ÚTMUTATÓ A BAKTERIÁLIS ENDOTOXIN VIZSGÁLAT ALKALMAZÁSÁHOZ

Átírás

1 ÚTMUTATÓ A BAKTERIÁLIS ENDOTOXIN VIZSGÁLAT ALKALMAZÁSÁHOZ 01/2010: BEVEZETÉS A gyógyszerek pirogénekkel való szennyezettsége következtében fellépő toxikus reakciókat leggyakrabban a Gram-negatív baktériumok endotoxinjai okozzák; pirogén aktivitásuk sokkal nagyobb, mint a legtöbb egyéb pirogén anyag aktivitása. Ezek az endotoxinok lipopoliszaharidok. Bár kis számban előfordulnak más szerkezetű pirogének is, általánosan elfogadott az a következtetés, hogy ha valamely termékben nincsenek jelen bakteriális endotoxinok, akkor amennyiben a nem endotoxin jellegű pirogén anyagok jelenléte kizárható pirogén alkotórészek sincsenek jelen. Az endotoxinok jelenlétét a termékben elfedhetik az endotoxinok és az amöbocita lizátum közötti reakciókat gátló faktorok. Ennél fogva annak az analitikusnak, aki a gyógyszerkönyvi cikkelyben előírt nyúl pirogén vizsgálatot bakteriális endotoxin vizsgálattal kívánja helyettesíteni, bizonyítania kell a vizsgálat érvényességét, ami a zavaró tényezők kiküszöbölésére szolgáló eljárás alkalmazását is maga után vonhatja. Amint arra a bakteriális endotoxinokra vonatkozó vizsgálat (2.6.14) is utal, mielőtt a mintán elvégzett vizsgálatot érvényesnek tekintjük, rendelkeznünk kell az alábbi két szempontra vonatkozó információval. A vizsgálatra felhasznált anyag alkalmasságát meg kell állapítani. Biztosítani kell, hogy a BET vizsgálatára alkalmas víz és az egyéb reagensek ne tartalmazzanak endotoxint, továbbá meg kell győződni az amöbocyta lizátum gyártó által megadott érzékenységéről is. Minthogy a vizsgálandó termék befolyásolhatja a vizsgálatot, az amöbocita lizátum érzékenységét mind a vizsgálandó termék jelenlétében, mind annak távollétében vizsgálni kell. A két érzékenységi érték között nem lehet szignifikáns különbség. A Bakteriális endotoxinok fejezet módszereket mutat be a vizsgálatot zavaró tényezők eltávolítására; interferencia fellépése esetén az ilyen módszer alkalmazását követően újabb vizsgálatot kell végezni annak ellenőrzése céljából, hogy a zavaró tényezőt valóban sikerült-e semlegesíteni vagy eltávolítani. Ez az általános fejezet magyarázatot ad a bakteriális endotoxinok vizsgálatának követelményeire, azt követően pedig kitér az eredmények értékelésére és értelmezésére is. Amennyiben egy gyógyszerkönyvi cikkelyben előírt nyúl pirogén vizsgálatot az amöbocita lizátum vizsgálattal helyettesítik, az utóbbit mivel ez egy alternatív módszer alkalmazását jelenti validálni kell; ennek végrehajtásához a 11. pont ad útmutatást. A bakteriális endotoxinokra vonatkozó referenciamódszert az adott termék cikkelye adja meg; ahol nincs módszer megadva, az A módszert használjuk referenciamódszerként. Ha a referenciamódszertől eltérő módszert használnak, az analitikusnak bizonyítania kell, hogy a módszer az adott termékre megfelelő, és a referenciamódszerrel megegyező eredményt ad (lásd még a 13. pontot).

