Cryptosporidium és Giardia mint vízszennyező patogének Magyarországon

Átírás

1 EREDETI KÖZLEMÉNY Cryptosporidium és Giardia mint vízszennyező patogének Magyarországon Plutzer Judit Országos Környezet-egészségügyi Intézet, Budapest Bevezetés: A Cryptosporidium több faja és a Giardia duodenalis két csoportja emberben leggyakrabban akut hasmenést okoznak. Ezek a paraziták rendkívül ellenálló, vastag falú (oo)cysták formájában kerülnek a környezetbe, ahol hosszú ideig megőrzik fertőzőképességüket. Célkitűzés: A fenti protozoonok hazai előfordulásának vizsgálata különböző vízforrásokban, kiegészítve a vízgyűjtő területeken található szennyezőforrások tanulmányozásával és egy epidemiológiai felméréssel. Módszer: A vizsgálatokhoz modern molekuláris és epidemiológiai módszerek széles körét használtuk. Eredmények: Magasabb (oo)cystaszámokat szennyvízbefolyások után, illetve erdei környezetben mutattuk ki. A vizsgálatok megerősítették, hogy a szarvasmarhatelepek jelentős vízszennyező források lehetnek, a vízimadarak pedig szerepet játszhatnak az (oo)cysták terjesztésében. Az epidemiológiai felmérés elgondolkodtató adatokat sorakoztatott fel az aszimptomatikus giardiosis és a vízfogyasztás összefüggéseiről. Új, olcsó, gyors és hatékony detektálási módszert fejlesztettünk ki a monitoringvizsgálatokhoz és az állapotfelmérésekhez. Következtetések: A bemutatott eredmények nagymértékben hozzájárulnak a fenti paraziták epidemiológiai jelentőségének megismeréséhez és a járványok, fertőzések elkerüléséhez Magyarországon. Orv. Hetil., 2013, 154 (46), Kulcsszavak: víz, vízszennyező források, Giardia; Cryptosporidium Cryptosporidium and Giardia as water contaminant pathogens in Hungary Introduction: Many species of Cryptosporidium, and two assemlages of Giardia duodenalis cause typically acute diaorrhoea in human. The oocysts and cysts of these parasites excreted in faeces are capable of infecting other hosts and those are environmentally stable. Aim: The aims of the study were to evaluate the prevalence and genotypes of Cryptosporidium and Giardia species from different water sources as well as to monitor and characterize the (oo)cyst contamination sources in watersheds. In addition, an epidemiological study was performed in three selected settlements. Method: Wide range of modern epidemiological and molecular detection methods have been applied. Results: (Oo)cysts densities were associated with water receiving effluents of sewage treatment plants or originating from a forest environment. It was confirmed, that cattle can be a source of Cryptosporidium oocysts at watersheds and aquatic birds can play a role in the environmental dissemination of these protozoa. The epidemiological study demonstrated a specific epidemiological situation, giving essential evidence about giardiasis in asymptomatic carriers. The applied novel detection technology was found to be cost effective and simple procedure for screening catchments to identify those that require further treatment and more detailed microscopic counts. Conclusions: The presented results contribute to a better understanding the epidemiology and relevance of waterborne parasites, their surveillance and performance of future control measures to prevent waterborne infections in Hungary. Keywords: water; contamination sources; Cryptosporidium; Giardia Plutzer, J. (2013). [Cryptosporidium and Giardia as water contaminant pathogens in Hungary]. Orv. Hetil., 154 (46), (Beérkezett: szeptember 6.; elfogadva: október 10.) DOI: /OH évfolyam, 46. szám indd :33:29

2 Rövidítések DAPI = 2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride; DIC = diffencial interference contrast; EF1A = elongation factor 1α; FITC = fluoresceine isothiocianate; GDH = glutamate dehydrogenase; gp-60 gene, Cpgp15/45 = prekurzor proteineket kódoló gén, amely sejtfelszíni glikoproteineket kódol, gp 45 és gp15; ELISA = enzime-linked immunosorbent assay; IFT = immunofluorescence test (FITC- és DAPI-festés kombinációja); IMS = immunomagnetic separation; LAMP = loop mediated isothetmal amplification; NTU = nephelometric turbidity unit; USEPA = United States Environmental Protection Agency; PBS = phosphate buffered saline; PCR = polymerase chain reaction; RFLP = restriction fragment length polymorphism; SAM-1 = S-adenosyl-L-methionine synthetase; SSU rrna = small ribosomal