Myelomasejtek apoptózisának és jellemzo markerének (CD 138) in vitro és klinikai vizsgálata

Átírás

1 Myelomasejtek apoptózisának és jellemzo markerének (CD 138) in vitro és klinikai vizsgálata Doktori értekezés Dr. Jánosi Judit Témavezeto: Dr. Tarkovács Gábor Konzulens: Dr. Kopper László Dr. Vályi-Nagy István Országos Gyógyintézeti Központ Haematológiai és Haemosztazeológiai Osztály Budapest

2 Összefoglalás Myelomasejtek apoptózisának és jellemzo markerének (CD 138) in vitro és klinikai vizsgálata Dr. Jánosi Judit Országos Gyógyintézeti Központ, Haematolgiai és Haemosztazeológiai Osztály Ismert, hogy az apoptózis zavara szerepet játszhat a B-sejtes lymphomák kialakulásában. Ezen belül az antiapoptótikus folyamatoknak szerepük lehet a myeloma multiplex pathomechanizmusában. A myeloma multiplex kemoterápiás kezelése még nem megoldott, így az új, elsosorban antiproliferativ és proapoptótikus támadáspontú gyógyszerek kifejlesztése és a rizikóadaptált terápia az érdeklodés középpontjában áll. In vitro kísérleteinkben mevastatin (HMG-COA reduktáz inhibitor) hatását vizsgáltuk U266 humán myeloma sejtvonalon. A mevastatin kaszpázaktivitást és mitokondrium-depolarizációt okozva vezet apoptózishoz. Kimutattuk, hogy az apoptózis során a BCL-2 mrns- és fehérje mennyisége csökkent, a BAX, illetve BCL xl termelés azonban nem változott. A mitokondriális változásokat kaszpáz-8 és BID aktiválás kísérte. A halálligandokat neutralizáló antitestek (TRAIL-R2Fc, anti-tnf-α, anti-fasl) nem gátolták a mevastatin okozta apoptózist, ami az eddig ismert halálreceptoroktól független sejthalálra utal. Az apoptózis indukálása során a mevastatin elosegítette a myelomasejtek felszínérol a syndecan-1 levedlését. Fenti hatásai alapján a sztatinoknak szerepe lehet a tumorellenes kezelésben, a kemoterápia kiegészítéseként. A syndecan-1 (CD138) epithel sejteken ill. számos B-sejt felszínén kifejezodik. Klinikai vizsgálatunk során a szérumban mértük a szolubilis syndecan-1 koncentrációt ismeretlen jelentoségu monoklonális gammopathia (MGUS), soliter plasmocytoma ill. myeloma multiplex (MM) miatt kezelt betegeinknél. Myelomás betegek esetén szignifikánsan magasabb volt a szérum syndecan-1 koncentrációja mint MGUS ill. soliter plasmocytoma esetén. A szérum syndecan-1 koncentrációban statisztikailag szignifikáns különbséget találtunk myelomás betegeinket az egyes Salmon-Durie alcsoportok szerint vizsgálva. Statisztikai korreláció mutatható ki a szérum syndecan-1 koncentráció és más független prognosztikai tényezok, mint a β2-microglobulin, a monoklonális immunglobulin koncentráció, valamint a csontveloi plazmasejtszám között. Szignifikáns mértékben csökkent a szérum syndecan-1 koncentráció azon myelomás betegeinknél, akik reagáltak a kemoterápiára, míg a terápia rezisztens betegek esetében nem változott. Fenti eredmények alapján szérum syndecan-1 koncentráció értékes prognosztikai marker lehet myeloma multiplexben. A syndecan-1 koncentráció változása a terápiás válasz jó jelzoje lehet. 2

3 SUMMARY The limited success of cancer chemotherapy calls for new and better drugs with more relevance to the regulation of tumor growth and progression. Apoptosis is a critical process in normal B-cell function, and in many cases the abnormalites in the apoptotic pathways contribute to the pathogenesis of B-cell malignancies. This scenario has particular relevance in multiple myeloma (MM). In the present study we analysed the effect of mevastatin - a novel inhibitor of HMG-COA reductase, the rate-limiting enzyme of the mevalonate pathway - on U266 human myeloma cells. Apoptosis induced by mevastatin was associated with increased caspase activity and depolarisation of mitochondrial membrane. Expression of BCL-2 mrna and protein was down-regulated, with no change in BAX or BCL xl protein production. The mitochondrial program was supported by caspase-8 and cleaved-bid activity. None of the antibodies neutralizing death-ligand/death-receptor pathway TRAIL-R2Fc, anti-tnf-α, anti FASL (NOK-1) - influenced the mevastatin-induced apoptosis. Mevastatin also stimulated shedding of syndecan-1 from the surface of myeloma cells. Syndecans are a family of cell surface proteoglycans. In the bone marrow of multiple myeloma patients syndecan-1 is expressed only on the surface of malignant plasma cells. In this study we analyzed the serum level of shed syndecan-1 in three groups of patients with multiple myeloma, solitary plasmocytoma, and monoclonal gammopathy of undetermined signific ance. Patients with multiple myeloma showed a significantly higher median serum syndecan-1 level than patients with plasmocytoma or monoclonal gammopathy of undetermined significance. Statistically significant differences were also observed among Salmon-Durie subgroups of 50 patients suffering from multiple myeloma. In addition to these findings a statistical correlation with other independent prognostic factors such as serum beta 2 microglobulin level, monoclonal immunoglobulin concentration, and bone marrow plasma cell count could also be noted. A significant decrease in median serum syndecan level was observed in patients who responded to chemotherapy, whereas no change in the median syndecan-1 level could be observed in nonresponders. Our findings confir m the observation that high serum soluble syndecan-1 level is associated with a more advanced disease stage and is a strong independent indicator of poor prognosis. A diminished serum syndecan-1 reading as a result of chemotherapy may be a good indicator of favorable response to antitumor treatment. 3

4 Tartalomjegyzék Bevezetés -Az apoptózis mechanizmusa -A B-sejtek homeosztázisa -Az apoptózis és a sejtciklus zavara myeloma multiplexben -A syndecan molekulacsalád -A HMG-COA reduktáz inhibitorok hatása humán sejtvonalakon Célkituzések Anyagok és módszerek Eredmények Megbeszélés Az értekezésben összefoglalt munka fobb megállapításai Irodalomjegyzék Rövidítések Közlemények Köszönetnyilvánítás Csatolt közlemények különlenyomatai 4

