Az RNS-átvizsgáló mechanizmus hibájából fakadó autoimmunitás Semsei Imre, Darise Farris, Michael Bachmann

Átírás

1 ÖSSZEFOGLALÓ KÖZLEMÉNY Az RNS-átvizsgáló mechanizmus hibájából fakadó autoimmunitás Semsei Imre, Darise Farris, Michael Bachmann Az autoimmun betegségek patomechanizmusa a mai napig sem ismert. Igen sok tényezô szerepét gyanítják a betegség kialakulásában (genetikai elrendezôdés, hormonális tényezôk, exogén és endogén vírusok stb.), a kiváltó okok magyarázatára több elmélet is született. A legtöbb elképzelés immunregulációs zavart feltételez a folyamatok hátterében, egyes elgondolások szerint viszont az immunrendszer helyesen reagál, s a kiváltó okokat máshol kell keresnünk. A jelen munka azt kívánja bemutatni, hogy egyes genetikai változások és a sejtek bizonyos javító mechanizmusainak hibája miként eredményezheti autoimmun reakciók kialakulását. Két évtizedes molekuláris immunológiai kutatások eredményei szerint az La autoantigén 7-es exonjának forrópont régiójában mutáció található egyes autoimmun betegségben Sjögren-szindrómában, SLE-ben szenvedôk perifériás vérének lymphocytáiban. A mutáns génrôl átíródó RNS olyan korai terminációs kodonokat tartalmaz, amelyeket az RNS-átvizsgáló mechanizmusnak eliminálnia kellene, hogy azokról ne íródhasson át fehérje. A mechanizmus hibája miatt mégis keletkeznek mutáns fehérjék, ezek léte végsô soron autoimmun reakciók kiváltását vonhatja maga után. autoimmunitás, La autoantigén, patomechanizmus, RNS-átvizsgáló rendszer Autoimmunity as a result of escape from RNA surveillance The pathomechanisms of autoimmune diseases are still unknown. Numerous factors are thought to play a role in the formation of the diseases (genetic arrangement, hormonal factors, exogen and endogen viruses, etc.) and many hypotheses have been formulated to explain the role of these factors. Most of the theories suspect that disturbance of the immune system is the clue but according to other researchers the immune system performs properly and one has to find other alterations that could be blamed for the formation of the autoimmune diseases. The aim of our present work is to show that certain genetic alterations together with the mistake of the RNA surveillance system could lead to autoimmune reactions. Results of immune research conducted in the past two decades revealed that there are mutations in the hot spot region of exon 7 of the La gene in the peripheral lymphocytes of patients suffering from certain autoimmune diseases (Sjögren's syndrome, SLE). RNAs originated from the mutant gene contain premature termination codon and therefore the RNA surveillance mechanism should get rid of these RNAs in order to prevent the formation of mutant proteins. However, because of the mistake of the surveillance system mutant proteins are formed that could finally lead to the autoimmune reactions. Magy Immunol/Hun Immunol 2007;6(1 2): autoimmunity, La autoantigen, pathomechanism, RNA surveillance DR. SEMSEI IMRE (levelezô szerzô/correspondent), Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Immunológiai Tanszék; 4032 Debrecen, Móricz Zs. u semsei@iiibel. dote.hu; DR. DARISE FARRIS, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, USA; DR. MICHAEL BACHMANN, Carl Gustav Carus Technische Universität, Institut von Immunologie, Dresden, BRD Érkezett: október 10. Elfogadva: január 3. Semsei Imre: Az RNS-átvizsgáló mechanizmus hibájából fakadó autoimmunitás 39