subunit; TPI = triose phosphate isomerase A Cryptosporidium rendszertanilag az Apicomplexa törzs, Sporozoae osztály, Eucoccidiida rend és Cryptosporidiidae család tagja, ámbár a legfrissebb biokémiai, genetikai és egyedfejlődési adatok rendszertani kérdéseket vetettek fel, amelyek még megválaszolásra várnak [1, 2]. Jelenleg 28 faja ismert: három halakban (C. cichlidis, C. molnari, C. reichenbachklinkei), egy kétéltűekben (C. fragile), három hüllőkben (C. ducismarci, C. saurophilum, C. serpentis), három madarakban (C. baileyi, C. galli, C. meleagridis) és 18 emlősökben (C. andersoni, C. agni, C. bovis, C. canis, C. cuniculus, C. fayeri, C. felis, C. hominis, C. macropodum, C. muris, C. parvum, C. pestis, C. ryanae, C. scrofarum, C. suis, C. ubiquitum, C. viatorum, C. wrairi) élősködik [2]. Az SSU-rRNS-alapú molekuláris vizsgálatok alapján megközelítőleg 60 genotípust írtak le, amelyek rendszertani helyzete bizonytalan és további vizsgálatokat igényel elhelyezésük [3]. A C. parvum-ot több szubtípuscsoportra különíthetjük el a gp60 prekurzor fehérjét kódoló DNS-szekvencia alapján, amelyekből kettő, a IIa és IId szubtípuscsoportok vesznek részt a zoonosisban [3]. A gazdaszervezetbe jutva a Cryptosporidium parvum oocystából négy fertőzőképes sporozoit szabadul ki epesók és emésztőnedvek hatására, amelyek a bél epithelsejtjeinek felszínére tapadnak [4]. A kialakuló trophozoit a fertőzött ileumban az epithelsejtek felszínéhez közel, intracellulárisan található, desmosomaszerű kapcsolata van a sejtekkel és ezen keresztül veszi fel a gazdasejtből a táplálékot. Ebből alakul ki az 1-es típusú meront, amelyből nyolc merozoit szabadul fel. A merozoitok szétszóródnak, majd a bélfalhoz tapadva 2-es típusú meronttá alakulnak. Ezekből négy merozoit keletkezik, amelyekből gametocyták fejlődnek. A gametocytákból ostor nélküli makro- és mikrogaméták alakulnak ki. A gaméták összeolvadása után kialakuló vastag falú oocysták a széklettel ürülnek, a vékony falú oocystából kiszabaduló sporozoitok révén pedig a bélben újabb ciklus indul el [5]. A cryptosporidiosis a giardiosishoz hasonlóan 2 10 napig tartó erős hasmenést (esetleg hányingert, hányást, fejfájást, izomfájdalmakat, lázat) jelent, előfordulhat kiszáradás és leromlott állapot, elerőtlenedés. Kezelés nélkül spontán gyógyul. A fertőzés immunhiányos betegeknél (AIDS-betegek) halált is okozhat [6, 7]. Állatoknál tünetet leginkább akkor okoz, ha az állat fiatal, illetve ellenálló képessége csökkent (alultápláltság, elválasztás, zsúfoltság, hideg, fröccstej hiánya, egyéb társfertőzések). Tünetmentes oocystaürítés is lehetséges [8, 9]. A Giardia egy eukaryota, ostoros, két sejtmagvú egysejtű. A legújabb genetikai, strukturális és biokémiai adatokon alapuló rendszertani besorolás szerint a Giardia a Metamonada törzs, Trichozoa altörzs, Eopharyngia főosztály, Trepomonadea osztály, Diplozoa alosztály, Giardiida rend és Giardiidae család tagja [10]. Jelenleg hat faját ismerjük, amelyből egy kétéltűekben (G. agilis), kettő madarakban (G. ardeae, G. psittaci), egy főként egerekben (G. muris) és egy egerekben, patkányokban (Cricetidae család, G. microti), míg a hatodik faja egyéb emlős gazdákban élősködik (G. duodenalis syn. G. lamblia vagy G. intestinalis). Ez utóbbi faj genetikailag meglehetősen heterogén: az Assemblage A-t és B-t emberben és emlősökben, az Assemblage C-t és az Assemblage D-t kutyákban, az Assemblage E-t háziállatokban (főképpen szarvasmarhában), az Assemblage F-et macskákban, az Assemblage G-t patkányokban, az Assemblage H-t pedig fókákban találták meg. Az A és B genotípusokon belül további szubgenotípusok különíthetőek el [11, 12]. A Giardia-sejt a fertőzött vékonybél kezdeti szakaszán, epicellulárisan található. Ez a vegetatív alak szívófelületével a bélhámsejtekre tapad. Növekedés, osztódás után encisztálódik. Ezt a folyamatot az organizmus számára kedvezőtlen körülmények, illetve a gazdaszervezet immunválasza indukálják. Az új szervezetbe került cysta vegetatív formává alakul és kezdődik a folyamat elölről [13]. Sárga, bűzös hasmenés, puffadás, hányinger, étvágytalanság, gyengélkedés, esetleg láz, a székletben megjelenő vér a heveny giardiosis velejárója. A tünetek elhúzódhatnak (kezelés nélkül akár két-három évig is), fokozódhatnak, enyhülhetnek. A fertőzés krónikus formába is átmehet. A giardiosis harmadik típusa a nagyon