MONOCITA-AKTIVÁLÁS VIZSGÁLAT

Átírás

1 1 0/2010: MONOCITA-AKTIVÁLÁS VIZSGÁLAT 1. BEVEZETÉS A monocita-aktivációs vizsgálat (Monocyte Activation Test = MAT) olyan anyagok kimutatására vagy mennyiségi meghatározására használatos, amelyek aktiválás révén humán monocitákból vagy monociter sejtekből endogén mediátor anyagokat szabadítanak fel. Ilyen anyagok a gyulladást elősegítő citokinek, például a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α), az interleukin-1-béta (IL-1β) és az interleukin-6 (IL-6). Ezeknek a citokineknek szerepük van a láz patogenezisében, következésképpen a MAT a pirogének jelenlétét mutatja ki a vizsgált mintában. A MAT alkalmas arra, hogy termékspecifikus validálás után helyettesítse a nyúl pirogénvizsgálatot. A nem-endotoxin pirogéneket vagy gyulladást elősegítő szennyező anyagokat tartalmazó gyógyszerek az endotoxin dózis-hatás görbéjéhez képest gyakran igen meredek dózis-hatás görbét mutatnak. Az ilyen szennyezett termékek esetében a legnagyobb válasz gyakran a vizsgált készítmény hígítatlan vagy kis mértékben hígított oldatával nyerhető. Ezért azokat a készítményeket, amelyek nem-endotoxin szennyezőket tartalmaznak vagy tartalmazhatnak, olyan hígítási tartományban kell vizsgálni, amely a legkisebb hígítást is magában foglalja. A jelen fejezetben a következő 3 módszer leírása szerepel. A-módszer. Kvantitatív vizsgálat B-módszer. Félkvantitatív vizsgálat C-módszer. Referencia gyártási tétel összehasonlító vizsgálata. A vizsgálatot olyan módon kell elvégezni, hogy a pirogénnel való szennyeződés kizárható legyen. 2. DEFINICÓK A legnagyobb érvényes hígítás (Maximum valid dilution = MVD) valamely minta megengedhető legnagyobb hígítása, amelynél a szennyezési határérték meghatározható. Az MVD-t a következő kifejezés alkalmazásával kell meghatározni: CLC C, LOD ahol: CLC = a szennyező határérték-koncentrációja; C = a vizsgálati oldat koncentrációja; LOD = a kimutatási határ. A megfelelésről vagy nem megfelelésről hozott döntés elfogadási kritériuma a szennyező határértékkoncentrációja (CLC), amelyet endotoxin-egyenérték/milligrammban vagy endotoxinegyenérték/milliliterben, illetve a vizsgált készítmény biológiai aktivitásának egységeiben fejeznek ki. A CLC-t a következő kifejezés alkalmazásával kell számítani:

2 2 K, M ahol: K = az endotoxin pirogén adagjának testtömeg-kilogrammra vonatkoztatott küszöbértéke; M = a készítmény legnagyobb ajánlott izomba adott adagja, testtömeg-kilogrammonként. Amennyiben a készítményt gyakori időközökben alkalmazott injekcióként vagy folyamatos infúzió formájában kell beadni, az M az egyórás időtartamon belül beadható legnagyobb teljes adagot jelenti. Amennyiben valamely készítményre már meghatározták az endotoxin határérték-koncentrációt (Endotoxin Limit Concentration = ELC), a CLC, hacsak nincs más előírás, azonos az ELC-vel. Ebben az esetben a vizsgálati oldat koncentrációját a következőképpen kell kifejezni: mg/ml-ben, ha az endotoxin határértékét tömegre vonatkoztatva fejezték ki (NE/mg), Egység/ml-ben, ha az endotoxin határértékét biológiai egységekben (NE/egység) határozták meg, és ml/ml-ben, ha az endotoxin határértékét térfogategységként (NE/ml) határozták meg. A szennyező koncentrációjának endotoxin-egyenértéke leolvasható a standard endotoxin dózis-hatás görbéről (A-módszer), vagy a standard endotoxin oldatokra adott válasszal összehasonlítva megbecsülhető (B-módszer). A standard enxotoxin-törzsoldat olyan endotoxin referenciastandardból készül, amelyet a Nemzetközi Standardra, például BRP endotoxin standardra állítottak be. A mérés cut-off értékét a következő kifejezés alkalmazásával számítjuk: x + 3s, ahol: x = a vak mintára kapott párhuzamos válaszérték (R 0 ) átlaga; s = a vak mintára kapott párhuzamos válaszérték (R 0 ) szórása. A mérés cut-off értékét a kiértékelésnek megfelelő egységekben fejezzük ki. A kimutatási határ (limit of detection = LOD) az endotoxin standard görbe felhasználásával határozható meg. Az LOD a cut-off értéknek megfelelő endotoxin-koncentráció. A vizsgálatban az LOD-t endotoxinegyenérték/ml-ben fejezzük ki. 3. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁS A vizsgált készítmény oldatát emberi monocita forrásból nyert sejtekkel, vagy humán monociter sejtekkel inkubálják. Ezek a sejtek származhatnak például humán heparinozott, lehetőleg négy óránál nem régebben levett perifériás vérből, vagy ugyanennek a vérnek a monocitákat tartalmazó frakciójából, például humán perifériás vérből (pl. sűrűséggradiens centrifugálással) nyert mononukleáris sejtekből (PBMC) vagy emberi monocita sejtvonalból. A humán heparinozott perifériás vért általában sejttenyésztő tápfolyadékkal vagy fiziológiás sóoldattal hígítják, például 2-50 %V/V végső koncentrációra. A PBMC-t vagy a monocita sejtvonalakat sejttenyésztő tápfolyadékban vagy a donor saját plazmájával, vagy AB savóval együtt tipikus esetben tenyésztőlyukanként, kémcsövenként, illetve egyéb tenyésztőedényenként 0,1-1, sejtkoncentrációban használják. A monocita sejtvonalak esetében az AB savó hővel kezelt embrionális borjúszérummal helyettesíthető. A sejtek tenyésztését 37±1 C-on, a tápfolyadéknak megfelelő atmoszférában, például 5% CO 2 -t tartalmazó nedves levegőben végzik el. A tenyésztési időtartamnak elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a választott kiértékelési érték kellő megnövekedését lehetővé tegye. A választott kiértékelésnek a vizsgált készítmény oldatára adott válaszát, például a