5 Bevezetés A szervezet homeosztázisának fenntartásában alapveto fontosságú a sejtek szabályozott keletkezése és pusztulása. Ma már bizonyított, hogy a daganatok keletkezésében fontos szerepet játszik a sejthalált gátló tényezok túlsúlya vagy a sejthalált indukáló tényezok hibája. A sejthalál lehet passzív folyamat, nekrózis következménye vagy aktív sejtmuködés eredménye, ezt nevezzük programozott sejthalálnak vagy apoptózisnak. Az apoptózis tehát feltételezi a sejt integritását, metabolikus aktivitását. Jellegzetes az apoptótikus sejt morfológiai változása, amely fénymikroszkóppal is felismerheto. Az apoptózis során a sejt zsugorodik, kromatinkondenzáció jön létre, majd membránnal borított apoptótikus testek alakulnak ki. Ezzel szemben a nekrotikus sejt megduzzad, a sejtmag illetve a sejtorganellumok szétesnek, megszunik a membrán integritása, a sejt tartalma a környezetbe kerül, ahol gyulladásos reakciót indukál, lokális szövetkárosodást okoz. A szervezetben a nemkívánatos sejtek elpusztítása elsosorban apoptózissal történik (1,2). Az apoptózis mechanizmusa: Apoptózist kiváltó jelek lehetnek fiziológiás hatások (pl. citokinek) vagy sejtkárosító tényezok (pl. oxidativ stressz, DNS károsodás). Az apoptózis két egymással kapcsolatban álló, de nem szükségszeruen együttmuködoláncreakció válthatja ki: a) az úgynevezett külso halálút, a halálreceptorokon át valamint b): a belso halálút, a mitokondriummembrán permeabilitásának fokozódásán keresztül (3). Az apoptózist kiváltó jelek továbbítása sejtfelszíni receptorok (halálreceptorok) és közvetíto (adaptor) fehérjéken át történik (DISC, death inducing signaling complex). A halálreceptorokon (TNFα-R, TRAIL-R, FAS-R) keresztül az apoptózis indukció mellett azonban az NF-κB illetve a Jun-kináz aktiválásával apoptózist gátló hatás is kiváltható. Halálreceptorok esetén a haláldomén felelos az apoptótikus szignál közvetítéséért. Az adaptorfehérjék (FADD, RIP, TRADD) feladata a közvetítés a receptorok és az apoptózist végrehajtó molekulák között. A közvetítés módja a direkt fizikai 5

6 kapcsolaton keresztül létrejött fehérjeaktiválás, általában foszforiláció (4). Az eddigi adatok arra utalnak, hogy az apoptózist kiváltó jelek ill. az azokat továbbító láncreakció két, az apoptózis elhatározásában fontos sejtorganellumot érint a) mitokondriumot ill. a mitokondriális elemeket b) kaszpáz rendszert. Valószínuleg az apoptózis irányába történo elkötelezodés a két rendszer együttmuködése során alakul ki (5). A kaszpázok cisztein-proteázok. A kaszpáz fehérjecsaládnak emberben 14 tagja ismert. Megkülönböztetünk iniciátor és effektor kaszpázokat. Az iniciátor kaszpázok közül a kaszpáz-8 elsosorban a halálreceptorok, míg a kaszpáz-9 a citosztatikus szerek indukálta apoptózissal áll kapcsolatban, de a következményes változások hasonlóak lesznek (6). A mitokondrium központi szerepet játszik az apoptózis folyamatában, részt vesz a folyamat elindításában és szabályozásában. Az apoptózis során citokróm-c (citoc) szabadul fel a mitokondriumból, amely a citoszólban az apoptoszóma részét képezi (citoc, Apaf-1, prokaszpáz-9, ATP). Az apoptoszóma kaszpáz-9 majd a többi kaszpáz aktiválódásához vezet. Valószínuleg a citoc felszabadulás jelenti az apoptózis irányába a végleges elkötelezodést. Azokban a sejtekben ahol a felszabadulás után is elég citoc áll rendelkezésre az ATP termeléshez, apoptózis jön létre, míg azon sejtekben ahol a citoc mennyisége nem elegendo, csökken az ATP-szint és a sejt nekrotizálni fog. Mitokondriumból felszabadulhat még prokaszpáz-3 és AIF (apoptosis inducing factor) (7). A mitokondrium és az apoptózis közötti kapcsolatot befolyásoló tényezok közé tartozik a BCL-2 család. A család pro- (pl: BAX, BID) és antiapoptotikus (pl: BCL-2, BCL xl ) hatású tagokból áll. A BCL-2 a mitokondrium külso membránjában, az endoplazmatikus retikulumban és a magmembránban helyezkedik el. BCL-2 és a BCL xl nyugalomban biztosítja a mitokondrium membrán megfelelo töltéselosztását, az ATP/ADP cserét. BCL- 2 antiapoptótikus hatását több úton is kifejti, részben közvetlenül gátolja az Apaf-1 kaszpázaktiváló hatását, valamint megakadályozza, hogy a mitokondriumból kiszabaduljon a citoc (8). Az antiapoptótikus BCL-2 gén potenciális onkogén, muködését a gén hibája ill. más szabályozók is fokozhatják, például haemopoetikus sejtekben RAS, AML-ETO. A proaptótikus tagok szupresszorként hatnak, a BAX expressziója p53-függo, így részben felelos a p53 apoptózis indukáló hatásáért (9). 6

7 Az apoptózis kivitelezése ma még nem tisztázott. Lényegében két fo esemény zajlik döntoen a kaszpázok irányítása alatt: a) a szerkezeti elemeket és enzimeket érinto proteolizis b) a DNS fragmentációja és degradációja (5) (1/a. ábra). A B-sejtek homeosztázisa: A B-sejtek homeosztázisának szabályozása még nem teljesen ismert. Az érett, génátrendezodésen átesett B-sejtek a csontvelobol a perifériás nyirokszervekbe, elsosorban a nyirokcsomó csíracentrumába vándorolnak.a nyirokcsomó kortexében a B-sejtek primer follikulust alkotnak, amely antigénstimulus hatására másodlagos follikulussá alakul. A szekunder follikulusban történik a B-sejtek aktivációja és a veloállományban vándorló, immunglobulint aktívan termelo plazmasejtekké ill. helyben maradó memóriasejtekké történo differenciácója. A felszíni antigénreceptorral rendelkezo B-sejt felveszi az antigént (Ag), majd szomatikus mutációk sorozatán megy át, amely az affinitásérés fontos lépése. A B-sejt az Ag-el való találkozás, a T helper-sejt (Th), valamint citokinek hatására különbözo Ig- izotípust termelo B- lymphocytákká majd plazmasejtekké differenciálódik a nyirokcsomó germinalis centrumában. Az antigénstimulust követoen egy meghatározott VDJ-vel jellemezheto a nehézlánc izotípusa, az osztályváltásban részben az Ag-inger, részben pedig a CD40 ligand játszik fontos szerepet. A B-sejt plazmasejtté való éréshez IL-6-ra és IL-11-re van elsosorban szükség. IL-6 elsosorban nem lymphoid, hanem endothel, fibrocyta eredetu. IL-6 a differenciálódott B-sejt apoptózisát is gátolja. A pontos mechanizmus, amelynek során a B-sejt plazmasejtté illetve memóriasejtté differenciálódik még nem teljesen ismert (10, 11). A primer plazmasejtre jellemzo az immunglogulin (Ig) szintézis, az MHC II expresszió, a csökkent sejtfelszíni g, a B220 és a CD19 expresszió mellett. Egér plazmasejteken igazolták, hogy az érés során csökken a CD40 és FAS expresszió, megtartott TRAIL expresszió mellett (12). Tehát a sejtciklus, a differenciálódás és a sejtfelszíni receptorok expressziója között összefüggés van. Az egyetlen sejtfelszíni protein, amely mind egérben, mind humán plazmasejteken illetve a malignus myelomasejteken is nagy mennyiségben expresszálódik a syndecan-1, ami azonban nem található meg a 7

