Szalai Renáta A CITOKRÓM P450 ENZIMRENDSZER FARMAKOGENETIKAILAG JELENTŐS POLIMORFIZMUSAINAK VIZSGÁLATA MAGYAR ÉS ROMA POPULÁCIÓBAN.

Átírás

1 A CITOKRÓM P450 ENZIMRENDSZER FARMAKOGENETIKAILAG JELENTŐS POLIMORFIZMUSAINAK VIZSGÁLATA MAGYAR ÉS ROMA POPULÁCIÓBAN PhD értekezés Szalai Renáta Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Sümegi Balázs Témavezető: Prof. Dr. Melegh Béla PTE KK Orvosi Genetikai Intézet Pécs, 2015

2 Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS Gyógyszermetabolizmus farmakogenetikája Citokróm P450 enzimrendszer CYP1A2 genetikája CYP1B1 genetikája CYP2C8 genetikája CYP3A5 genetikája CYP4F2 genetikája Taxán vegyületek Antikoaguláns gyógyszerek Roma populáció bemutatása CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Vizsgált populációk Molekuláris biológiai módszerek DNS izolálás PCR reakció RFLP Real time-pcr Direkt szekvenálás Statisztikai módszerek EREDMÉNYEK CYP1A2 gén Taxán terápiát befolyásoló citokróm P450 gének CYP1B1 gén CYP2C8 gén CYP3A5 gén CYP4F2 gén EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE ÉS KÖVETKEZTETÉSEK EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE IRODALOMJEGYZÉK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

3 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ABC BBMRI COPD CYP EM GWAS ht IM NSAID OATP PAH PCG PCR PM RBC RFLP SLC SNP UM wt 5 -UTR ATP-binding casette (ATP-kötő kazetta) Biobanking and Biomolecular Resources Research Infrastructure chronic obstructive pulmonary disease (krónikus obstruktív tüdőbetegség) citokróm P450 extenzív metabolizáló genome-wide association study (genomszintű asszociációs tanulmány) haplotípus intermedier metabolizáló nonsteroidal anti-inflammatory drug (nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszer) organic anion-transporting polypeptide policiklusos aromás szénhidrogén primer congenitalis glaucoma polymerase chain reaction (polimeráz láncreakció) poor metabolizer (gyengén metabolizáló) red blood cell (vörösvértest) restriction fragment length polymorphism (restrikciós fragmenthossz polimorfizmus) solute carrier transporter single nucleotide polymorphism (egypontos nukleotid polimorfizmus) ultragyors metabolizáló wild type (vad típus) 5 - untranslated region (5 - nem transzlálódó régió) 3

4 1. BEVEZETÉS Az első megfigyelések a farmakogenetika történetében az 1930-as években kezdődtek és csupán néhány ritka véletlennek köszönhetően kialakult extrém reakció tanulmányozására vezethetők vissza. Ezek a fenotípusok a szokásos gyógyszeres kezelésre adott szokatlan válaszon, vagy egyéb környezeti faktorok által kiváltott abnormális reakciókon alapultak. A személyre szabott orvoslásra való igényt Sir William Osler ( ) kanadai orvos már az 1800-as években megfogalmazta, aki szerint Ha nem lenne az egyének közötti hatalmas variabilitás, akkor az orvoslást pusztán tudománynak tekinthetnénk és nem művészetnek. Mégis a farmakogenetika fogalmának bevezetése csak az 1950-es évek végére tehető (1959), Friedrich Vogel ( ) német humán genetikus nevéhez fűződik. A gyógyszerválaszban jelentkező interindividuális variabilitás egy gyakori, komplex probléma az orvosi klinikai gyakorlatban. Ezeket az egyedi különbségeket okozhatják a gyógyszer adszorpciójában, eloszlásában, metabolizmusában és exkréciójában mutatkozó eltérések, melyeknek hátterében genetikailag determinált faktorok állhatnak. A gyógyszerhatásban megmutatkozó egyének közötti különbségek oka 20-95%-ban a különböző genetikai háttérrel magyarázható. Az enzimek szubsztrát specificitásában jelentkező átfedések, a genetikai polimorfizmusok nagy száma és a különböző etnikai csoportok között észlelt variációk megnehezítik a kezelés hatékonyságának predikcióját. A farmakogenetikai vizsgálatok középpontjában elsősorban olyan receptorok, transzport fehérjék, target proteinek és gyógyszer metabolizáló enzimek állnak, melyek heterogenitásáért olyan genetikai variánsok felelősek, melyek hatással vannak az egyéni gyógyszerválaszra mind a terápiás hatás, mind pedig a mellékhatások tekintetében. A napi szinten alkalmazott gyógyszerek a betegek 50-60%-ánál hatástalannak bizonyulnak, a súlyos és fatális mellékhatások évente százezrek haláláért és milliók kórházi gondozásáért tehetők felelőssé. Európai adatok alapján a súlyos gyógyszerhatás az ötödik leggyakoribb halálok, évente csaknem 200 ezer haláleset hozható vele összefüggésbe. Az emiatt keletkező többletköltség évente nyolcvanmilliárd euróra becsülhető. Ezeket a tényeket szem előtt tartva az egyénre szabott orvoslás kertein belül egy korszerűbb, prevenciós, genetikai információn alapuló szemlélet kialakítása lenne a cél farmakogenetikai vizsgálatok segítségével. A genetikai és környezeti tényezők együttes figyelembevételével lehetőség nyílhat az optimális terápia kiválasztására és a gyógyszer dózisának pontos meghatározására, elkerülve a nem kívánt mellékhatásokat és a terápiás kudarcot. 4

5 1.1. Gyógyszermetabolizmus farmakogenetikája Farmakokinetikailag fontos lépés a szervezetbe került gyógyszerek és más idegen anyagok (xenobiotikumok) eliminációjában a metabolizmus folyamata, mely eredményeként vízoldékonyabb, könnyebben kiválasztható termék keletkezik [1]. Az enzimek által katalizált biotranszformációs folyamatok során inaktív, aktív vagy toxikus metabolitok keletkeznek [2, 3]. A metabolizmus elsődleges színtere a máj, de más szövetek, szervek is rendelkeznek metabolikus aktivitással, mint például a tüdő, vese, vékonybél, bőr és a placenta [4]. Ezek alapján beszélhetünk hepatikus-mikroszomális enzimekkel történő, hepatikus nem mikroszomális enzimek segítségével végbemenő és extrahepatikus metabolizmusról (1. ábra) [4]. 1. ábra A szervezeten belüli gyógyszereliminációs utak százalékos megoszlása (Functional pharmacogenetics/genomics of human cytochromes P450 involved in drug biotransformation. Zanger UM. Anal Bioanal Chem. 2008) Farmakológiai klasszifikáció alapján a gyógyszerek metabolizmusában két fő fázist különítenek el, a fázis I és fázis II reakciókat [5]. A fontosabb fázis I és fázis II reakciókat az 1. táblázat foglalja össze. A fázis I reakciókat alkotják a májsejtek endoplazmatikus retikulumában lejátszódó (mikroszomális) ún. előkészítő vagy funkcionalizációs reakciók (oxidáció, redukció, hidrolízis). Ezen folyamatok 90%-át monooxigenáz enzimek katalizálják, 5

