Semmelweis Egyetem. Doktori (PhD) értekezés tézisei

Átírás

1 Semmelweis Egyetem Doktori (PhD) értekezés tézisei A vasháztartás és az extracelluláris antioxidáns rendszer összefüggése újszülöttekben és koraszülöttekben Dr. Szabó Miklós Semmelweis Egyetem Budapest I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola 2005

2 Klinikai orvostudományok Krónikus betegségek gyermekkori prevenciója Doktori (PhD) értekezés tézisei A vasháztartás és az extracelluláris antioxidáns rendszer összefüggése újszülöttekben és koraszülöttekben Dr. Szabó Miklós Témavezeto: Dr. Vásárhelyi Barna Programvezeto: Prof. Dr. Tulassay Tivadar Semmelweis Egyetem Budapest, 2005

3 Összefoglalás Vizsgálataimmal a vasháztartás és az extracelluláris (EC) antioxidáns kapacitás összefüggéseit tanulmányoztam újszülöttekben és koraszülöttekben. Elsoként egészséges újszülöttek megszületés utáni vérmintáinak vizsgálatával arra a kérdésre kerestem a választ, hogy az EC antioxidáns védekezo képesség hogyan változik a korai neonatális adaptáció idoszakában. Az antioxidáns kapacitás vizsgálatokat a vasháztartás paramétereinek egyideju mérésével végeztem el. Az eredmények alapján arra a következtetésre jutottam, hogy az újszülöttek EC antioxidáns kapacitása röviddel a megszületés után megemelkedik, jelezve, hogy az újszülött szervezete az oxidatív terhelés ellenére, képes fokozni antioxidáns védekezését. A primer és a szekunder antioxidánsok aktivitása egyaránt növekszik posztnatálisan. A szérum vas és ferritin szintjében bekövetkezo hasonló ütemu, gyors változások részben magyarázatul szolgálnak az antioxidáns védekezo képesség posztnatális javulására. Eredményeim arra utalnak, hogy az oxidatív környezet, születés okozta, megváltozásához történo gyors alkalmazkodásban, a vas-metabolizmus szélsoséges változásai lényeges szerepet töltenek be. További vizsgálataimmal igazoltam, hogy a rekombináns humán eritropoetin (rhuepo) kezelés csökkenti a nagy morbiditású koraszülöttek transzfúzió igényét és mérsékeli a kóros szöveti vasraktározást. A rhuepo kezeléssel kapcsolatban a BPD és ROP szövodménybetegségek csökkeno elofordulásának tendenciáját észleltem. A rhuepo kezelés kezdeti szakaszában, a fokozott celluláris vasfelhasználás ellenére, rövidtávon sem a vasmetabolizmus paraméterei, sem az antioxidáns védekezo képesség nem változnak számottevoen. Eredményeim alapján azt a következtetést vontam le, hogy amennyiben a rhuepo kedvezo hatást gyakorol az antioxidáns rendszerre, akkor az csak hosszabb kezelési idoszak után válik kimutathatóvá. A rhuepo BPD-re és ROP-ra gyakorolt esetleges kedvezo hatását nagy esetszámú, további vizsgálatokkal lehet tisztázni.