8 differenciálódás elott álló B-sejteken. Így a syndecan-1 hasznos sejtfelszíni marker a plasmocytoid sejtek identifikálásában (13). A legtöbb plazmasejt az Ig-szekréciót követoen gyorsan eliminálódik, kivéve néhány hosszú élettartamú populációt a csontveloben illetve a bélrendszerben, így az apoptózis fontos tényezoje in vivo a plazmasejt homeosztázisnak. Egérkísérletek igazolták, hogy az egér B-sejt és plazmasejt is expresszál TRAIL-t, de míg a plazmasejtek apoptózisa TRAIL-függo és FAS-független, addig a az aktivált B-sejtek esetén ez FAS-függo. Ez a megfigyelés alátámasztja, hogy az aktivált B-sejt és a plazmasejt apoptózisa eltéro szabályozás alatt áll, de a pontos mechanizmus ma még nem ismert (12). Az apoptózis és a sejtciklus zavara myeloma multiplexben: Myeloma multiplexben a csontveloi plazmasejtszaporulat kialakulásához a sejtciklus zavara vagy az apoptózis hibája vezet. Sejtciklus zavara: A cyclin D1 és D3 fokozott expressziója gyakran megfigyelheto myeloma multiplexben és a myeloma prekurzor sejtek fokozott proliferációjához vezet. Cyclin D gén diszregulációja létrejöhet IgH génhez történo translokáció következményeként, illetve kromoszómatranszlokációtól függetlenül is (14). A cyclin D fokozott expressziója azonban csak akkor vezet a myelomasejtek fokozott proliferációjához, ha a CDK4 (ciklin dependens kinase) és CDK6 muködése is fokozott. Igazolták, hogy az INK4, egy CDKinhibitor, csökkent muködése szerepet játszik myeloma multiplex pathogenezisében (15). Apoptózis zavara: Az IL-6 központi jelentoségu növekedési és túlélési faktor B-sejtek esetén. Sejtfelszíni receptorához (IL-6R/gp80) kötodve, az intracellularis jelátvivo gp130-at aktiválja, amely a JAK aktivációját idézi elo. A JAK autofoszforilálódik és STAT (signal transducers and activators of transcription) aktivációját okozza. Ennek hatására a sejtmagban génaktiváció (pl:akut fázis protein gén) jön létre (16). Az IL-6 aktiválja a RAS-függo mitogénaktivált protein-kinázokat (MAPK) (17). Mikor az aktivált B-sejt plazmasejtté érik, elveszti a gp80 és a gp130 receptorát. Myelomasejtek esetén ez a negatív szabályozó hatás hiányzik, így a STAT hatására folyamatos tirozin-kináz aktiváció jön létre, sejtproliferációt okozva. A STAT aktiváció az endotélproliferációt is elosegíti, ez pedig fokozott angiogenezishez vezethet 8

9 (18). A myelomában észlelt fokozott angiogenezis pontos mechanizmusa nem ismert. A két legfontosabb, angiogenezist indukáló citokin a myelomasejtek által is termelt bázikus fibroblast növekedési faktor (bfgf) és a vascularis endothel növekedési faktor (VEGF) (19). A VEGF myeloma multiplexben nemcsak az angiogenezist serkenti, de az endothelsejtek IL-6 szekrécióját is elosegíti ill. autokrin módon a plazmasejteket is stimulálhatja (20). Igazolták, hogy myeloma multiplexben az emelkedett IL-6 szint összefüggést mutatott a kemorezisztenciával (21). Feltételezheto, hogy a csontveloi mikrokörnyezet, a sejtadhezió is gátolhatja a myelomasejtek apoptózisát. A myelomasejt a fibronektinhez kötodve rezisztenssé válik a kemoterápiára (pl: doxurubicin, melphalan), illetve a radioterápiára. A myelomasejtekben a fibronektinhez kötodést követoen no a citoplazmatikus C-FLIP L koncentráció, amely gátolja a FAS-indukálta apoptózist (22). A FAS-indukálta apoptózis β1 integrinnel is gátolható volt. β1 integrin hatását prokaszpáz-8 gátlásán át fejti ki (23). Igazolták, hogy különbözo stressz-ágensek, pl: dexamathason, ionizáló sugárzás, FAS-ligand, képesek kiváltani a myelomasejtek apoptózisát. A dexamethason indukálta apoptózis során a RAFKT indukálódik, tehát egy IL- 6-függo, cytokrom-c-tol független folyamat alakul ki. A FAS ill. irradiáció indukálta apoptózis cytokrom-c-tol függo út, IL-6-tól részben vagy teljesen független. A myelomasejtek esetén az apoptózis tehát legalább 2 úton valósul meg, részben egy cytokrom-c-tol függo ill.egy cytokrom-c-töl független úton (1/b ábra). Bár az apoptózis iniciátorok különböznek, mindkét folyamat a kaszpáz-3 aktiválódáshoz vezet (24,25). A myelomasejtek apoptózisuk során szemben más sejtfelszíni markereikkelelvesztik syndecan-1 pozitivitásukat. Nem ismert, hogy a syndecan levedlése oka vagy következménye az apoptózisnak (26). A syndecan molekulacsalád: A syndecanok sejtfelszíni proteoglikánok, amelyek konzervatív transzmembrán és citoplazmatikus doménbol, valamint variábilis 9

10 extracellularis doménbol állnak (27, 28). Az extracelluláris domén jellemzoje, hogy proteáz-érzékeny hasítási hellyel rendelkezik, így a sejtfelszínrol leválva az extracellularis térben és a keringésben is megjelenik (29). A syndecancsalád számos ismert funkciója az extracellularis doménhez kötodo heparan szulfát láncoknak tulajdonítható (30). A molekulacsaládnak eddig négy tagja ismert (syndecan 1-4) (31). Legismertebb a syndecan-1 (2a. ábra). A humán syndecan-1 gén a kettes kromoszómán található, a N-myc gén mellett, 5 exonból és 4 intronból áll (32). Syndecan-1 expresszálódik az epithel sejteken és a B-lymphocytákon. Egérben a normál B- sejt fejlodése során a syndecan-1 expresszió a pre-b sejtekre és a differenciált plazmasejtekre jellemzo, míg a keringo érett B-lymphocyták felszínérol hiányzik (13). Egérben a plazmasejt syndecan-1 expressziója összefügg az immunglobulin szekrécióval (33) (2b. ábra). A syndecan-1 expressziójára hormonok ( pl. tesztoszteron, glucocorticoid) ill. citokinek (pl: IL-6, TNFα, TGFβ ) egyaránt hatnak (34, 35). A syndecan-1 pontos biológiai szerepe még nem tisztázott, de számos funkciója ismert. Receptorként, ko-receptorként muködik különbözo mátrix molekulák (pl.: fibronektin, kollagén I-III-IV) számára és így részt vehet a sejtek szöveti rögzítésében, gátolva ezáltal a sejtek invázióját (36). Növekedési faktorok megkötésével is befolyásolja mikrokörnyezetét, bfgf koreceptoraként elosegíti a fibroblasztok differenciációját (29). Az extracelluláris domén proteolítikus hasítását követoen az extracelluláris térben autokrin vagy parakrin hatást fejt ki (29). Igazolták, hogy a szolubilis extracelluláris domén bizonyos sejtvonalakon gátolta a proliferációt (37). Az extracelluláris domén fontos a sejt-sejt kapcsolat kialakulásában is (10). A konzervatív citoplazmatikus domén részt vesz az intracellularis jelátvitelben, valamint intracellularis molukulák kötésében (38). A syndecan-1 expresszió a sejtek differenciáltsági fokától függo expressziót mutat lymphoproliferativ betegségek esetén. Lymphoplasmocytoid lymphoma, plasmocytoma, myeloma multiplex és néhány diffúz nagy sejtes B-sejtes lymphoma syndecan-1 pozitivitással rendelkezik (39). Nem igazoltak syndecan-1 expressziót B-CLL, prolymphocytas lymphoma, köpenysejtes lymphoma, follikuláris lymphoma, hajas sejtes leukémia, extranodalis marginális zóna lymphoma és Burkitt-lymphoma esetén (40,41). 10

