerepét támasztja alá, mindhárom molekuláról leírták, hogy korai, prediabeteses stádiumban adagolva képes az autoimmun folyamatot pozitív irányba befolyásolni, azaz a betegséget megelőzni, vagy legalább enyhíteni, előfordulási arányát csökkenteni, vagy a manifesztáció időpontját késleltetni. A hsp60 és annak p277 peptidjének kulcsfontosságú szerepét a diabeteshez vezető autoimmun folyamatokban több tanulmány bebizonyította. Prediabeteses egerekben spontán T sejt válasz mutatható ki a hsp 60 molekula és a humán illetve egér p277 ellen, p277 elleni antitestek viszont spontán nem termelődtek (61). P277 elleni T sejtekkel a diabetest sikerült átvinni olyan egértörzsből származó állatokra, amely egyébként nem hajlamosak a betegségre (63). Ez arra utalna, hogy a peptidnek közvetlen szerepe lenne a primer immunfolyamatban, és az immunválasz nemcsak a szigetsejtek pusztulása utáni károsodásnak köszönhető fokozott autoantigén felszabadulás következmény lenne. Örök kérdés ugyanis a diabetesben felmerülő autoantigénekkel és ellenük irányuló immunfolyamatokkal kapcsolatban, hogy mi a primer kiváltó ok, és melyek a szekunder következmények, melyek azonban kétségtelenül a folyamat súlyosbodásához vezetnek. Amellett azonban, hogy a p277 (és hsp60) elleni immunreakciónak bizonyítottan szerepe van a betegség kialakulásában, megfigyelték azt is, hogy a peptid kívülről történő adagolásával befolyásolható a szigetsejtek elleni immunreakció. Az adagolás módjának, dózisának és időpontjának függvényében különböző eredményeket értek el. Prediabeteses stádiumban szubkután adagolással a NOD egerekben megelőzhető volt a diabetes (64) hetes korban adva az előrehaladott insulitist megállította, a humán és az egér variáns is effektívnek bizonyult (60, 65, 66). Kovalensen immunogén karrier molekulához kötve (ovalbumin, BSA) átmeneti enyhe diabetest indukált, mely később 23

24 megszűnt és az egér nem lett többé diabeteses (67). Nem konjugálva, karrier molekula nélkül adva megállította az autoimmun folyamatot anélkül, hogy hiperglikémiát indukált volna (67). Az effektív dózis 7 hetes korban ug volt, egyszeri szubkután adagolással. Ennél nagyobb dózissal nem értek el jobb hatást, és az egész molekula szükséges volt a megfelelő hatás eléréséhez, sem a molekula C, sem N terminálisa nem volt hatékony. Egy másik erősen immunogén peptiddel, a p278-al sem lehetett megelőzni a betegséget, pedig ez ellen is kimutatható spontán immunreakció NOD egerekben (68). A kezelés időpontjától függött a hatás. Ha 7 illetve 12 hetes korban adták, akkor egy egér sem pusztult el és az egerek több mint fele egészséges maradt. 15 hetes korban adva, amikor az egereknek már 50%-a diabeteses, sikerült a mortalitást szinte nullára csökkenteni és az egerek fele teljesen meggyógyult. Még 17 hetes korban is hatékony volt, amikor az egereknek már 80% diabeteses volt: 40. hétre 30% egészséges volt, 10% halt meg, szemben a BSA-val kezelt kontroll csoporttal, ahol 80%-os volt a halálozás (68). Vizsgálták a peptid kezelés hatását az insulitisre a szigetek szövettani analízisével: a peptiddel kezelt állatokban jelentősen enyhébb volt vagy egyáltalán nem alakult ki insulitis. A kezelés a T sejt rekativitást is befolyásolta, a kezelés hatására a 14. hét körül egy tranziens reaktivitás növekedés volt megfigyelhető, majd az aktivitás teljesen megszűnt (68). Egy másik kísérletben p277 kezelt egerekből 8 hónapos korban lépsejteket izoláltak és adoptálták 2 hetes NOD egerekbe, ezután a diabetes incidenciájának jelentős csökkenését észlelték a kontroll egerekhez képest. A kezelt állatokban nem voltak olyan T sejtek, melyekkel át lehetett adni a betegséget, míg a nem kezelt egerek T sejtjei képesek voltak diabetest indukálni. Kezelt és nem kezelt állatok T sejtjeit együtt