4 Bevezetés A maradandó szervkárosodással járó neonatológiai szövodménybetegségek, mint a retrolentáris fibroplázia (ROP), bronchopulmonális diszplázia (BPD), a periventrikuláris leukomalacia (PVL) és hypoxiás-ischaemiás encephalopathia (HIE) keletkezésében nagy jelentoséggel bírnak a szabadgyökök közvetítette patológiás folyamatok. Az intenzív kutatás ellenére a mai napig nem sikerült a mindennapi gyógyítás számára hatékony antioxidáns kezelést vagy terápiát kidolgozni. Ennek a hátterében az állhat, hogy az antioxidáns rendszer perinatális fiziológiája is csak részletekben ismert. A sejtmembrán károsodása szempontjából a szabadgyökök közül kitüntetett szereppel bír a legtoxikusabb hatású szabad hidroxilgyök. Keletkezése a Fenton-reakció során a szabad, fehérjéhez nem kötött vas jelenlététol függ. Így a szervezet számos, a szabadgyök képzést meghatározó mechanizmusa közül a vasforgalomban résztvevo proteinek aktivitása, és koncentrációja nagy szerepet játszik abban, hogy a szabadgyök terhelés nyomán létrejön-e szervkárosodás. Az újszülöttek és koraszülöttek vasforgalmának perinatális fiziológiás változásai a vasháztartást jellemzo paraméterek rövidtávú, szélsoséges változásait eredményezik. Korábban nem történt olyan átfogó, klinikai szintu vizsgálat, amely a vasháztartás és a vasfüggo antioxidáns tulajdonságok perinatális, egyideju változásait, és ezek lehetséges kapcsolatát vizsgálta volna újszülötteken. Ezen összefüggések mélyebb megismerése két szempontból is indokolt. Egyre világosabban körvonalazódik, hogy az érett újszülöttek hypoxiás ischaemiás károsodásainak, elsosorban az encephalopathiának egyik lehetséges jövobeni terápiája a reperfúzió során keletkezett extrém mennyiségu szabadvas semlegesítésében rejlik. Másrészt egyre kiterjedtebben kerül alkalmazásra koraszülöttekben a vasháztartás mélyreható változásait okozó eritropoetin kezelés. Kutatómunkám során ezért az újszülött-kori vasháztartás perinatális változásának a leírását tuztem ki célul. Ennek során elemeztem a vasháztartás és az antioxidáns kapacitás változásainak összefüggését, illetve kitértem a vasháztartás és az azt alapvetoen befolyásoló rekombináns humán eritropoetin (rhuepo) kezelés közötti kapcsolatra.

5 Célkituzések Az újszülött perinatális adaptációjának lényeges részjelensége a méhen belüli alacsonyabb oxigenizációs környezet és metabolikus státusz gyors ütemu megváltozása. Az oxigén kínálat (parciális artériás oxigénnyomás) a megszületést követoen pillanatok alatt, a metabolikus ráta az elso életnapok során fokozatosan no, csaknem megduplázódik. Vizsgálatsorozatommal az újszülött-kori vasháztartás és az EC antioxidáns védekezoképesség összefüggéseit vizsgáltam két kérdéskör kapcsán, és az alábbi kérdések megválaszolását tuztem ki célul. 1. Újszülöttek perinatális vasanyagcsere-változásainak összefüggése az antioxidáns védekezoképességgel.? Érett újszülöttek korai posztnatális adaptációja során a vasháztartásban milyen változások figyelhetok meg az elso 3 életnap alatt?? Ezek összefüggenek-e az EC antioxidáns kapacitás változásaival?? Érett újszülöttek posztnatális adaptációja során a vasháztartást meghatározó antioxidáns hatású fehérjék milyen hatással vannak az EC térben kimutatható szabadvas megjelenésére, illetve eliminációjára? 2. Rekombináns humán eritropoetin (rhuepo) hatása koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére, a vasanyagcserére és az antioxidáns védekezoképességére? Az rhuepo kezelés milyen hatást gyakorol a koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére, vasháztartására és szövodmény betegségeire?? Az rhuepo által stimulált vérképzés és a következményes EC vasdepléció befolyásolja-e rövidtávon az EC antioxidáns kapacitást koraszülöttekben?

