Tömegspektrometria /MS/

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Tömegspektrometria /MS/"

Irma Bogdánné
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 Tömegspektrometria /MS/ FIZIKA-BIOFIZIKA Huber Tamás PTE ÁOK Biofizikai Intézet A tömegspektrometria rövid története: Goldstein 1886: gázfázisú ionok felfedezése (anódsugár). Thomson 1912: az első tömegspektrométer. Aston, Dempster 1919-től: izotópok pontos tömege, tömegspektrum kifejezés. 1942: első kereskedelmi készülék. Cameron, Eggers : time-of-flight (TOF) analizátor Paul 1955: quadrupol analizátor. McLafferty 1974: HPLC és MS összekapcsolása Karas et al. 1987: MALDI (matrix assisted laser desoption ionisation) Fenn 1988: elektrospray szervetlen MS szerves MS 1950-től 1

2 A tömegspektrometria Definíció: térben és időben szétválasztott részecskék egymás utáni elektromos detektálása. Alapelvek: Ionok képzése bármely alkalmas anyagból. Ionok szétválasztása töltésegységre eső tömegük szerint. Ionok minőségi és mennyiségi detektálása az m/z gyakoriság függvény szerint. Az ionintenzitás- fajlagos tömeg közötti függvénykapcsolat a tömegspektrum. Miért jó az MS? Nagy érzékenység kvalitatív kimutathatósági tartomány: g kvantitatív kimutathatósági tartomány: g Széles tömegtartomány relatív tömegegység Specifitása, reprodukálhatóság, alacsony mintaigény ~μg - ~pg Bármilyen halmazállapotú, érzékenységű, szerkezetű anyag vizsgálható. 2

Milyen információkat kaphatunk az MS-el? MW meghatározás, minőségi azonosítás. Szerkezetvizsgálat (pontos tömeg = elemösszetétel) Izotóparány GC, LC, stb.

3 Milyen információkat kaphatunk az MS-el? MW meghatározás, minőségi azonosítás. Szerkezetvizsgálat (pontos tömeg = elemösszetétel) Izotóparány GC, LC, stb. kombinációk összetett mátrixok elemzésére Proteomika Molekulák termodinamikai tanulmányozása: ionizációs energia, aktivációs entalpia és entrópia stb. LC/LC-MS/MS-Tandem LC, Tandem MS 3

4 Az MS elvi felépítése Vákuum rendszer Mintabevitel Ion forrás Analizátor Detektor Adatfeldolgozás, vezérlés A minta folyékony biológiai minták fehérjék peptidek oligoszaharidok DNS szérum vér vizelet agy-, gerincvelői folyadék kismolekulák szilárd szöveti minták gyógyszerek a mintából ionokat kell készíteni 4

5 Mintabeviteli megoldások 1. Direkt mintabevitel (zsilipelés) gázok folyadékok szilárd minták bevitele 2. Indirekt (elválasztás utáni) mintabevitel GC-MS LC-MS CE-MS Vákuumrendszerek: Analitikai készülékek: kétfokozatú Szerkezetvizsgálók: három fokozatú: 1. fokozat: elővákuum-rotációs szivattyú (10 2 kpa-0.1-1kpa-ig) 2. fokozat: turbomolekuláris szivattyú diffúziós szivattyú (0.1-1 kpa-ról kpa-ig) 3. fokozat: ion getter pumpa (IGP)(10-8 -kpa-ig) 5

6 Az ionforrások feladata: Ionok előállítása ionok gyorsítása koherens ionnyaláb biztosítása Az ionizáció történhet gáz, folyadék és szilárd fázisban. Ionizálás Hő (töltéscsere elektrolitban) Elektromos mező Foton Elektronütközés (EI) Atomok, ionok ütközése. Elsősorban a minta anyagi minősége, stabilitása, oldószere határozza meg. Befolyásolja az érzékenységet, kinyerhető szerkezeti információkat. 6