11 A syndecan-1 pozitivitást eloször a plazmasejteken igazolták. Mind a normál, mind a malignus plazmasejt expresszál syndecant illetve a keringésbe került plazmasejteken is kimutatták a syndecan-1 expressziót (42). Ismert, hogy a sejtfelszíni syndecan-1 képes a myelomasejteket az extracellularis mátrixhoz kötni, segíti a sejt-sejt kapcsolatot és részt vehet a plazmasejtek homing folyamatában (43). A myelomasejtek apoptózisuk során elvesztik syndecan-1 pozitivitásukat (26). Valószínuleg a non-matrix metalloproteázok (MMP9, ADAM) segítik a syndecan-1 extracellularis doménjének hasítását (44). HMG-COA reduktáz inhibitorok hatása humán sejtvonalakon: A myeloma multiplex kemoterápiás kezelése még nem megoldott, így az új, elsosorban antiproliferativ és proapoptotikus támadáspontú gyógyszerek kifejlesztése és a rizikóadaptált terápia az érdeklodés középpontjában áll. A HMG-COA-reduktáz (3 hidroxi-3 metilglutaril koenzim A reduktáz) központi jelentoségu enzim a koleszterin szintézisben. A mevalonát-út végtermékei számos biológiai folyamatban alapveto jelentoséguek (45). Szterolok, pl. a koleszterin, alapveto fontosságúak a membránok ill.szteroid hormonok felépítésében, az ubiquinon (koenzim q) szerepet játszik az elektron- transzportban, a dolichol a glicoprotein szintézisben, valamint a retinsav prekurzora, a farnesyl és a geranylgeranyl izoprenoid szerepet játszik számos fehérje (pl.: RAS protein) szintézisében (45,46,47). A mevalonát alapveto fontosságú a sejtproliferáció és a transzformáció szabályozásában. Számos malignoma, így lymphoma, vastagbél ill. tüdo adenocarcinoma esetén fokozott HMG-COA-reduktáz aktivitást igazoltak (48,49,50) A sztatinok -HMG-COA-reduktáz inhibitorok- alapveto fontosságúak a hyperkoleszterinaemia kezelésében. Retrospektív vizsgálatok igazolták, hogy a sztatin kezelés mellett nemcsak a cardiovascularis, de az összmortalitás is csökkent, ezen belül a malignus betegségek okozta halálozás 28-33%-al mérséklodött (51,52). A sztatinok antiproliferativ hatása részben proliferációgátláson, részben apoptózis indukción alapul. In vitro vizsgálatok igazolták a sztatinok sejtproliferációt gátló hatását, amely elsosorban a sejtciklus G1/S fázis gátlásán át érvényesül (53). Számos sejtvonalon a lovastatin proliferációgátló hatása p53 függetlennek bizonyult, a CDK 2 (ciklin dependens kinase) expresszió 11

12 csökkenése valamint p21 cip1 (CDK inhibitor) aktiváció kísérte (54). A sztatinok proliferációgátló hatása mevalonáttal felfüggesztheto (53). Számos vizsgálat igazolta, hogy a sztatinok in vitro apoptózist indukálnak. Mevastatin (3. ábra) CaCo2 humán adenocarcinoma sejtvonalon indukált apoptózist (55). Lovastatin apoptózist okozott myeloma, prostata carcinoma, acut myeloid leukémia, pancreas és colon carcinoma sejtvonalon. Nem világos mi okozza a tumorsejtek eltéro szenzitivitását a lovastatin indukálta apoptózissal szemben. A sztatin indukálta apoptózis HMG-COA-reduktáz gátláson alapul, feltételezheto, hogy a rezisztens sejtvonalakon génamplifikáció miatt nem jön létre ez a gátlás. A sztatin indukálta apoptózis tumor-specifikus. Jellemzo, hogy amíg sztatin hatására az AML sejtvonalon apoptózis alakul ki, a normál myeloid sejtek rezisztensek a sztatin okozta apoptózisra és megtartják proliferációs potenciáljukat (61). A sztatinok indukálta apoptózis folyamata pontosan még nem ismert. Sztatin-szenzitiv AML sejtvonalon az apoptózis során nott a kaszpáz-3 aktivitás, csökkent a BCL2 expresszió, mind mrns, mind fehérje szinten (62,63). Ismert, hogy a sztatinok számos protein, így a sejtek túlélésében fontos, K-RAS és N-RAS szintézisét, geranylgeranilációját gátolják (64). Fentieknek szerepe lehet a sztatinok antiproliferativ hatásában, illetve a metasztáziskialakulás gátlásában (65). Ismert a sztatinok antiinflammatorikus, antioxidans, immunmoduláló és angiogenezist gátló hatása (66,67). Sztatinok gátolják a normál nem malignusan traszformált- sejtek, így az érfali simaizomsejtek proliferációját és az endothel progenitorok túlélését és expanzióját (68). 12

13 Célkituzések -A bevezetésben bemutatottak alapján feltételeztük, hogy a mevastatin ( HMG-KOA reduktáz inhibitor) befolyásolhatja a myelomasejtek muködését. In vitro vizsgálatunkban mevastatin hatását vizsgáltuk U266 humán myeloma sejtvonalon. Vizsgáltuk a mevastatin indukálta apoptózis és proliferációgátlás mechanizmusát. - In vitro a myelomasejtek apoptózisakor a syndecan-1 leválik a sejtfelszínrol. Klinikai vizsgálatunk célja a szolubilis syndecan-1 prognosztikai szerepének vizsgálata plazmasejt- dyscrasiában, így MGUS, soliter plasmocytoma illetve myeloma multiplex esetén. Szintén vizsgáltuk, van-e korreláció a szérum syndecan-1 koncentráció és az ismert prognosztikai tényezok között illetve van e összefüggés a szérum syndecan-1 koncentráció változása és a terápiára adott válasz között. 13

14 Anyagok és módszerek A) In vitro vizsgálat Sejtkultúra: Kísérleteinket U266 humán myeloma sejtvonalon végeztük. A sejteket RPMI médiumban (Sigma), 10% hoinaktivált fötális borjú-szérummal -FCS-sel (GIBCO-BRL)-, L-glutaminnal és penicillin-streptomycinnel kiegészítve tenyésztettük 5% CO 2 koncentrációt biztosító termosztátban 37 o C-on. A sejteket mosás után (0,5 ml-ben sejt) 48 lyukú tálcán eloinkubáltuk (5% CO 2, 37 o C), majd a sejteket 0,5-1-2,5µg/ml dózisban mevastatinnal kezeltük órán át. Anyagok: Mevastatint (Sigma) DMSO-ban oldottuk (10ng/ml), -20C-on tároltuk. Kísérleteink során a következo anyagokat használtuk: ZVAD-fmk (Enzim System Product) egy általános kaszpáz inhibitor, Z-IETED-fmk (Pharmingen) kaszpáz-8 inhibitor, Z-LEHD-fmk (Pharmingen) kaszpáz-9 inhibitor. Kaszpáz inhibitorokat µmol koncentrációban alkalmaztuk, a kezelés idotartama alatt (72-96 óra) minden 24 órában hozzáadtuk a kaszpáz inhibitorokat a sejtkúltúrához. Sejt-morfológia: Cytospinnel történt preparációt követoen sejteket 80%-os methanolban fixáltuk, majd haematoxilin-eosin (HE) történo festést követoen a sejtmorfológiát fénymikroszkóppal vizsgáltuk. 14