6 Betegek és módszer A mintavételek a Regionális Tudományos és Kutatásetikai Bizottság (TUKEB 192/1998. és 57/2002) és a Kórházi Etikai Bizottság engedélye, valamint minden egyes esetben elozetes írásos szüloi beleegyezo nyilatkozat birtokában történtek. A szérum vas és EC antioxidáns kapacitás akut perinatális változásainak vizsgálata. A vizsgálat elso szakaszába 10, második szakaszába 21 egészséges újszülöttet vontunk be. A mintavételt követoen a szérumot (4000 g 10 perc, 4 C ) centrifugálás után 80 C fokon tároltuk a laboratóriumi meghatározások elvégzésig. Koraszülöttek rekombináns humán eritropoetin kezelésének hatása a transzfúzió igényre és a vasháztartásra. A rhuepo vérképzésre és transzfúzió igényre gyakorolt hatását 46, 1250 g-nál kisebb születési súlyú koraszülött bevonásával prospektív, 1:1 arányban randomizált, kontrollált klinikai vizsgálat keretében végeztük. A rhuepo-t (Eprex l000, Janssen-Cilag) hetente 3 alkalommal 200 E/ttkg adagban, szubkután injekció formájában alkalmaztuk. A kezelést a 3-7. életnapon indítottuk, és 6 héten keresztül folytattuk. Kiegészíto kezelésként enterálisan 6 mg/ttkg/nap elemi vas adagolását kezdtük el, amennyiben a megelozo 2 hétben nem történt transzfúzió, a szérum ferritin érték 100 µg/l alatt volt, és nem állt fenn infekció. Mindkét csoportban 15 mg/ttkg/2 nap i.m. E vitamin (Ephynal, Roche) szupplementációt folytattunk. A vizsgálatban résztvevo intézetekben a transzfúziós kezelést standardizált indikációs kritériumok szerint végezték. A rhuepo antioxidáns rendszerre gyakorolt akut hatását 14, 1500 g-nál kisebb születési súlyú koraszülött vizsgálatával végeztük el. A rhuepo kezelés megkezdésének átlagos ideje a 17. (10-26) életnap volt. Minden beteg 3 x 200 E /ttkg /hét rhuepo (Neorecormon, Roche) kezelésben részesült. A kezelés megkezdése elott ill. 1 hetes kezelési periódus után vérmintát (500? l) vettünk, ill. retikulocita meghatározás történt. E vitamin (15 E/nap) és C-vitamin 50 mg/nap adását leszámítva nem történt célzott antioxidáns kezelés. Az egy hetes vizsgálati periódusban a fenti indikációk alapján nem volt olyan beteg akinél parenterális vagy enterális vaskezelésre szükség lett volna. A vérvételt követoen a mintákat centrifugáltuk (4000 g 10 perc, 4 C ) és a szérumot -80 C fokon tároltuk a meghatározások idejéig.

7 Laboratóriumi vizsgálatok Vasanyagcsere- és vérképvizsgálatok Hagyományos rutin laboratóriumi eljárásokkal határoztuk meg a szérum összbilirubin, vas, transzferrin és ferritin szinteket, kvalitatív és kvantitatív vérképet. A retikulocita szám mérése 1 %- s alkoholos brillant-krezil-kékkel történt szupravitális festést követoen történt. Antioxidáns védekezoképesség-vizsgálatok A szérum teljes antioxidáns kapacitást Randox Total Antioxidant Status (Randox Laboratories) kit segítségével határoztuk meg. A hem-specifikus antioxidáns kapacitás (HSAA) azt tükrözi, hogy a szérum minta milyen mértékben képes gátolni a lipid peroxidációt. A HSAA meghatározás során azt vizsgáltuk, hogy az LDL hem-katalizálta lipidperoxidációjának kinetikája hogyan változik szérum hozzáadására. A szérum minta által okozott deltat at Vmax változás reprezentálja a szérum minta antioxidáns aktivitását. Szabadvas( NPBI) mérés: A batofenantrolin-diszulfonát (BPS) segítségével kelátot képez a Fe 2+ ionokkal, melynek 535 nm-en mért abszorbanciája arányos a szabadvas szinttel. A ceruloplazmin monoamino-oxidáz aktivitásának meghatározását a ceruloplazmin hatására az o-dianizidint lila színu festékké alakulásával mértük, 540 nm- en, fotometriás úton. A plazma vas redukáló képességének (FRAP) meghatározása: 300 µl friss FRAP reagenst felmelegítünk 37 C-ra és 593 nm-en vak reagenssel leolvassuk az abszorbanciát. A vérplazma mintából 10 µl-t, valamint hígításként további 30 µl vizet hozzáadunk a reakcióelegyhez. Az abszorpciót kinetikusan a következo 5 percben leolvassuk. Egy lineáris szakaszon (?t = 50 sec.) leolvassuk az abszorbancia változását, mely egyenes arányban van a Fe 2+ koncentrációval. Statisztikai módszerek A köldökzsinór vérmintákban és a 2. életnapon vett mintákban mért eredményeket egymintás t-próbával hasonlítottuk össze. A szérum ferritin és hem-specifikus antioxidáns kapacitás (HSAA) változások összefüggését lineáris korrelációval vizsgáltuk. A koraszülöttek rhuepo kezelése során vizsgált paramétereket a leíró statisztika módszereivel mutattuk be, a kezelt és kontroll csoportnál észlelt különbségeket Mann-Whitney próbával, a kategórikus változókat Fisher-exact teszttel hasonlítottuk össze. A rhuepo kezelés elotti és az egy hetes gyógyszer expozíciót követo eredményeket Mann- Whitney próbával hasonlítottuk össze. A rhuepo EC antioxidáns kapacitásra kifejtett hatását Kruskall-Wallis teszttel vizsgáltuk.