2 Az autoimmun reakciók során a szervezet olyan saját komponensekre támad, amelyekre normális mûködése során nem kellene. Ezek a reakciók legtöbbször a szervezet helytelen mûködését eredményezik, ezeket autoimmun betegségként definiáljuk. A betegség patomechanizmusát nem ismerjük pontosan, de több hipotézis az immunrendszer elváltozásait például az immuntolerancia génjeinek defektusait teszi felelôssé. Emellett számos más elképzelés látott napvilágot, mint a vírusfehérjék molekuláris mimikrije 1, vagy az apoptotikus sejtek helytelen eliminációja 2. Kiváltó tényezôként több külsô és belsô faktor ismert exogén és endogén vírusok (EBV, HIV CMV, HTLV) 3 6, de emellett a betegség kialakulásának faktoraként említik az UV-sugárzást, gyógyszerek hatásait, valamint hormonális tényezôket és a komplex genetikai hátteret is 7. Az autoimmun reakciók egzakt diagnózisában segít bennünket a megjelenô antitestek detektálása. Az utóbbi idôk megfigyelései alapján azonban igen valószínûnek tûnik, hogy egyes antigének nemcsak a betegség kimutatását segítik, de az autoimmun betegség kiváltó okai is lehetnek. Az La antigén esetleges szerepét több betegségben is például Sjögrenszindrómában (Ss) vagy szisztémás lupus erythematosusban (SLE) gyanítják. Az elmúlt két évtizedben az La gént számos oldalról tanulmányozták behatóan, s több megfigyelés tovább erôsíti azt az elképzelést, hogy az autoantigén változásai elôsegíthetik az autoimmun reakciók kialakulását 8, 9. La autoantigén Az La gén közel két évtizedes tanulmányozása során 10 a gént már 1993-ban klónoztuk 11, s hamar kiderült, hogy a génnek több splicing variációja is létezik 12, 13. A normális, addig ismert forma mellett két másik mrns-forma is megtalálható sejtjeinkben (1. ábra), s a gén több pszeudogénjét is azonosítottuk 14. Már ezek az eredmények ráirányították figyelmünket a 7-es exon forrópont régiójára, ahol a pszeudogénekben eltérô tagszámú oligoa-szakaszok találhatók. Ahogyan közben kiderült 15, vannak olyan La-mRNS-ek is, amelyek mutációt tartalmaznak ebben a régióban; ezek expressziója mutáns fehérjéket eredményezhet (2. ábra). Már a különbözô splicing variánsok is mutáns La fehérjék megjelenését hordozták magukban, azonban a meglévô stop kodonok mellett ez csak keretugrás révén lenne lehetséges. Ismert azonban, hogy vírusok hatására a keretugrás lehetségessé válik, s mivel több autoimmun betegség kialakulásában feltételezik a vírusok közremûködését, elképzelhetô, hogy a splicing variánsok önmagukban 1. ábra. Az La antigén mrns-ei és pszeudogénjei. A genomban a három mrns-formát kódoló DNS-szakasz mellett három pszeudogén is megtalálható. Az egyik pszeudogén az La 1 mrns-formára, a másik kettô a normális formára hasonlít. Mindegyik pszeudogénnek eltérô oligoa-tagszámú szakasza található a 7-es exonban, amely még a kódoló mrns-tôl is eltér. 40 Magy Immunol/Hun Immunol 2007;6(1 2):39 45.