2 2. MÓDSZER Az endotoxin hozzáadása az amöbocita lizátumhoz zavarosodást, kicsapódást vagy dermedést (gélkoagulációt) okozhat; a Gyógyszerkönyvben a bakteriális endotoxin vizsgálat első típusában kiértékelési kritériumként csak a gélkoagulációs módszert használták. Ennek a módszernek előnye az egyszerűsége volt: a termék megfeleléséről vagy meg nem feleléséről hozott döntés azon alapult, hogy a szabad szemmel is látható gélkoaguláció megjelenik-e vagy sem. A C, D, E és F-fel jelölt kvantitatív módszereket később fejlesztették ki: ezek nagyobb műszerezettséget igényelnek, de egy adott termék nagyszámú mintáinak rendszeres vizsgálatára könnyebben automatizálhatók. Az endotoxinok bizonyos műanyagokból és üvegfajtákból készült kémcsövek és pipetták felszínén adszorbeálódhatnak. A műanyagokból felszabaduló anyagok a vizsgálat során interferenciát okozhatnak. A felhasznált eszközöket ezért ellenőrizni kell: a kémcsövek és pipetták egymást követő gyártási tételeinek összetétele kismértékben különbözhet, ezért ajánlatos, hogy az analitikus az új eszközökkel megismételje az ilyen vizsgálatokat. Amennyiben a bakteriális endotoxin vizsgálatot határérték-vizsgálatként alkalmazzák, akkor a vizsgálandó termékre meg kell határozni az endotoxin-koncentráció küszöbértékét, másrészt pedig, meg kell állapítani, hogy a vizsgált termék endotoxin-koncentrációja a küszöbérték alatt vagy felett van-e. A C, D, E és F kvantitatív módszerek lehetővé teszik, hogy meghatározzuk a vizsgált minta endotoxin-koncentrációját. A Gyógyszerkönyv követelményeinek való megfelelés szempontjából, valamint a rutinszerűen végzett minőségellenőrzésben azonban az a döntő kérdés, hogy ez a koncentráció a meghatározott határértéket meghaladja-e vagy sem. A vizsgált termék endotoxin-koncentrációja küszöbértékének megállapításakor különös figyelmet kell fordítani a termék dózisára. A küszöbértéket úgy kell megállapítani, hogy biztosítsuk: amennyiben a termék endotoxin-koncentrációja a küszöbérték alatt marad, úgy még az óránként alkalmazandó legnagyobb dózis sem tartalmaz toxikus reakció előidézéséhez elegendő mennyiségű endotoxint. Ha a termék endotoxin-koncentrációja éppen megegyezik a küszöbértékkel, gélesedés következik be mint ahogy abban az esetben is, ha a termék endotoxin-koncentrációja sokkal magasabb és a termék nem felel meg a vizsgálat követelményének, mert a vizsgálat minden vagy semmi jellege lehetetlenné teszi, hogy különbséget tegyünk a küszöbértékkel megegyező és az annál magasabb koncentráció között. Az analitikus csak abban az esetben következtethet arra, hogy az endotoxin-koncentráció a küszöbérték alatt van, ha gélesedés nem következik be. Szilárd állapotú termékek esetén az endotoxinnak ezt a tömegegységre vagy Nemzetközi Egységre (NE) vonatkoztatott küszöbkoncentrációját a vizsgálandó oldat milliliterére vonatkoztatott endotoxinkoncentrációra kell átszámítani, mert a vizsgálat csak oldatban végezhető el. Abban az esetben, ha a termék már folyékony állapotban van (mint például infúziós oldatok) a vizsgálatok menetét az alábbiakban tárgyaljuk. Endotoxin-határérték: a parenterálisan alkalmazott hatóanyagokra vonatkozó endotoxin-határérték, a dózis alapján megállapítva, a következőképpen fejezhető ki: K, M ahol K = az endotoxin pirogén dózisküszöbe, testtömeg-kilogrammonként, M = a termék legnagyobb ajánlott, izomba adható adagja, testtömeg-kilogrammonként.