6 melyek közül legfontosabb a citokróm P450 enzimrendszer [6]. A fázis II konjugációs reakciókban a metabolit valamilyen endogén szubsztráttal konjugálódva tovább fokozza a vegyület hidrofil tulajdonságát. Ezek az acetilációs, glükuronizációs, szulfatációs, metilációs reakciók a citoszolban zajlanak le. Farmakogenetikai szempontból a legfontosabb fázis II enzimeket kódoló polimorf gének a NAT2 (N-acetil-transzferáz), UGT1A1 (UDP-glükuroniltranszferáz) és TPMT (thiopurin-s-metiltranszferáz) [2, 5, 7]. A metabolizmust követően transzportfehérjék segítségével a már poláros, konjugálódott molekula szekretálódik a sejtből. A transzportfehérjéket kódoló génekben (pl.: MDR1, SLCO1B1) előforduló mutációk megváltoztathatják a hatóanyag biológiai elérhetőségét, multidrog rezisztenciához és más betegségek kialakulásához (cisztás fibrózis, Dubin-Johnson szindróma, Tangier kór) vezethetnek [8, 9]. 1. táblázat Fázis I és fázis II reakciók, enzimek és fontosabb szubsztrátjaik Reakció típusa Enzim Gén Szubsztrát Fázis I Fázis II CYP1A2 koffein, warfarin CYP2C9 warfarin, fenitoin Citokróm P450 CYP2C19 omeprazol, mefenitoin CYP2D6 debrizokvin, kodein Oxidáció CYP3A4 statinok, clopidogrel CYP2E1 etanol, halotán Dihidropirimidin-dehidrogenáz DPYD fluorouracil Aldehid-dehidrogenáz ALDH ciklofoszfamid, heroin Alkohol-dehidrogenáz ADH etanol, retinol Hidrolízis Butiril-kolinészteráz BCHE szukcinilkolin Acetiláció N-acetil-transzferáz NAT2 izoniazid, koffein Glükuronizáció UDP-glükuronil-transzferáz UGT1A1 irinotecan, bilirubin Metiláció Tiopurin-S-metiltranszferáz TPMT azatioprin, merkaptopurin Katekol-O-metiltranszferáz COMT katekolaminok 6

7 Genetikailag polimorf enzim által metabolizált, standard dózisban alkalmazott gyógyszer klinikai hatása más-más módon és mértékben változhat meg, toxicitást, elnyújtott terápiás hatást vagy hatástalanságot okozva. Míg egyes enzimek tekintetében a monogénes polimorfizmusok már önmagukban is magyarázzák a variabilitás legnagyobb részét (pl.: CYP2D6), a legtöbb esetben további polimorfizmus jelenléte, epigenetikai és környezeti tényezők egyaránt hatással lehetnek a génexpresszióra [2, 10]. Funkcióvesztéses mutáció csökkent clearence értéket és a gyógyszer emelkedett plazmakoncentrációját, míg funkciónyeréses polimorfizmus emelkedett clearence-t és alacsonyabb gyógyszer koncentrációt eredményez [10]. A nem DNS szekvencia variáción alapuló ún. epigenetikai regulátorok (DNS metiláció, hiszton modifikáció, mikro RNS-ek) szintén fontos szerepet játszanak a gyógyszerek metabolizmusában és a gyógyszerhatás kialakításában. Az epigenetikai mintázat reverzibilis, lehet szövet-specifikus és környezeti tényezők által befolyásolt [10, 11]. A nem genetikai tényezők közül a nem, kor, különböző társuló betegségek jelentősen befolyásolhatják a szervezet gyógyszer metabolizáló képességét. Zhang és munkatársai jelentős eltérést észleltek az mrns expresszió mértékében nők és férfiak között különböző citokróm P450 génekben [12]. Míg a CYP1A2, CYP3A4 és a CYP7A1 női túlsúlyt mutatott, addig férfiakban a CYP3A5 és CYP27B1 gének mutattak fokozottabb expressziót [12]. Az életkor szintén fontos befolyásoló tényező a gyógyszerek biotranszformációjában, különösen a még éretlen enzimrendszerrel rendelkező újszülöttek és az idősebb populáció tekintetében [13]. Idős betegek körében számolni kell az együttesen alkalmazott gyógyszerek potenciális interakcióiból adódó vagy a csökkent vérkeringés és vesefunkció miatt kialakuló gyengébb metabolizáló képességgel [14]. Ezt különösen fontos szem előtt tartani azon gyógyszerek esetében, melyek szűk terápiás tartományúak (antidepresszánsok, antipszichotikumok, antikoagulánsok). Továbbá az infekciók, gyulladások és daganatos megbetegedések során felszabaduló proinflammatorikus citokinek (IL-1ß, TNF-α, IL-6), mint szignál molekulák jelentősen befolyásolhatják a máj génexpressziós profilját, ami a gyógyszer metabolizáló enzimek down-regulációjához vezethet [15, 16]. Funkcionális sajátosságuk, vagyis az enzimaktivitás alapján a gyógyszer metabolizáló enzimek négy fenotípusos csoportját különböztethetjük meg [17]. Az extenzív metabolizáló (EM) csoport normál enzimaktivitással jellemezhető a két funkcionális (vad típusú) allél jelenlétének köszönhetően, amik az eredeti szekvencia szerinti teljes, funkcionális fehérjét kódolják [11]. Ilyen betegek esetében a gyógyszer standard dózisban adva inaktív formává transzformálódik, vagy a prodrug hatásos vegyületté alakul minimális mellékhatással vagy 7

8 mellékhatás nélkül. Az intermedier metabolizáló (IM) csoportban a génpár alléljai közül legalább az egyik csökkent működésű enzimet kódol, így a metabolizmus kismértékű csökkenése emelkedett hatóanyagszinthez és mérsékelt toxicitáshoz vezethet. Az ilyen genotípussal rendelkezők körében a szokásosnál alacsonyabb dózisban kezdve a gyógyszerelést a mellékhatások kivédhetőek [10, 11]. A gyengén metabolizáló (PM) fenotípus esetén hiányzik az aktív allél, gyakrabban kell számolnunk a csökkent metabolizmus miatt emelkedett gyógyszer koncentrációval és toxicitás kialakulásával. Ultragyors metabolizálók (UM) körében nagyobb mennyiségű enzim expresszálódik, mert az érintett gén kettő vagy több példányban van jelen génduplikáció eredményeképpen [11, 18]. Előfordulhat az is, hogy az egyik allél normál mennyiségű fehérjét, a másik pedig egy polimorfizmusnak vagy mutációnak köszönhetően nagyobb mennyiségű, illetve fokozott aktivitású funkcionális fehérjét produkál. Ilyen esetekben a gyors elimináció miatt a klinikai gyakorlatban fennáll az aluldozírozás veszélye. Gyógyszerhatás szempontjából jelentős genetikai különbségek léteznek nem csupán egyének között, de populációs szinten (rassz, etnikum) is [17, 19-22]. Az interetnikai polimorfizmusok lehetnek kozmopoliták és populáció specifikusak. Kozmopolitának nevezzük őket akkor, ha ugyan eltérő frekvenciával, de minden etnikai csoportban jelen vannak, míg a populáció specifikusak gyakoribbak a geográfiailag elszigetelt csoportokban Citokróm P450 enzimrendszer A citokróm P450 (CYP) rendszer az emberi és más alacsonyabb rendű szervezetekben univerzálisan előforduló enzim szupercsalád. A citokróm P450 enzimek legfontosabb feladata a különböző endogén és exogén vegyületek biotranszformációja [5]. Legfontosabb fiziológiai szubsztrátjai közé tartoznak a szteroidok, zsírsavak, prosztaglandinok, leukotriének és biogén aminok [7]. Ezen felül számos xenobiotikum, úgy, mint gyógyszerek, növényi toxinok, környezetből származó mérgező vegyületek átalakítását végzik [7, 23]. A CYP enzimek a fázis I reakciókban túlnyomórészt oxidatív reakciókat katalizáló monooxigenázok, oxidázok és peroxidázok. Fontos szerepet játszanak inaktív prodrug -ok aktív metabolittá alakulásában, mint például a CYP2D6-mediálta kodein-morfin átalakulás [24]. Általában a CYP enzimek nem specifikusak, egy enzim több különböző gyógyszert is képes átalakítani és egy gyógyszer gyakran több enzim révén is metabolizálódhat. A CYP1, CYP2 és CYP3 enzimcsalád felelős a klinikumban alkalmazott gyógyszerek 70-80%-ának fázis I-függő 8

