Mycobacterium fajok terjedése kereskedelmi forgalomban kapható fagyasztott haleleségek útján

Átírás

1 Halászatfejlesztés 34 - Fisheries & Aquaculture Development ISBN Mycoacterium fajok terjedése kereskedelmi forgaloman kapható fagyasztott haleleségek útján Eszterauer Edit 1, Rónai Zsuzsanna 2, Marton Szilvia 1, Ursu Krisztina 2, Baska Ferenc 3 és Láng Mária 2 1 MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézet, Budapest 2 Mez gazdasági Szakigazgatási Hivatal, Állategészségügyi Diagnosztikai Igazgatóság (MgSzH ÁDI), Budapest 3 Szent István Egyetem, Állatorvos-tudományi Kar, Budapest Kivonat Vizsgálatainkat a laoratóriuman nevelt fehér usa (Hypophthalmichthys molitrix) állomány akteriális fert z dése indította el. A pikkelyorzolódást, idült eseten izomzata terjed fekélyes rtüneteket mutató egyedek oncolása során a vér akteriális fert zése (szeptikémia), halvány, megnagyoodott máj és a els szerveken Ziehl-Neelsen festéssel pozitivitást mutató granulómák voltak kimutathatók. A szövettani vizsgálatok meger sítették a nagyszámú güm jelenlétét a májan, a veséken és a lépen. Az RNS-polimeráz éta-alegység (rpob) és az elongációs faktor Tu (tuf) gének egy-egy szakaszának szekvenálása a M. chelonae jelenlétét igazolta a fert zött hal egyedeken. Mivel a fehér usa állomány természetes vízforrással nem érintkezett és más halak sem kerültek az állomány közelée, a kizárólag a usa állomány etetésére használt, kereskedelmi forgaloman kapható fagyasztott haleleségek (homár ikra, zooplankton) voltak gyanúsíthatók a fert zés terjesztésével. A haleleségeken végzett molekuláris vizsgálatok meger sítették számos Mycoacterium faj el fordulását mind a homár ikrákan, mind a zooplankton mintákan. Az eleségmintákól és a fert zött halakól él mycoaktériumokat izoláltunk és leves táptalajan tenyésztettük. Az izolált mycoaktériumok genotipizálása és továi DNS szekvenálások töek között a M. arupense, M. nonchromogenicum fajokat azonosította a homár ikráól és M. fortuitum-ot a zooplankton mintákól. Vizsgálataink során els ként mutattuk ki M. chelonae jelenlétét és kórokozó képességét fehér usáan. Eredményeink felhívják a figyelmet arra, hogy a kereskedelmi forgaloman kapható haleleségek olyan veszélyes kórokozók terjesztéséen játszhatnak szerepet, mint a halgüm kórt okozó mycoaktériumok. Kulcsszavak: halgüm kór, Mycoacterium chelonae, szeptikémia, fehér usa, fagyaszott haleleség, genotipizálás. Bevezetés A halakan el forduló Mycoacterium fajok nemcsak a halgazdálkodás szempontjáól fontos kórokozók, hanem humán egészségügyi szerepük is jelent s a zoonózist 71