3 is megváltozott fehérjék kialakulására adnak alkalmat. Normális esetben azonban mindegyik splicing variánsról normális La fehérje íródik át. A mutációk hatása az La génben A mutációk következtében azonban direkt módon is keletkezhetnek megváltozott fehérjék. Ezek közül figyelmünket elôször a deletióval keletkezô 7A formára irányítottuk, ahol a mutáció miatt egy neoepitóp alakulhat ki (3. ábra). Ez az epitóp autoimmun reakciót is kiválthat, hiszen az átíródott rész a szervezet számára ismeretlen aminosavsorrendet tartalmaz. Emellett a normális fehérjéhez képest csonkolt fehérje keletkezik, s így az elveszíti a C-terminális részben található dimerizációs szignált, s a mag lokalizációs szignálját is. A dimerizációs jel elengedhetetlen az La fehérjék funkciójának kifejtéséhez, hiszen az dimerként funkcionál. A maglokalizációs jel elvesztése következtében pedig az új fehérje többé már nem marad a sejtmagban, hanem a citoplazmába is kivándorol. A mutáns fehérje valóban megjelenik a mutációt hordozó sejtekben, sôt, az anti-la-pozitív SLE-ben szenvedô betegek mintegy 30%-ánál detektálható (4. ábra) is 9 (a kimutatási módszer kis érzékenysége miatt esetleg még ezen felül is található a többi SLE-s beteg szérumában is). Látható tehát, hogy egy mutáció miatt olyan mutáns fehérjék keletkeznek, amelyek nem képesek ellátni eredeti funkcióikat. 2. ábra. Mutáns La fehérjék kialakulásának lehetséges módjai. a kép: a normális és a mutáns fehérjék deletio ( A) és insertio (+A) hatására. Deletiókor neoepitóp, insertiókor crypticus epitóp keletkezik. b kép: A = normális fehérje; B = az exon 1 splicing variáns lehetséges hatásai; C = a deletio ( A) hatása; C = minden hatás együttesen. NLS (nuclear localization signal): maglokalizációs jel; ORF (open reading frame): nyílt olvasási keret; RNP (ribo-nucleo protein): magfehérje Az viszont még kérdéses, hogyan vezet mindez autoimmun betegségek kialakulásához. A mutáns fehérjét hordozó transzgenikus egértörzs tanulmányozása során érdekes adatok váltak ismertté az autoim- Semsei Imre: Az RNS-átvizsgáló mechanizmus hibájából fakadó autoimmunitás 41

4 Granzim B Kaszpáz valamelyik antitest jelenléte. Egyértelmû tehát, hogy a mutáns La fehérje nemcsak a mutáns La elleni antitestek megjelenését eredményezte, de több másét is, ahogy az epitópszóródás jelensége más kísérleteknél is elôfordult 7. Az RNSátvizsgáló mechanizmus 3. ábra. Az La fehérje szerkezete és egy mutáció hatása a fehérje képzôdésére. a kép: normális La (nla) és mutáns La fehérje (mla). A dimerizációs (DIM) és maglokalizációs (NLS) szignálokat jelöltük a C-terminálison. b kép: A deletio hatása a mutáns La aminosavsorrendjére, a normális La összehasonlításában. A mutáció neoepitóp kialakulásához vezet (aláhúzott rész). RNP (ribo-nucleo protein): magfehérje munitás kialakulásával kapcsolatban 9. Az 5. ábra két transzgenikus egérvonal tanulmányozása során nyert adatokat szemléltet. A két hónapos transzgenikus egereknél nem, vagy csak igen kis mennyiségû mutáns La elleni antitesteket figyeltek meg. A négy hónapos állatoknál is csak az egyik vonal mutatott szignifikáns mutáns és normális La elleni antitesteket. Az öt-hat hónapos állatoknál viszont már megjelentek a dsdns és az Ro elleni antitestek is. Nyolc hónapos kor felett már kivétel nélkül minden állatnál kimutatható volt Amint azt a 3. ábra is szemlélteti, a mutáció következményeként stop kodon jelent meg az aminosavsorrendben. Több megfigyelés is azt mutatta, hogy létezik olyan mechanizmus, amely eliminálja a korai terminációs kodonokat (premature termination codon, PTC) tartalmazó RNS-eket, s ezt nonszensz mediálta lebontásnak (nonsense mediated decay, NMD), vagy RNSátvizsgáló mechanizmusnak (RNA surveillance) nevezték el 16, 17. A szervezetünkben folyamatosan keletkezô mutációk tehát nem feltétlenül jelentik azt, hogy arról mutáns fehérjék is keletkezni fognak. Amennyiben ez a mechanizmus nem mûködne korrekten, a mutációt hordozó RNS-ekrôl mutáns betegségek kialakulását elôsegítô fehérjék íródnának 4. ábra. A mutáns La fehérje elôfordulási frekvenciája. A szokásos La antitestre pozitív SLE-s betegek szérumának körülbelül 30%-ában megtalálhatók a mutáns La elleni antitestek. 42 Magy Immunol/Hun Immunol 2007;6(1 2):39 45.