9 metabolizmusáért (2. ábra) [6, 25]. A legtöbb CYP enzim jelentős interindividuális variabilitást mutat, mely részben a genetikai polimorfizmusoknak, részben pedig a különböző mértékű génexpressziónak tulajdonítható. A humán citokróm P450 enzimrendszert 57 funkcionálisan aktív gén és 58 pszeudogén alkotja [10]. A Humán Genom Projekt a szekvencia szimilaritás alapján 18 családot és 44 alcsaládot különböztet meg [26]. A citokróm P450 enzimek klasszifikációjához egy egységes nomenklatúra került kidolgozásra ( E nevezéktanban a CYP1A2*1 példáján a jelölés a következő: a CYP szó a standard rövidítés a humán citkoróm P450-re. Az ezt követő első szám (pl.: 1) jelöli a családot, melybe olyan izoenzimek tartoznak, amelyek fehérje szekvenciájában egymással legalább 40%-os homológiát mutatnak. Az enzimek ugyanazon alcsaládba sorolása 55%-nál nagyobb homológiára utal, megkülönböztetésükre betűt használunk, ami az enzimcsalád rövidítést követi (pl.: A). Az alcsaládok egyes gén tagjait rövidítjük az alcsaládot rövidítő betűt követő számmal (pl.: 2). Az ezt követő csillagos szám jelenti az allélt. A *1 jelölést alkalmazzuk általában a normál enzimaktivitással jellemezhető, vad típusú allélra [24]. 2. ábra Citokróm P450 enzimek által metabolizált gyógyszerek százalékos eloszlása ( 9

10 CYP1A2 genetikája A citokróm P450 1A2 (CYP1A2) gén a 15-ös humán kromoszóma hosszú karján helyezkedik el 15q24.1 pozícióban, 7 exon és 6 intron alkotja, fehérje terméke egy Da molekulatömegű, fázis I típusú enzim [19, 27]. Konstitutívan expresszálódik a májban, emellett expressziója indukálható a tüdőben, hasnyálmirigyben, gasztrointesztinális traktusban és az agyban [28]. A CYP1A2 enzim a klinikumban alkalmazott gyógyszerek körülbelül 11%-át metabolizálja (2. ábra). A CYP1A2 mikroszómális enzim szerepet játszik számos klinikailag fontos gyógyszer (klozapin, paracetamol, verapamil, teofillin, koffein) metabolizmusa mellett olyan endogén szubsztrátok biotranszformációjában, mint a melatonin, bilirubin, ösztradiol [20, 27, 29]. A CYP1A2 gén által kódolt enzim felelős bizonyos prokarcinogén vegyületek, úgy, mint aromás- és heterociklusos aminok, policiklusos aromás szénhidrogének (PAH) metabolikus aktivációjáért is. Az enzim aktivitását egyes környezeti tényezők - vegyszerek, gyógyszerek (protonpumpa-gátlók, orális kontraceptivumok), táplálkozási faktorok, dohányzás befolyásolhatják [27, 30, 31]. A génexpresszióban bekövetkező változások daganatos megbetegedések, infarktus, krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD) és más kórkép kialakulásához vezethetnek [32-37]. A CYP1A2 gén rendkívül variábilis, a leírt polimorfizmusokat a Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature Committee adatbázis ( összegzi. A fontosabb CYP1A2 alléleket, polimorfizmusokat és azok funkcióit a 2. táblázat foglalja össze. Az egy nukleotidot érintő polimorfizmusok (SNP-k) egy része funkcionális jelentőséggel bír, gyakoriságuk figyelemre méltó egyének közötti és interetnikai különbséget mutat [27, 29, 38, 39]. Az interindividuális különbségek szorosra tehetők a CYP1A2 expresszióban és aktivitásban [40]. Az általunk vizsgált négy polimorfizmus a CYP1A2 gén nem-kódoló régióiban helyezkednek el, közülük kettő (rs , rs ) a szabályozó régióban, kettő pedig az első intronban (rs762551, rs ). A vizsgálatainkban szereplő nem-kódoló polimorfimusok elhelyezkedését a 3. ábra szemlélteti. A legalaposabban tanulmányozott CYP1A2 nem-kódoló régióiban elhelyezkedő polimorfizmusok a -3860G>A, -2467delT és -163C>A SNP-k. 10

11 2. táblázat Fontosabb CYP1A2 allélek és polimorfizmusok elhelyezkedése, funkciója Allél SNP Aminosav csere Elhelyezkedés CYP1A2 aktivitás CYP1A2*1A - vad típus - 15q24.1 normál CYP1A1*1B C5347T (N516N) 7. exon ismeretlen CYP1A2*1C G-3860A - enhancer indukció CYP1A2*1D T-2467delT - enhancer ismeretlen CYP1A2*1E T-739G - 1. intron ismeretlen CYP1A2*1F C-163A - 1. intron aktivitás CYP1A2*1J -739G; -163A - 1. intron ismeretlen CYP1A2*1K -729T; -739G; -163A - 1. intron transzkripció CYP1A2*2 C2866G (F21L) 2. exon ismeretlen CYP1A2*3 T5347T (D348N) 4. exon génexpresszió CYP1A2*4 A2499T (I383F) 5. exon génexpresszió CYP1A2*5 G3497A (C406Y) 6. exon ismeretlen CYP1A2*6 G5090T (R431W) 7. exon génexpresszió CYP1A2*7 G3533A - 6. intron splicing defektus CYP1A2*8 G5166A (R456H) 7. exon génexpresszió CYP1A2*9 C248T (T38M) 2. exon ismeretlen CYP1A2*10 G502C (E168Q) 2. exon ismeretlen CYP1A2*11 C558A (F186L) 2. exon génexpresszió CYP1A2*12 A634T (S212C) 2. exon ismeretlen CYP1A2*13 G1514A (G299S) 3. exon ismeretlen CYP1A2*14 C5112T (T438I) 7. exon normál CYP1A2*15 C125G (P42R) 2. exon génexpresszió CYP1A2*16 G2473A (R377Q) 5. exon génexpresszió ( 11

12 3. ábra Általunk vizsgált CYP1A2 nem-kódoló SNP-k lokalizációja (Insights into the substrate specificity, inhibitors, regulation, and polymorphisms and the clinical impact of human cytochrome P450 1A2. AAPS J 11, Zhou 2009.) A -3860G>A (CYP1A2*1C, rs ) variáns, mely a CYP1A2 gén enhancer régiójában foglal helyet, csökkent enzimaktivitást eredményez megváltoztatva egy nem meghatározott transzkripciós faktor kötőhelyét [31, 41]. Korábbi vizsgálatok bizonyították, hogy a CYP1A2*1C variánst hordozó betegek esetében a prodrugként alkalmazott gyógyszerek biotranszformációja alacsonyabb, ami a gyógyszer csökkent biológiai elérhetősége és hatékonysága miatt a betegség súlyosbodásához vezet [39, 42, 43]. A CYP1A2 enzim hatását a legnagyobb mértékben a -2467delT (CYP1A2*1D, rs ) polimorfizmus befolyásolja. A CYP1A2 gén promoter régiójában, pozícióban található timin deléció egy megváltozott transzkripciós faktor kötőhelyet hoz létre egy rövid DNS szakaszon, az ún. xenobiotikum reszponzív elemben, ezáltal stimulálja a CYP1A2 gén transzkripcióját a dohányfüstben megtalálható komponensek jelenlétében [44]. A CYP1A2*1D variáns hordozása egyes népcsoportokban fokozott kockázatot jelent COPDre és tüdőrák kialakulására főként dohányzó férfiakban [44, 45]. 12

13 A CYP1A2 gén első intronjában elhelyezkedő -163C>A (CYP1A2*1F, rs762551) polimorfizmus az enzim fokozott indukciójával hozható összefüggésbe, ami a gyakorlatban konvencionális dózisban alkalmazott CYP1A2 szubsztrát gyógyszerre nézve csökkent terápiás hatást eredményez [35, 46, 47]. Tian és munkatársainak munkája, valamint Bu és kutatócsoportjának metaanalízise rávilágított, hogy kaukázusi populációban a CYP1A2*1F SNP hordozása kapcsolatba hozható különböző daganatos megbetegedések kialakulásával [36]. A CYP1A2-729C>T (rs ) SNP fontos hatással lehet a karcinogén vegyületek bioaktivációjára, a -729T allélnek tulajdonítható csökkent génexpresszió révén, ami hatással lehet egyes gyógyszerek metabolizmusára [29, 41]. A*1K haplotípus (-163C>A, -739T>G, -729C>T) fontos eleme a -729C>T polimorfizmus, ami 40%-kal csökkent enzimindukcióval hozható összefüggésbe, szintén az első intronban foglal helyet [29]. Számos, a CYP1A2 gén kódoló régióit érintő, többnyire aminosav szubsztitúciót eredményező, ritka SNP (CYP1A2*2 - *16) került leírásra. Ezeknek a variánsoknak a funkciója vagy ismeretlen, vagy csökkent génexpressziót, esetleg splicing defektust okoznak (*7), jellemzően nagyon alacsony előfordulási gyakorisággal (0,5-1%) (2. táblázat) [27] CYP1B1 genetikája A citokróm P450 1B1 (CYP1B1) gén egy hem-tiolát NADPH-függő monooxigenáz enzimet kódol a 2p21-22 humán kromoszóma pozícióban [48, 49]. A gént 3 exon és 2 intron alkotja 12 kbp hosszú régión keresztül [49]. A CYP1B1 elsődleges feladata szteroid hormonok, terápiás gyógyszerek metabolizmusa és a környezetből származó toxinok detoxifikációja [50-52]. A CYP1B1 az egyik legfontosabb fázis I enzim a prokarcinogén vegyületek reaktív metabolittá alakításában és klinikailag fontos daganat ellenes gyógyszerek metabolizmusában, mint a tamoxifen és a flutamid [52, 53]. A CYP1B1 konstitutívan expresszálódik a tüdőben és szteroid célszervek szöveteiben, mint a méh, mell, petefészek, here, prosztata és mellékvese [48, 54]. A környezeti szennyezőanyagok (pl.:pah) metabolikus aktivációja mellett a 17ß-ösztradiol metabolizmusban is szerepet játszik, így jelentős mértékben járul hozzá a hormon mediált karcinogenezishez [48, 49, 55, 56]. Napjainkig a polimorf CYP1B1 génben *1-*26-ig számos allél került leírásra ( Ezek közül jónéhány SNP-t hoztak összefüggésbe daganatos megbetegedésekre való fokozott hajlammal. A leginkább CYP1B1 variáns 13

14 jelenlétével kapcsolatos rákos megbetegedések közé sorolják a petefészek-, endometrium-, vese-, prosztata-, tüdő-, fej-nyaki daganatokat kaukázusi és ázsiai populációkban [57, 58]. A legrészletesebben tanulmányozott variáns allélok a CYP1B1*2, *3, *4 és *7, melyek jelenléte funkcionális vizsgálatokban fokozott CYP1B1 mrns expressziót és erősebb hidroxilációs aktivitást eredményezett, összehasonlítva a CYP1B1*1 vad típusú alléllal [59, 60]. A CYP1B1*2 allélen, két kapcsolt polimorfizmus, nevezetesen a c.142c>g (p.arg48gly) és c.355g>t (p.ala119ser) együttes előfordulását értjük ( A CYP1B1*2 hordozása összefüggésben áll fejnyaki daganatok kialakulásával és koraszülésre való emelkedett kockázattal [61, 62]. Egyes vizsgálatokból kiderült, hogy a CYP1B1*3 (c. 4326C>G; p.leu432val) variáns hordozása és az idiopátiás férfi infertilitás, endometrium daganat, nyitott zugú glaukoma, valamint tüdő daganat előfordulása között kapcsolat mutatható ki [57, 58]. A CYP1B1*3 polimorfizmus a leggyakoribb SNP-nek számít észak-indiai populációban 48,8%-os frekvenciával, ezt követi a CYP1B1*4 47,3%-kal, majd a CYP1B1*2 39%-os gyakorisággal és a CYP1B1*7 16,5%-kal [54]. A CYP1B1 *3/*3 homozigóta variáns genotípus kaukázusi populációban mérsékelt kockázatot jelent endometrium daganatra [63]. Továbbá egyes elképzelések szerint a CYP1B1*3 genotípus modulálhatja a docetaxel kezelésre adott választ a fokozott ösztrogén metabolizmusnak köszönhetően [63]. A CYP1B1 nem metabolizálja a taxán vegyület docetaxelt, mégis a CYP1B1 gén túlexpressziója docetaxel rezisztenciával társul, mivel csökken a hatásos gyógyszer koncentráció a rákos sejtekben [64]. A CYP1B1*3 allélt hordozók körében szignifikánsan alacsonyabb gyakorisággal fordul elő hiperszenzitív reakció taxán kezelést követően [65]. Mivel a CYP1B1 génben bekövetkező mutációk állnak elsődlegesen az autoszomális recesszív módon öröklődő primer congenitalis glaucoma (PCG) hátterében, úgy vélik, hogy a CYP1B1 enzim szerepet játszik egy valószínűleg szteroid természetű, a szem fejlődéséhez nélkülözhetetlen szignál molekula metabolizmusában [66-68]. Li és munkatársai PCG-s betegek CYP1B1 mutációit összegző összefoglaló közleményükben beszámoltak arról, hogy roma populációban a misszensz c.7996g>a (E387K) founder mutációnak bizonyult a CYP1B1 génben 79,63%-os prevalenciával. Kaukázusi populációban a legközönségesebben előforduló mutációnak a c.7940g>a (R368H) bizonyult [55]. 14

15 CYP2C8 genetikája A fázis I metabolizmusban szerepet játszó citokróm P450 2C8 (CYP2C8) polipeptid sokféle különböző xenobiotikum és endogén vegyület biotranszformációjáért felelős [69]. A máj összes CYP enzimeinek körülbelül 7%-át adja, továbbá kisebb mértékben expresszálódik a vesében, mellékvesében, agyban, petefészekben, uterusban és a duodenumban [70, 71]. A CYP2C8 enzim végzi a klinikumban alkalmazott gyógyszerek 5%-ának oxidatív metabolizmusát, köztük struktúrálisan meglehetősen heterogén vegyületek átalakítását, ami az enzim szubsztrát kötő aktív centrumának felépítésével áll összefüggésben [72]. Az enzim aktív centrumának mérete hasonló a CYP3A4 enzim aktív centrumának méretéhez, de alakjában különbözik, ez magyarázhatja a két gyógyszer metabolizáló enzim nagy mértékben átfedő szubsztrát specificitását, de eltérő metabolikus profilját [70, 73]. A CYP2C8 enzim fő szubsztrátjai közé tartoznak az aminokinolin, antiarrythmiás, leukotrién antagonista és taxán gyógyszerek, de kisebb mértékben részt vesz számtalan más vegyület csoport átalakításában is, úgy, mint nem szteroid gyulladáscsökkentők (NSAID), statinok, kálcium csatorna blokkolók, ópioid és tirozin-kináz gátló szerek [74-76]. Több korábbi tanulmány számol be arról, hogy in vivo és in vitro vizsgálatok során a CYP2C8 enzim legfontosabb inhibitora a koleszterin szint csökkentésére alkalmazott gemfibrozil hatóanyag [77-80]. A CYP2C alcsalád legjelentősebb mértékben indukálható tagja a CYP2C8, transzkripciós aktivációja a nukleáris pregnán X (NR1I2) -, konstitutív androsztán (NR1I3) - és glükokortikoid (NR3C1) receptor által közvetített. Indukciójában részt vevő in vitro upregulátor a rifampicin, dexametazon és a fenobarbitál [69]. A CYP2C8 gén lokalizációja a 10q24.1 pozícióra tehető, a CYP2C klaszter legkisebb tagjának számít. A 31 kb hosszú gént 9 exon alkotja [71, 81]. A CYP2C8 interindividuális variábilitása, mind a fehérje expressziójában, mind pedig az enzim katalitikus aktivitásában a nagy számú genetikai polimorfizmus jelenlétének köszönhető. A fontosabb polimorfizmusokat a CYP2C8 génben a 4. ábra szemlélteti. Mára több mint 450 SNP-t azonosítottak a CYP2C8 génben, melyek jelentősen befolyásolhatják a CYP2C8 mediált metabolizmust és hatással lehetnek a gyógyszerválaszra, különös tekintettel azokra a variánsokra, melyek a kódoló régióban foglalnak helyet [82, 83]. A CYP2C8 promoter régiójában azonosított SNP-k, a CYP2C8*1B (g.-271c>a, rs ) és CYP2C8*1C (g.-370g>t, rs ) eltérő gyakorisággal fordulnak elő különböző populációkban. Variáns alléljuk kaukázusi populációban gyakori frekvenciájú (23% és 12%), azonban afrikai populációban ez a két polimorfizmus ritka, vagy egyáltalán nem fordul elő 15

16 [84]. A CYP2C8*1B variánst összefüggésbe hozták a promoter régió fokozott aktivitásával egy transzkripciós faktor erősebb kötése révén, míg a CYP2C8*1C allél jelenlétének funkcionális konzekvenciája még nem teljesen tisztázott. A CYP2C8 gén ötödik exonjában helyet foglaló missszensz (p.i269f) c.805a>t (rs ) SNP-t jelölő CYP2C8*2 allél csökkent enzimaktivitást és alacsonyabb gyógyszer clearence értéket ereményez, mint a vad típusú gén [85, 86]. A c.805a>t variáns afrikai populációban gyakori (19%), míg kaukázusi és ázsiai népcsoportokban ritkán fordul elő [85]. A CYP2C8 génben a *3 allél két kapcsolt variáns együttes jelenlétét feltételezi. Az egyik ezek közül a c.416g>a (rs ) SNP, ami egy arginin-lizin aminosav cserét eredményez a 139-es pozícióban (p.r139k), a gén 3. exonjában, a c.1196a>g (rs ) SNP pedig egy lizin-arginin kicserélődéshez vezet a 399-es aminosav pozícióban (p.k399r), a gén 8. exonjában [85]. A CYP2C8*3 allél frekvenciája kaukázusi fehér populációban 11-14% [84]. Egyes kutatók vizsgálatai alapján a CYP2C8*3 allél csökkent enzimaktivitást eredményez, ami gyengébb paclitaxel metabolizmussal társul, míg más kutatók nem találtak összefüggést a *3 allél jelenléte és a paclitaxel clearance között [84, 87]. Néhány CYP2C8 szubsztrát esetében, úgy, mint a repaglinid és a cerivastatin a CYP2C8*3 allél megléte fokozott metabolizmussal társult [88, 89]. A CYP2C8*3 allél eltérő gyógyszer metabolizáló hatása hátterében álló egyik valószínűsíthető ok a nagy, több szubsztrátot felismerő CYP2C8 szubsztrátkötőhely, a másik lehetséges magyarázat a CYP2C8*3 és a CYP2C9*2 közötti erős, részleges linkage disequilibrium lehet [88, 90]. A két variáns között fennálló kapcsoltság egyes elképzelések szerint felelős lehet a NSAID-indukálta gasztrointesztinális vérzésekért [91]. A CYP nomenklatúrában a CYP2C8 gén 5. exonjában a c.792c>g, rs variáns (p.i264m) egyezményes jelölésére használt CYP2C8*4 allél kaukázusi populációban 7% gyakorisággal mutatható ki [69]. A *4 variáns hordozása a vad típushoz mérten csökkent enzimaktivitással és gyengébb szubsztrát metabolizmussal hozható összefüggésbe [84, 88, 92]. További ritka variánsokat írtak le CYP2C8*5-től *14-ig, melyek jellemzően ázsiai populációban fordulnak elő <1%-os frekvenciával [93]. A paclitaxel, statinok, antidiabetikus-, antimaláriás- és nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek metabolizmusán túl a CYP2C8 más klinikai asszociációban is a kutatások középpontjába került. A bifoszfonátok (pl.: zoledronsav), melyek széles körben alkalmazott gyógyszerek a benignus és malignus csontbetegségek kezelésében ritka, de súlyos mellékhatása lehet az állkapocscsont nekrózis. Egy GWA tanulmány számolt be a CYP2C8 rs intronikus SNP-ről, mely szignifikáns kapcsolatot mutatott az állcsont szövet elhalás kialakulásában myeloma multiplex-es betegekben bifoszfonát kezelést követően [94]. 16

17 Bár a bifoszfonátok nem a CYP450 enzimrendszer segítségével metabolizálódnak, a jelenség hátterében feltételezhetően a CYP2C8-nak az angiogenezisben és/vagy gyulladás kialakulásában játszott szerepe állhat. Smith és munkatársai párhuzamot vontak a renális diszfunkció kialakulásának kockázata és a CYP2C8 polimorfizmusok jelenléte között, olyan szervtranszplantált betegekben, akik a calcineurin inhibitorok csoportjába tartozó, allograft kilökődés kezelésére használt ciklosporin és takrolimusz terápiában részesültek [95]. 4. ábra A CYP2C8 génben előforduló fontosabb polimorfizmusok (Genetic polymorphisms of CYP2C8 in Japanese population.nakajima M, 2003) CYP3A5 genetikája A CYP3A5 gén a sokoldalú CYP3A alcsalád tagja a CYP3A4, CYP3A7 és a CYP3A43 génnel együtt, ami a 200 leggyakrabban alkalmazott gyógyszer 37%-ának eliminációjáért felelős [4]. A CYP3A4 és CYP3A5 együttesen a máj citokróm enzimeinek körülbelül 30%-át teszik ki, a P450 rendszeren keresztül metabolizálódó gyógyszerek fele CYP3A szubsztrát [96]. A májban és a bélben expresszálódó CYP3A5 a 7q22.1 kromoszomális pozícióban helyezkedik el. Kilenc kódoló exonjának fehérje terméke egy 502 aminosavból felépülő protein [96]. A funkcionális CYP3A5*1A vad típusú allélon kívül polimorf tulajdonságának köszönhetően több variánsa (CYP3A5*9-ig) létezik [97]. A CYP3A5 gén részben funkcionálisnak tekinthető, aminosav cserével járó CYP3A5*2 (c.1193c>a; T398N; rs ) variánsa is ismert, mely kaukázusi fehér populációban 0,3-1,3%-os gyakorisággal van jelen [98, 99]. 17

18 A leggyakoribb és legrészletesebben tanulmányozott, mrns splicingot megváltoztató variáns a CYP3A5 génben a CYP3A5*3 (c.6986a>g, rs776746) [96, 97]. Az alternatív splice forma egy a 3. intronból származó inszerciót tartalmaz, ami a leolvasási keret eltolódásán keresztül a kódoló régiójában egy korai stop kodon beépülést és funkcióképtelen fehérje létrejöttét eredményezi [97]. A CYP3A5*3/*3 homozigóta genotípusú egyéneket nemexpresszáló fenotípusúnak tekintjük. Ezzel szemben a CYP3A5*1/*1 és CYP3A5*1/*3 genotípusú személyek az expresszáló -k, akik gyorsabban metabolizálják a CYP3A5 szubsztrát gyógyszereket, például a tacrolimust, midazolamot, az antiretrovirális szakinavirt vagy az akut limfoblasztos leukémiában szenvedők kezelésére használt vinkrisztint [97, ]. A CYP3A5*3 allél gyakoriságában jelentős interetnikai különbségek mutatkoznak. Előfordulási gyakorisága kaukázusi populációkban 82-95%-os, afroamerikaiakban 33%, japán populációban 85%, kínaiban 65%, mexikói népcsoportban 75%-ra tehető [97, 104, 105]. A változó gyógyszerválaszon kívül a különböző CYP3A5 genotípusok hajlamosító, illetve védő szerepet tölthetnek be egyes betegségek kialakulásában. Shimada és kutatócsoportja japán populációban végzett vizsgálatainak eredményei azt mutatják, hogy azok a nőbetegek, akik CYP3A5 expresszálónak tekinthetők, fokozott kockázattal rendelkeznek emlődaganat kialakulására szemben a nem-expresszálókkal [106]. Hasonló eredményhez jutottak Borst és munkatársai, mely szerint a CYP3A5 expresszálók körében gyakoribb a gyermekkori akut limfoblasztos leukémia kialakulása, mint a CYP3A5*3/*3 genotípus esetén [107]. További fontos CYP3A5 variánsnak tekintjük a CYP3A5*6 és CYP3A5*7 allélokat, amelyek csonka, funkcióképtelen fehérjét eredményeznek különböző mechanizmusok révén. A CYP3A5*6 (c.624g>a; rs ) variáns esetén a hetedik exonban egy G>A tranzíció eredményeként, a CYP3A5*7 ( insT; rs ) tekintetében pedig egy timin inszerció útján jön létre egy korai stop kodon a 348-as pozícióban [97, 108]. A CYP3A5*6 és CYP3A5*7 allélok afroamerikai populációkban viszonylag gyakoriak (7-17% és 8%), kaukázusi és ázsiai populációkban nagyon ritkán vagy egyáltalán nem fordulnak elő [97, 104, 108, 109]. 18

19 CYP4F2 genetikája A sejtek endoplazmatikus retikulumaiban lokalizálódó citokróm P450 4F2 (CYP4F2) enzim katalizálja a hosszú szénláncú zsírsavak, K vitamin (K 1, K 2 ), E vitamin, arachidonsav és leukotrién B 4 NADPH-függő oxidációját [110]. A hepatikus CYP4F2 regulálja továbbá az antimaláriás furamidin prodrugjának, a pafuramidinnek bioaktivációját is [111]. A CYP4F2 humán gén kromoszomális elhelyezkedése a 19p13 pozicióra tehető. A gén 13 kódoló exonból áll, aminosav szekvenciája a CYP4F3 génnel 81-93%-os homológiát mutat [112]. Legfontosabb, funkcionális jelentőséggel bíró genetikai variáns a CYP4F2 génben a c.1297g>a (rs ) polimorfizmus (CYP4F2*3), mely egy valin-metionin aminosav cserét eredményez a fehérjében (V433M). Bár a CYP4F2*3 variáns jelenléte nem befolyásolja sem az mrns transzkripciót, sem az enzimaktivitást, mégis csökkent fehérje szintet eredményez, feltehetőleg a csökkent transzláció vagy a fokozott protein degradációnak köszönhetően [113]. A CYP4F2 1297A allél hordozása módosult warfarin metabolizmussal hozható összefüggésbe, ami 4-12%-kal magasabb kívánt antikoaguláns dózist határoz meg különösen ázsiai és európai populációkban [114, 115]. A CYP4F2 rs polimorfizmus nem csupán a warfarin dózist, de az Európában szélesebb körben alkalmazott K vitamin antagonista acenokumarol hatékony dózisát is hasonló módon befolyásolja [116]. Korábbi vizsgálatok eredményei számolnak be arról, hogy CYP4F2*3 variáns hordozása kapcsolatban állhat magas vérnyomás kialakulásával és csökkent E vitamin metabolizmussal [117, 118]. 19

20 1.3. Taxán vegyületek A széles körben alkalmazott paclitaxel (Taxol ) és docetaxel (Taxotere ) a mikrotubulus stabilizáló vagy mikrotubulus inhibitor természetű taxán vegyületek csoportjába tartozó, különösen aktív kemoterápiás ágensek, melyeket emlő-, petefészek- és tüdődaganatos betegek kezelése során alkalmaznak [ ]. A mikrotubulusok olyan α- és ß-tubulin alegységekből álló komplex struktúrák, melyek számos sejtfunkcióban játszanak szerepet, úgy, mint intracelluláris transzport, szekréció, a sejt alakjának fenntartása és neurotranszmisszió [122]. A taxán gyógyszerek a tubulin ß alegységéhez kötődve a tubulin polimerizációt stabilizálják, ezáltal különböző fázisaiban tartóztatják fel a sejtciklust, így gátolják a mitózist a metafázis-anafázis határán [120, ]. Az 1970-es évek elején a mellrák kezelésének gyógyszeres terápiája az alkiláló ágensek (pl.: ciklofoszfamid) methotrexáttal és 5-fluorouracillal való kombinációjára korlátozódott, ami átlagosan 14 hónap átlagos túlélést eredményezett [125]. Az 1980-as években terjedt el az antraciklinek (doxorubicin és epirubicin) használata, mint elsővonalbeli daganatellenes szerek, majd az 1990-es években bevezetésre került paclitaxel és docetaxel kombinációban alkalmazva antraciklinekkel és alkiláló szerekkel jelentősen emelték a metasztatikus emlődaganatos betegek teljes- és betegségmentes túlélését [ ]. A taxánok elsővonalbeli használata során a gyógyszeres válasz 25-69%-ra tehető, a betegek gyakran mutatnak rezisztenciát a kezeléssel szemben [ ]. A paclitaxelt 1971-ben izolálták először az amerikai tiszafa (Taxus brevifolia) kérgéből [122, 133]. A vegyület kémiai szerkezetét az 5. ábra szemlélteti. Használatát ben engedélyezte az Amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerbiztonsági Felügyelet (FDA), előrehaladott petefészekrák kezelésére használt kemoterápiás gyógyszerként került forgalomba [134]. A paclitaxel erősen hidrofób természetű vegyület, mely megkívánja, hogy vivőanyagként oldatban alkohollal és Cremophor EL-lel (polyoxyetilezett ricinusolaj) együtt alkalmazzák [135]. Ez az oldószer súlyos hiperszenzitív reakciókat válthat ki, így a terápia részeként dexametazon egyidejű alkalmazása javasolt [135]. A paclitaxel nem lineáris farmakokinetikát mutat, mely megnehezíti a gyógyszer helyes adagolását [122, 136, 137]. A gyógyszer felezési ideje óra, a májban metabolizálódik és az epével kerül kiválasztásra [122]. Gyakori mellékhatásai a paclitaxel gyógyszernek a hajhullás, myeloszupresszió, gasztrointesztinális tünetek, febrilis neutropenia, myalgia és perifériás neuropathia [122, 130]. 20

21 A második generációs taxán, a docetaxel, az inaktív taxán prekurzor - 10-deacetylbaccatin III - oldalláncának észteresítésével nyert szemiszintetikus vegyület [130, 138]. A docetaxel a közönséges tiszafából (Taxus baccata) az 1980-as években került azonosításra [134]. Kémiai struktúráját az 5. ábra szemlélteti. A docetaxel nagyobb affinitással kötődik a ß-tubulinhoz és kétszer hatékonyabban gátolja a mikrotubulus depolimerizációt szemben a paclitaxellel [139]. A docetaxel a sejtciklust 3 fázisban képes blokkolni a centroszómát célozva, az S, G 2 és M fázisokban, míg paclitaxel esetén a mikrotubulus target a mitotikus orsó. Sejtciklusbeli specifikussága csak a G 2 és M fázisra terjed ki [139]. Ellentétben a paclitaxellel, a docetaxelhez használt vivőanyag, a Poliszorbát 80 jelentősen kevesebb mellékhatást eredményez a szervezetbe jutva, mint a Cremophor EL [122]. További különbség a két taxán vegyület között, hogy a docetaxel lineáris farmakokinetikájú, eliminációs felezési ideje 1 óra [122, 140, 141]. A gyógyszer szedése során hasonló mellékhatások jelentkezhetnek, mint paclitaxel terápia esetén, további tünetként előfordulhat pleuralis ascites, oedema, neutropenia, bőr- és körömelváltozás (Palmar-plantar erythrodysesthesia), hyperlacrimatio, melyek limitálhatják a dózist [122, 130]. Bár hatásmechanizmusukban hasonlóság, farmakológiai és farmakokinetikai jellegükben különbségek figyelhetők meg, a rutin klinikai gyakorlatban elérhető két taxán vegyület jelentősen javítja a mellrákos betegek teljes- és betegségmentes túlélési rátáját, különösen antraciklin alapú terápiában [128, 142, 143]. Ennek ellenére a taxán rezisztencia gyakori jelenség, azonban előfordulhat szolid tumorokban szenvedő betegeknél, hogy paclitaxellel szemben rezisztenciát mutatnak, docetaxelre mégis szenzitívnek bizonyulnak [ , 144, 145]. 5. ábra Paclitaxel és docetaxel kémiai struktúrája ( 21

22 A taxán vegyületekre adott egyéni gyógyszerválaszt befolyásolhatják azok a genetikai variánsok, melyek a taxán útvonalban szerepet játszó metabolizáló enzimek és transzporter fehérjék működését érintik. A taxánok metabolikus útvonalát a 6. ábra szemlélteti. A paclitaxel és a docetaxel egyaránt a máj mikroszómális citokróm P450 enzimrendszerén keresztül metabolizálódik. Mindkét vegyület elsődleges metabolizálója a CYP3A4 enzim, a paclitaxel a CYP2C8, a docetaxel pedig a CYP3A5 enzim további hozzájárulásával biotranszformálódik. Mindkét taxán egyaránt szubsztrátja több membránhoz asszociált, aktív transzportot végző ABC (ATP-binding casette) transzporternek, mint az ABCB1, ABCG2, ABCC1 és ABCC2. A hepatikus influxban fontos szerepet játszó szerves anion transzportáló polipeptid (OATP) család SLCO1B3 tagja kulcs regulátornak bizonyult mind a paclitaxel, mind pedig a docetaxel transzportban. 6. ábra Taxán vegyületek metabolikus útvonala ( 22

23 Számos tanulmány született, mely próbálta feltárni a taxán útvonalban szerepet játszó gének polimorfizmusai és a taxán kezelés várható kimenetele közötti kapcsolatot, az eredmények mégis ellentmondásosak. Marsh és kutatócsoportja emlődaganatos betegek gyógyszerválaszt befolyásoló farmakogenetikai vizsgálata során kapcsolatot találtak a CYP1B1 gén *3 (c.4326c>g; L432V; rs ), leucin-valin aminosav cserét eredményező misszensz variánsának hordozása és a progresszió mentes túlélés között, függetlenül a paclitaxel clearance-től [146]. Sissung és munkatársai hasonlóan rosszabb prognózisról számoltak be docetaxel kezelés kapcsán a CYP1B1 *3/*3 homozigóta genotípus esetén összehasonlítva a CYP1B1*1 allélt hordozókkal. Ezen eredmények bizonyítékul szolgálhatnak, hogy a CYP1B1*3 polimorfizmus egy fontos biomarkernek tekinthető a kemoterápia kimenetelének predikciójában [64]. A CYP2C8*3 allél, mely a c.416g>a (Arg139Lys) és c.1196a>g (Lys399Arg) aminosav cserékkel járó nukleotid szubsztitúciók együttes jelenlétével definiálható, csökkent enzimaktivitást eredményez [147]. Gréen és munkatársai kimutatták, hogy a CYP2C8*3 allél felelős a csökkent paclitaxel eliminációért, illetve, hogy a paclitaxel indukálta neurotoxicitás korrelál a gyógyszer expozícióval [148]. Egy másik tanulmány számolt be docetaxel metabolizmus farmakogenetikai vizsgálata kapcsán arról, hogy a CYP3A4*1B (-392A>G) nem-kódoló polimorfizmusa és a CYP3A5 gén vad típusú *1A allélja jobb docetaxel clearance értékkel hozható összefüggésbe [149]. 23

24 1.4. Antikoaguláns gyógyszerek A K vitamin antagonista orális antikoagulánsok hatóanyagai, mint a warfarin (Marfarin ) és az acenokumarol (Syncumar ) széles körben alkalmazott gyógyszerek a thromboemboliás kórképek (mélyvénás trombózis, tüdőembólia) hosszú távú kezelésében [150]. A kumarin származékok szűk terápiás tartománya miatt fontos a dózis pontos meghatározása, ami nagy kihívást jelenthet a klinikus számára, mivel a gyógyszerválasz nagyfokú individuális és etnikai különbségeket mutat [22, 151]. Az egyéni gyógyszerválaszban megmutatkozó különbségek hátterében demográfiai, környezeti, klinikai és genetikai faktorok állnak [152, 153]. Napjainkig számos nemzetközi tanulmány született azzal a céllal, hogy megvizsgálja és azonosítsa azokat a genetikai variánsokat, valószínűsíthető SNP-ket, melyek kapcsolatba hozhatók a véralvadásgátlók megváltozott farmakokinetikájával, farmakodinamikájával [150, 154, 155]. Az antikoaguláns gyógyszerválasz fő genetikai determinánsai a CYP2C9, VKORC1 és a CYP4F2, de számos további gén is részt vesz a warfarin biotranszformációjában és hatásmechanizmusának kialakításában, mint a CYP2C19, CYP1A2, CYP1A1, CYP3A4, GGCX, EPHX1 és CALU [ ]. A módosult warfarin válaszért felelős kulcsfontosságú enzimeket kódoló gének: a K vitamin ciklust, mint farmakológiai célpontot érintő VKORC1 (K vitamin epoxid-reduktáz komplex 1), az S-warfarint metabolizáló CYP2C9 (citokróm P450 2C9), a K vitamin katabolizmusban szerepet játszó CYP4F2 (citokróm P450 4F2), valamint a K vitamin-függő véralvadási faktorokat (II., VII., IX. és X. faktor) aktiváló γ-karboxiláz enzimet kódoló GGCX (gamma-glutamil karboxiláz) [113, 150, 159, 160]. Az FDA 2007-ben kiadott közleményében hangsúlyozza a genetikai teszt fontosságát a warfarin kezdő dózisának meghatározásához [161]. A CYP2C9 és VKORC1 génben található polimorfizmusok együtt 30-40%-ban felelősek a warfarin dózis variabilitásért, míg a VKORC1, CYP2C9 és CYP4F2 genotípusok a társuló klinikai faktorokkal együttesen 60%-ban magyarázzák az antikoaguláns gyógyszerválasz változékonyságát [ ]. A CYP2C9*2 (c.430c>t) és CYP2C9*3 (c.1075a>c) misszensz polimorfizmusok jelenléte jelentős csökkenést eredményez az enzim aktivitásában [160]. A helyes dózis megállapításához a VKORC1 genotípus meghatározásában a három legfontosabb funkcionális polimorfizmus a -1639G>A (VKORC1*2), c.9041g>a (VKORC1*3) és a c.6009c>t (VKORC1*4) SNP-k [165]. A CYP4F2 gén által kódolt enzim a K vitamin biotranszformációban szerepet játszó oxidáz, melynek variánsai csökkentik az enzim K vitamin metabolizáló kapacitását [115]. Újabb kutatási eredmények számolnak be 24