2 okozó fajok miatt. A halak mycoacteriosis-át általáan három faj, a Mycoacterium fortuitum, a M. marinum és a M. chelonae váltja ki. A mycoaktériumok széles kör elterjedésér l számos tanulmány született az elmúlt évtizedeken (Belas és mtsai. 1995, Bruno és mtsai. 1998, Decostere és mtsai. 2004, Whipps és mtsai. 2007, st.). Magyarországon el ször 1975-en mutatták ki a halgüm kór jelenlétét akváriumi halakan, valamint compóan (Tinca tinca) és dévérkeszegen (Aramis rama). A szerz k közleményüken kiemelték a tógazdasági pontyfélék veszélyeztetettségét és a etegség gazdasági és közegészségügyi jelent ségét (Molnár és Sziklai, 1975) en szintén magyar szerz k számoltak e nyolc különöz országól származó kínai paradicsomhal (Macropodus opercularis) egyedek akteriológiai vizsgálatának eredményeir l. A 25 izolált Mycoacterium törzs l öt fajt, a M. marinum-ot, a M. aqua-t, a M. terrae-t, a M. fortuitum-ot, a M. parafortuitum-ot és a M. smegmatis-t sikerült azonosítaniuk e díszhal fajan (Körmendy és mtsai. 1979). Jelen vizsgálataink elindítója egy laoratóriuman nevelt fehér usa (Hypophthalmichthys molitrix) állomány hirtelen ekövetkez megetegedése volt, ami nagyszámú egyed elhullásával járt. Célunk a etegség diagnosztizálása mellett a kórokozó faj szint meghatározása, és nem utolsó soran a kórokozó laoratóriumi rendszere való ejutási módjának azonosítása volt. Anyag és módszer A fehér usa ivadékokat a töi laoratóriumi körülmények között nevelt halfajtól elkülönítve, vízátfolyás nélküli, leveg ztetett akváriumokan tartottuk. Etetésükhöz haltápot (Perla larva, Skretting) és töféle fagyasztott haleleséget (zooplanktont és homár ikrát) használtunk (Van Gerven). A kórtani tünetek jelentkezése után a halak egy részét elhullott állapotan vizsgáltuk. A akteriológiai és szövettani vizsgálatokhoz azonan minden eseten frissen kiirtott halól származó mintát használtunk. A elváltozott szervek l (els soran a májól és a lép l) lenyomatokat készítettünk és a jelenlév alkohol- és saválló aktériumokat Ziehl-Neelsen festéssel mutattuk ki. A szövettani vizsgálatokhoz halszerveket (májat, lépet, vesét) fixáltunk 10%-os pufferolt formalin oldatan, majd a paraffinos eágyazást követ en 5 µm-s metszeteket készítettünk, amiket hematoxillin-eozinnal festettünk meg. Molekuláris vizsgálatokhoz a klinikai tüneteket mutató egyedek májáól illetve a kés ieken a különféle haleleségek l vettünk mintákat. Az RNS polimeráz éta alegység (rpob) gén PCR-rel történ felsokszorozása során Adékami és mtsai (2006) módszerét követtük. Az elongációs faktor Tu (tuf) gén egy szakaszának PCR-s vizsgálatához Mignard és mtsai (2007) által leírt módszert alkalmaztuk. Miután a kapott PCR termékek nukleotidsorrendjét DNS szekvenálással meghatároztuk, a DNS szekvenciákat BLASTn homológiakeres program segítségével összevetettük a GenBank adatázisan szerepl szekvenciákkal. A aktérium-tenyésztéshez frissen oncolt, tüneteket mutató hal máját és PCRpozitív, fagyasztott haleleségeket használtunk. El ször Middlerook 7H9 táplevest, majd Löwenstein-Jensen-féle szilárd táptalajt használtunk a tenyésztéshez. Az elszaporított él aktériumokat GenoType Mycoacterium CM kit segítségével, valamint DNS szekvenálással azonosítottuk, el inél a gyártó által javasolt protokollt követve (Hain Lifescience). 72

3 Eredmények és értékelés A klinikai tünetek megjelenése után 1-2 nappal már nagyszámú egyed pusztulását tapasztaltuk. A eteg halak egy része lesoványodott, más részénél viszont a hasfal nagymérték kidomorodása volt észlelhet. Idült eseteken pikkelyorzolódás és mélyre terjed fekélyes rtünetek is megjelentek (1.a. ára). a 1. ára Izomzata terjed fekélyes rtüneteket mutató fehér usa ivadékok (a), melyek oncolása során halvány, er sen megnagyoodott máj (fekete nyíl) képe volt makroszkóposan látható (). A oncolás során az esetek túlnyomó töségéen a vér akteriális fert zése (szeptikémiája), halvány, jelent sen megnagyoodott máj (1.. ára) és a els szerveken (vese, máj, lép, vékonyél) granulómák voltak kimutathatók, amik a Mycoacterium fajok által okozott halgüm kór tüneteire engedtek következtetni. a 2. ára Mycoaktériumokat tartalmazó güm k fehér usa els szerveien. Ziehl-Neelsen festés. Fiatal güm májan (a) és töréteg köt szövetes tokkal körülvett, idült fert zésre utaló güm lépen (). Natív preparátum (a) és szövettani metszet (). 73