15 Apoptózis mérése áramlási citométerrel DNS tartalom alapján: Mevastatin kezelést követoen a megfelelo ideig inkubált sejteket ( /ml) centrifugáltuk (300g/2perc), a felülúszó leöntése után az összerázott sejtüledéket -20 o C fokos, 70%-os etanolban fixáltuk 25 percig szobahomérsékleten, majd 30 percig -20 o C-on inkubáltuk. A mintákat újra centrifugáltuk (300g/3perc) és 800µl 100µg/ml RNáz A (Sigma) tartalmú extrakciós puffert (200mM-os dinátrium foszfát puffer, ph=7,8 citráttal beállítva) adtunk a pellethez. 15 perc inkubáció után 5µg/ml végkoncentrációban etidium-bromidot (Calbiochem) adtunk a mintákhoz és 15 percet inkubáltuk szobahomérsékleten. Az áramlási citométer (FACScan, FACScalibur, Becton-Dickinson, Erembogeden, Belgium) segítségével a sejtek fluoreszcencia intenzitását vizsgálhattuk. Az adatok kiértékeléséhez Winlist 1.0 (Verity Software House, USA) programot használtuk. Western-blot analizis: Sejteket fent leírt módon kezeltük mevastatinnal. Ezután a sejteket PBS pufferben mostuk, centrifugáltuk (1300g, 5 perc Sigma 3K10 Laborcentrifuga), pelletet lizis pufferben (5mM TRIS, 150mM NaC l, 1mM NaF, 0,5mM sodium-vanadate, 10µl/mg leupeptin, 1mM PMSF, 10% glycerol) reszuszpendáltuk és 10 percig jégen inkubáltuk. Inkubációt követoen a sejteket centrifugáltuk (4C, 20 perc, 15000g) majd a fehérjetartalmat BioRad Bradfordreagens segítségével határoztuk meg. A gélelektroforézist 12,5%-os akrilamid gélen végeztük. Az analizishez 30µg fehérjét használtunk Az ellenanyagokat a következo higításban alkalmaztuk: monoklonális Bcl-2 1:1000 (Dako), Bid 1:1500 (Transduction Laboratories), poliklonalis Bax 1:2000 (Dako). Elohíváshoz Vectastain ABC Kit-et (Vector Laboratories) és ECLPlus (Amersham Pharmacia Biothec, UK) kemiluminescens szubsztrátot használtunk. RT-PCR: Az RNáz mentesités érdekében a háromszor desztillált vizet dietilpirokarbonáttal kezeltük és autoklávoztuk, az eszközöket holég- sterilizáltuk (200 C, 4 óra). Munkánk során 10x10 6 sejtbol izoláltunk RNS-t Rneasy Total RNA kit segitségével. A reverz transzkripciót 100ng RNS-bol végeztük MMLV reverz 15

16 transzkriptázzal és random primerekkel (Gibco BRL), 42 C-on. A PCR során red-taq polimerázt (Sigma) használtunk. A következo ciklusparamétereket alkalmaztuk: 65 C, 1 perc, 72 C 1 perc, 28 ciklus. Belso standardként a β- aktint használtuk a cdns minoségének megítélésére. A DNS minták méret szerinti elválasztását agaróz gélelektroforézissel végeztük (1,5% agaróz). A gélek értékelése UV mellett Eagle Eye Videodensitometerrel (Strategene) történt. Primerek: β-actin 538bp 5,GTG-GGG-CGC-CCC-AGG-CAC-CA3, 5,CTC-CTT-AAT-GTC-ACG-CAG-GAT-TTC3, Bcl bp 5,CGA-CTT-CGC-CAG-GAT-GTC-CAG-CCA-G3, 5,ACT-TGT-GGC-TCA-GAT-AGG-CAC-CCA-G3, Bax 517 bp 5,CAT-GAA-GAC-AGG-GGC-CCT-T3, 5,CAT-CTT-CTT-CCA-GAT-GGT3, Kaszpáz-aktivitás mérése: A mintákat ( sejt/ eppendorf cso) centrifugáltuk (200g/3perc). A sejteket kétszer mostuk 1ml PBS-ben (Dulbeco-foszfáttal pufferelt só oldat). A felülúszó leszívása után a pellethez kaszpáz puffert (100mM HEPES, ph=7,5, 10% szukróz, 0,1% CHAPS, 5mM DTT) adtunk. A mintákat 96 lyukú tálcára helyeztük. 1 %-os triton X-100-zal feltártuk a sejteket, majd 20µM DEVD- AMC (Sigma) kaszpázszubsztrát hozzáadásával indítottuk a reakciót. A fluoreszcencia intenzitását detektáltuk, amelybol AMC hígítási sor alapján határoztuk meg a felszabadult AMC mennyiséget (Fluoroskan Ascent Fluorimet, Labsystem). Mitokondrium membrán depolarizáció mérése: Az élo sejtekhez ( sejt/ml) 10nM DIOC 6 (3) festéket (3,3 - dihexiloxakarbocianin-jodid, SIGMA) adtunk és 15 percig inkubáltuk (37C o, 5%CO 2 ). Az áramlási fotometria során mért fluoreszcencia ( nm) 16

17 mértékébol következtettünk a mitokondrium depolarizáció mértékére, mert depolarizált (pozitívabb töltésu) mitokondriumban kevesebb festék gyulik össze, mint a polarizáltban. BAX-transzlokáció vizsgálata: A mevastatinnal elokezelt sejteket 5µM CMTMRos-al inkubáltuk 15 percig, majd a sejteket PBS-ben mostuk és 80%-os methanolban fixáltuk. Immunhisztokémia vizsgálathoz poliklonális BAX-antitestet (1:20, DAKO), Vectastain EliteABC kitet és streptavidin-fitc- et (DAKO) használtunk. Az analizis Confocal Laser Scanning mikroszkóppal történt (Bio- Rad). TRAIL, TNF-alfa, FASL neutralizáció: A halálreceptorok - TRAIL, TNF-R, FAS - szerepét vizsgálva a mevastatin indukálta apoptózis során, halálligand neutralizáló reagenseket használtunk: rekombináns TRAIL-R2Fc (Alexis, 100ng/ml), monoclonalis anti-humán TNFalfa (Alexis 1ng/ml), és NOK1 (anti-fasl antitest, Alexis 1ng/ml). Syndecan-1 meghatározás áramlási citometriával: Mevastatin kezelést követöen a sejteket PBS-ben mostuk, 80%-os methanolban fixáltuk, majd 10 6 sejtet jelöltönk meg két lépésben. Eloször a sejteket antihumán syndecan-1 monoclonalis antitesttel (1:200, Serotec MCA681), majd anti-egér biotinilált antitesstel inkubáltuk 45 percig, mostuk, majd streptavidin- FITC-et adtunk a mintához. A méréseket FACSCAN flow cytométerrel végeztük. Statisztikai analizis: Statisztikai analizis során a Student T-tesztet használtuk. B) Klinikai vizsgálat: Betegek: Vizsgálatunkban 67 beteg szerepelt. Az American Southwest Oncology Group (SWOG) kritériumrendszer (69) alapján 13 betegnél monoklonális gammopathiát, 4 betegnél szoliter plasmocytomát, 50 betegnél pedig myeloma 17