3 3 gyulladást elősegítő vagy pirogén citokinek esetében, a standard endotoxinra vagy a vizsgált készítmény valamely referencia gyártási tételére adott válasszal hasonlítják össze. A kiválasztott kiértékelési módszert megfelelő standardok felhasználásával kalibrálják.. ESZKÖZÖK Minden üveget és egyéb hőálló eszközt hőlég-szárítószekrényben, validált eljárás alkalmazásával pirogénmentesíteni kell. Az általánosan használt legrövidebb idő és legalacsonyabb hőmérséklet 30 perc, illetve 250 C. Ha műanyag eszközöket, például mikrotiter lemezt és automata pipettákhoz tartozó pipettahegyeket alkalmazunk, olyan eszközt kell használni, amelyről bizonyították, hogy mentes a meghatározható pirogén anyagoktól, és amely nem zavarja a vizsgálatot. 5. A SEJTFORRÁSOK ÉS MINŐSÍTÉSÜK 5-1. TELJES VÉR A teljes vért egyedi donoroktól vagy egyesített teljes vérből nyerik, és az 5-3, illetve az 5- pontban meghatározott követelményeknek megfelelő módon minősítik PERIFÉRIÁS VÉRBŐL NYERT MONONUKLEÁRIS SEJTEK (PBMC) A PBMC-t egyedi donoroktól nyert teljes vérből vagy egyesített teljes vérből különítik el, és az 5-3, illetve az 5- pontban meghatározott követelményeknek megfelelő módon minősítik A VÉRADÓK MINŐSÍTÉSE A véradóknak, az egyéb hatályban levő követelmények mellett, amelyek a donor belegyezésére, egészségére, a biztonságosságra és az etikai tényezőkre vonatkoznak, meg kell felelniük a következő minősítési kritériumoknak. A véradóknak nyilatkozniuk kell arról, hogy egészségi állapotuk megfelelő, nem szenvednek semmiféle bakteriális- vagy vírusfertőzésben, és a véradást megelőző legalább 1 héten belül nem volt fertőzésre utaló tünetük. A donorok a véradást megelőző 8 órában nem vehettek be nemszteroid gyulladásgátló gyógyszert, valamint a véradást megelőző 7 napban szteroid gyulladásgátló gyógyszert. Azok az egyének, akik immunszuppresszív hatású vagy más olyan gyógyszert szedtek, amelyről ismert, hogy a kiválasztott kiértékelést befolyásolhatja, nem lehetnek véradók. A véradást a hazai transzfúziós egészségügyi követelményeknek megfelelően kell fertőzési markerekre vizsgálni. 5-. TÖBB DONORBÓL SZÁRMAZÓ EGYESÍTETT SEJTEK MINŐSÍTÉSE A teljes vérből vagy vérfrakciókból, például PBMC-ből egyesített sejtek legalább, de lehetőleg 8 vagy több egyedi donor véréből származzanak; ha lehetséges, minden donortól megközelítőleg azonos térfogatú vért kell levenni, illetve a sejteket megközelítőleg azonos térfogatú vérből kell kinyerni. Az egyesített sejtek minősítése a következőképpen történik: a vérvételt követő órán belül az egyesített sejtek felhasználásával felvesszük a dózis-hatás görbét, amelyhez standard endotoxint használunk, legalább, mértani sor szerint készített hígítás (például 0,01,0 NE/ml koncentráció) alkalmazásával. A dózis-hatás görbének a standard görbére megadott, 6.1 pontban leírt 2 követelménynek meg kell felelnie A FAGYASZTVA TÁROLT (KRIOKONZERVÁLT) SEJTEK MINŐSÍTÉSE A MAT meghatározás során felhasználandó sejtforrások, például a humán teljes vér, vérfrakciók (pl. PBMC) vagy monocita sejtvonalak fagyasztva tárolhatók. Egyesített fagyasztva tárolt sejtek a sejtek fagyasztás előtti egyesítésével vagy az egyedi fagyasztva tárolt vérminták közvetlenül a felolvasztás után való egyesítésével nyerhetők. Az egyesítetések legalább, de lehetőleg 8 vagy több egyedi donor véréből

4 származzanak; ha lehetséges, minden donortól megközelítőleg azonos térfogatú vért kell levenni, illetve a sejteket megközelítőleg azonos térfogatú vérből kell kinyerni. A fagyasztva tárolt vér vagy vérsejtek minősítését a felolvasztás (és szükség esetén egyesítés) után azonnal el kell végezni: a fagyasztva tárolt vér vagy vérsejtek feleljenek meg a standard görbére megadott, 6.1 pontban leírt 2 követelménynek FOLYAMATOSAN FENNTARTOTT MONOCITA SEJTVONALAK A humán monocita sejtvonalat azért tenyésztik folyamatosan, hogy a MAT céljára megfelelő készletet biztosítsanak. A módszer optimalizálására a sejtvonalból származó klónok használhatók. A sejteket steril körülmények között kell fenntartani, és rendszeresen vizsgálni kell mikoplazma szennyezés jelenlétére. Ezen felül, a sejteket rendszeresen vizsgálni