5 át. Mindamellett, hogy ez a mechanizmus mûködik, ismert néhány példa arra, hogy a mutáns RNS kikerüli ezt a mechanizmust, s ennek következményeként valóban betegségek kialakulását észlelhetjük Noha ezek a mechanizmusok még nem teljesen tisztázottak, már több vonatkozását sikerült feltárni. Az RNS-eknél az exonok csatlakozásánál fehérjék kötôdnek fel, s ha az RNS korai terminációs kodont tartalmaz, ezek a transzláció elsô köre után is fennmaradnak; az RNS-átvizsgáló rendszer ezt észlelvén lebontja az ilyen RNS-eket. Az La-RNS esetében azonban (6. ábra) az elsô kör után nem maradnak fenn az exoncsatlakozást jelzô fehérjék, s így arról fehérje íródhat át. Ez visszavezethetô a forrópont régióban meglévô oligoa-szakaszra, ami lehetôséget nyújt a keretugrásra, s így a csatlakozó fehérjék leválnak a mutáns RNS-rôl, hiszen a riboszómákon az RNS végigfut, mintha az normális La lenne, és nem tartalmazná a korai terminációs kodont. Az RNSátvizsgáló rendszer tökéletlensége miatt tehát a mutáns RNS-ekrôl mutáns fehérjék keletkezhetnek. A mutáns fehérjéket hordozó lymphocytákat egyrészt az immunrendszer megkísérli eliminálni, másrészt azok maguk is elpusztulnak az apoptózis során. Az La-mutáció esetében éppen a normális apoptózis folyamata sérül (7. ábra). A mutáns fehérjék nem képesek funkcióikat ellátni (nincs dimerizáció), s ez kihat a p53 fehérje negatív regulációját végzô mdm2 fehérjére 21. A p53 részt vesz az apoptózis irányításában és a sejtciklus-inhibitor p21 regulációjában. A p21-szint emelkedése figyelhetô meg több autoimmun betegség esetén is, ahogy például a mutáns La fehérje megjelenése után is. Ez a p21 képes az autoreaktív memóriasejtek stabilizálására 22, s így hozzájárul autoimmun reakciók kiváltásához. 5. ábra. La transzgenikus egerek antitest-repertoárja. A két egérvonalban a különbözô antitestek más idôskálán és más eloszlásban jelennek meg, de a mutáns La elleni antitestek mellett megjelenik a normál La elleni is, sôt, még az Ro és a dsdns elleniek is. Komplex genetikai és epigenetikai háttér Látható tehát, hogy egy mutáció kialakulása és az RNS-átvizsgáló rendszer hibája az La gén esetében végül is autoimmun reakciók kialakulását vonja maga után. Így esetünkben az alapfolyamatok elindulásához elengedhetetlen volt három tényezô megléte. Emellett nyilvánvalóan más faktorok és folyamatok is szükségesek a tényleges autoimmunitás kialakulásához 23, 24. Az a tény, hogy egyes autoimmun betegségekben szenvedôk rokonságában az autoimmun betegség kifejlôdésének esélyei sokkal nagyobbak a többiekhez képest 25, számos más ténnyel együtt azt vetíti elénk, hogy mindenképpen lennie kell valamilyen Semsei Imre: Az RNS-átvizsgáló mechanizmus hibájából fakadó autoimmunitás 43

6 6. ábra. Az La-mRNS az összeszerelés után. Az exonok csatlakozását fehérjekomplexek jelzik, amelyek a transzláció elôtt (a kép) mindenütt megtalálhatók, míg az RNS-átvizsgáló rendszer helyes mûködése esetén a transzláció elsô köre után (b kép) még a korai stop kodon után is megtalálhatók lennének, ami az RNS degradációját vonná maga után. A lehetséges keretugrás miatt viszont a mutáns mrns mégis normális mrns-ként funkcionálhat, ami a mutáns fehérje megjelenését eredményezi. PTC (premature termination codon): érés