18 multiplexet igazoltunk. A vizsgálat kezdetekor minden betegnél meghatároztuk a csontveloi plazmasejtszámot, a monoklonális fehérje típusát és mennyiségét, a szérum β2-microglobulin koncentrációját, valamint a szérum albumin, kálium, kreatinin, karbamid-nitrogén, alkalikus foszfatáz és CRP koncentrációját is (1. táblázat). A Salmon-Durie kritériumrendszer (70) szerint prognosztikai csoportok alapján is vizsgáltuk a myeloma multiplex miatt kezelt betegeinket, ennek alapján I/A csoportba a betegek 8%-a (n=4), II/A: 40% (n=20), II/B: 6%(n=3), III/A: 24% (n=12), III/B csoportba 22% (n=11) került. A monoklonális immunglobulin (M-protein) megoszlása a következo volt: IgG (n=27), 54%, IgA (n=16), 32%, IgD (n=2), 4%, könnyulánc (n=3), 6%, nonszekretoros (n=2, 4%). A vizsgálat kezdetekor 35 beteg már részesült megelozo kemoterápiában. 15 még kezeletlen beteget követtünk a kemoterápia során. Az átlagos utánkövetési ido 6 hónap volt. 15 betegbol 7 (47%) ICOMP protokoll (idarubicin, cyclophosphamid, vincristin, methylprednisolon), 8 beteg (53%) pedig VAD protokoll (vincristin, doxorubicin, dexamethason) szerinti indukciós kezelésben részesült. Mindkét kemoterápiás protokollt 4 hetente ismételtük hat cikluson át. Minden beteg részesült biszfoszfonát terápiában is. A terápiára adott választ az M-protein koncentráció változásával monitoroztuk, illetve a hatodik kemoterápiás ciklust követoen a csontveloi plazmasejtszámot is vizsgáltuk. Objektív terápiás válasznak tekintettük a szérum paraprotein koncentráció 50%-os csökkenését. Nonszekretoros myelomás betegeknél a csontveloi plasmasejtszám 50%-os csökkenését tekintettük terápiás válasznak. Szérum syndecan-1 meghatározás : A perifériás vér centrifugálását (3000g, 10 perc) követoen a szérumot 7O Con tároltuk. A szérum szolubilis syndecan-1 koncentrációját a kereskedelmi forgalomban kapható humán syndecan-1 ELISA-val (Diaclon Research, Besancon, Franciaország), specifikus scd138 monoclonalis antitest segítségével határoztuk meg. Statisztikai analízis: Eredményeink statisztikai analízisét az SPSS for Windows 9.0 programmal végeztük. Szignifikánsnak tekintettük az eredményt, ha a p érték kevesebb 18

19 volt, mint 0,05. A csoportok közötti összehasonlítás esetén a Mann-Whitney U- tesztet használtuk. A terápiára adott választ logisztikus regressziós módszerrel vizsgáltuk. 19

20 Eredmények A) In vitro eredmények Mevastatin hatása U266 sejtvonalon: Mevastatin gátolta a proliferációt és apoptózist indukált U266 humán myeloma sejtvonalon. A proliferációgátlás alapvetoen a G1-fázis gátlásán át valósult meg. A mevastatin indukált apoptózis dózis- (0,25-1-2,5µg/ml) és idofüggo (24-96ó) volt. Az apoptózis viszonylag lassan, a kezelés megkezdését követoen 48 órával alakult ki, maximumát a 72. órában érte el (4. ábra). Mindezt a sejtek jellegzetes morfológiai változása kísérte (5 ábra). Mevastatin indukálta apoptózis mechanizmusa: A kaszpázok szerepére utal, hogy a mevastatin indukálta apoptózis, Z-VADfmk-val, egy általános kaszpáz gátlóval blokkolható volt (6/a. ábra), ugyanakkor apoptózis kialakulásával párhuzamosan nott a DEVD-AMC fluoreszcenciája, amely fokozott kaszpáz-3 aktivitásra utalt (6/b ábra). Az apoptózis mind kaszpáz-8, mind kaszpáz-9 inhibitorral gátolható volt (7/a,b ábra). DiOC 6 segítségével kimutattuk, hogy a mevastatin indukálta apoptózis során mitokondrium depolarizáció alakult ki, 48 órával a mevastatin kezelést követoen (8.ábra). A mitokondrium permeabilitását befolyásoló tényezok közül BCL-2 mrns mennyisége csökkent (9/a. ábra), míg a BAX és BCL xl expresszió változatlan maradt. Western blot analízis során igazoltuk, hogy a BCL-2 fehérje mennyisége is csökkent (9/b. ábra). A proapoptotikus BAX protein mennyisége változatlan maradt, bár a BCL-2/BAX arány csökkent. A BAX lokalizációja szintén megváltozott. Konfokális mikroszkóppal vizsgálva a kezdeti homogén citoplazmatikus BAX eloszlás a mevastatin kezelés után 72 órával megváltozott és mitokondriális elrendezodés alakult ki. Western-blot analízissel vizsgálva a kimutatható BID- fragmentek mennyisége csökkent a mevastatin kezelés 72. órájában. Vizgáltuk a halál-receptorok szerepét a mevastatin indukálta apoptózisban. Neutralizáló antitestek (TRAIL-R2FC, anti-tnf-alfa, NOK1) nem befolyásolták a mevastatin indukálta apoptózist (10. ábra). Ez az eredmény 20

21 arra utal, hogy a kaszpáz-8 aktiváció az eddig ismert halál-receptorokól független folyamat. Syndecan-1 vedlés: Ismert, hogy myelomasejtek apoptózisuk során levedlik felszínükrol a syndecan-1 extracelluláris doménjét. Áramlási citometriás vizsgálatunk igazolta, hogy a mevastatin kezelés (2,5µg/ml) indukálta apoptózis során idofüggést mutatóan csökkent a syndecan-1 pozitív sejtek aránya. (pozítiv kontroll: 24ó: 57,33%, 48ó: 53,4%, 72ó: 54,5%, kezelt sejtek: 24ó: 31,8%, 48ó: 28,7%, 72ó: 5,91%) B) Klinikai eredmények: Szérum syndecan-1 koncentráció: A 11. ábra mutatja diagnóziskor a szérum syndecan-1 koncentrációt MGUS, soliter plasmocytoma ill. myeloma multiplex miatt kezelt betegeinknél. Az átlag syndecan-1 koncentráció MGUS-ban szenvedo betegeknél (n=13) 77,9ng/ml (33-122ng/ml) ill. soliter plasmocytoma esetén 65,6 ng/ml (33,8-94,5 ng/ml) volt. A myeloma multiplex miatt kezelt betegeknél (n=50) az átlag syndecan-1 koncentráció 223,8ng/ml volt (36-508ng/ml). Tehát a MGUS ill. soliter plasmocytoma esetén észlelt szérum syndecan-1 koncentráció szignifikánsan különbözött a myelomás betegeknél észlelttol. Statisztikailag szignifikánsan különbözött a szérum syndecan-1 koncentráció az egyes Salmon Durie alcsoportokban (12. ábra). A nagyobb tumortömeggel párhuzamosan magasabb szérum syndecan-1 koncentrációt észleltünk. Szérum syndecan-1 koncentráció korrelációja ismert prognosztikai faktorokkal MM esetén: A 3. táblázat mutatja a korrelációt a szolubilis szérum syndecan-1 koncentráció ill. az ismert prognosztikai tényezok között myeloma multiplexben szenvedo betegeinknél. Korrelációt találtunk a szérum kreatinin, β2-microglobulin, monoklonális protein koncentrációja valamint a csontveloi plazmasejtszám és a szérum syndecan-1 koncentráció között. 21

22 6 hónapos utánkövetés eredményei MGUS ill. myeloma multiplex esetén: A 6 hónapos utánkövetési ido alatt a klinikailag stabil MGUS-ban szenvedo betegeknél (n=13) nem változott a szérum syndecan-1 koncentráció. Tizenöt, korábban kemoterápiás kezelésben még nem részesült myelomás beteget követtünk a kemoterápia során. 7 beteg ICOMP, 8 beteg pedig VAD protokoll szerinti citosztatikus kezelésben részesült. Minden betegnél biszfoszfonat kezelést is alkalmaztunk. A szérum syndecan-1 szintet a kemoterápia megkezdése elott, valamint a hat hónapos kemoterápiát követoen határoztuk meg. Ahogyan azt a 13. ábra mutatja, az átlagos syndecan-1 koncentráció szignifikáns mértékben csökkent azoknál a betegeknél, akik reagálták a kemoterápiára, nem változott azonban a syndecan-1 koncentráció a terápiára rezisztens betegek esetén. 22