enyhe tünetekkel járó, illetve tünetmentes forma. Állatoknál fejlődési visszamaradást okozhat, de halálos kimenetelű giardiosisról is beszámoltak már [14, 15]. A Cryptosporidium- és Giardia-fertőzés terjedhet emberről emberre fekál-orál úton, állatról emberre a hordozó állatoktól. Az indirekt, vízzel közvetített fertőzésnek kiemelt a jelentősége, mivel fürdőzéskor vagy ivás során a kórokozó közvetlenül a bélcsatornába juthat. A vizek szennyeződését a szennyvizek szabadba vagy fogadóba engedése okozza, illetve a hordozó, főként fiatal állatok ürülékéből kerülhetnek a protozoonok cystái, oocystái a nyers vízbe. Ennek kockázata az állattartó telepek környékén, tavasszal, az esőzések miatti árvizek idején a legnagyobb, ekkor az újszülött állatok száma is nagy [12, 16] évfolyam, 46. szám indd :33:29

3 Számos tényező hozzájárul a vízeredetű járványok, fertőzések kialakulásához: A Cryptosporidium és Giardia (oo)cysták fertőző dózisa kicsi (1 10 cysta, illetve oocysta). A Cryptosporidium oocysták mérete csupán 4 6 µm, könnyen átjuthatnak a víztisztítás során a szűrőkön. Az eltávolítás csak koaguláció és mikroszűrés (0,1 5 µm nagyságú részecskék eltávolítása) vagy ultraszűrés (0,1 0,01 µm nagyságú részecskék eltávolítása) alkalmazásával hatékony. Az (oo)cysták nagyon ellenállók, mind vízben, mind talajban hetekig életképesek maradnak. A fertőtlenítőszer-koncentráció, ami baktériumokhoz elegendő, a protozoonokhoz nem; az (oo)cysták életképtelenné tételéhez különleges eljárás, ózon, illetve UV alkalmazása szükséges. Ezek a technológiák a legtöbb kis vízműnél nem találhatók meg [12, 17]. Ahhoz, hogy a Giardia és Cryptosporidium vízben való jelenlétének jelentőségét felbecsüljük, rendszerszemléletre van szükség: a protozoonok vízből való pontos kimutatása mellett szükség van a vízgyűjtő területek védelmére, a víztisztítás optimalizálására és a tisztított ivóvíz védelmére egészen a fogyasztói felhasználásig. Munkánk célja, hogy: bevezessük és rutinszerűen használjuk a modern Cryptosporidium oocysta és Giardia cysta kimutatási technikákat: a különböző vízkoncentrálási módszereket (Filta-Max szivacsszűrés, membránszűrés és flokkuláció), IMS-t, IFT-t, PCR-t, real-time PCR-t, RFLP-t; költséghatékony kimutatási módszert dolgozzunk ki; rendszeresen monitorozzuk a budapesti vízellátás nyers vizét, a Dunát Budapestnél, a budapesti ivóvizet a parti szűrés után, valamint a felszíni vízműveket és veszélyeztetett vízbázisokat, különleges időjárási és vízállási adatokat is figyelembe véve; tanulmányozzuk a víztisztítási technológiákat, és felmérjük azok hatékonyságát a fent említett protozoonok szempontjából; a PCR-termékek szekvenciaanalízise segítségével meghatározzuk a jelen levő Giardia és Cryptosporidium fajokat, genotípusokat és szubgenotípusokat, amely alapján megállapíthatjuk, hogy emberre nézve milyen veszélyt jelentenek; a szubgenotípus-meghatározással a szennyezőforrásokat is nyomon kövessük; felmérést végezzünk a szarvasmarhatartó telepeken, hogy a hígtrágya-kibocsátás milyen veszélyt jelenthet a környező vizekre és a vízellátásra a fenti protozoonok szempontjából, és meghatározzuk a vízimadarak szerepét a kórokozók terjesztésében; a releváns településeken epidemiológiai felmérést végezzünk; kapcsolatot tartsunk a vízművekkel annak érdekében, hogy az esetlegesen felmerülő protozoonszennyeződési problémákat megoldjuk. Módszer A paraziták vízből történő koncentrálásához speciális Filta-Max szivacsszűrést és Millipore, illetve Macherey Nagel-membránszűrést alkalmaztunk, nagy turbiditású vizek esetén pedig kalcium-karbonátos flokkulációt. Bevezettünk egy új mikroszálas szűrőt (ARAD). A szivacsszűrőből, a membránszűrőről és a mikroszálas szűrőről az (oo)cystákat PBS-sel mostuk le. Centrifugálással a mintákat tovább koncentráltuk, végül az (oo)cystákat IMS-sel választottuk el a törmeléktől [18, 19]. A Cryptosporidium (oo)cysták székletből történő koncentrálásához éter-foszfát pufferes szedimentációt és cukorgradiens-centrifugálást végeztünk. A Giardia cysták dúsításához IMS-t alkalmaztunk [20]. A mikroszkópos azonosítás előtt a cystákat, oocystákat FITC-, DAPI-festékekkel festettük [18]. A mikroszkópos vizsgálathoz epifluoreszcens és DIC-mikroszkópiát használtunk [18]. A Giardia GSA 65 nevű fehérje antigén-kimutatása székletmintákból a Prospect T Giardia microplate assayvel történt a gyártó