3 Amennyiben a terméket gyakori időközönként vagy folyamatos infúzióban adják, M az egy órán belül beadható legnagyobb teljes adagot jelenti. Az endotoxin határértéket, amely függ a terméktől és az alkalmazási módtól, a cikkely adja meg. A K értékekre vonatkozó ajánlást az táblázat tartalmazza. Más alkalmazási módok esetén a bakteriális endotoxinokra vonatkozó elfogadási feltételeket általában a készítményfejlesztés során kapott eredmények alapján állapítják meg táblázat Az alkalmazás módja K (NE endotoxin / testtömegkilogramm) Intravénás 5,0 Intravénás, radioaktív gyógyszerkészítmények esetén 2,5 Intratekális 0,2 A terméknek milyen hígítását kell alkalmazni a vizsgálat során ahhoz, hogy a lehető legnagyobb mértékben biztosítsuk, hogy a negatív eredmény azt jelenti, hogy a termék endotoxin-koncentrációja kisebb, mint az endotoxin-határérték, illetve hogy a pozitív eredmény azt jelenti, hogy a lizátum az endotoxin határértékével megegyező vagy annál nagyobb endotoxin-koncentrációt határozott meg? Ez a hígítás az endotoxin-határértéktől és a lizátum érzékenységétől függ: ezt hívjuk MVD-nek (Maximum Valid Dilution= Maximális Valid Hígítás) és értékét a következő kifejezéssel lehet kiszámítani: A vizsgálati oldat koncentrációja: Endotoxin-határérték a vizsgálati oldat koncentrációja mg/ml, ha az endotoxin-határértéket tömegegységre vonatkoztatva adták meg (NE/mg), λ Egység/ml, ha az endotoxin határértéket a biológiai aktivitás egységére vonatkoztatva adták meg (NE/Egység), ml/ml, ha az endotoxin-határértéket térfogatra vonatkoztatva adták meg (NE/ml). λ = a feltüntetett lizátum-érzékenység a gélkoagulációs módszer esetében (NE/ml), illetve a turbidimetriás vagy kromogén technikák standard görbéiben alkalmazott legkisebb koncentráció. Amennyiben a maximális valid hígítás értéke nem egész szám, az MVD-nél kisebb, kényelmesen alkalmazható egész szám használható rutin célokra (ami azt jelenti, hogy a termékből kisebb hígítást készítünk, mint amit az MVD jelöl). Ebben az esetben a negatív eredmény azt jelzi, hogy a termék endotoxin-koncentrációja a küszöbérték alá esik. Ha azonban egy ilyen vizsgálatban a termék endotoxinkoncentrációja kisebb, mint az endotoxin küszöbértéke, de elég magas ahhoz, hogy a lizátummal reakcióba lépve gélesedést hozzon létre, a vizsgálat ilyen körülmények között pozitív lehet. Ennél fogva, ha a vizsgálat ezzel a kényelmes hígítási faktorral pozitív eredményt ad, a terméket az MVD értékre kell hígítani, és a vizsgálatot meg kell ismételni. Bármilyen kétes vagy vitatott esetben az MVD-t kell használni. Ez rávilágít arra, hogy milyen fontos a lizátum érzékenységének igazolása. Példa A fenitoin-nátrium 50 mg/ml töménységű intravénás injekciós oldatát kell vizsgálnunk. Határozzuk meg az MVD értéket, a következő változók alapján: M = az emberben alkalmazható legnagyobb adag = 15 mg/testtömeg-kilogramm,

4 c = 50 mg/ml, K = 5 NE endotoxin/testtömeg-kilogramm, λ = 0,4 NE endotoxin/ml. MVD = ,4 = 41,67 Ennek a terméknek a rutinszerű vizsgálataihoz célszerű a vizsgálandó oldat 1 ml-ét 20 ml-re hígítani (MVD/2, a kisebbik egész számra kerekítve). Ha azonban az így végzett vizsgálat pozitív eredményt ad, a vizsgálatot végzőnek 1 ml oldatot 41,67 ml-re hígítva meg kell ismételnie a vizsgálatot. A 41,67 ml-re történő hígítást abban az esetben is el kell elvégezni, ha a vizsgálatot vitás kérdés eldöntésének céljából végzik el. 3. REFERENCIAANYAG Referenciakészítményként BRP endotoxin standardot ajánlott használni. Ezt a WHO Nemzetközi Endotoxin Standarddal szemben határozták meg, és hatóértékét endotoxin Nemzetközi Egység/ampulla értékben fejezik ki. Az endotoxin Nemzetközi Egységét (NE) a Nemzetközi Standard meghatározott tömegének fajlagos aktivitásaként határozzák meg. Rutin célokra egyéb endotoxin készítmény is felhasználható, feltéve, hogy a Nemzetközi Endotoxin Standarddal vagy a BRP-vel szemben határozták meg, és hatóértékét endotoxin Nemzetközi Egységben fejezik ki. MEGJEGYZÉS: Az endotoxin 1 Nemzetközi Egysége (NE) 1 Endotoxin Egységgel (E.E.) egyenlő. 