23 Megbeszélés Myeloma multiplex (MM) egy klonális plazmasejt-betegség, melyet a 10%-ot meghaladó csontveloi plazmasejtszám vagy plasmocytoma jelenléte valamint a következok közül legalább egy jelenléte jellemez: szérumban monoklonalis fehérje (M-protein) jelenléte (>30g/l), vizeletben M-protein, osteolítikus csontlézió. A stádiumbesorolás a Salmon-Durie kritériumrendszer alapján történik, a csontveloi plazmasejtszám, hypercalcaemia, anaemia jelenléte és mértéke, monoklonalis protein mennyisége ill. a csontléziók száma, valamint a vesekárosodás megléte ill. hiány alapján (70). Ismert más klonalis plazmasejt-betegség is, az ismeretlen jelentoségu monoklonalis gammopathia (MGUS-monoclonal gammopathia of unknown significance), a smoldering (parázsló) myeloma, valamint a soliter plasmocytoma. A MGUS jellemzoje, hogy a monoclonalis protein mennyisége kevesebb, mint 30g/l, a csontveloi plazmasejtszám kevesebb, mint 10%, nincs osteolitikus csontelváltozás, anaemia, hypercalcaemia, vesekárosodás (71). Nem ismerünk olyan prognosztikai faktort, amely a diagnóziskor elore jelezné a MGUS myeloma multiplexbe történo transzformálódását. A legfontosabb prediktor tényezonek a diagnóziskor észlelt M-komponens mennyisége bizonyult (72). Gyakrabban alakult ki MM IgA monoclonalis gammopathia esetén (73), szintén prognosztikai tényezonek bizonyult a csontveloi plazmasejtszám (74). A konvencionális citogenetika vizsgálat nem segíti a MGUS és a MM elkülönítést, mert a 13q deleció MGUS-ban az esetek 25%- ban kimutatható (75). Ez a betegcsoport kezelést nem igényel, de a betegek követése indokolt, mert 25%-ban MM, ritkábban plasmoblastoma, amyloidosis ill. non-hodgkin lymphoma alakul ki. Parázsló myelomára jellemzo a mérsékelten emelkedett M-protein mennyiség ( 30g/l), az emelkedett csontveloi plazmasejtszám ( 10%), de nincs csontlézió anaemia, hypercalcaemia, veselézió. A plazmasejtek festodési indexe alacsony (76). Hasonlóan a MGUS-hoz ez a betegcsoport sem igényel kezelést csak szoros megfigyelést. 23

24 A negyedik entitás a soliter plasmocytoma, amelynek a diagnózisa akkor állítható fel, ha a csontelváltozás szövettani vizsgálat plasmocytomat igazol, a csontveloi plazmasejtszám kevesebb, mint 10%, valamint nincs anaemia, hypercalcaemia, veseérintettség (77). Sugárterápia mellett a 10 éves betegségmentes túlélés 25-40% (77,78). A relapszus rizikója nagyobb a nonszekretoros esetekben, szekunder antiteshiány ill. a terápiát követoen is perzisztáló monoclonalis protein esetén (78). A myeloma multiplex esetén a terápia megválasztásakor a beteg életkorát, társbetegségei mellett alapvetoen az ismert prognosztikai tényezoket kell figyelembe venni. A prognózis megítélésére korábban a Salmon-Durie kritériumrendszert alkalmazták (70). Az új képalkotó eljárások, elsosorban az MRI, pontosabb anatómiai megítélést tett lehetové, így ma már ezt is figyelembe veszi a Salmon-Durie PLUS kritériumrendszer (79). A SWOG ajánlás alapján a prognózis megítélése a szérum β2-microglobulin és albumin koncentráció alapján történik (80). Az IFM kritériumrendszer a prognózis megítélésekor már figyelembe veszi a genetikai abnormalitásokat, így a 13-as kromoszóma deléciót is (81). Az IPI ( International Prognostic Index) kritériumrendszerben a prognózis megítélése az életkor, szérum kreatinin, LDH, CRP, β2-microglobulin és albumin koncentráció, thrombocytaszám valamint a 13-as kromoszóma deléció illetve komplex kromoszóma abnormalitások jelenléte alapján történik (82). A rizikóadaptált kezeléshez azonban további prognosztkai tényezok megismerése feltétlenül szükséges. A magas szolubilis syndecan-1 koncentráció rossz prognosztikai markernek tekintheto fej-nyak daganatok esetén (83,84). Igazolták, hogy a myelomasejtek levedlik felszínükrol a syndecan-1 fehérjét a szérumba (85). Szemikvantitativ módszerrel vizsgálva 20 myelomás betegnél a szérum syndecan-1 koncentrációt, 7 beteg esetén emelkedést észleltek. A magas szérum syndecan-1 koncentráció korrelációt mutatott a béta2-microglobulin koncentrációval valamint az emelkedett csontveloi plazmasejtszámmal (85,86). 138 myeloma multiplexben szenvedo beteget vizsgálva a szérum syndecan-1 koncentrációt független prognosztikai faktornak találták a béta-2 mikroglobulin ill. a WHO performance statusz mellett (87,88). Igazolták, hogy a szolubilis syndecan-1 a csontveloben is nagy koncentrációban van jelen (89,90). 24

25 A sejtfelszíni syndecan-1 számos biológiai funkcióval rendelkezik, fontos a sejtadhézió és migráció szabályozásában, az intercelluláris és a sejt-mátrix interakciókban, szerepet játszhat a transzformált plazmasejtek csontvelobe történo homing mechanizmusában is (91). A csontveloi szolubilis syndecan-1 akkumuláció a növekedési faktorok csontveloi felszaporodásához vezet (91,92). Klinikai vizsgálatunk eredménye alapján myeloma multiplex esetén szignifikánsan magasabb a szérum syndecan-1 koncentráció, mint MGUS ill. soliter plasmocytoma esetén. Összehasonlítva a szérum syndecan-1 koncentrációt a Salmon-Durie alcsoportokban, szintén szignifikáns különbséget észleltünk. Korrelációt igazoltunk a szérum szolubilis syndecan-1 ill. a szérum β2-microglobulin, monoklonális protein koncentráció valamint a csontveloi plazmasejtszám között. A szérum syndecan-1 koncentráció szignifikáns csökkenését észleltük a terápiára reagáló myelomás betegeknél, mig a terápiarezisztens betegek esetén nem változott a szérum syndecan-1 koncentrációja. Szintén megjegyzést érdemel, hogy 2 nonszekretoros myelomás betegünknél alacsony szérum syndecan-1 szintet észleltünk. Ez az eredmény felveti a lehetoségét, hogy összefüggés lehet az immunglobulin és a syndecan-1 expressziója között. Eredményeink szoros korrelációt igazoltak a szérum kreatinin valamint a szérum béta2-microglobulin és syndecan-1 koncentráció között. Ennek magyarázata lehet, hogy rossz vesefunkció mellett a béta2-microglobulinhoz hasonlóan a syndecan-1 akkumulálódhat, de további vizsgálatok szükségesek az összefüggés megértéséhez. Eredményeink alapján a magas szérum syndecan-1 koncentráció rossz prognosztikai tényezo myeloma multiplex esetén. A szérum syndecan-1 koncentráció változása jó jelzoje a terápiás válasznak. In vitro vizsgálatok eredménye, hogy szolubilis syndecan-1 gátolja a myelomasejtek növekedését, látszólag ellentmondásban van eredményünkkel, hogy in vivo a magas szérum syndecan-1 koncentráció rossz prognosztikai jel. Ennek magyarázata lehet, hogy a szolubilis syndecan-1 növekedési faktorokat köt, megvédve ezáltal azokat a degradációtól, míg a sejtfelszíni syndecan-1 elosegíti a myelomasejtek adhézióját, gátolva a tumorsejt invázióját (93). A myeloma multiplex kezelése napjainkban sem megoldott. A kezelésre adott válasz a konszenzuskonferenciák állásfoglalása alapján lehet: 25