utasításai szerint. A DNS-extrahálást Qiagen Stool kittel és Mini kittel végeztük a gyártó utasításai szerint, 10 olvasztási és fagyasztási ciklus beiktatásával az (oo)cysták szétroncsolására. Nested, illetve seminested PCR-módszert alkalmaztunk mindkét protozoon esetében. A PCR targetjei: a Cryptosporidium SSU rrns 850, illetve 435 bp hosszú szakaszai a faj- és genotípus-meghatározáshoz, a Cryptosporidum gp 60 prekurzor fehérjét kódoló gén 850 bp hosszú szakasza a szubgenotípusmeghatározáshoz, illetve a Giardia 18S rrns 292 bp hosszú szakasza faj- és Assemblage-meghatározáshoz és a gdh enzimet kódoló gén 432 bp hosszú fragmentje a szubtípusok meghatározásához. A keletkezett termékek azonosságát gélektroforézissel ellenőriztük [20, 21]. Giardia Assemblage B-specifikus real-time PCR-hez a tpi enzimet kódoló 141 bp hosszú génszakaszt szaporítottuk fel a Power SyBrGreen PCR Master mix és ABI 7300 real-time PCR-készülék felhasználásával. A keletkezett termék azonosságát olvadáspont-analízissel ellenőriztük [22]. LAMP során a Giardia EF1A és Cryptosporidium SAM-1 178, illetve 145 bp hosszú génszakaszát szaporítottuk fel speciális Bst polimeráz segítségével [22, 23]. A keletkezett termékeket gélelektroforézissel és Agilent Chip DNS-analízissel a Bioanalyser 2100 készüléken ellenőriztük a gyártó utasításai szerint. RFLP-t a Cryptosporidium 850 bp hosszú SSU rrns PCR-termékeken végeztünk SspI és MboII restrikciós enzimek felhasználásával, valamint a 432 bp hosszú Giardia gdh PCR-termékeken NlaIV és RsaI restrikciós enzimek felhasználásával. A keletkezett termékeket gélelektroforézissel és Agilent Chip DNS-analízissel a Bioanalyser 2100 készüléken ellenőriztük a gyártó utasításai szerint [20] évfolyam, 46. szám 46.indd :33:29

4 A PCR-termékek tisztítását a Qiagen Gel Extraction kittel végeztük a gyártó utasításai szerint. A PCR-termékek plazmidba ligálása Promega pgem-t vektor felhasználásával történt a gyártó utasításai szerint, majd a plazmidot transzformáltuk Escherichia coli DH5-α-sejtekbe és a sejteket felszaporítottuk. A plazmid izolálása a felszaporított E. coli DH5-α-sejtekből a Qiagen Plazmid Mini kit felhasználásával történt a gyártó utasításai szerint. A plazmidba ligált PCR-termék szekvenálása plazmidspecifikus primerek (T7 és M16) felhasználásával, a PCR-termékek közvetlen szekvenálása a PCR-primerek felhasználásával BigDye terminator V.3.1 cycle sequencing kittel ABI Prism 3100 szekvenálóberendezésen történt. A szekvencia elemzéséhez és szerkesztéséhez a Chromas programot, a szekvenciák összehasonlításához a ClustalW programot, filogenetikai fák létrehozásához a weboldalt használtuk. Az egyedi, illetve reprezentatív szekvenciákat feltöltöttük a génbankba és a génbankból referenciaszekvenciákat is felhasználtunk a saját szekvenciák elemzéséhez [21]. Eredmények Cryptosporidium és Giardia előfordulása hazai nyers és ivóvizekben: az első országos felmérés eredményei 2000-től 2005-ig 233 vízmintát gyűjtöttünk és vizsgáltunk meg flokkuláció/szűrés, IMS és festés után mikroszkóposan Giardia és Cryptosporidium protozoonokra (31 nyers vizet, 44 ivóvizet, 87 Duna-vizet és 71 parti szűrés utáni vizet). A parti szűrés hatékonyságának ellenőrzése során a Dunában rendszeresen kimutattunk Giardiát és Cryptosporidiumot, a parti szűrésű kutakból sosem, ami a parti szűrés hatékonyságát jelzi a protozoonok eltávolítása szempontjából. Emellett országos felmérést végeztünk a veszélyeztetett vízbázisoknál: a 16 felszíni vizet feldolgozó vízmű nyers és hálózatra menő vizét vizsgáltuk minimum két alkalommal, egy szárazabb és egy esős időszakot kiválasztva; három olyan forrást és három karsztkutat, ahol a környéken legeltetéses állattartás van, és megvan a lehetőség a kontaminációra; két mélyfúrású kutat pedig azért, mert az egyik esetben az ellátott településen giardiosisjárvány volt, a másik esetben a bakteriológiai eredmények kontaminációt jeleztek. Az eredmények alapján két forrásban tudtunk kimutatni Giardiát és Cryptosporidiumot (2 Giardia cysta/100 L, 4 Cryptosporidium oocysta és 3,5 Giardia cysta/100 L). Tíz vízmű nyers vizét találtuk szennyezettnek mindkét protozoával (5 50 Cryptosporidium oocysta/100 L és 0, Giardia cysta/100 L), nyolc vízmű ivóvizében tudtunk azonosítani Giardiát (0,2 63,6 cysta/100 L) és Cryptosporidiumot (0,1 3 oocysta/100 L). A magasabb cysta- és oocysta-előfordulás