elõtti terminációs kodon 7. ábra. A mutáns La fehérje expressziójának következményei. A normális apoptózisban részt vevô p53 fehérjét reguláló MDM2 fehérje helytelenül expresszálódik, ez a p21 fehérje szintjének emelkedéséhez és az autoreaktív memóriasejtek apoptózisának zavarához vezet. IRES: (internal responsive element): belsõ reagáló elem genetikai és/vagy epigenetikai meghatározottságnak is. A genomon belül több olyan helyet azonosítottak, amelyek szerepet játszhatnak különbözô autoimmun betegségek kialakulásában 26. Emellett azt is megállapították, hogy közös gének expressziója változik meg autoimmun betegségek esetén 27. További igen fontos megfigyelés, hogy ezek a gének nem random módon helyezkednek el a genomon belül, és helyzetük korrelál a genomon belül az autoimmun betegségek kialakulásában szerepet játszó gének helyzetével 28. Emellett számos polimorfizmus is fontos tényezôként jöhet szóba az autoimmun betegségek kialakulásában 29, 30, ami akár genetikai, akár epigenetikai szabályozó tényezôként is hozzájárulhat a 44 Magy Immunol/Hun Immunol 2007;6(1 2):39 45.

7 betegség iránti fogékonysághoz, annak kialakulásához. Mindezen fent említett tények nem zárják ki, hogy az eddig felfedezett monogénes autoimmun betegségek 24 mellett esetleg további kórképekrôl is bebizonyosodik, hogy egy-egy gén konkrét hibája képez kiváltó okot. IRODALOM 1. Oldstone MB. Molecular mimicry and autoimmune disease. Cell 1987;50: Andrade F, Casciola-Rosen L, Rosen A. Apoptosis in systemic lupus erythematosus. Clinical implications. Rheum Dis Clin North Am 2000;26: Flescher E, Talal N. Do viruses contribute to the development of Sjögren s syndrome? Am J Med 1991;90: Fox RI, Luppi M, Pisa P, Kang HL. Potential role of Epstein-Barr virus in Sjögren s syndrome and rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1992;19: James JA, Kaufman KM, Farris AD, Taylor-Albert E, Lehman TJA, Harley JB. An increased prevalence of Epstein-Barr virus infection in young patients suggests a possible etiology for systemic lupus erythematosus. J Clin Inv 1997;100: Magistrelli C, Samoilova E, Agarwal RK, Banki K, Ferrante P, Vladutiu A, et al. Polymorphic genotypes of the HRES-1 human endogenous retrovirus locus correlate with systemic lupus erythematosus and autoreactivity. Immunogenetics 1999;49: James JA, Scofield RH, Harley JB. Immunoglobulin epitope spreading and autoimmune disease after peptide immunization: Sm B/B -derived PPPGMRPP and PPPGIRGP induce spliceosome autoimmunity. J Exp Med 1995;181: Semsei I. Az La gén mutációi: az immunrendszer helyesen reagál. Magy Immunol 2006;5: Bachmann MP, Holger B, Gross JK, Maier SM, Gross TF, Workman JL, et al. Autoimmunity as a result of escape from RNA surveillance. J Immunol 2006;177: Bachmann M., Pfeifer K, Schröder HC, Müller WEG. Characterization of the autoantigen La as a nucleic acid dependent ATPase/ datpase with melting properties. Cell 1990;60: Semsei I, Tröster H, Bartsch H, Schwemmle M, Igloi GL, Müller WEG, Bachmann M. Isolation of rat cdna clones coding for the autoantigen SS-B/La: Detection of species specific variations. Gene 1993;126: Tröster H, Metzger T, Semsei I, Schwemmle M, Mayet W, Bachmann M. One gene two transcripts: Isolation of an alternative