4 a c d 3. ára Heveny és idült fert zésre utaló Mycoacterium chelonae által okozott güm k fehér usa els szerveien. Köt szövetes tokkal körülvett érett güm veséen (a) és lépen (). Fiatal güm k lép (c) és máj parenchymáan (d). Hematoxillin-eozinnal festett szövettani metszetek. A diagnózist a Ziehl-Neelsen festéssel liláspirosan (a képen sötétszürkén) fest d aktériumok nagy számának jelenléte er sítette meg a güm ken (2. ára). Még egy évvel a etegség kitörése után is találtunk güm kkel teli, de tünetmentes hordozó egyedeket. A szövettani metszeteken a máj, vese és lép állományáan nagyszámú gócot találtunk. A fiatal güm ken (3.c. és 3.d. ára) a parenchyma sejteknél világosaan fest d, ezáltal azoktól jól elkülönül epitheloid sejteket láttunk. A gócokat ekkor még köt szöveti sejtek egysoros rétege vette körül. Az id se güm ket (3.a. és 3.. ára) köt szöveti sejtek tösoros rétege határolta el a els szervek parenchyma sejtjeit l. Az id s güm k közepén élénk eozinofil fest dés mellett az epitheloid sejtek elhalása volt észlelhet (3.. ára), és jóval kevese mycoaktérium volt kimutatható (2.. ára). Mivel a fehér usa állomány természetes vízforrással nem érintkezett és más halak sem kerültek az állomány közelée, a kizárólag az állomány etetésére használt, kereskedelmi forgaloman kapható fagyasztott haleleség volt gyanúsítható a fert zés terjesztésével. A haleleségek molekuláris vizsgálata meger sítette a gyanút. A usa ivadékok etetésére használt fagyasztott haleleségek közül a zooplankton és a homár ikra minták mutattak er s pozitivitást a rpob és tuf gének PCR-es vizsgálata során (4.a. és 4.. ára). A DNS szekvencia elemzésekkel tö, faj szinten nem azonosított Mycoacterium törzs mellett M. arupense és M. nonchromogenicum jelenlétét mutattuk ki homár ikráól és M. fortuitum-ot zooplanktonól. A halmájan jelenlév 74

5 aktérium DNS egy nukleotid különséggel megegyezett a génankan megtalálható M. chelonae rpob génjének (génanki azonosítója: EU109288) szekvenciájával. a A tenyésztett aktérium mintákon végzett genotipizálás igazolta él M. chelonae aktériumok jelenlétét a klinikai tüneteket mutató usa egyedek májáan. A haltápokól kitenyésztett Mycoacterium törzsek közül genotipizálással csupán egyet sikerült azonosítani: a M. fortuitum-ot zooplanktonól, azonan az ezt kiegészít, már említett DNS szekvenálás összesen három Mycoacterium fajt (M. fortuitum, M. arupense, M. nonchromogenicum) azonosított. Ugyanaól a haleleség típusól tö különöz gyártási dátumú és Lot számú mintát is megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a aktérium-összetétel eltér volt a különöz mintákan. S t egyes mintákól nem sikerült aktériumokat kitenyészteni, ami arra utalt, hogy él aktériumot nem tartalmazott az adott minta. Sajnos a usa ivadékokat fert z M. chelonae kimutatása egyik haleleség mintáól sem sikerült. Ennek valószín síthet en éppen az volt az oka, hogy az eleségek aktérium-összetétele változó volt, és a etegség tüneteinek megjelenése el tt használt eleség l már nem állt rendelkezésünkre minta, így csak kés i szállítmányól származó mintákat tudtunk vizsgálni. Ennek ellenére eredményeink kétséget kizáróan izonyították, hogy a vizsgált fagyasztott eleségek él és fert z képes mycoaktériumokat tartalmaztak (4.c. ára). Vizsgálataink során els ként mutattuk ki M. chelonae jelenlétét és kórokozó képességét fehér usáan, ami úja fontos adattal egészíti ki a korái vizsgálati eredményeket a hazánkan el forduló pontyfélék halgüm kórra való fogékonyságának tekintetéen. Ezenkívül eredményeink felhívják a figyelmet arra, hogy a keresc 4. ára (a) Az RNS-polimeráz éta-alegység (rpob) gén k. 770 p hosszú szakaszát felsokszorozó PCR eredménye különöz fagyasztott haleleségek l származó mintákól. I: homár ikra, II-IV: zooplankton, M: molekulasúly marker. (-c) A haleleség mintákól leves táptalajan kitenyésztett mycoaktériumok genotipizálása: () A DNS amplifikálás eredménye: 200 és 230 p hosszú PCR termékek. Zárójelen a DNS szekvenálással azonosított Mycoacterium faj neve látható (tuf gén alapján). 1: homár ikra (M. arupense). 2: zooplankton (M. fortuitum), 3: homár ikra (M. arupense), 4: homár ikra (M. nonchromogenicum), 5: homár ikra, M: molekulasúly marker. (c) Fordított DNS hiridizációval kapott fajspecifikus DNS mintázat. Faj szint azonosítás ezzel a módszerrel csak a 2. minta esetéen volt lehetséges (M. fortuitum). 75