összefüggésben van a kommunális szennyvizet befogadókkal, illetve erdős, vadakban gazdag területekkel [18]. Cryptosporidium és Giardia kimutatása és molekuláris analízise magyarországi nyers, felszíni és szennyvizekben Tizenhat nyersvíz-mintát gyűjtöttünk molekuláris vizsgálatra a felszíni vízműveinkből (Duna, Tisza, Keleti-főcsatorna, Lázbérc, Komravölgy, Köszörűvölgy, Hasznos, Csórrét, Mátrafüred, füzéri Nagy patak, Bódva folyó Sajóecsegnél és Borsodsziráknál), valamint 20 vízmintát, szintén molekuláris vizsgálatra, olyan felszíni vizekből és szennyvizekből, amelyek hatással lehetnek az ivóvíznyerő helyek szennyezettségére, ezek: Balatonba ömlő kis vízfolyások, árkok (balatonfüredi Kéki patak, keszthelyi Büdös-árok, balatonfűzfői Séd, ábrahámhegyi Burnót patak, vörösberényi Séd, Keleti-Bozót), balatoni szennyvíztisztítók (Zánka, Keszthely, Balatonújlak, Révfülöp), a tassi parti szűrésű kutak felett közvetlenül a Dunába ömlő rácalmási szennyvíz, a dunaújvárosi ivóvízkivétel felett 1 km-re a dunaújvárosi kommunális szennyvíz, budapesti szennyvíz, a szolnoki vízkivétel felett a Tiszába ömlő tiszadorogmai szennyvíz, a lázbérci vízkivételtől 16 km-re, a Bán patakba (Lázbérc) ömlő szilvásváradi szennyvíz és a sajóecsegi vízkivételtől 10 km-re, a borsodsziráki vízkivételtől 5 km-re a Bódvába ömlő edelényi szennyvíz. Az összesen 36 mintából a protozoonkoncentrálás után a minták feléből festés után mikroszkópos azonosítást végeztünk, majd a minták második feléből DNS-extrahálás után a Cryptosporidium és Giardia SSUrRNS gén egy szakaszát szaporítottuk fel külön PCRreakcióban. A PCR-termékeket szekvenáltuk, majd a kapott szekvencia analízise során állapítottuk meg a jelen levő Giardia, illetve Cryptosporidium fajt, genotípust. Giardia esetében a szubtípusok meghatározására a gdh-t kódoló PCR-termékeket is analizáltuk. A 36 mintából 24 (67%) volt Giardia-pozitív és 15 (42%) Cryptosporidium-pozitív az IFT-vel. PCR-rel 13 minta (36%) volt Giardia-pozitív és 10 minta (28%) Cryptosporidium-pozitív. 12 Giardia és két Cryptosporidium PCR-terméket tudtunk szekvenálni. Hét mintában G. duodenalis Assemblage A, egy mintában Assemblage B, négy esetben A és B Assemblage is kimutatható volt, egy mintában C. parvum-ot és egy másik mintában C. meleagridis-t mutattunk ki. A szekvenciaanalízis alapján egy, a Balatonba ömlő kis vízfolyásban (Séd) új szubtípust azonosítottunk a G. duodenalis komplexen belül, amely a gdh filogenetikai analízis alapján az Assemblage A csoporthoz mutatott a legnagyobb hasonlóságot. Mindegyik megtalált faj humán patogén. A molekuláris analízis alapján a szennyvizek hatása az ivóvíznyerő helyekre jól nyomon követhető. Néhány helyen a szennyezés forrása ismeretlen [21] évfolyam, 46. szám indd :33:29

5 Hasmenéses borjakból izolált Cryptosporidium genotípus és szubgenotípus analízise Magyarországon a közegészségügyi parazitológiai laboratóriumokban és egyes kórházak mikrobiológiai laboratóriumaiban folynak székletparazitológiai vizsgálatok. A G. duodenalis vonatkozásában a prevalencia az egyes megyékben meglehetősen egyenlőtlen, és előfordulása hazánkban mind a beteganyagban (székletminták), mind a vizekben jóval gyakoribbnak tűnik, mint a Cryptosporidium-é, ámbár lehetséges, hogy a Cryptosporidium által megbetegedettek jelentős része rövid ideig tartó, magától gyógyuló hasmenésben szenved, amellyel nem fordul orvoshoz. Hazai állatorvosi felmérések és irodalmi adatok alapján a hasmenéses borjak nagy szerepet játszanak a cryptosporidiosis terjesztésében [24]. Előző vizsgálataink Cryptosporidium oocysták és C. parvum jelenlétét is igazolták a vizekben. Annak kiderítésére, hogy hazánkban lehet-e szerepe az ál lattartó telepeknek, tehenészeteknek a vízszennyezésben és azon keresztül az emberi megbetegedésekben, 2006-ban 79 hasmenéses borjú székletmintáját gyűjtöttük be 52 állattartó telepről, különböző megyékből. Oocystadúsítás és mikroszkópos oocystaazonosítás után a pozitív mintákat molekuláris analízisnek vetettük alá. Elsőként felszaporítottuk PCR-rel az SSU-rRNS gén egy szakaszát és RFLP-analízissel faj- és genotípusmeghatározást, majd a gp 60 génszakasz amplifikálása után szekvencia- és filogenetikai analízist végeztünk. Huszonegy mintában Cryptosporidium parvum-ot, egy mintában Cryptosporidium deer-like genotípust (C. ryanae) tudtunk azonosítani. A 21 