kell azonosság (például kettőződési idő, morfológia és funkció), valamint stabilitás szempontjából. A sejtvonal funkcionális stabilitását olyan módon határozzák meg, hogy a továbboltások számához viszonyított teljesítőképességét folyamatosan ellenőrzik a rutin vizsgálatok során. A funkcionális stabilitás kritériumait meg kell határozni, ami magában foglalhatja a növekedési kritériumokat, a vizsgálat során kapott legnagyobb jelet, a háttérzajt és a receptor kifejeződést. A receptor kifejeződést specifikus ligandokkal, például a toll-like receptor (TLR) esetében lipopoliszaharidokkal (LPS), a toll-like receptor 2 (TLR2) esetében lipoteikonsavval (LTA), a TLR2-TLR1, illetve a TLR2-TLR6 esetében pedig szintetikus bakteriális lipoproteinnel lehet vizsgálni. 6. ELŐKÉSZÍTŐ VIZSGÁLATOK Abból a célból, hogy a vizsgálat pontosságáról és érvényességéről meggyőződjünk, előkészítő vizsgálatokat kell elvégezni annak biztosítására, hogy a standard görbére vonatkozó kritériumok teljesülnek, hogy az oldat nem befolyásolja a vizsgálatot, hogy a vizsgálat endotoxinokat, valamint nemendotoxin jellegű szennyezéseket mutat-e ki, továbbá hogy az oldat nem befolyásolja a kimutatási rendszert A STANDARD GÖRBÉRE MEGADOTT KRITÉRIUMOK BIZTOSÍTÁSA A standard görbe felvételéhez a standard endotoxin legalább különböző töménységű oldatát használjuk. A vizsgálatot a standard endotoxin oldat valamennyi hígítása esetében legalább párhuzamos mintával kell elvégezni. A kiválasztott kiértékelésnél (vak érték) az alap kibocsátást a hozzáadott standard endotoxin jelenléte nélkül olyan módon kell optimalizálni, hogy az a lehető legalacsonyabb legyen. A standard görbe elfogadhatóságának két kritériuma van: A log dózis válasz (utóbbi szükség esetén megfelelően transzformálva) függvény regressziója statisztikailag szignifikáns ( p<0.01) legyen; A log dózis válasz függvény regressziója nem térhet el szignifikánsan (p >0.05) a linearitástól. Ha az analízist paraméteres logisztikai görbére végezzük el, az észlelt görbe, a szokásos statisztikai módszereket (lásd az 5.3. általános fejezetet) alkalmazva, nem térhet el szignifikánsan az elméleti görbétől A ZAVARÓ TÉNYEZŐK VIZSGÁLATA A vizsgálat érvényességének biztosítása céljából előzetes vizsgálatokat kell végezni annak igazolására, hogy a vizsgálati oldat nem befolyásolja vizsgálat eredményét. A vizsgálati módszert minden olyan esetben validálni kell, amikor a kísérleti feltételek úgy változnak, hogy az befolyásolhatja a vizsgálat eredményét. Megfelelő hígítószerrel a vizsgálandó készítményt mértani sor szerint hígítjuk, olyan módon,

5 5 hogy egyetlen hígítás se haladja meg az MVD-t. A vizsgálandó készítményből azonos módon még egy hígítási sort készítünk, és az endotoxint a standard görbe középértékének megfelelő vagy ahhoz közeli koncentrációban (A-módszer), illetőleg a LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban (B-módszer) adjuk hozzá. Más lehetőségként olyan hígító oldatot is használhatunk, amely a standard görbe közepértékének megfelelő vagy ahhoz közeli koncentrációban (A-módszer), illetőleg a LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban (B-módszer) hozzáadott endotoxin tartalmaz. Ezeket a hígítási sorozatokat egy kísérleten belül párhuzamosan vizsgáljuk. Minden egyes oldat endotoxin-egyenérték koncentrációjának kiszámítására a standard görbét használjuk. Az oldathoz hozzáadott endotoxin átlagos visszanyerését úgy számítjuk ki, hogy az oldat átlagos endotoxin-egyenérték koncentrációját (ha egyáltalán tartalmaz endotoxint) levonjuk a hozzáadott endotoxint is tartalmazó oldatéból. A vizsgálati oldat akkor tekinthető a vizsgálatot befolyásoló tényezőktől mentesnek, ha a vizsgálati körülmények között a mért endotoxin egyenérték-koncentráció abban a vizsgálati oldatban (miután levontuk belőle a hozzáadott endotoxint nem tartalmazó oldatban mért endotoxin-egyenérték koncentrációt), amelyhez endotoxint adtunk, a hozzáadott koncentráció %-a között van. Amennyiben ez a kritérium nem teljesül, az A- vagy a B-módszer alkalmazásával szemben a C-módszert kell előnyben részesíteni. A C-módszerben a vizsgálandó készítmény oldatát három hígításban kell vizsgálni: abban a legnagyobb koncentrációban (legkisebb hígításban), amely a választott kiértékelésnél a legnagyobb kibocsátást serkenti, valamint a közvetlenül e feletti és alatti kétszeres hígításban. Minthogy az a koncentráció, amely a kiválasztott kiértékelésnél a legnagyobb kibocsátást serkenti, egyaránt függhet a donortól és a gyártási tételtől, a termékspecifikus validálást legalább három független vizsgálatban kell elvégezni, amelyekben más-más donoroktól származó sejteket kell felhasználni. A legmagasabb koncentrációt (legkisebb hígítást), amelyről úgy gondolják, hogy a kiválasztott kiértékelésnél a donorok többségében