8 .Eredmények A vasháztartás és EC antioxidáns kapacitás változásai érett egészséges újszülöttekben korai posztnatális idoszakban A vasháztartást jellemzo paraméterek változásai A megszületéskor a szérumvas értékek kifejezetten magasak. Az átlagosan a második életnapon a szérum vas hirtelen csökkenést követoen olyan alacsony értéket mutat, mint amilyen súlyos vashiányban vagy krónikus gyulladásos állapotokban fordul elo. Szabad vas (NPBI) a köldökzsinór és a posztnatális minták mintegy 25 %-ban volt kimutatható. A minta-párok többségében a NPBI csökkenését, illetve eltunését észleltük a megszületést követoen, de kisebb számban voltak olyan minta-párok, amelyekben a megszületés idején nem, de azt követoen megjelent a NPBI. A megszületéskori mintákban és az átlagosan a 42. életórában vett mintákban mért ferroxidáz aktivitás nem mutatott különbséget. A megszületéskor mért szérum ferritin értékek mindegyike a normális referencia tartományban volt, az intrauterin idoszak kielégíto vasellátottságát tükrözve. A ferritin értékek mindkét vizsgálati szakaszban meghatározásra kerültek, és kivétel nélkül minden mintapárban emelkedést: a megszületéskor észlelt érték megduplázódását mutatták szérum vas szint (umol/ óra 1 2.életnap 2 3 A szérumvas csökkenése a megszületést követoen (p < 0,001)

9 Az extracelluláris (EC) antioxidáns kapacitás változások A Randox TAS értékek a megszületéskor az egészséges felnottekhez képest alacsonyabb szintet mutattak. A megszületést követoen kivétel nélkül minden mintában az aktivitás emelkedését detektáltuk. A FRAP érték megszületéskor mért átlaga nem különbözött a posztnatális minták átlagértékétol. A mintavételi ido szerinti további analízis a FRAP értékek stabilitását mutatta az elso 3 életnap folyamán, jóllehet az értékek feltunoen nagy szórást mutattak. A köldökzsinór vérminták HSAA értékének átlaga 100%-nál kisebb értéket mutat, ami arra utal, hogy a standard mintához képest a szérum fokozza a hem kiváltotta lipidperoxidációt. A megszületéskor a minták több mint 80 %- a volt ilyen, prooxidáns hatású. A 2. életnapon a lipidperoxidáció gátlóképesség jelentos emelkedése észlelheto, a minták antioxidáns hatást tükröznek, csupán egyetlen mintában mértünk prooxidáns aktivitást HSAA aktivitás (%) óra 2. életnap 2 3 A szérum hem-specifikus antioxidáns kapacitásának (HSAA) változása a megszületést követoen ( p< 0,001)

10 Az antioxidáns kapacitás és a vas-metabolizmus összefüggése A fentebb vizsgált változók korreláció analízise során nem találtunk összefüggést az antioxidáns változások és a szérum vas csökkenés, vagy a szabad vasköto kapacitás változása között. Ugyanakkor a ferritin szint emelkedésének mértéke pozitív korrelációt mutatott a lipidperoxidáció gátlóképességet jellemzo HSAA érték posztnatális növekedésével. A rekombináns humán eritropoetin kezelés hatása koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére, vasháztartására és az EC antioxidáns kapacitásra RhuEPO hatása a vérképzésre és transzfúzió igényre A rhuepo kezelés hatására az elso életnapokban még fiziológiásan magas retikulocita szám a következo hetek során is fennmaradt, ill. még tovább emelkedett. A kontroll csoportban az 1. élethetet követoen igen alacsony értékek voltak számlálhatók. A relatív retikulocita számok hetente mért mediánjai a kezelési idoszakban minden mérési alkalommal szignifikánsan magasabbak voltak a kezelt csoportban a kontrollhoz képest. A hetente mért Htk értékek vonatkozásában a 2. élethéten az EPO csoportban észlelt magasabb érték kivételével sem a kezelés megkezdése elott, sem a terápia során nem mutatkozott különbség. A kezelés hatására az EPO csoportban mind a szükséges transzfúziók száma, mind az adott transzfúziók összesített volumene a felére csökkent a kontrollhoz képest. Vizsgálatunkban a koraszülötteket sújtó szövodményállapotok közül kevesebb súlyos stádiumú ROP eset elofordulását észleltük az EPO csoportban, mint a kontroll csoportban. Jóllehet a ROP III. stádiuma miatt végzett kriokoagulációs kezelés egyenlo számban fordult elo a csoportokban, a kezelés sikeressége szignifikánsan jobb volt az EPO csoportban. A kezelést igénylo szemek száma 8 volt mindkét csoportban, amely után további progresszió nyomán az EPO csoportban csak 1 szemen alakult ki vakság, míg a kontroll csoportban 6 szemen (p <0,05). A vizsgálat során a rhuepo kezeléssel kapcsolatos számottevo mellékhatás nem fordult elo.

11 Szérum vas változása rhuepo kezelés hatására A szérum vas szint a kezelési periódusban szignifikánsan kisebb volt az EPO csoportban. A szérum vas szint az elso élethéttol folyamatosan csökkeno tendenciát mutatott a rhuepo kezelt koraszülöttekben, míg a kontroll csoportban nem változott. A két csoport közötti különbség a 3. héttol vált szignifikánssá. Az EPO csoportban a transzferrin szint nem változott, míg a kontroll csoportban valamelyest csökkent a vizsgálati idoszakban. A transzferrin értékek mediánja a 2. élethéttol szignifikánsan magasabb volt az rhuepo koraszülöttekben. Számított szabad vasköto kapacitás A számított szabad vasköto kapacitás értékei már a vizsgálati idoszak elso hetét követoen szignifikánsan magasabbak volt a rhuepo kezelt csoportban a kontrollhoz képest. A szabad vasköto kapacitásban észlelt markáns különbség elsosorban a transzferrin (teljes vasköto kapacitás), és kisebb részben a szérum vas, a két csoportban már elozoleg leírt, különbségének additív hatása okozza. Ferritin változása A szérum ferritin a kontroll csoportban a vizsgálat utolsó hetéig folyamatos, meredek emelkedést mutatott. A néha rendkívül magas abszolút értékek, a koraszülöttek többségében súlyos hemosziderózisra jellemzo, kóros szöveti vasraktározást jeleztek. Az EPO csoportban ez az emelkedés nem alakult ki, ráadásul a 4. héttol csökkeno tendencia volt észlelheto Egy hetes rhuepo kezelés hatása koraszülöttek EC antioxidáns kapacitására A kezdeti, a neonatális idoszakban egyébként fiziológiás, igen alacsony relatív retikulocita szám már a kezelés 2-3. napján megemelkedett a kiindulási értékhez képest. A kezelés 7. napjára a relatív retikulocita szám további növekedése következett be, melyet a szolubilis transzferrin receptor szérum szintjének, a kiindulási értékhez viszonyított emelkedése kísért. A szérum vas, transzferrin és ferritin szintek valamint az antioxidáns kapacitás még nem mutattak változást az egy hetes megfigyelési periódus alatt.