C. parvum-izolátumból IIa A16G1R1 szubgenotípust találtunk a minták 70%-ában. IIaA17G1R1 szubgenotípus három esetben, IIdA22G1 és IIdA19G1 szubgenotípusok egy-egy esetben voltak kimutathatók, továbbá egy akkor új IIaA18G1R1 szubgenotípust is azonosítottunk. A fenti szubgenotípusok közül hármat emberi székletből is azonosítottak Európában, ami igazolja azt a feltételezést, hogy a Cryptosporidium IIa- és IId-csoportba tartozó szubgenotípusok vesznek részt a zoonosisban [20]. A vízimadarak szerepe a Giardia és Cryptosporidium oocysták terjesztésében A cryptosporidiosis az egyik leggyakoribb parazitafertőzés a házi- és vadmadarak körében. Habár az eddigi megfigyelések szerint a madarak megbetegedését okozó Cryptosporidium fajok egy része emberre nem veszélyes, számos faj feceséből mutattak ki humán patogén C. parvum-ot. Néhány madárfaj ürülékben találtak emberi eredetű Giardia duodenalis cystákat is. Hogy megtudjuk, milyen szerepet játszhatnak a vízimadarak a Cryptospridium oocysták és Giardia cysták terjesztésében Magyarországon 2008 tavaszán Baranya, Békés, Csongrád és Szabolcs-Szatmár-Bereg megyei kacsa- és libatartó telepekről származó 29 házikacsa és házilúd ürülékmintáit, valamint 103 Kis-Balaton környékén gyűjtött vadon élő vízimadár ürülékét vizsgáltuk meg klasszikus és molekuláris biológiai (IFT, PCR-szekvenálás, LAMP) módszerekkel. Vizsgálatunk alapján a Cryptosporidium és Giardia elterjedési gyakorisága Magyarországon a vadmadarak esetében 5,8% és 5,8%, illetve házimadarak esetében 13% és 24%. A PCR-pozitív minták szekvenciaanalízise alapján a minták C. baileyi-t, C. parvum-ot, G. lamblia Assemblage A-t és B-t tartalmaztak. Az utóbbi kettő detektált faj humánpatogén és zoonotikus terjedésük sem kizárt, ezért feltételezzük, hogy a vízimadarak, ha csekély mértékben is, de emberre nézve potenciális fertőzésforrást jelenthetnek és szerepük lehet e protozoonok által okozott járványok kialakításában Magyarországon. Akkor elsőként detektáltunk Cryptosporidium sp.-t vetési lúdban és nyári lúdban, valamint Giardia sp.-t szárcsában, vetési lúdban és kárókatonában. A PCR-termékek szekvenciaanalízise megerősítette C. parvum előfordulását tőkés récében és szárcsában, valamint G. lamblia Assemblage A és B jelenlétét kendermagos récében, illetve nyári lúdban szintén elsőként Magyarországon [25]. Giardiaepidemiológiai felmérés két településen Az epidemiológiai felmérés célja a Giardiá-val fertőzött ivóvíz fogyasztása és az aszimptomatikus giardiosis kialakulása közötti lehetséges kapcsolat kimutatása volt. A felmérésben három település vett részt. Közülük kettő, Füzér és Mátrafüred, nyers, illetve ivóvize a szabványos USEPA 1623-módszerrel végzett korábbi vizsgálatok során pozitívnak bizonyult mindkét protozoonra. Budapest szolgált kontrollként, mivel ennek ivóvízében a rutinszerű vízminőség-vizsgálatok soha nem mutatták ki a protozoonok jelenlétét. A vizsgálat céljára a három település állandó lakosaitól székletmintát gyűjtöttünk. A mintaadással egy időben a vizsgálati alanyok egy életkörülményekre és szokásaikra vonatkozó validált kérdőívet is kitöltöttek. Ezzel párhuzamosan a települések nyers és ivóvízéből is történt mintavétel, amelyet a fent leírt módszerekkel vizsgáltunk a protozoonok jelenlétére. A három településen gyűjtött humán székletminták közül a fent leírt antigén-kimutatási teszttel és immunofluoreszcens mikroszkópiával Füzéren négy, a mátrafüredi és budapesti székletmintákban egy-egy esetben volt Giardia-pozitív a vizsgálat. A négy pozitív székletmintában Füzéren egyszer Assemblage A, egyszer Assemblage B és kétszer koinfekció volt kimutatható. Ezzel ellentétben Mátrafüreden és a kontrollvárosban (Budapest) egy-egy székletmintában G. duodenalis Assemblage A-t mutattunk ki. A kontrollvárosban a fertőzött személy valószínűleg utazásai során Ázsiában betegedett meg, míg a két faluban a fertőzött személyek nem számoltak be külföldi tartózkodásról. Füzéren, ahol az ivóvízforrásban a G. duodenalis Assemblage B PCR-módszerrel évfolyam, 46. szám 46.indd :33:29