transcript encoding for the autoantigen La/SS-B from a cdna library of a patient with primary Sjögren s syndrome. J Exp Med 1994;180: Grölz D, Laubinger J, Wilmer F, Tröster H, Bachmann M. Transfection analysis of expression of mrna isoforms encoding the nuclear autoantigen La/SS-B. J Biol Chem 1997;18: Grölz D, Bartsch H, Tröster H, Bachmann M. The nuclear autoantigen La/SS-B. Mapping and sequencing of the gene and the three retropseudogenes. Gene 1997;191: Bachmann M, Tröster H, Bartsch H, Grölz D. A frame shift mutation in a hot spot of the nuclear autoantigen La/SSB. J Autoimmun 1996;9: Fasken MB, Corbett HA. Process or perish: quality control in mrna biogenesis. Nat Struct Biol 2005;12: Weischenfeldt J, Lykke-Andersen J, Porse B. Messenger RNA surveillance: neutralizing natural nonsense. Curr Biol 2005;15:R559- R Schell T, Kocher T, Wilm M, Seraphin B, Kulozik AE, Hentze MW. Complexes between the nonsense-mediated mrna decay pathway factor upf1 (up-frame shift protein 1) and essential nonsensemediated mrna decay factors in HeLa cells. Biochem J 2003; 373: Culbertson MR. RNA surveillance: unforeseen consequences for gene expression, inherited genetic disorders and cancer. Trends Genet 1999;15: Hentze MW, Kulozik AE. A perfect message: RNA surveillance and nonsense-mediated decay. Cell 1999;96: Trotta, R, Vignudelli T, Candini O, Intine RV, Pecorari L, Guerzoni C, et al. BCR/ABL activates mdm2 mrna translation via the La antigen. Cancer Cell 2003;3: Lawson BR, Baccala R, Croft M, Kono DH, Theofilopoulos AN. Deficiency of cyclin kinase inhibitor p21(waf-1/cip-1) promotes apoptosis of activated/memory T-cells and inhibits spontaneous systemic autoimmunity. J Exp Med 2004;199: Buzás E, Falus A, Szegedi Gy. Az autoimmun betegségek patogenetikai jellemzôi. Orv Hetil 2006;148: Rioux JD, Abbas AK. Path to understanding the genetic basis of autoimmune disease. Nature 2005;435: Szegedi Gy. Autoimmun betegségek sajátosságai. LAM 2004;14: Jawaheer D, Seldin MF, Amos CI, Chen WV, Shigeta R, Monteiro J, et al. A genomwide screen in multiplex rheumatoid arthritis families suggests genetic overlap with other autoimmune diseases. Am J Hum Genet 2001;68: Maas K, Chan S, Parker JS, Slater A, Moore JH, Olsen N, Aune TM. Cutting edge: Molecular portrait of human autoimmune disease. J Immunol 2002;169: Aune TM, Parker JS, Maas K, Liu Z, Olsen NJ, Moore JH. Colocalization of differentially expressed genes and shared susceptibility loci in human autoimmunity. Genet Epidemiol 2004;27: Márka M, Bessenyei B, Zeher M, Semsei I. IL-10 prometer 1082 polymorphism is associated with elevated IL-10 levels in control subjects but does not explain elevated plasma IL-10 observed in Sjögren s syndrome in a Hungarian cohort. Scan J Immunol 2005; 62: Bessenyei B, Márka M, Urbán L. Zeher M, Semsei I. Single nucleotide polymorphisms: Aging and diseases. Biogerontology 2004;5: HÍR 3RD INTERNATIONAL CONFERENCE ON AUTOIMMUNITY: MECHANISMS AND NOVEL TREATMENTS Place and date: October 7 12, 2007, Aldemar Paradise Village, in Rhodes, Greece The deadline for receipt of abstracts, early registration, and hotel reservations is July 15, Further information: Semsei Imre: Az RNS-átvizsgáló mechanizmus hibájából fakadó autoimmunitás 45