4. BET VIZSGÁLATÁRA ALKALMAS VÍZ A BET vizsgálatára alkalmas víz endotoxin-mentességének vizsgálatára a nyúl pirogén vizsgálati módszert gyakorlati és elméleti megfontolások alapján nem találták alkalmasnak: a nyúl pirogén vizsgálat nem elég érzékeny ahhoz, hogy a nagyon alacsony endotoxin-határértékű készítmények vizsgálatára alkalmazandó BET vizsgálatára alkalmas vízben az endotoxint kimutassa; a nyulak testhőmérséklet-emelkedése meghatározásának viszonylagos pontatlansága a vizsgálatok többszöri ismétlését tenné szükségessé; a pirogének és endotoxinok kifejezések nem teljesen egybeeső entitásokat jelentenek. A Bakteriális endotoxinok fejezet ajánlása szerint a háromszoros desztilláción kívül más módszerek is alkalmazhatók a BET vizsgálatára alkalmas víz előállítására. A fordított ozmózist eredményesen alkalmazták; egyes analitikusok a háromszorosnál többszöri desztillációt részesítik előnyben. Bármilyen módszert alkalmazzanak is, a végtermék nem tartalmazhat kimutatható mennyiségű endotoxint. 5. AZ ELEGY ph-ja A bakteriális endotoxinok vizsgálata során a legmegfelelőbb gélkoaguláció 6,0-8,0 ph-jú elegyekben megy végbe. A lizátumnak a mintához való hozzáadása azonban csökkentheti a ph-értéket.

5 6. A LIZÁTUM VALIDÁLÁSA Fontos, hogy a lizátum oldatait a gyártó utasításai szerint készítsük el. Az A és B gélkoagulációs módszerek alkalmazásakor a pozitív végponthoz tartozó hígítási faktorok logaritmusát képezzük. Ennek oka, hogy ezeknek a logaritmusértékeknek a gyakorisági eloszlásgörbéje általában jobban közelíti a normál eloszlásgörbét, mint maguknak a hígítási faktoroknak a gyakorisági eloszlásgörbéje; gyakorlatilag annyira hasonló, hogy a normál eloszlásgörbét elfogadhatjuk, mint matematikai modellt, és a konfidencia határokat a Student-féle t-próbával kiszámíthatjuk. 7. ELŐZETES VIZSGÁLAT ZAVARÓ TÉNYEZŐKRE Egyes termékek közvetlenül nem vizsgálhatók endotoxinok jelenlétére, mert nem elegyíthetők a reagensekkel, ph-juk nem állítható be 6,0 és 8,0 közötti értékre, vagy gátolják, illetve aktiválják a gélképződést. Ezért szükséges előzetes vizsgálatot végezni a zavaró tényezők jelenlétének ellenőrzésére. Amennyiben ilyen tényezők kimutathatók, az analitikusnak igazolnia kell, hogy az eltávolításukra szánt eljárás hatékony volt. Az előzetes vizsgálat célja annak a nullhipotézisnek a vizsgálata, amely szerint a lizátum érzékenysége a vizsgálati készítmény jelenlétében nem különbözik szignifikánsan a lizátum érzékenységétől a készítmény távollétében. Az A és B módszer esetében egyszerű kritériumot alkalmazunk: a nullhipotézist elfogadjuk, ha a lizátum érzékenysége a vizsgálati készítmény jelenlétében legalább fele és legfeljebb kétszerese a lizátum saját érzékenységének. A klasszikus megközelítés az lenne, ha a készítmény jelenlétében és távollétében is kiszámítanánk a lizátum érzékenységéhez tartozó hígítási faktor logaritmusának középértékét, és a két középérték különbségét a Student-féle t-próbával vizsgálnánk. Az A és B gélkoagulációs módszerben a zavaró tényezők vizsgálatához az előírás alapján olyan termékminta alkalmazására van szükség, amelyben endotoxin nem mutatható ki. Amennyiben teljesen új készítményt kell vizsgálnunk, ez elvi problémát vet fel. Ennél fogva, a C, D, E és F kvantitatív módszerek esetében teljesen más megközelítést alkalmazunk. 