6 kedelmi forgaloman kapható haleleségek olyan veszélyes kórokozók terjesztéséen játszhatnak szerepet, mint a halgüm kórt okozó mycoaktériumok. Köszönetnyilvánítás Köszönetet mondunk Dr. Dán Ádámnak egyes DNS minták szekvenálásáan való közrem ködéséért és Dr. Jánosi Szilárdnak a aktériumtenyésztésen nyújtott segítségéért. Irodalomjegyzék Adékami, T., Berger, P., Raoult, D., Drancourt, M RpoB gene sequence-ased characterization of non-tuerculous mycoacteria with descriptions of Mycoacterium olletti sp. nov., Mycoacterium phocaicum sp. nov. and Mycoacterium auagnense sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microiol. 56: Belas, R., Faloon, P., Hannaford, A Potential applications of molecular iology to the study of fish mycoacteriosis. Annu. Rev. Fish Dis. 5: Bruno, D.W., Griffiths, C.G., Mitchell, C.G., Wood, B.P., Fletcher, Z.J., Droniewski, F.A., Hastings, T.S Pathology attriuted to Mycoacterium chelonae infection among farmed and laoratoryinfected Atlantic salmon Salmo salar. Dis. Aquat. Org. 33: Decostere, A., Hermans, K., Haeserouck, F Piscine mycoacteriosis: a literature review covering the agent and the disease it causes in fish and humans. Vet. Microiol. 99: Körmendy B., Tuoly S., Bánki M., Csaa Gy., Békési L., Kovács-Gáyer É Mykoakteriose der Fische. I. Die Eigenschaften der aus Fischen isolierten Mykoakterienstämme. Schweiz. Arch. Tierheilk. 121: Mignard, S., Flandrois, J-P Identification of Mycoacterium using the EF-Tu encoding (tuf) gene and the tmrna encoding (ssra) gene. J. Med. Microiol. 56(Pt 8): Molnár K., Sziklai F A halgüm kor el fordulása Magyarországon akváriumi, tógazdasági és természetes vízi halakan. Magyar Állatorvosok Lapja 10: Whipps, C.M., Butler, W.R, Pourahmad, F., Watral, V.G., Kent, M.L Molecular systematics support the revival of Mycoacterium salmoniphilum (ex Ross 1960) sp. nov., nom. rev., a species closely realted to Mycoacterium chelonae. Int. J. Syst. Evol. Microiol. 57:

7 Dissemination of Mycoacterium spp. via commercial fish food Edit Eszterauer, Zsuzsanna Rónai, Szilvia Marton, Krisztina Ursu, Ferenc Baska and Mária Láng Astract Our study was initiated when a acterial infection was oserved in laoratoryreared silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). The dissection of several specimens with ulcerated skin and anormal swimming ehaviour revealed septicaemia, pale and enlarged livers, and Ziehl-Neelsen positive granulomas in the internal organs. Histology confirmed the presence of a great numer of granulomas in the liver, kidney and spleen. By sequencing of a DNA fragment of the RNA polymerase ß-suunit (rpob) and elongation factor Tu (tuf) genes, Mycoacterium chelonae was identified in the affected fish specimens. As the silver carp stock had no connection to natural water, and there were no other fish introduced to the laoratory, the diet consisting of commercial fish food (frozen loster eggs, and frozen zooplankton) was suspected as possile source of infection. The molecular examination of the food indeed proved the presence of several Mycoacterium spp. oth in frozen loster eggs and in zooplankton. Mycoacteria from infected fish and from the food were isolated and cultured in liquid media. The genotyping of isolated mycoacteria and additional DNA sequencing identified among others M. arupense and M. nonchromogenicum in the frozen loster eggs and M. fortuitum in the frozen zooplankton. This is the first report of M. chelonae infection in silver carp. Besides the detection of a mycoacteriosis in a yet different fish species, the findings draw attention to the dangerous dissemination of living acteria via frozen fish food as sold in pet shops. Keywords: fish mycoacteriosis, Mycoacterium chelonae, septicaemia, silver carp, commercial frozen fish food, genotyping. 77