a legnagyobb kibocsátást serkentette, valamint a közvetlenül e feletti és alatti kétszeres hígítást, további vizsgálatokban kell validálni. Amennyiben a nem hígított vizsgálati oldat serkenti a legnagyobb kibocsátást a kiválasztott kiértékelésnél, a PBMC-hez való hozzáadás előtt további vizsgálatokat kell végezni a nem hígított vizsgálati oldat, valamint annak 1:2 és 1: arányú hígításainak felhasználásával. Az egymást követő vizsgálatokban felhasznált 3 hígítás nem haladhatja meg az MVD-t; ennek a három hígításnak a hígítási faktorát f 1 -gyel, f 2 -vel és f 3 -mal jelöljük. A termékspecifikus validálást követően a vizsgálatot rutinszerűen vagy egyedi donorból származó sejteken, vagy egyetlen, egyesített sejteket tartalmazó szuszpenzión, vagy humán monocita sejtvonal egyetlen passzázsából származó sejteken végezzük el A NEM -ENDOTOXIN JELLEGŰ? MONOCITA-AKTIVÁLÓ SZENNYEZÉSEK MEGHATÁROZÁSI MÓDSZERÉNEK VALIDÁLÁSA Az előkészítő vizsgálat során azt is bizonyítani kell, hogy a kiválasztott vizsgálat, a bakteriális endotoxinok kimutatásán felül, a nem-endotoxin jellegű, gyulladást elősegítő vagy pirogén szennyezőket is kimutatja. Ezt olyan, korábban már vizsgált gyártási tételek felhasználásával lehet elvégezni, amelyekben nem-endotoxin jellegű szennyezőket mutattak ki, és amelyek a nyúl pirogén vizsgálatban pozitív reakciót adtak, illetőleg emberben nem várt gyógyszerreakciót váltottak ki. Amennyiben ilyen gyártási tételek nem állnak rendelkezésre, az előkészítő validálásnak magában kell foglalnia a vizsgáló rendszer validálását is, a toll-like receptorok specifikus ligandjainak (például peptidoglikánok, lipoteikolsavak vagy szintetikus bakteriális lipoproteidek) felhasználásával. 6- A KIMUTATÁSI RENDSZERT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK Amikor a vizsgálandó készítmény oldatának a további vizsgálatok céljára legmegfelelőbb hígítását már meghatározták, a meghatározási rendszerben (például ELISA) előforduló interferáló tényezők vizsgálatára a választott kiértékelés során ezt a hígítást alkalmazzák. A választott kiértékelésben a standard hígítási sorozatoknak, a vizsgálandó készítmény jelenlétében vagy a vizsgálandó készítmény nélkül, 20 százalékon belüli egyezést kell mutatniuk.

6 6 7. MÓDSZEREK 7-1. A MÓDSZER: KVANTITATÍV VIZSGÁLAT Az A-módszer alapja a vizsgálandó készítmény standard endotoxin dózis-hatás görbével történő összehasonlítása. A vizsgálandó készítmény akkor felel meg a vizsgálat követelményének, ha szennyezőinek koncentrációja kisebb, mint a CLC érték A vizsgálat menete A validált vizsgálati módszert alkalmazva a táblázat alapján oldatokat készítünk, és minden egyes oldatból - párhuzamos mintát tenyésztünk, amit végezhetünk külön-külön egyedi donor sejtjeivel, egyetlen egyesített sejtszuszpenzióval vagy humán monocita sejtvonal egy passzázsából származó sejtekkel táblázat Oldat Oldat Hozzáadott endotoxin (NE/ml) Párhuzamos minták száma A vizsgálati oldat/f nincs B vizsgálati oldat/2f nincs C vizsgálati oldat/f nincs D R 0 R 1 -R vizsgálati oldat/f pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes élettani sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer az endotoxin standard görbe szerinti középadag (R 3 ) nincs ( negatív kontroll) -féle töménységű standard endotoxin minden egyes koncentrációból db A-oldat = A vizsgálandó készítmény oldatának az a hígítása (itt f-fel jelölve), amellyel a zavaró tényezőkre vonatkozó vizsgálatot elvégezték, tehát az a legnagyobb töménység (legkisebb hígítás), amelynél az endotoxin visszanyerése % közé esik. B-oldat = Az A-oldat kétszeres hígítása, amely nem haladja meg az MVD értéket. C-oldat = A B-oldat kétszeres hígítása, amely nem haladja meg az MVD értéket. D-oldat = Hozzáadott standard endotoxint (az endotoxin standard görbe szerinti középadagot (R 3 )) tartalmazó A-oldat. R 0 oldat = negatív kontroll. R 1 -R oldat = standard endotoxin oldatok, a zavaró tényezők meghatározására szolgáló vizsgálatban használt koncenrációkban Számolás és értelmezés Minden elemezendő adatnak olyan sejtekre kell vonatkoznia, amelyek megfelelnek a standard görbe két kritériumának. Az endotoxin-egyenérték visszanyerése, amit a D-oldatban az A-oldat endotoxinegyenértékének levonása után számítunk ki, % között legyen. Az A-, B- és C-oldatok párhuzamos mintái endotoxin-egyenértékének kiszámításához minden egyes különböző sejtforrás esetén (pl. egyedi vérminták, egyesített donorsejtek vagy sejtvonal) az R1-R endotoxin standard görbét használjuk fel. A vizsgált készítmény akkor felel meg az adott sejtforrásra vonatkozó vizsgálat követelményeinek, ha az A-, B- és C-oldatok párhuzamos mintáiban mért endotoxinegyenérték-koncentráció középértéke, a hígításra és koncentrációra történő korrekció után kisebb, mint a vizsgált készítményre előírt CLC érték.