12 Tézisek, a munka gyakorlati jelentosége Munkámban egészséges újszülöttek és beteg koraszülöttek vizsgálatával a vasháztartás és az extracelluláris antioxidáns rendszer összefüggéseit vizsgáltam a perinatális idoszakban. A hem-specifikus antioxidáns kapacitás mérést elsoként alkalmaztam újszülött populáción. Méréseimmel megállapítottam, hogy a megszületést követoen, 48 órán belül, a szérumvas szint rohamosan csökken, a szabad vasköto kapacitás megno és a ferritin szint megnövekszik. Ezzel egyidoben az EC antioxidáns kapacitás is fokozódik. Az újszülött vasmetabolizmusának fiziológiás posztnatális változásai közül a ferritin szint emelkedése közvetlenül hozzájárul az antioxidáns védekezoképesség javulásához. Vizsgálataim arra utalnak, hogy a korai neonatális antioxidáns-adaptációban a vasmetabolizmus változása lényeges szerepet játszik, továbbá, hogy az elso két életnapban jelentosége nagyobb, mint a bilirubin emelkedésé. Bizonyítottam, hogy nagy transzfúzió igényu, beteg koraszülöttek rekombináns humán eritropoetin (rhuepo) kezelésével csökkentheto ezen betegek transzfúzióinak száma és a kóros szöveti vasraktározás. Koraszülöttek rhuepo kezelésével kapcsolatban a vakságot okozó, súlyos retinopátia (ROP) esetek kisebb elofordulási gyakoriságát észleltem. További vizsgálataimmal beteg koraszülöttek rhuepo kezelésének kezdeti szakaszában megállapítottam, hogy a rhuepo rövidtávon nem befolyásolja az EC antioxidáns rendszert. A vasmetabolizmus fiziológiás perinatális változásaira, fél évszázaddal az elso közlést követoen, elsoként hívtam fel a figyelmet. A vasmetabolizmussal kapcsolatos EC antioxidáns védekezoképesség növekedés, az eddig leírt legkorábban fellépo extracelluláris antioxidáns adaptációs mechanizmus az újszülöttben. Megfigyeléseim tovább erosítik annak az elgondolásnak a helyességét, hogy hypoxiás inzultust követoen a reperfúziós károsodás során megjeleno szabadvas eliminálása hatékony terápiás eljárás lehet a lipidperoxidáció és a szervkárosodások kivédésében. Koraszülötteken tett megfigyeléseim felvetik annak lehetoségét, hogy a rhuepo kezelés közvetett és/vagy közvetlen nem eritroid hatásai révén befolyásolja a koraszülöttek maradandó károsodást okozó szövodmény betegségeinek lefolyását.

13 Publikációs lista Az értekezés témájában megjelent elso szerzos közlemények Szabó M, Vásárhelyi B, Balla G, Szabó T, Machay T, Tulassay T: Acute postnatal increase of extracellular antioxidant defence of neonates: the role of iron- metabolism Acta Pediatrica 2001;90: IF: 1,582 Szabó M, Vásárhelyi B.: Iron supplementation during erythropoietin treatment Pediatrics 2001;108: IF: 3,708 Szabó M.: Leukocyta-mentesített és osztott vörösvérsejt-koncentrátum alkalmazása magyarországi újszülött intenzív osztályokon Gyermekgyógyászat 2004;55:85-91 Az értekezés témájában megjelent nem elso szerzos közlemények Vannai A, Dunai Gy, Bányász I, Szabó M, Vamos R, Treszl A, Hajdú J, Tulassay T, Vásárhelyi B.: Association of genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor and risk for proliferative retinopathy of prematurity. Pediatr Res 2005 Mar;57 (3): IF: 3,604 Farkas V, Szabó M, Rényi I, Kohlhéb O.: Pure Red-cell Aplasia During Valproate Monotherapy: Clinical Observations and Spectral Electroencephalographic Aspects J of Child Neurology 2000;15: IF:1,134 Egyéb nem az értekezés témakörében megjelent közlemények Treszl A, Szabó M, Dunai Gy, Nobilis A, Kovács I, Macahy T, Tulassay T, Vásárhelyi B.: Angiotensin II Type Receptor A1166C Polymorphism and Prophylactic Indomethacin Treatment Induced Ductus Arteriosus Closure in Very Low Birth Weight Neonates Pediatr Res 2003;54: IF:3,064 Szatmári M, Vásárhelyi B, Szabó M, Szabó A, Reusz G, Tulassay T.: Higher Osteocalcin Levels and Cross-Links Excretion in Young Men Born with Low Birth Weight Calcif Tissue Int 2000;67: IF: 2,189 Várkonyi I, Kis É, Kövi R, Máttyus I, Szabó M.: Thrombose der V. cava inf. Im Neugeborenenalter: Bildgebende Diagnostik in drei Fallen Radiologe 2000;40: IF: 0,608 Kádár K, Király L, Fodor F, Szabó M.: Magzati és újszülöttkori endocarditis Orvosi Hetilap 1994;135:

14 Köszönetnyilvánítás Köszönöm Prof. Tulassay Tivadarnak, programvezetomnek, hogy a kutatói pályán elindított és a tudományos munkához nagyfokú önállóságot biztosított. Miközben a kutatói magatartás és felelos gondolkodás területén példát adott, tevékenységemet kezdettol nagyra értékelte. Külön köszönöm, hogy minden körülmények között bátorított, türelemmel bíztatott és hiányaimban mindig segítségemre sietett. Köszönöm Prof. Machay Tamásnak, munkahelyi vezetomnek, gyógyító orvosi, oktatói és emberi példáját, amellyel elottem járva meghatározó szerepet töltött be pályaválasztásomban, valamint a folyamatos lelki és szellemi támogatást amellyel tudományos munkámat kísérte. Köszönöm Dr. Vásárhelyi Barnának, témavezetomnek, hogy elkötelezetten mellém állt, a publikációk és a vizsgálati eredmények értékelésének módszertanába bevezetett. Nemcsak alkotótársként, hanem barátként is számíthattam rá. Köszönöm a klinikai vizsgálatok kivitelezésében nyújtott önzetlen együttmuködést Dr. Nobilis András adjunktus úrnak, Dr. Hajdú Júlia, Dr. Görbe Éva docenseknek, Dr. Rónaszéki Ágoston, Dr. Téglás Emma, Dr. Závodi Erzsébet foorvosoknak, és a mintavételekben segédkezo ápolóknak valamint a szüloknek, és hálával tartozom a gyermekeknek is. Köszönöm a laboratóriumi vizsgálatok kivitelezésében nyújtott nélkülözhetetlen segítséget Dr. Szabó Teréznek, Dr. Jakus Juditnak, Dr. Sc. Chem. Szabó Antalnak valamint az I. sz. Gyermekklinika, és az I. sz. Szülészeti és Nogyógyászati Klinika laboratóriumaiban dolgozó asszisztenseknek, Molnár Éva haematológiai szakasszisztensnek, Kelen Dorottya és Machon Attila TDK hallgatóknak. Ezen a helyen emlékezem meg Prof. Dr. Nagy Ivánról, aki a vasháztartás paramétereinek mérését tette lehetové a Heim Pál Kórház Központi laboratóriumában. Hálás vagyok Dr. Treszl Andrásnak és Róka Anikónak, akik a statisztikai számítások és a kézirat elkészítésében nyújtottak önzetlen segítséget. Külön köszönettel tartozom Prof. Balla Györgynek, aki nemcsak biztosította az antioxidáns kapacitás méréseket, hanem elmélyült tudásával, baráti konzultációival hozzájárult a kutatási hipotézis felállításához és az eredmények helyes értelmezéséhez. Köszönöm közvetlen munkatársaimnak, köztük külön Dr. Szolnoki Juditnak, hogy önfeláldozó munkájukkal a betegellátás feladatait helyettem is hordozták, amikor tudományos tevékenységet végeztem. Végül köszönöm szüleimnek és családomnak, hogy munkámat és életemet imádságukkal és szeretetükkel folyamatosan orzik.