8. ZAVARÓ TÉNYEZŐK KIKÜSZÖBÖLÉSE A zavaró faktorok kiküszöbölését célzó műveletek során a vizsgálati készítmény endotoxin-tartalma nem nőhet vagy csökkenhet (például adszorpció révén). Ezt korrekt módon úgy ellenőrizhetjük, hogy az eljárásokat mesterségesen hozzáadott endotoxint tartalmazó mintákra alkalmazzuk, azaz a vizsgálatot a készítmény egy olyan mintájával végezzük el, amelyhez ismert mennyiségű endotoxint adunk, majd megmérjük a visszanyerhető endotoxin mennyiségét. C és D módszer. Ha a vizsgálandó készítmény olyan természetű, hogy a vizsgálatot zavarja, de a zavaró tényező a klasszikus módszerekkel nem küszöbölhető ki, a kalibrációs görbét megfelelő kezeléssel vagy hígítással endotoxin-mentesített, azonos típusú termékkel vehetjük fel. Ilyen esetben az endotoxin vizsgálat elvégzésekor ezt a standard görbét használjuk összehasonlításként. Cellulóz-triacetátból készült aszimmetrikus membránszűrőkön történő ultraszűrés a legtöbb esetben megfelelő eredményt ad. A szűrőket megfelelő módon validálni kell, mert bizonyos körülmények között egyes cellulóz származékok (például a β-d-glükánok) álpozitív eredményt adhatnak. A poliszulfon szűrők alkalmatlannak bizonyultak, mert egyes felhasználók ezekkel álpozitív eredményeket kaptak.

6 9. A KONTROLL VIZSGÁLATOK CÉLJA A BET vizsgálatára alkalmas vízzel készített kontroll és a feltüntetett lizátum érzékenységéhez képest kétszeres koncentrációjú referenciakészítmény alkalmazásának célja, hogy igazolja a lizátum aktivitását a vizsgálat időpontjában és körülményei között. A negatív kontroll alkalmazásának célja annak igazolása, hogy a BET vizsgálatára alkalmas víz nem tartalmaz kimutatható koncentrációjú endotoxint. A vizsgálandó készítményt a vizsgálatban előírt koncentrációban tartalmazó pozitív kontroll alkalmazásának célja annak igazolása, hogy a vizsgálat időpontjában és körülményei között nincsenek jelen zavaró tényezők. 10. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE A BET vizsgálatára alkalmas vízben, illetve bármilyen más reagensben vagy anyagban, amellyel a lizátum a vizsgálat során kapcsolatba kerül, igen kis mennyiségű endotoxin mindaddig nem mutatható ki, amíg nem éri el a lizátum érzékenységi küszöbértékét. Ez az igen kis mennyiségű endotoxin azonban a vizsgált készítmény oldatában jelen levő endotoxin mennyiségét éppen az érzékenységi határ fölé emelheti, ami pozitív reakciót eredményezhet. A jelenség bekövetkezésének kockázata csökkenthető, ha a BET vizsgálatára alkalmas vizet, illetve az egyéb reagenseket és anyagokat a rendelkezésre álló legérzékenyebb lizátumokon, vagy legalább olyan lizátumon vizsgáljuk, amely érzékenyebb, mint az, amelyet a készítmény vizsgálatakor használunk. Ennek ellenére sem zárható teljesen ki az álpozitív eredmény kockázata. Ezzel együtt tisztában kell lennünk azzal, hogy ebben a vonatkozásban a vizsgálatot hiba-biztosra tervezik, ellentétben az olyan vizsgálati tervekkel, amelyek álnegatív eredmény előfordulását teszik lehetővé, ami nem megfelelő készítmények felszabadítását eredményezheti, veszélyeztetve a páciensek egészségét. 