7 A készítmény megfelelési/nem megfelelési kritériumai Amennyiben egyedi donorok sejtjeit használjuk, a vizsgálandó készítménynek mind a négy különböző donor sejtjei esetében meg kell felelnie a vizsgálat követelményeinek. Ha a vizsgált készítmény a donor közül 3 sejtjeivel végzett vizsgálatban megfelel (egy donort kizárnak a vizsgálatból a vizsgálat követelményeinek való meg nem felelés miatt, vagy azért mert pozitív reakciót mutatott), a vizsgálatot további olyan donorból származó sejtekkel kell folytatni, ahol egyetlen donor sejtjei sem szerepeltek az első számú vizsgálatban, és a vizsgált készítménynek a 8 donor közül hétnek a sejtjeivel megfelelő eredményt kell adnia (azaz 8 donorból legfeljebb egy pozitív reakció engedhető meg.) Amennyiben a monociták több egyedi donor sejtjeinek egyesítéséből származnak, a vizsgált készítménynek az egyesített sejtekkel végzett vizsgálat követelményének kell megfelelnie. Amennyiben a vizsgálatban humán monocita sejtvonalat használnak, a vizsgált készítménynek a sejtvonal egyetlen passzázsán vizsgálva meg kell felelnie a követelményeknek. 7-2 B-MÓDSZER, FÉL-KVANTITATÍV VIZSGÁLAT A B vizsgálati módszerben a vizsgálandó készítményt standard endotoxinnal hasonlítjuk össze. Az eredmény elfogadásához a vizsgált készítmény szennyezőanyag-koncentrációjának kisebbnek kell lennie, mint a CLC. Indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve a felszabadítási döntéshez az A-oldatot kell választani A vizsgálat menete A validált vizsgálati módszer felhasználásával a táblázat szerint oldatokat készítünk, és minden egyes oldatból párhuzamos tenyészetet készítünk, külön-külön egyedi donor sejtjeivel, egyetlen egyesített sejtszuszpenzióval vagy humán monocita sejtvonal egy passzázsának sejtjeivel táblázat. Oldat Oldat Hozzáadott endotoxin (NE/ml) Párhuzamos minták száma A vizsgálati oldat/f nincs B vizsgálati oldat/f 1 nincs C vizsgálati oldat/f 2 nincs D vizsgálati oldat/f E vizsgálati oldat/f 1 F vizsgálati oldat/f 2 R 0 R 1 R 2 R 3 R pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy hígító folyadék A vizsgálati rendszerre számolt LOD 2-szeresének A vizsgálati rendszerre számolt LOD 2-szeresének A vizsgálati rendszerre számolt LOD 2-szeresének nincs (negatív kontroll) A vizsgálati rendszerre számolt LOD 0,5-szeresének A vizsgálati rendszerre számolt LOD 1-szeresének A vizsgálati rendszerre számolt LOD 2-szeresének A vizsgálati rendszerre számolt LOD -szeresének

8 8 A-oldat = A vizsgálandó készítmény oldatának az a hígítása (itt f-fel jelölve), amellyel a zavaró körülményekre vonatkozó vizsgálatot elvégezték. B-oldat = A vizsgálandó készítmény oldatának az a termékspecifikus validálási adatok áttekintése után kiválasztott hígítása (itt f 1 -gyel jelölve), amely nem haladja meg az MVD értéket (pl. 1:2 MVD, vagyis az MVD felének megfelelő hígítás). C-oldat = A vizsgálandó készítmény oldatának az a termékspecifikus validálási adatok áttekintése után kiválasztott hígítása (itt f 1 -gyel jelölve), amely nem haladja meg az MVD értéket (pl az MVD érték). D-oldat = Az előzetes vizsgálatok során a vizsgálati rendszerre meghatározott LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban hozzáadott standard endotoxint tartalmazó A-oldat. E-oldat = A vizsgálati rendszerre meghatározott LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban hozzáadott standard endotoxint tartalmazó B-oldat. F-oldat = A vizsgálati rendszerre meghatározott LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban hozzáadott standard endotoxint tartalmazó B-oldat. R 0 -oldat = negatív kontroll. R 1 -oldat = Standard endotoxin, a vizsgálati rendszerre meghatározott LOD felének megfelelő koncentrációban. R 2 -oldat = Standard endotoxin, a vizsgálati rendszerre meghatározott LOD-nak megfelelő koncentrációban. R 3 -oldat = Standard endotoxin, a vizsgálati rendszerre meghatározott LOD 2-szeresének megfelelő koncentrációban. R -oldat = Standard endotoxin, a vizsgálati rendszerre meghatározott LOD -szeresének megfelelő koncentrációban Számolás és értelmezés Valamennyi elemzésre kerülő adatnak olyan sejtekre kell vonatkoznia, amelyeknél az R 0 -R oldatokra adott válaszok átlagértéke fokozatosan nő. Az R 0 -oldatra adott válaszok átlagértéke megegyezhet az R 1 - oldatra adott válaszok átlagértékével. Minden egyes különböző sejtforrás, azaz az egyedi vérminták, az egyesített donorsejtek vagy a sejtvonal esetében az R 2 -oldatra adott válaszok átlagértékének nagyobbnak kell lennie, mint a pozitív cut-off érték. A megállapított cut-off érték alatti értékeket negatívnak kell tekinteni. Amennyiben az R1- vagy az R2-oldatra adott átlagos válaszérték meghaladja a megállapított cut-off értéket, a megfeleléssel kapcsolatos döntésre kiválasztott oldatra adott válasznak negatívnak kell lennie (= megfelelt). A hozzádadott endotoxin százalékos visszanyarésének megállapításához a vizsgálandó készítmény minden egyes negatív oldatának (A-, B-, illetve C-oldat) esetében a megfelelő, hozzáadott endotoxint is tartalmazó oldatokra (sorrendben D-, E-, illetve F-oldat) adott átlagos válaszértékeket össze kell hasonlítani az R3-oldatra kapott átlagos válaszértékkel. Adott sejtforrásra vonatkoztatva a szennyezők koncentrációja abban az esetben kisebb, mint a CLC, ha a vizsgálandó készítménynek a megfelelésől szóló döntésnél használandó oldata, valamint annak nagyobb hígításai egyaránt negatív eredményt adnak, továbbá ha a hozzáadott endotoxinra % közötti visszanyerést kapunk A készítmény megfelelési/nem megfelelési kritériumai A kritériumok azonosak az A.