7 Közvetlen ionizáció. Elektron ionizáció Ütközés fűtött katódból kilépő elektron-nyalábbal (50-75eV). Könnyen gázfázisba vihető anyagok meghatározására alkalmas 1000 Da-ig, magas hőmérséklet. Intenzív, stabil, jól reprodukálható. Anyagok szűk körére alkalmas, jelentős fragmentáció (in source decay, ISD) Az elektron ütközéses ionizáció elve izzó katód gyorsító elektród repeller minta (M) elektron nyaláb U rep () ionnyaláb Analizátor M e M 2e anód ionoptika - U = 1-100kV 7

8 Lágy ionizációs technikák Kémiai ionizáció (chemical ionisation, CI) Gyors atom/ion bombázás (fast atom/ion bombardment, FAB/FIB) Plazmadeszorpció (plasma desorption, PD) Térdeszorpció erős elektromos térrel (field desorption, FD) Kémiai ionizáció Közvetett ionizáció. Kombinált EI/CI forrás. Ion-molekula ütközések a reagens ionok és a minta molekulái között. Reagens gázok: metán, i-bután, ammónia. Gyenge fragmentáció, főleg molekulatömeg információ. 8

9 CI ionforrás M CH 5 [MH] CH 4 izzó katód gyorsító elektród repeller CH 5 Analizátor Reagens gáz: CH 4, NH 3, propán, PB CH 4 e CH 4 2e anód minta (M) CH 4 CH 4 CH 5 CH 3 Elektrospray/ionspray ionizáció (ESI, ISI) Porlasztásos technika Fém kapilláris, 2-5 kv, szemben erős ellentétes töltés Külső csövön vezetett porlasztógáz (N 2 ) Fűtött N 2 ellenáram oldószer párologtatás Nem illékony, poláros szerves vegyületek 9

10 ESI Pressure = 1 atm Inner tube diam. = 100 um Sample Inlet Nozzle (Lower Voltage) Partial vacuum N 2 MH Sample in solution N 2 gas MH 2 2 MH 3 3 High voltage applied to metal sheath (~4 kv) Charged droplets a minta porlasztása /spray/ elektromos erőtér vákuumba apró cseppek az oldószer gyorsan párolog a vákuumban a csepp mérete csökken, a töltéssűrűség megnövekszik a cseppben az elektrosztatikus taszítóerő a cseppet egyre kisebb cseppecskékre bontja 10

11 MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Szerves mátrix (mustársav, -ciano-4-oh-fahéjsav, 2,5-dihidroxi-benzoesav). Minta a mátrixszal fémfelületre szárítva. Lézerimpulzusok. Mátrix az elnyelt energia révén ionizálja és elpárologtatja a mintát. Gyors, kíméletes, érzékeny, keverék mintákhoz is jó makromolekulák vizsgálata MALDI [Mátrix M] lézer [Mátrix] M [Mátrix] M Nitrogén lézer Mátrix M D ionizáció deszorpció a mátrix és a minta (M) elnyeli a lézer energiáját a mátrixminta leválik a fémfelszínről a vákuumba gázfázisú molekulák jönnek létre a minta részecskéit a mátrix ionizálja gázfázisú protontranszfer során 11

12 Analizátorok Feladatuk: Az ionforrásból érkező nagy sebességű ionok szétválasztása fajlagos tömegük szerint. Mágneses analizátorok (180, 90, 60 -os eltérítésű) kvadrupól analizátorok (felső tömeghatár: 100 kda) Ioncsapda (olcsó, érzékeny, de mennyiségi meghatározásra nem alkalmas) Repülési idő (TOF) készülék (felső tömeghatár: 300 kda) Orbitrap FT-ICR kettős fókuszálású Tandem analizátorok: MS/MS, MS n Kvadrupól analizátor a kvadrupól elektromos erőterében a részecske pályája függ a tömegétől és töltésétől egy adott DC és AC erőtér esetén csak az annak megfelelő tömeg/töltés aránnyal rendelkező részecskék tudnak áthaladni a kvadrupólon és elérni a detektort a DC és AC erőtér változatásával szekvenciálisan különböző tömeg/töltés aránnyal rendelkező részecskék detektálhatóak 12