11. A NYÚL PIROGÉN VIZSGÁLAT HELYETTESÍTÉSE BAKTERIÁLIS ENDOTOXIN VIZSGÁLATTAL Azon parenterális gyógyszerek cikkelyei, amelyek toxikus mennyiségű bakteriális endotoxint tartalmazhatnak, vagy bakteriális endotoxin vizsgálatot, vagy nyúl pirogén vizsgálatot írnak elő. Az általános vezérelvek a következők: bármely olyan egyedi cikkelyben, ahol ilyen vizsgálatot előírnak, csak az egyik, vagy a pirogén-, vagy a bakteriális endotoxin vizsgálat szerepelhet; hacsak nincs bizonyíték az ellenkezőjére, a bakteriális endotoxin vizsgálatot előnyben kell részesíteni a pirogén vizsgálattal szemben, mert a beteg számára általában azonos vagy nagyobb védelmet biztosít; mielőtt egy cikkely előírja a bakteriális endotoxin vizsgálatot, bizonyítani kell, hogy a fejezetben leírt módszerek valamelyike megfelelő módon alkalmazható a kérdéses készítmény esetében; a szükséges információkat az előállítóktól kell beszerezni; a cégeket fel kell kérni, hogy adjanak át a rendelkezésükre álló minden olyan validálási adatot, amely az érintett anyagok és gyógyszerformák bakteriális endotoxin vizsgálatának alkalmazhatóságára vonatkozik. Ezeknek az adatoknak tartalmazniuk kell a minta előállításának részleteit, és a zavaró tényezők eltávolításához szükséges valamennyi eljárás részleteit; ezenfelül közölni kell valamennyi olyan, nyulakban párhuzamosan

7 végzett pirogén vizsgálat rendelkezésre álló adatait, amelyek alátámaszthatják, hogy a nyúl pirogén vizsgálatnak a bakteriális endotoxin vizsgálattal történő helyettesítése megfelelő eljárás. A további követelményeket a következő pontok tartalmazzák. 12. A CIKKELYBEN ELŐÍRTTÓL ELTÉRŐ BAKTERIÁLIS ENDOTOXIN VIZSGÁLAT ALKALMAZÁSA Ha a cikkely bakteriális endotoxinra vonatkozó vizsgálatot ír elő, de a fejezetben előírt 6 vizsgálat (A F) egyikét sem nevezi meg, akkor az adott termékre vonatkozóan az A módszer, a gélkoaguláción alapuló határérték-vizsgálat a validált módszer. Amennyiben a többi módszer (B F) egyikét megnevezik, akkor az adott termékre vonatkozóan azt a módszert validálták. 13. ALTERNATÍV MÓDSZEREK VALIDÁLÁSA A nyulakon végzett pirogén vizsgálat bakteriális endotoxin vizsgálattal történő helyettesítését, vagy a cikkelyben megnevezett vagy hivatkozott bakteriális endotixin vizsgálati módszer más módszerrel való helyettesítését az Alapelvek értelmében úgy kell tekinteni, mint egy alternatív módszer alkalmazását egy gyógyszerkönyvi módszer helyett: A Gyógyszerkönyvben előírt tartalmi meghatározások és egyéb vizsgálatok képezik azokat a hivatalos módszereket, amelyeken a Gyógyszerkönyv követelményei alapulnak. Az illetékes hatóság jóváhagyásával más vizsgálati módszerek is alkalmazhatók az ellenőrzésben, feltéve, ha ezen módszerek alapján egyértelműen eldönthető, hogy a hivatalos módszerek alkalmazása esetén teljesülnének-e a cikkely követelményei. Kétes vagy vitás esetben kizárólag a Gyógyszerkönyv vizsgálati módszerei mérvadók. A cikkelyben megnevezett vagy jelzett bakteriális endotoxin vizsgálati módszertől eltérő módszer validálására a következő eljárások javasoltak Az eljárást, valamint a módszer során felhasznált eszközöket és reagenseket az érintett vizsgálatra előírtak szerint kell validálni A zavaró tényezők jelenlétét (és szükség esetén a kiküszöbölésükre szolgáló eljárást is) legalább 3 különböző gyártási tételből származó mintán kell vizsgálni. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy a D és E módszer esetében, amelyeknél kromogén peptidet alkalmazunk, olyan reagenseket is fel kell használni, amelyek az A, B, C és F módszerben nincsenek jelen. Ennél fogva az, hogy az A, B, C és F módszerek megfelelnek a zavaró tényezőkre vonatkozó követelményeknek, nem jelenti azt, hogy mindez a D és az E módszerre is további vizsgálatok elvégzése nélkül érvényes lenne. 14. ÚJ TERMÉKEK VIZSGÁLATÁNAK VALIDÁLÁSA Minden olyan parenterális alkalmazásra szánt új termék esetében, amelynél a Gyógyszerkönyv a bakteriális endotoxinok jelenlétére vonatkozó vizsgálatot ír elő, a és pontokban leírt eljárásokat kell alkalmazni.