-módszerre leírtakkal (lásd: ) 7.3. C-MÓDSZER: REFERENCIA GYÁRTÁSI TÉTELLEL VÉGZETT ÖSSZEHASONLÍTÓ VIZSGÁLAT A C-módszer a vizsgálandó készítménynek, valamint a készítmény egy validált referencia gyártási tételének összehasonlításán alapul. A referencia gyártási tétel kiválasztása indokolt és engedélyezett

9 9 kritériumok figyelembevételével történik. A módszer olyankor alkalmazható, amikor a készítmény vizsgálata során jelentős interferencia lép fel, amely azonban nem szüntethető meg a készítménynek az MVD határértéken belüli hígításával, mivel az biztosan vagy vélhetően nem-endotoxin jellegű szennyezőket tartalmaz. A nem-endotoxin típusú szennyezőkre adott válasz lecsökkenése gyorsabb lehet, mint az endotoxinra adott válaszé, ami miatt a vizsgálatot olyan hígítási tartományban kell elvégezni, amely a legkisebb hígítást is tartalmazza. A vizsgálat menetét a közvetkezőkben írjuk le. A leírás egy példát is tartalmaz a vizsgálati tétel és a referencia tétel összehasonlítására vonatkozóan A vizsgálati eljárás A validált vizsgálati módszer felhasználásával elkészítjük a sz. táblázatban megadott oldatokat, és minden egyes oldatból egyedi donor mindegyikének sejtjeivel, egyesített sejtszuszpenzióval vagy humán monocita sejtvonal egy passzázsának sejtjeivel - párhuzamos tenyészetet készítünk táblázat Oldat Oldat/hígítási faktor Párhuzamos minták száma A a referencia gyártási tétel oldata / f 1 B a referencia gyártási tétel oldata / f 2 C a referencia gyártási tétel oldata / f 3 D a vizsgálandó készítmény oldata / f 1 E a vizsgálandó készítmény oldata / f 2 F a vizsgálandó készítmény oldata / f 3 G pozitív kontroll (standard endotoxin) R 0 hígítószer (negatív kontroll) Az A-, B- és C-oldatok a referencia gyártási tételből készülnek, a zavaró tényezőkre vonatkozó vizsgálatban meghatározott f 1, f 2, illetőleg f 3 hígítási faktor szerint hígítva. A D-, E- és F-oldatok a vizsgálandó készítményből készülnek, a zavaró tényezőkre vonatkozó vizsgálatban a referencia gyártási tételre meghatározott f 1, f 2, illetőleg f 3 hígítási faktor szerint hígítva. A G-oldat a sejtek életképességére vonatkozó pozitív vizsgálati kontroll, illetve az a standard endotoxin koncentráció, amely egyértelmű pozitív választ ad. Az R 0 -oldat az a hígítószer, amit a vizsgált minta hígítására használnak és vak értékként szolgál Számítás és értelmezés Az elemezendő adatok csak olyan sejtekből származhatnak, amelyek esetében a G-oldat, valamint az A-, B- és C-oldatok közül legalább egy nagyobb választ ad, mint a kiértékelés alapértéke (R 0 -oldat). Minden egyes különböző sejtforrásra (pl. egyedi vérmintákból nyert sejtek, összeöntött donorsejtek vagy sejtvonalból származó sejtek) a kiértékelés standard görbéjét (két párhuzamos kalibrálási görbe vakértékkel és a választott kiértékelés standardjának legalább mértani hígításával) használjuk, és kiszámoljuk az A-F-oldatokra adott párhuzamos válaszértékek átlagát. Kiszámítjuk az A-, B- és C-oldat párhuzamos mintáira adott válaszok átlagértékeinek összegét, valamint a D-, E- és F-oldat párhuzamos mintáira adott válaszok átlagértékeinek összegét. A D-, E- és F-oldatra adott válaszok átlagértékeinek összegét elosztjuk az A-, B- és C-oldatra adott válaszok átlagértékeinek összegével. A vizsgálandó készítmény megfelel egy meghatározott sejtforrásra vonatkozó vizsgálat követelményeinek, ha az eredményként kapott érték megfelel meghatározott 2,5-et meg nem haladó elfogadási kritériumnak A készítmény megfelelési/nem megfelelési kritériumai A kritériumok azonosak az A-módszerre leírtakkal (lásd: )

10 10 A szennyezők mennyiségének pontosabb meghatározására az A-, B vagy C-módszert a vizsgálandó oldat olyan egyéb hígításaival is el lehet végezni, amelyek nem haladják meg az MVD-t. A következő fejezetet tájékoztató jellegű. Útmutató 1. BEVEZETÉS A monocita aktivációs vizsgálat (MAT) elsősorban a nyúl pirogén vizsgálat alternatív módszereként szolgál. A MAT a lázkeltő, gyulladást kiváltó szennyezőanyagokat, beleértve a Gram-negatív baktériumokból származó endotoxinokat, valamint a nem-endotoxin jellegű szennyezőket, azaz a Grampozitív és Gram-negatív baktériumokból, vírusokból, gombákból származó patogén-kapcsolt molekuláris mintázatokat (PAMP) és a készítménnyel összefüggő vagy az eljárással összefüggő biológiai vagy kémiai entitásokat mutatja ki. Minthogy a nem-endotoxin jellegű szennyezőanyagok fizikai-kémiai értelemben változatos molekulaosztályokba tartoznak, és a vizsgált készítmény szennyezőanyagának természete általában ismeretlen, a szennyezés szintjét endotoxin-egyenérték egységekben fejezzük