6 is detektálható volt, magasabb volt az aszimptomatikus giardiosis aránya, mint a másik két településen. Annak ellenére, hogy a viszonylag alacsony pozitív mintaszám miatt a statisztikai analízis nem alkalmazható, az eredmények egy specifikus epidemiológiai szituációt jeleznek és jelentős információt hordoznak az aszimptomatikus giardiosissal kapcsolatosan. A vizsgálatok utáni években mindkét település (Füzér és Mátrafüred) más vízellátó forrásra csatlakozott, a víz minősége megbízható. A legköltséghatékonyabb kimutatási módszer Vizsgálataink során az újonnan bevezetett és tesztelt ARAD mikroszálas szűrő és a LAMP-technológia kombinációja bizonyult a legolcsóbb, legegyszerűbben kivitelezhető és hatékony detektálási módszernek. Az ARAD szűrő 1000 liter ivóvíz (2 NTU) átszűrésére alkalmas 24 órás periódusban, a LAMP-technológia pedig a legfontosabb humán patogén fajok és genotípusok, nevezetesen C. parvum, C. hominis, C. meleagridis és G. duodenalis Assemblage A, B azonosítását teszi lehetővé. Az ARAD szűrő és LAMP együttes alkalmazásának tesztelése során 1000 liter koncentrált mintát alapul véve már 1 (oo)cysta 10 liter ivóvízben kimutatható volt [19]. Megbeszélés A giardiosis és cryptosporidiosis elterjedése az emberi populációban egyre nagyobb problémát jelent világszerte. Ezeknek a patogéneknek a cystái, oocystái megjelenhetnek az ivóvízellátásban, rekreációs helyeken, a mezőgazdasági felhasználású vizekben. Fejlett országok nagyobb sikerrel kontrollálják ezeknek a protozoonoknak a jelenlétét, bár a vízminőségi problémák ha kisebb számban is jelen vannak. A megvizsgált nyers vizek 55%-ában és az ivóvizek 34%-ában tudtunk kimutatni Giardiá-t és Cryptosporidium-ot. Két vízmű vízkezelése bizonyult nem megfelelőnek a protozoonok eltávolítása szempontjából, egyik vízmű sem alkalmazott flokkulációs víztisztítási technológiát. Ma ezek a vízművek nem működnek, az ellátott települések más forrásból kapják az ivóvizet. A vizsgálataink alapján azok a vízművek, amelyek nyers vizében a Giardia- vagy Cryptosporidiumszennyeződés előfordulhat és kockázatot jelent, részletes tájékoztatást kaptak, elkezdték a rendszeres kontrollvizsgálatokat. A PCR-es vizsgálatok megerősítették, hogy a megvizsgált vizek 36%-a Giardia-pozitív volt, illetve 28%-a Cryptosporidium-pozitív. Továbbá humán patogén Giardia duodenalis csoportokat és Cryptosporidium fajokat, valamint egy új Giardia szubtípust azonosítottunk. Az eredmények nagymértékben hozzájárulnak az ember egészségének védelmében teendő intézkedések meghozatalához. A jelenlegi tanulmány elsőként alkalmazza a Giardia és Cryptosporidium szimultán kimutatását és genotipizálását a magyar vízellátókban. Ugyanakkor azt is bemutatja, hogy milyen nehéz az igen alacsony számban előforduló protozoonok különböző vizekből és fekáliából történő kimutatása. A leírt és bevezetett detektálási technikák ma rutinszerűen alkalmazhatók. Mivel a bemutatott módszerek mind klinikai, mind környezeti, sőt élelmiszermintákhoz is használhatók, segítségünkre lesznek a jövőben az állati és emberi fertőzőforrások meghatározásához, Cryptosporidium-, illetve Giardia-szubtípusok állatról emberre való terjedésének, és az átterjedés dinamizmusának meghatározásához. A biztonságos, patogénmentes ivóvíz mindenki számára létfontosságú. A Cryptosporidium és Giardia elterjedése a magyarországi vizekben eddig nem volt ismert. Felmérések és tudományos munka szükséges, hogy jobban megérthessük ezeknek a protozoonoknak a természetét vizeinkben. Köszönetnyilvánítás Hálás köszönettel tartozom prof. Panagiotis Karanisnak, prof. Márialigeti Károlynak és dr. Török Tamásnénak a szakmai támogatásért, valamint az OKI Vízhigiénés Főosztály, az OEK Parazitológiai Osztály, a Fővárosi Vízművek Biológiai és Toxikológiai Laboratórium összes dolgozójának az együttműködésért, az obihirói kollégák segítségéért. Mindemellett országszerte számtalan állatorvos, Füzéren és Mátrafüreden a háziorvosok, a Balaton területén a Balaton-felvidéki Nemzeti Park madarászai gondoskodtak a zökkenőmentes mintagyűjtésről. Az új szűrő validálását az Arad Hungária Kft., Budapest tette lehetővé. Anyagi támogatást az alábbiak nyújtottak: ETT (T08-076), GVOP AKF (0517), (HEALTHY-WATER) EU-Project, FP 6, Environment & Health Program (FOOD-CT ), Japán Minisztérium ösztöndíja fiatal kutatók támogatására. Irodalom [1] Fall, A., Thompson, R. C., Hobbs, R. P., et al.: Morphology is not a reliable tool for delineating species within Cryptosporidium. J. Parasitol., 2003, 89, [2] Slapeta, J.: Cryptosporidiosis and Cryptosporidium species in animals and humans: A thirty colour rainbow? Int. J. Parasitol., 2013, 43, Doi: pii: S (13) / j.ijpara [Epub