26 a) komplett remisszió, amelyet a kevesebb, mint 5%-os csontveloi plazmasejtszám, a monoclonalis fehérjr eltunése (immunfixációval több mint 6 hétig nem mutatható ki), változatlan csontstátusz, a lágyrész plasmocytoma eltunése jellemez, b) komplett válasz esetén a szérum M-protein mennyisége 90%-al csökken, csontveloi plazmasejtszám kevesebb, mint 5%, változatlan csontstátusz, a lágyrész plasmocytoma eltunik, c) részleges válasz esetén a a szérum M-protein mennyisége 50%-al csökken, non-szekretoros myeloma esetén a csontveloi plazmasejtszám 50%-al csökken, a litikus csontelváltozások száma nem no és lágyrész plasmocytoma mérete 50%-al csökken, d) minimális válasz esetén a monoclonalis protein mennyisége 25-49%-al, a 24 órás könnyülánc ürités 50-89% csökken, a lágyrész plasmocytoma mérete 25-49%- al csökken változatlan csontstátusz mellett (94). A hagyományos melphalán, prednisolon alapú kezelésre (MP) a betegek 40-60%-a reagál, komplett terápiás válasz kevesebb, mint 10%, az átlagos túlélés 3 év, az ötéves túlélés 24% (95). A cyclophophamid a melphalánnal azonos hatékonyságúnak bizonyult (96). Az α-interferon elsosorban fenntartó kezelésként jön szóba, a túlélést nem javítja, de egyes vizsgálatokban megnyújtotta a platófázis idotartamát (97), mást vizsgálatok azonban ezt nem erosítették meg (98). A kombinált kemoterápiás prokollok (pl: VBMCP: vincristin, carmustin, melphalan, cyclophosphamid, VAD: vincristin, adriamycin, dexamethason) alkalmazása esetén a terápiás válasz 70%, ám az ötéves túlélés nem volt szignifikánsan jobb, mint a MP kezelés esetén (99, 100). Az autológ ossejt-transzplantáció védelemben végzett nagy dózisú kemoterápia eredménye lényegesen jobb, a komplett remisszió aránya 30-50%, a 6 éves túlélés 43%, még a kezeléssel összefüggo mortalitás kevesebb, mint 10% volt (101). Az egyetlen potenciálisan kurativ terápia az allogén csontveloátültetés lenne, ám a beavatkozással összefüggo mortalitása igen magas. 162 beteg adatát feldolgozva 34% volt a 6 éves progressziómentes túlélés, de a transzplantációval összefüggo halálozás 41% volt (102). A thalidomid kedvezo hatását igazolták transplantáció ill. kemoterápia utáni relapsusban, a betegek 25%-ban észleltek terápiás választ, a remisszió átlagos idotartama 7 hónap volt (20,103). Fázis II vizsgálatokban vizsgálják egy proteoszóma-inhibitor, PS-341 hatékonyságát, 41%-ban észleltek terápiás választ refrakter vagy relabált myelomas betegek esetén (104,105). További terápiás lehetoség lehet az immunmoduláció, fázis I vizsgálatban refrakter vagy 26

27 relabált myelomas betegeknél a CC-5013 kezelés mellett 25%-ban alakult ki parciális válasz (106). Fenti eredmények alapján a myeloma multiplex kemoterápiás kezelése még nem megoldott, így az új, elsosorban antiproliferativ és proapoptotikus támadáspontú gyógyszerek kifejlesztése és a rizikóadaptált terápia az érdeklodés középpontjában áll. Számos klinikai vizsgálatban használták a sztatinokat a kemoterápia kiegészítésére. Fázis I vizsgálatban egy anaplasztikus astrocytomában szenvedo betegnél havonta egy hétig per os mg/kg/nap dózisú lovastatin kezelést alkalmazva pozitív klinikai válasz alakult ki (107). Hatástalan volt a lovastatin terápia emlo, prostata, ovarium, illetve primer központi idegrendszeri daganatok esetén (107). Fázis II vizgálatban nagy dózisú lovastatin (35 mg/kg/nap per os négy hetente egy hétig) 14 gyomorrák miatt kezelt betegbol 1 beteg esetén eredményezett klinikai választ. Lovastatin kezelést a betegek jól tolerálták, sem neurológiai, sem vese- vagy hepatotoxicitás nem jelentkezett (108). Egy idos, relabált AML miatt kezelt betegnél 54 napos, 2 mg/kg/nap dózisú lovastatin kezelés csökkentette a blasztszámot a gyógyszerszedés ideje alatt (109). Hepatocelluláris carcinoma esetén 5-FU és 0,5 mg/kg/nap pravastatin kombinált kezelés megkettozte az átlagos túlélést (110). In vitro vizsgálatunkban, U266 humán myeloma sejtvonalon a mevastatin apoptózist indukált. Az apoptózis során kaszpáz-3 aktiváció alakult ki. A kaszpáz-3 aktiváció szinte minden esetben az apoptózis központi végrehajtó lépése. Ezt segíti elo a kaszpáz-8 és/vagy a kaszpáz-9 aktiválása. A kaszpáz-8- at mind a halálreceptorok, mind más kaszpázok (pl. kaszpáz 3) aktiválhatják. Az U266 sejtvonalon a mevastatin-indukált apoptózis halálligandoktól függetlennek bizonyult, mert neutralizáló antitestek (TRAIL-R2FC, anti-tnfalfa, NOK1) nem gátolták az apoptózist. A kaszpáz-8 a BID hasításán át segíti elo a mitokondriumból a cytokrom-c felszabadulását. A cytokrom-c az apoptoszóma részeként aktiválja az effektor kaszpázokat, foleg a kaszpáz-3-at (111). Számos adat bizonyítja, hogy a mevastatin elsosorban az apoptózis mitokondriális útját aktiválja. DiOC 6 segítségével igazoltuk, hogy az apoptózis során a kezelést követoen 48 órával mitokondrium-depolarizáció alakul ki. A folyamat során a BCL-2 expresszió csökkent, mind mrns, mind fehérjeszinten. A BAX expresszió változatlan maradt, de konfokális mikroszkóppal igazoltuk, hogy a BAX a citoszolból a mitokondriumba 27

28 transzlokálódott, azaz aktiválódott. A mitokondriális út szerepére utal az is, hogy kaszpáz-9 inhibitorral gátolható volt az apoptózis, valamint, hogy az apoptózis viszonylag lassan, a mevastatin kezelés 48. órájában alakult ki. In vitro vizsgálatban igazolták, hogy a myelomasejtek apoptózisuk során levedlik felszínükrol a syndecan extracellularis doménjét (112). Ezt a jelenséget mi is megfigyeltük mevastatin kezelés után. Fenti eredmények alapján a mevastatin a daganatsejtek apoptózisának indukciójával a kemoterápia kiegészítéseként javíthatja a terápiás választ myeloma multiplex esetén. Tekintettel a sztatinok alacsony általános toxicitására, a nem transzformált sejtekre gyakorolt minimális citotoxicitásra, az ismert hagyományos cytostatikumok hatását potencirozhatja.. 28