ki, a standard endotoxinra adott válasszal összehasonlított eredményből származtatva, vagy a vizsgálati készítmény referencia gyártási tételével összehasonlítva. A MAT-ban a standard endotoxinra adott válasz általában megközelítőleg 1 log hígítási tartományon belül csökken le, a nem-endotoxin jellegű szennyezők pedig (önmagukban vagy endotoxinnal kombinálva), monocita stimuláló hatásukat vizsgálva gyakran nagyon meredek dózis-hatás görbét mutatnak, rendszerint már 1 vagy két hígítási lépésen belül. Gyakran az ilyen szennyezett készítményeknél a legnagyobb választ a nem hígított vagy a kis mértékben hígított vizsgálati készítménnyel kapjuk. Ebből az okból kifolyólag a vizsgálati készítmények oldatát, amelyek nem-endotoxin jellegű szennyezéseket tartalmaznak vagy tartalmazhatnak, olyan hígítási tartományban kell vizsgálni, amely a legkisebb hígítást is magában foglalja. 2. MÓDSZEREK 2-1. A MÓDSZEREK KIVÁLASZTÁSÁRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK Az A-, B- és C-módszert általában nem alkalmazzuk olyankor, amikor maga a vizsgált készítmény olyan aktivitással bír, amely serkenti a kiválasztott kiértékelés felszabadulását, illetve amikor a vizsgálati készítmény a kiválasztott kiértékeléssel szennyezett. Ezt a tényezőt mindkét esetben figyelembe kell venni, és a kiválasztott módszert ennek megfelelően kell módosítani és validálni. A kiválasztott módszer készítményspecifikus validálásának célja, hogy egy adott készítmény-szennyezés kombináció esetében meghatározza a válasz elmaradásának gyakoriságát, és megállapítsa az ennek kezeléséhez szükséges lépéseket (például donorok szűrése, az egy vizsgálathoz tartozó donorok számának növelése, a vizsgálat megfelelési kritériumának kellő szigorúsággal történő megadását abból a célból, hogy a szennyezett gyártási tételek kimutatási valószínűsége a lehető legnagyobb legyen). Az A- és a B-módszer megfelelő abban az esetben, ha a vizsgált készítmény hígításaira adott válaszok nagyjából párhuzamosak a standard endotoxin hígításaira adott válaszokkal. A B-módszer félkvantitatív vizsgálat, amely akkor is alkalmazható, amikor a vizsgálati készítmény hígításaira adott válaszok nem párhuzamosak a standard endotoxin hígításaira adott válaszokkal. A C-módszert, a referencia gyártási tétellel való összehasonlítást azért fejlesztették ki, hogy a donoroknak

11 11 bizonyos készítmény-szennyezés kombinációkra adott szélsőségesen változó válaszait kezelni tudják. Ebben a tekintetben figyelembe kell venni azt, hogy míg a legtöbb donor monocitái nagyjából hasonló módon válaszolnak a bakteriális endotoxinra, a különböző donorok monocitáinak válasza a nemendotoxin jellegű szennyezésekre olyan jelentős mértékben különbözhet, hogy lehetségessé válhat a bizonyos készítmény-szennyezés kombinációkra nem reagálók azonosítása A SZENNYEZŐ HATÁRÉRTÉK-KONCENTRÁCIÓJÁNAK KISZÁMÍTÁSA A megfelelésről szóló döntés elfogadásának kritériuma a szennyező határérték-koncentrációja (CLC), amit a vizsgált készítményre endotoxin-egyenérték/milligrammban, endotoxin-egyenérték/milliliterben, vagy a biológiai aktivitás egységeiben fejezünk ki. Amennyiben egy készítményre az endotoxin határértékkoncentrációját (ELC) pontosan meghatározták, hacsak nincs más előírás, a CLC ugyanaz, mint az ELC. A CLC-t endotoxin-egyenérték egységekben fejezzük ki. A CLC-t a következő kifejezés alapján számoljuk: K, M ahol K = az endotoxin lázkeltő adagja testtömeg-kilogrammonként; M = a készítmény testtömeg-kilogrammonkénti legnagyobb ajánlott izomba adott adagja. Amennyiben a készítményt gyakori időközökben alkalmazott injekcióként vagy folyamatos infúzió formájában kell beadni, az M az egyórás időtartamon belül beadható legnagyobb teljes adagot jelenti. Az endotoxin-határérték a készítménytől és az alkalmazás módjától függ. Értékét a cikkelyek írják elő. K ajánlott értékeit a táblázat tartalmazza táblázat Alkalmazási mód K (endotoxin NE/testtömeg-kilogramm) Intravénás 5,0 Intravénás (radioaktív gyógyszerkészítményekre) 2,5 Intratekális 0,2 Az egyéb alkalmazási módokra a bakteriális endotoxinokra vonatkozó elfogadási kritériumot általában a készítmény kifejlesztése során kapott eredmények alapján határozzák meg A KRIOPROTEKTÍV ANYAGOKRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK A krioprotektív anyagok, például a dimetilszulfoxid (DMSO), és felolvasztott sejtekben kimutatott maradványaik hatását figyelembe kell venni. A DMSO toxikus a sejttenyészetekre, továbbá még abban az esetben is, ha a sejteket gondosan mossák a fagyasztva tárolás megváltoztathatja a sejtek tulajdonságait, például a sejtmembrán áteresztőképességét. 2-. AZ INTERFERENCIA VIZSGÁLATA Ha megvalósítható, az interferencia vizsgálatát a vizsgált készítmény legalább 3 különböző gyártási tételén el kell végezni. Azon vizsgálati készítmények esetében, amelyek gyártási tételről gyártási tételre jelentős változékonyságot mutanak, tehát az interferencia vizsgálat szempontjából minden gyártási tételük egyedinek tekinthető, az interferencia vizsgálatot minden egyedi vizsgálatnál el kell végezni (kísérő validálás).