ahead of print] [3] Plutzer, J., Karanis, P.: Genetic polymorphism in Cryptosporidium species: an update. Vet. Parasitol., 2009, 165, [4] Fayer, R., Leek, R. G.: The effects of reducing conditions, medium, ph, temperature, and time on in vitro excystation of Cryptosporidium. J. Protozool., 1984, 31, [5] Current, W. L., Reese, N. C.: A comparison of endogenous development of three isolates of Cryptosporidium in suckling mice. J. Protozool., 1986, 33, [6] Current, W. L., Garcia, L. S.: Cryptosporidiosis. Clin. Lab. Med., 1991, 11, [7] Hunter, P. R., Nichols, G.: Epidemiology and clinical features of Cryptosporidium infection in immunocompromised patients. Clin. Microbiol. Rev., 2002, 15, [8] Becher, K. A., Robertson, I. D., Fraser, D. M., et al.: Molecular epidemiology of Giardia and Cryptosporidium infections in dairy calves originating from three sources in Western Australia. Vet. Parasitol., 2004, 123, 1 9. [9] Skerrett, H. E., Holland, C. V.: Asymptomatic shedding of Cryptosporidium oocysts by red deer hinds and calves. Vet. Parasitol., 2001, 94, évfolyam, 46. szám indd :33:29

7 [10] Cavalier-Smith, T.: Protist phylogeny and the high-level classification of Protozoa. Eur. J. Protistol., 2003, 39, [11] Lasek-Nesselquist, E., Welch, D. M., Sogin, M. L.: The identification of a new Giardia duodenalis assemblage in marine vertebrates and a preliminary analysis of G. duodenalis population biology in marine systems. Int. J. Parasitol., 2010, 40, [12] Plutzer, J., Ongerth, J., Karanis, P.: Giardia taxonomy, phylogeny and epidemiology: Facts and open questions. Int. J. Hyg. Environ. Health, 2010, 213, [13] Gillin, F. D., Reiner, D. S., McCaffery, J. M.: Cell biology of the primitive eukaryote Giardia lamblia. Annu. Rev. Microbiol., 1996, 50, [14] Farthing, M. J.: Giardiasis. Gastroenterol. Clin. North Am., 1996, 25, [15] Upcroft, J. A., McDonnell, P. A., Gallagher, A. N., et al.: Lethal Giardia from a wild-caught sulphur-crested cockatoo (Cacatua galerita) established in vitro chronically infects mice. Parasitology, 1997, 114, [16] Karanis, P., Kourenti, C., Smith, H.: Waterborne transmission of protozoan parasites: a worldwide review of outbreaks and lessons learnt. J. Water Health, 2007, 5, [17] Medema, G., Teunis, P., Blokker, M., et al.: WHO Guidelines for Drinking Water Quality, Environmental Health Criteria, Cryptosporidium, Draft health/gdwqrevision/cryptodraft2.pdf [18] Plutzer, J., Takó, M. H., Márialigeti, K., et al.: First investigations into the prevalence of Cryptosporidium and Giardia spp. in Hungarian drinking water. J. Water Health, 2007, 5, [19] Plutzer, J., Törökné, A., Karanis, P.: Combination of ARAD microfibre filtration and LAMP methodology for simple, rapid and cost-effective detection of human pathogenic Giardia duodenalis and Cryptosporidium spp. in drinking water. Lett. Appl. Microbiol., 2010, 50, [20] Plutzer, J., Karanis, P.: Genotype and subtype analyses of Cryptosporidium isolates from cattle in Hungary. Vet. Parasitol., 2007, 146, [21] Plutzer, J., Karanis, P., Domokos, K. et al.: Detection and characterisation of Giardia and Cryptosporidium in Hungarian raw, surface and sewage water samples by IFT, PCR and sequence analysis of the SSUrRNA and GDH genes. Int. J. Hyg. Environ. Health, 2008, 211, [22] Plutzer, J., Karanis, P.: Rapid identification of Giardia duodenalis by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) from faecal and environmental samples and comparative findings by PCR and real-time PCR methods. Parasitol. Res., 2009, 104, [23] Bakheit, M. A., Torra, D., Palomino, L. A., et al.: Sensitive and specific detection of Cryptosporidium species in PCR-negative samples by loop-mediated isothermal DNA amplification and confirmation of generated LAMP products by sequencing. Vet. Parasitol., 2008, 158, [24] Nagy, B.: Epidemiological data on Cryptosporidium parvum infection of mammalian domestic animals in Hungary. [Cryptosporidium parvum fertőzöttség előfordulása magyarországi emlős haszonállatokban.] Magy. Allatorv. Lapja, 1995, 50, [Hungarian] [25] Plutzer, J., Tomor, B.: The role of aquatic birds in the environmental dissemination of human pathogenic Giardia duodenalis cysts and Cryptosporidium oocysts in Hungary. Parasitol. Int., 2009, 58, (Plutzer Judit, Budapest, Gyáli út 2 6., plujud@yahoo.com) évfolyam, 46. szám 46.indd :33:30