25 arról, hogy a magas warfarin dózist meghatározó CYP4F2*3 (rs ; V433M) SNP frekvenciája szintén szignifikáns különbségeket mutat különböző populációkban. Ez az érték kaukázusi népcsoportokban 30%-ra, ázsiai populációkban 17%-ra tehető. A CYP4F2*3 variáns hordozása további 2-5%-ban magyarázhatja az egyéni, hatékony dózisok közötti különbségeket [115, 166]. 25

26 1.5. Roma populáció bemutatása A vizsgálataink tárgyát képező magyar és roma populáció közös tulajdonsága, hogy eredetüket tekintve mindkettő különbözik más európai kaukázusi népektől. A romák az indiai szubkontinens északi részéről származnak. Indiából észak-nyugat felé történő migrációjukat körülbelül 1000 évvel ezelőtt kezdték ismeretlen okból [167, 168]. Társadalomtudományi és nyelvészeti tanulmányok a romák ázsiai eredetére utalnak. A genetikai bizonyítékok szintén a romák indiai eredete mellett szólnak, úgy, mint az Y kromoszóma H-M82 haplocsoportjának és a mitokondriális DNS-ben az mtdns M haplocsoport hordozása, mely nagyon ritkán fordul elő az indiai szubkontinensen kívül [169, 170]. Morar és munkatársai balkáni, oláh és nyugat-európai roma csoportokban 5 betegség okozó génmutáció vizsgálata során kimutatták a congenitalis myasthenia szindróma kialakulásáért felelős 1267delG mutációt roma és indiai (pakisztáni) mintákban, ami a legerősebb bizonyítékul szolgál a romák indiai eredetére [171]. Világszerte számos országban él roma populáció, melynek becsült mérete körülbelül 12 millió főre tehető, ebből 8-10 millióan élnek Európában, legnagyobb számban Romániában, Szlovákiában, Bulgáriában és Magyarországon [170, 171]. Magyarországon több minor etnikum is előfordul, közülük is a romák képviseltetik magukat a legnagyobb számban. A Központi Statisztikai Hivatal 2008-as felmérése szerint roma él Magyarországon, ezzel hazánk a negyedik romák által legsűrűbben lakott országának számít európai viszonylatban ( A magyarországi romák megyénkénti eloszlását az állandó populációhoz viszonyítva a 7. ábra mutatja be. A magyarországi roma populáció 3 fő alpopulációra osztható nyelvi és történeti szempontból; a romungrókra, az oláh és a beás romák csoportjára. A magyar nyelvű romungrók közé tartozik a magyarországi romák mintegy kétharmada. A magyar és lovári nyelvet beszélő, 19. században Havasalföld irányából érkező oláh roma szubpopuláció a roma populáció 21%-át teszi ki [172]. A harmadik csoportot a főként Dél-Dunántúl falvaiban élő beás roma emberek alkotják, akik a magyar nyelv mellett az archaikus román nyelvet használják. Nagyjából a magyarországi romák 8%-a a beás roma alpopuláció tagja. A roma populáció egy kitaszított, hátrányos helyzetben lévő etnikai csoport Európában, rossz szocioökonómiai státusszal [173]. A roma berendezkedésben élő emberek gyakran jelentősen alacsonyabb iskolázottságúak, magasabb köztük a munkanélküliek aránya, várható élettartamuk messze elmarad az átlag európai populációkban mért adatoktól. A romák körében a csecsemőhalandóság szintén emelkedett értéket mutat, továbbá gyakrabban 26

27 szenvednek krónikus légzőszervrendszeri- (asztma, bronchitis), kardiovaszkuláris- és daganatos betegségektől [174, 175]. A herediter motoros és szenzoros neuropátia, congenitalis myasthenia szindróma, galaktokináz deficiencia és a policisztás vesebetegség, mint ritka, öröklődő betegségek is azonosításra kerültek a roma populáció tagjaiban [ ]. Kovács és munkatársai egy kis magyarországi roma csoportban a IV-es típusú rövid bordapolydactylia szindróma eseteit írták le [179]. Szintén magyarországi anhidrotikus ektodermális diszpláziás roma beteg kapcsán került bemutatásra a GJA1 génben egy különös, sporadikus, a GJB2 génben pedig egy heterozigóta mutáció [180]. 7. ábra A romák megyénkénti aránya Magyarországon 2003-ban (Janky, Kemény, Lengyel: A magyarországi cigányság , 2005) 27

28 2. CÉLKITŰZÉSEK Kutatásunk célja a citokróm P450 enzimrendszer különböző, farmakogenetikai szempontból releváns génjeiben leírt polimorfizmusok genetikai vizsgálata, mely magába foglalja ezen polimorfizmusok gyakoriságának és eloszlásának meghatározását roma és magyar populációban. Ezáltal rávilágíthatunk azokra a jelentős genetikai különbségekre, melyek a gyógyszermetabolizmus fázis I enzimeit érintik és hatással lehetnek a gyógyszerválaszra. Kitűzött céljaink pontokban: 1. A CYP1A2 kapcsán a gén szabályozó régiójában elhelyezkedő rs és rs és az intronikus rs és rs polimorfizmusok gyakoriságának meghatározása roma és magyar populációban. 2. A vizsgált CYP1A2 variánsok együttállásaiból a különböző haplocsoportok frekvenciájának meghatározása a két vizsgált populációban. 3. A taxán kezelés kimenetelét befolyásoló CYP1B1, CYP2C8 és CYP3A5 rs , rs , rs variánsok allélfrekvenciáinak vizsgálata. 4. Az antikoaguláns terápiát érintő CYP4F2 rs polimorfizmust vizsgálva átfogó képet kapni arról, hogy az általunk tanulmányozott két népcsoport között az említett SNP tekintetében mutatkozik-e olyan jelentős genetikai különbség, mely eltérő módon befolyásolhatja a két populáció véralvadásgátló gyógyszerekkel szembeni érzékenységét. 5. A CYP1A2, CYP1B1, CYP2C8, CYP3A5 és CYP4F2 gének vizsgált polimorfizmusaiban kapott allélfrekvencia értékek összehasonlítása más kutatók szakirodalomban leírt populációs adataival, különös tekintettel a kaukázusi és indiai populációkra. 28