12 12 Az interferencia vizsgálatot lehetőleg a vizsgált készítmény olyan gyártási tételein végezzük el, amelyek endotoxintól és más pirogén/gyulladást előidéző szennyezéstől mentesek, illetve ahol ez nem kivitelezhető, egyetlen vizsgált gyártási tétel sem lehet súlyosan szennyezett. Amennyiben csak egyetlen gyártási tétel áll rendelkezésre, a validálást ezen a gyártási tételen három független vizsgálatban kell elvégezni. A reprodukálhatóság paramétereinek (pl. ±50%) teljesülnie kell. 3. A NYÚL PIROGÉNVIZSGÁLAT HELYETTESÍTÉSE MONOCITA-AKTIVÁCIÓS VIZSGÁLATTAL Amint ezt a fentiekben említettük, a monocita-aktivációs vizsgálat (MAT) célja elsősorban a nyúl pirogénvizsgálat kiváltása. Azon parenterális célra szánt gyógyszerkészítmények esetében, amelyek pirogén szennyezőket tartalmazhatnak, a rájuk vonatkozó cikkely bakteriális endotoxin vizsgálatot vagy monocita-aktivációs vizsgálatot ír elő. Általános elvek: bármely olyan egyedi cikkelyben, amely vizsgálat elvégzését írja elő, csak egy vizsgálat vagy a bakteriális endotoxin vizsgálat vagy a MAT szerepel. A MAT csak akkor követelhető meg egy cikkelyben, ha előzetesen bizonyították, hogy a MAT fejezetben leírt három módszer közül legalább az egyik megfelelően alkalmazható a kérdéses termékre; a megfelelő információt a gyártótól kell beszerezni. Kívánatos, hogy a cégek minden olyan validálási adatot rendelkezésre bocsássanak, amely a MAT adott anyagra és gyógyszerformára való alkalmazhatóságára vonatozik. Ezek az adatok tartalmazzák a mintaelőkészítés és az interferenia kiküszöböléséhez szükséges eljárások részleteit. Ezen felül minden olyan nyúl pirogénvizsgálatból származó párhuzamos adatot is rendelkezésre kell bocsátani, amely hozzájárulhat annak alátámasztásához, hogy a nyúl pirogénvizsgálat megfelelően helyettesíthető a MAT vizsgálattal.. AZ ALTERNATÍV MÓDSZEREK VALIDÁLÁSA A nyúlban végzett pirogénvizsgálat MAT-tal való helyettesítését, illetve a gyulladást kiváltó/pirogén szennyezők más módszerrel végzett meghatározását az Alapelvek fejezetben leírtak szerint gyógyszerkönyvi vizsgálatot helyettesítő alternatív módszernek kell tekinteni: A Gyógyszerkönyvben előírt tartalmi meghatározások és egyéb vizsgálatok képezik azokat a hivatalos módszereket, amelyeken a Gyógyszerkönyv követelményei alapulnak. Az illetékes hatóság jóváhagyásával más vizsgálati módszerek is alkalmazhatók az ellenőrzésben, feltéve, ha ezen módszerek alapján egyértelműen eldönthető, hogy a hivatalos módszerek alkalmazása esetén teljesülnének-e a cikkely követelményei. Kétes vagy vitás esetben kizárólag a Gyógyszerkönyv vizsgálati módszerei mérvadók. A cikkelyben előírttól eltérő MAT alkalmazása esetén a következő validálási eljárások javasoltak: az eljárást és a módszerben alkalmazott anyagokat és reagenseket az adott vizsgálatra előírt módon validálni kell; a zavaró tényezők jelenlétét (és, amennyiben szükséges, az eltávolításukra alkalmazott eljárást) legalább három gyártási tételből származó mintákon kell vizsgálni.

13 A MAT vizsgálatot minden olyan új, parenterális célra szánt terméken el kell végezni, amelyet az Európai Gyógyszerkönyv követelményei alapján monocita-aktiváló szennyezők jelenlétére meg kell vizsgálni. 13