adva megfigyelték, hogy a p277 terápián átesett egerek T sejtjei még szuppresszálták is a potens T sejtek diabetogén hatását: az így T sejteket kapott állatokban csökkent a diabetes incidenciája a pozitív kontrollokhoz képest (68). Felvetették a kérdést, hogy a p277-e az egyetlen olyan peptid, amelyet a diabetes terápiájára fel lehet használni, vagy minden olyan peptid effektív-e amely ellen spotnán T sejt válasz kimutatható. A hsp60 molekula átfedő peptidjeit szintetizálták meg (38db aminosavból álló, 5 aminosavval átfedő peptidet), és ezek között találtak még egy immunogén peptidet, ezt p12-nek nevezték el ( ), de ez ellen a peptid ellen nem észleltek spontán T sejt választ a prediabeteses stádiumban. 10 hetes NOD egereket kezeltek p277-el, p12-vel, a GAD65 molekula p35 nevű peptidjével és M. tuberculosis p278-al. Ezen peptidek mindegyike NOD egerekben immunogénnek bizonyult, ami azt jelenti, hogy adagolásuk után ellenük immun-válasz indukálódott. Spontán válasz 24

25 egyedül a p277 ellen és a M. tuberculosis p278 ellen volt észlelhető. A diabetes kialakulását csak a p277 és a p12 volt képes gátolni, és ezek a peptidek IgG1 és IgG2b típusú antitestek termelődését indukálták. A 7. hónapban a p277-tel kezelt egereknek 60%-a, a p12-vel kezelt egerek 50%-a nem volt hiperglikémiás. Ezzel szemben a p278- al és GAD35-el kezelt állatok 90%-a diabeteses volt ugyanebben az életkorban. A p277 és p12 peptidek elleni antitestek szintje 7 hónapos korban jelentősen emelkedett volt, izotípust tekintve az IgG1 és 2b domináltak. Minél magasabb volt ezeknek az antitesteknek a szintje, annál alacsonyabb vércukorértékek voltak megfigyelhetőek (69). NOD egerekben a p277 peptid Th2 típusú citokinek szintjének emelkedését idézte elő és down regulálta az egyéb béta-sejt antigének elleni autoimmunitást (69). Állatkísérletekben kimutatták, hogy mind a CD4+ helper, mind a CD8+ citotoxikus T sejtek felelőssé tehetőek az autoimmun destrukcióért. Az egér CD4+ T sejteknek funkcionális szempontból két csoportját írták le: Th1 típusú T sejteket, melyek főleg IL2-t (T sejt proliferációt indukál) és proinflammatorikus citokineket (IFN gamma) termelnek, szöveti gyulladást indukálnak és a B sejteket IgG2a típusú antitestek képzésére serkentik. Ezzel szemben a Th2 sejtek IL4-t (B sejtek IgG1 termelését növeli, Th1 proinflammatorikus citokinek termelését szuppresszálja) és IL10-t (indirekt módon gátolja a Th1 aktivációt, antigén prezentációt befolyásolja, proinflammatorikus citokinek termelődését csökkenti, Th1 sejteket down regulálja) (61). Ismert tény, hogy a diabetest csak a Th1 típusú T sejtek képesek átadni, Th2 típusúak nem pathogének, sőt inkább hasznosnak tűnnek. A p277 adagolás tehát hatással van a citokin profil alakulására, és az egyéb béta sejt antigének elleni immunválaszt is módosítja, ennek vizsgálatára a következő kísérletet végezték: NOD egereket a 12 hetes korban 1 alkalommal kezeltek 100ug p277-el, kontrollként M. tbc p278-al és PBS-sel. 5 héttel később a lépből T sejteket izoláltak és a vérből antitesteket mértek GAD, hsp60, insulin és p277 ellen, valamint figyelték a diabetes kialakulását is. A p277-tel kezelt állatok 47%-a volt diabeteses, ezzel szemben a M. tbc p278-al kezelt állatok 83%-a, a PBS-sel kezeltek 90-97%-a. Az antitestek profiljára is hatással volt a kezelés: a kontroll csoportokban (kezelt és nem kezelt is) 80%-os GADA, 90%-os hsp60 At, 50%-os insulin At pozitivitást észleltek és nem volt mérhető p277 elleni antitest. A p277 kezelt állatokban ezzel szemben 80%-os volt a p277 elleni antitest pozitivitás (p<0.0001), és csökkent a GAD, hsp60 és insulin elleni antitestek előfordulása. Ezen kívül izotípus váltást is megfigyeltek: IgG2a helyett komplementet kevésbé aktiváló IgG1 és 2b típusú 25