13 TOF (time of flight) analizátor Detektorhoz való megérkezés ideje függ a tömegtől és a töltéstől (gyorsítófeszültség). Hosszú tér- és ütközésmentes útszakasz kell. Lineáris és reflektron mód. Olcsó, jó felbontóképesség, széles tömegtartomány. MALDI TOF fehérjeanalitika TOF analizátor E á = zu E á = 1 2 mv sebesség(v) = távolság(d) idő(t) E á = E á zu = 1 2 mv t = d 2U m z 13

14 Detektorok Feladatuk: A ionáram érzékelése. Ionsokszorozó, fotosokszorozó. A detektorok jellemzése: érzékenység ionáram változás követésének sebessége erősítési tényező elektromos zajszint (ún. sötétáram) stabilitás (élettartam) MS felbontás Felbontóképesség: R m/ m R<10 4 kisfelbontású R>10 4 nagyfelbontású 10 % szabály: két egyenlő intenzitású csúcs között a völgy legfeljebb a csúcsmagasság 10 %-a. 14

15 Tömeg/töltés spektrum Relatív intenzitás Szén-dioxid m/z Az n-dekán tömegspektruma C10H22 15

16 Összetevők azonosítása sztearinsav- metilészter A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai I. Mintabevitel: folyékony állapotú biológiai minta, megfelelően elkészített szérum, vércsepp, vizelet, liquor, szövetminta extraktum. Egy vizsgálatból gyorsan, akár 30 féle anyagcsere betegségre adható diagnosztikai vélemény Fehérje (enzim) szint diagnosztika: szekvenciaeltérés azonosítása poszttranszlációs modifikációk azonosítása konformáció eltérések vizsgálata kvantitatív fehérje expressziós profil vizsgálata 16

17 közép-láncú acyl-coa dehydrogenase hiány (MCAD) marker metabolit: C6, C8, C10:1-karnitin propionsav acidaemia (PA) marker metabolit: C3-karnitin A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai II. Metabolit szint diagnosztika: veleszületett anyagcsere-betegségek karnitin-észter profil meghatározás: primér/szekunder karnitinhiány, zsírsavoxidációs zavarok, aciduriák aminosav profil meghatározás: aminoacidopathiák guanidinovegyületek: kreatinszintézis zavarok epesavmetabolitok: epesavszintézis zavarok homocystein: hiperhomocysteinaemiák purinok, pirimidinek galaktosaemia szteroidszintézis, koleszterinszintézis zavarok hormonszintézis zavarok (trijódtironin, katekolaminok) szénhidrát-anyagcsere zavarai 17

18 Betegség rövid-láncú acyl-coa dehydrogenase hiány (SCAD) közép-láncú acyl-coa dehydrogenase hiány (MCAD) hosszú-láncú hydroxi-acyl- CoA dehyrogenase hiány (LCHAD) nagyon hosszú-láncú acyl- CoA dehydrogenase hiány (VLCAD) carnitin-palmytoil transferase hiány (CPT-I, II) Detektált molekula marker metabolit C4-karnitin C6, C8, C10:1-karnitin C14OH, C16OH, C18OHkarnitin C14:1, C16:1-karnitin Emelkedett C0/C16C18 karnitin arány fenilketonuria Betegség jávorfaszörp betegség (MSUD) tyrosinaemia I, II citrullinaemia I (ASS) arginosuccinic aciduria (ASL) argininaenemia glutársav aciduria I (GA-I) isovaleriánsav acidaemia (IVA) metilmalonsav acidaemia (MMA) propionsav acidaemia (PA) Detektált molekula marker metabolit fenilalanin/tirozin leucin, izoleucin tirozin citrullin arginin glutarinkarnitin C5-karnitin C3-karnitin, metilmalonil karnitin C3-karnitin Köszönöm a figyelmet! 18

Hasonló dokumentumok

Tömegspektrometria A tömegspektrometria. Az n-dekán tömegspektruma. A tömegspektrometria rövid története: Biofizika szeminárium

Tömegspektrometria A tömegspektrometria. Az n-dekán tömegspektruma. A tömegspektrometria rövid története: Biofizika szeminárium Tömegspektrometria Biofizika szeminárium Huber Tamás PTE ÁOK Biofizikai Intézet A tömegspektrometria Definíció: térben és időben szétválasztott részecskék egymás utáni elektromos detektálása. Alapelvek: