Doktori (PhD) értekezés tézisei. Mohamed Ahmed Dow. Eötvös Loránd Tudományegyetem, Budapest

Átírás

1 GYERMEKEK ÉS NYULAK ENTERÁLIS MEGBETEGEDÉSEIBİL SZÁRMAZÓ KÓROKOZÓ ESCHERICHIA COLI TÖRZSEK ÖSSZEHASONLÍTÓ ELEMZÉSE Doktori (PhD) értekezés tézisei Mohamed Ahmed Dow Eötvös Loránd Tudományegyetem, Budapest Biológiai Doktori Iskola Vezetı: Prof. Dr. Erdei Anna, az MTA l. tagja Evolúciós genetika, ökológia és klasszikus genetikai program Vezetı: Prof. Dr. Szathmáry Eörs, az MTA doktora Témavezetık: Dr. Tóth István, az MTA doktora, Prof. Dr. Nagy Béla, az MTA r. tagja MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézete Budapest, 2006

2 BEVEZETÉS A különbözı kórokozó E. coli törzsek által okozott megbetegedések legjellemzıbb klinikai tünetei enterális jellegőek, s leggyakrabban hasmenésben nyilvánulnak meg. A hasmenést okozó E. coli törzseket minimálisan hat csoportba lehet sorolni, így megkülönböztetünk enteropatogén E. coli (EPEC), enterotoxikus E. coli (ETEC), enteroinvazív E. coli (EIEC), enterohaemorrhagiás E. coli (EHEC), enteroaggregatív E. coli (EAEC) és diffúzan adheráló E. coli (DAEC) patotípusokat. Az EPEC törzsek nagy jelentıséggel bírnak a gyermekek hasmenésében. A statisztikai adatok szerint egyes fejlıdı országokban, a gyermekek halálát leggyakrabban EPEC okozza. Ellentétben a többi hasmenést okozó E. coli csoporttal az EPEC nem termel egyetlen klasszikus fehérje toxint sem, viszont a hasmenést a baktériumnak a bélhámsejtekhez való szoros tapadásával tudja elıidézni az alábbiak szerint. A kórokozó és gazda bélhámsejt membránjának kölcsönhatása által kiváltott szignálfolyamatok hatására az érintett gazda sejtek citoszkeletonja is jelentısen átrendezıdik úgy, hogy a polimerizálódott aktin szálak felhalmozódnak és ezzel is elısegítik a tapadó baktériumok adhézióját, mely folyamat eredményeként a mikrovillusok elhajlanak, ill. elpusztulnak és hasmenés alakul ki. Az így létrejött elváltozás neve az attaching és effacing (A/E) lézió, melynek a kialakulását elıidézı virulencia faktorokat kódoló gének az EPEC törzsek kromoszómáján lokalizálódó LEE (locus of enterocyte effacement) patogenitási szigeten foglalnak helyet. A tipikus EPEC törzsek esetében a fenti folyamat egy laza tapadással kezdıdik, amit az ún. köteg képzı pilusok (bundle forming pili, BFP) alakítanak ki. A BFP termeléshez szükséges gének az EAF (EPEC adhéziós faktor) virulencia palzmidon foglalnak helyet. A BFP kimutatása szolgál a tipikus és atipikus EPEC törzsek megkülönböztetésére. A járványtani vizsgálatok szerint a tipikus EPEC fertızés egyetlen természetes forrását az ember jelenti, mivel a tipikus EPEC csoportot jellemzı szerocsoportú törzseket állatokból nem izolálták. Ugyanakkor az atipikus EPEC szerocsoportok különbözı állatokban is elıfordulnak. Számos állatfaj (sertés, szarvasmarha, juh, kecske és nyúl) egészséges és hasmenéses egyedeibıl izoláltak EPEC baktériumot. Eddig, csupán a nyúl jelenti az egyetlen olyan állatfajt, melyben az EPEC fertızés következtében, az emberi fertızéshez hasonló súlyos kórtani folyamat alakul ki. 1

3 CÉLKITŐZÉSEK Az EPEC törzsek által okozott gyermekkori hasmenések járványtani jelentısége a világ eltérı régióiban eltérı jelentıséggel bírnak. A sporadikus fertızések a fejlett ipari országokat, a járványos halmozódások és gyakori elıfordulások a fejlıdı országokat jellemzik. A legtöbb fejlıdı országban a hasmenéses megbetegedések okozói a protozonok, rotavírusok és a baktériumok. Sajnálatos módon csupán néhány tanulmány vizsgálta ezen ágenseknek a gyermekkori akut hasmenésben játszott szerepét Észak Afrikában, különösen Líbiában. Mivel a humán patogén E. coli törzsek virulencia génjeirıl ill. patotípusairól Líbiában nem álltak rendelkezésre ilyen adatok, ezért 1. Jelen dolgozatban célunk volt líbiai gyermekekbıl izolált E. coli törzsek patotípusának és fıbb virulencia génjeinek a meghatározása és analízise 2. Továbbá, meghatározni a törzsek szerotípusát, in vitro ahéziós képességét, antibiotikum rezisztenciáját (R profilját), valamint az 1 típusú integron elıfordulását 3. Mivel Közép-Európában a nyulak EPEC fertızését okozó törzsek részletes elemzésérıl mindeddig nem számoltak be, ezért célunk volt a Magyarországon ill. Cseh Köztársaságban hasmenéses nyulakból izolált E. coli törzsek jellemzése, különös tekintettel a virulencia génekre 4. Végezetül, azon kérdésünkre kerestünk választ, hogy a fent említett humán és nyúl eredető törzsek mennyiben hasonlítanak, s hogy közöttük elıfordulnak-e eddig nem azonosított új pato- ill. virulencia típusok. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Baktérium törzsek Összesen 50 líbiai gyermek ( 3 év) székletébıl izolált E. coli törzset jellemeztünk. Húsz törzs akut hasmenéses gyermektıl, 30 törzs pedig nem hasmenéses gyermekektıl származott. A törzseket az Al -Jala Kórházban (Tripoli, Líbia) izolálták. Továbbá, 66 nyúl eredető E. coli törzset jellemeztünk. A törzseket összesen 101 választott állat (4-6 hetes) vakbelébıl lettek izolálva, úgy, hogy 40 hasmenés állatból 22 törzs, 32 nem- 2

4 hasmenéses nyúlból pedig 15 törzs származott. Ez utóbbi törzsek egyetlen nagymérető magyarországi nyúlteleprıl származtak. A további 29 törzs 29 hasmenéses nyúlból származott, s a törzseket 17 különbözı telepen a Cseh Köztársaságban izolálták. Genotípusos vizsgálatok A líbiai gyermekekbıl és nyulakból izolált E. coli törzsek virulencia génjeit az irodalomból ismert patotípus specifikus PCR primerekkel az ott megadott programok szerint vizsgáltuk. Meghatároztuk, hogy a törzseink között elıfordul-e ETEC, STEC/VTEC, EIEC, EPEC, EAEC vagy nektrotoxikus E. coli (NTEC). Továbbá, az összes törzset jellemeztük, hogy hordoznak-e toxin, adhezin és long polláris fimbria specifikus géneket, valamint vizsgáltuk a törzseinket, hogy rendelkeznek-e jellegzetes OI-122 specifikus génekkel, a HPI (high patogenicity island) patogenitási szigetre jellemzı fyua pesticin receptor génnel, vagy az 1 típusú integronnal. A dolgozatban vizsgált fontos toxin és adhezin gének Gén A terméknek ill. a génnek a neve eae Intimint kódoló gén bfp Köteg képzı pilus (bundle forming pili) EAF EPEC adhéziós faktor plazmid lpf R141 OI-141 sziget által kódolt long poláris fimbria gén lpfa O113 OI-154 sziget által kódolt long poláris fimbria gén fyua sziderófor receptor gén (HPI-ra jellemzı) pic intesztinális kolónizációban résztvevı protein efa/lifa EHEC adhéziós faktor/limfocita inhibíciós faktor A pagc phop activálta C gén (EHEC OI-122 homológ) afr1 adhéziós faktor/ nyúl (rabbit) 1 afr2 adhéziós faktor/ nyúl (rabbit) 2 ralg nyúl-epec adhéziós lókusz paa sertés (porcine) attaching és effacing-asszociált gén aggr enteroaggregatív specifikus fimbria regulátor agga aggregatív adhéziós I típusú fimbria agg-3a aggregatív adhéziós III típusú fimbria sen Shigella enterotoxin pet plazmid kódolta toxin east1 enteroaggregatív hı-stabil enterotoxin 1 cdt citoletális duzzasztó (distending) toxin Kolónia hibridizáció 3

5 A baktérium telepeket LB agar lemezen növesztettük, majd nitrocellulóz membránra vittük át, lúggal lizáltuk és hıvel fixáltunk Sambrook és mtsai (1989) eljárása szerint. A próbaként használt ralg specifikus PCR fragmentet QIAquick PCR tisztító kittel (Qiagen, GmbH) izoláltuk, a digoxigenines jelölést a ready to use kittel a forgalmazó (Roche Diagnostics GmbH) leírása szerint végeztük. A hibridizációs eljárást 68 o C-on folytattuk. Szorbit és ramnóz bontás A nyúl eredető vadtípusú törzsek cukorbontását 1% szénhidrátot tartalmazó fenol vörös (Difco) agar lemezen Camguilheim és Milon (1989) módszere szerint vizsgáltuk. A törzsek csepp formájában növesztettük és a kiértékelést 6 és 24 órás 37 o C-os inkubációt követıen végeztük. In vitro HeLa adhézió A törzsek adhéziós képességét HeLa szövettenyészetet alkalmazva DeRycke és mtsai (1997) közleménye szerint vizsgáltuk. A HeLa sejteket (ATCC CCL-2) NUNCLON szövettenyésztı lemezeken 24 órán át 10% magzati borjú szérumot (FCS; Gibco) és gentamicint (80 µg/ml) tartalmazó MEM (minimum essential medium) szövettenyésztı folyadékban növesztettük. A baktérium tapadását antibiotikum-mentes, 5% FCS és 1% D-mannóz-tartalmú MEM-ben vizsgáltuk, úgy hogy a mintákat 6 óráig 37 o C-on 5% CO 2 jelenlétében inkubáltuk. Az interakciós idıszakot követıen a sejteket foszfát pufferral (PBS, ph 7,2) négyszer mostuk, metanollal rögzítettük, 10%-os Giemsa oldattal festettük, és a baktériumok tapadását fénymikroszkóppal vizsgáltuk. A HeLa sejtekhez tapadó baktériumok számát legalább 3 független kísérletben határoztuk meg. Nyúl bélkacsban végzett in vivo adhéziós vizsgálatok Összesen hat nyúl eredető EPEC törzsnek és a K-12 kontrol törzsnek vizsgáltuk az in vivo adhéziós képességét. A kísérleteket 6 hetes választási nyulak (n=3) lekötött csípıbél bélkacsaiban az Állatorvosi és Élelmiszer-biztonsági Hivatal, Budapest 1226/001/2003 számú engedélye alapján Moon és mtsai (1983) eljárása szerint végeztük. Mintáinkat a kórszövettani és az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz standard eljárásokkal készítettük elı. 4

6 A baktériumok citotoxikus aktivitásának vizsgálata A baktérium lizátumok elıállítását és azok citotoxikus hatását HeLa sejttenyészeteken Tóth és mtsai (2003) közleménye szerint vizsgáltuk. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS A humán populációban az EPEC fertızések továbbra is vilgágmérető problémát jelentenek, s a fejlıdı országokban gyakran okozzák a fiatal gyermekek magas mortalitású megbetegedéseit. Éppen ezért az E. coli törzsek patotípusának a meghatározása továbbra is rendkívül fontos és szükséges feladat marad. Jelen disszertációban a líbia gyermekekbıl izolált 50 E. coli törzsbıl 9 EPEC és 9 EAEC törzset azonosítottunk, viszont ETEC, EIEC, VTEC/EHEC törzs nem fordult elı. Az EPEC törzsek zöme hasmenéses gyermekektıl származott és tipikusnak (eae +, EAF +, bfp + ) két törzs pedig atpikusnak (eae + ) bizonyult. A tipikus EPEC törzsek lokalizált adhéziós mintázattal (LA) tapadtak a HeLa sejtekhez, és jellegzetes EPEC szerocsoportokba, O55, O114 és O127, tartoztak. A tipikus EPEC törzseink α, β vagy γ típusú eae gént hordoztak, míg a két atipikus EPEC törzs γ- ill. ε típusú eae génnel rendelkezett. Az egyetlen nem-hasmenéses kontroltól származó atipikus EPEC törzs által hordozott eae gén nem-tipizálhatónak bizonyult. Négy atipikus EPEC törzs hordozta az efa1 gént is, ami az irodalom szerint (Klapproth et al., 2000) elısegítheti a törzsek in vitro adhézióját. Ezek az efa-pozitív törzsek rendelkeztek a pagc és sen génekkel is, jelezvén, hogy hordozzák az OI-122 patogenitási szigetet (Perna et al., 2001). Az LT18 jelzéső, O82:NM szerotípusú atipikus EPEC törzsünk hordozta paa gént, ami nyúl és sertés EPEC esetében igen gyakori és nagy valószínőséggel az A/E léziók kialakulásának korai stádiumában játszik szerepet (Batisson és mtsai, 2003; Malik és mtsai, 2006). Ezen O82:NM humán EPEC törzs a paa gén mellett rendelkezett lpfr 141 és pet génekkel is, bár a pet gén nem jellemzi az EPEC törzseket. Ezek alapján megállapíthattuk, hogy ez az atipikus EPEC törzs egyedülálló. A törzsbıl kierısített pet-specifikus PCR fragment bázis összetételét 5

7 meghatároztuk, amely szekvencia >99 %-ban megegyezett a referencia génnel (Gén Banki szám: AF056581). A kilenc EPEC törzs közül hét volt rezisztens legalább egy antibiotikummal szemben, és négy multirezisztens EPEC törzsben az 1 típusú integront mutattuk ki. Az EAEC törzseink jelentısebb genetikai heterogenitást mutattak. A kilenc aggr + törzsbıl hat EAEC törzs hasmenéses és három nem-hasmenéses gyerektıl származott. Négy hasmenéses eredető és három nem-hasmenéses eredető EAEC törzs rendelkezett a paa plazmid specifikus marker génnel, azaz a törzsek vélhetıen hordozták a nagymérető virulencia plazmidot. Csupán a hasmenéses eredető EAEC törzsek rendelkeztek az agga adhezin- vagy az east1 toxin génnel. Egy törzsben az AAF/I specifikus agga gént, két törzsben az AAF/III-specifikus agg-3a gént és egy törzsben a long poláris fimbria lpfa O113 génjét mutattuk ki. Két O126:H27 törzs rendelkezett a pic génnel és két, O3 ill. O104 törzs hordozta east1 toxin gént. A kilenc EAEC törzs közül nyolcban fordult elı a pesticin receptor specifikus fyua gén és a sziderofór yersiniabactint kódoló régió egyik jellegzetes génje, az irp. Érdekes módon öt törzsben a vizsgált adhezin gének egyike sem fordult elı. A hasmenéses gyermekektıl származó törzsek közül hat nem bizonyult sem EPEC, sem EAEC patotípusúnak, azonban mindegyik törzs enteroaggregatív módon tapadt a Hela sejtekhez. Közülük négy törzs O20:H34, O35:HUT, O75:HUT, O81:NM szerotípusúnak bizonyult. További négy hasméses eredető törzs is az enteroaggregatív törzsekre jellemzı adhéziós mintázat szerint tapadt a HeLa sejtekhez, annak ellenére, hogy nem rendelkeztek a vizsgált adhezin gének egyikével sem. Fontosnak tarjuk, hogy egy a nem-hasmenéses betegbıl izolált O75 törzs is specifikusan és enteroaggregatív módón kötıdött a HeLa sejtekhez, annak ellenére, hogy nem volt kimutatható egyetlen általunk vizsgált adhezin gén sem a törzsben. Két nem-hasmenéses eredető E. coli (O22:HUT és OUT:HUT) törzsben mutattuk ki a cdt gént. Ezek a CDT- termelı nem rendelkezetek további virulencia génekkel. Gyakran jellemezte a törzseket a antibiotikum-rezisztencia. A kilenc EAEC törzs közül öt volt rezisztens legalább két antibiotikummal szemben és a négy multirezisztens törzs közül a klinikai képtıl függetlenül kettıben az1 típusú integront mutattuk ki. A 32 nem-epec ill nem-eaec közül húsz volt rezisztens legalább egy antibiotikummal szemben, közülük 13 volt multirezisztens és kilenc rezistens törzsben mutattuk ki az1 típusú integront. 6

8 Összegezve a humán törzsekkel végzett vizsgálatainkat, jelen munkánk volt az elsı melynek során a hasmenéssel társult líbiai E. coli törzsek genotípusos jellemzését elvégezték. Eredményeink szerint a gyermekek hasmenését okozó E. coli törzsek leginkább EPEC és EAEC patotípusúak lehetnek. Továbbá, a vizsgálataink plazmid ill. kromószóma eredető virulencia gének vonatkozásában az EAEC törzsekre jellemzı heterogenitást megerısítették. Ezen kívül a hasmenéses eredető E. coli törzsek gyakori antibiotikum rezisztenciáját és szintén gyakori 1 típusú integron hordozását mutattuk ki. A hatvanhat nyúl eredető E. coli törzsbıl PCR-rel 43-ban mutattuk ki az eae gént. Ezek közül 36 törzs származott hasmenéses és 7 törzs nem-hasmenéses állattól. Az eae gén minden esetben β típusúnak bizonyult. A 43 nyúl eredető EPEC törzs, sertés eredető EPEC törzsekhez hasonlóan (Malik és mtsai, 2006), nem rendelkezett az EHEC/VTEC, ETEC, EAEC vagy a NTEC csoportokra jellemzı virulencia génekkel, vagyis nyulakban csupán EPEC típusú kórokozókat találtunk. A nyúl törzsek érdekessége volt, hogy a magyar nyúl farmon egy O55:H7 szerotípusú EPEC törzset izoláltunk, noha az ilyen szertípusú törzseket klasszikus humán EPEC-ként tartja számon az irodalom (McGraw és mtsai, 1999). Meglepı, hogy jelen vizsgálataink során egy O157:NM EPEC és három O157:H2 EPEC törzset azonosítottunk, ezek a törzsek egyetlen ismert fimbriális adhezinnel sem rendelkeztek. Korábban, spanyolországi házinyulakból származó E. coli törzseket (n=503) vizsgálva csupán egyetlen O157 szerocsoportú (nem- EPEC, nem-ehec) törzset azonosítottak. Az általunk azonosított O157 EPEC törzsek szorbit negatívak voltak. A törzsek biotípusát vizsgálva a hat O103:H2 törzs ramnóz-negatív volt, ami harmonizál mások eredményeivel: Franciaországban szintén egy ramnóz-negatív O103:H2:K klón terjedt el. Érdekes módon ezek az O103 afr2 + törzsek a cseh törzsek között voltak túlsúlyban. Ugyanakkor mind a négy O132:H2 szerotípusú törzs szorbit-pozitív és ramnóz- pozitív volt. A nyúl eredető EPEC törzsekben elsıként leírt fimbriát AF/R1-nak nevezték el, ami a legtöbb nyugat-európai országban ritkán jellemzi a törzseket. Jelen munkánkban az afr1 gén jelét írtuk le két egymással kapcsolatban nem lévı cseh O153 EPEC törzsben. Eredményeink szintén azt mutatják, hogy az AF/R1 fimbria Közép-Európában is ritka. Az AF/R2 fimbriára jellemzı szekvencia volt a domináns; összesen tíz, magyar és cseh eredető O103 szerocsoportú törzsben mutattuk ki az afr2 gént. A közelmúltban felfedezett másik nyúl eredető O15:NM 7

9 EPEC adhezinre jellemzı ralg gént mutattunk ki tizenöt törzsben. A ralg pozitív törzsek O145, O153, O49, O15 és O132 szerocsoportokba tartoztak. A ralg gén jelenlétét hat random módon választott ralg-pozitív törzsben kolónia hibridizációval is megerısítettük. A PCR pozitív törzsek specifikusan hibridizáltak a ralg-specifikus próbával, míg a három ralgnegatív törzs egyike sem kötötte a próbát. Vizsgálva a leggyakrabban elıforduló EPEC szerocsoportokat reprezentáló törzseknek az in vitro adhéziós képességét, azt tapasztaltuk, hogy azok függetlenül a fimbriák típusától diffúz módon tapadtak a HeLa sejtekhez. A törzsek tapadását valószínőleg a fimbriális adhezinek (AF/R1, AF/R2 és Ral) alakítotották ki. Érdekes, viszont, hogy a sertés eredető EPEC törzsek nem tapadtak a HeLa sejtekhez, de erısen kötıdtek a sertés vese (PK-15) sejtekhez (Malik és mtsai, 2006). Nyúl bélkacsban végzett in vivo adhéziós kísérletekben a reprezentatív nyúl eredető törzsek tapadását és a jellegzetes attaching és effacing léziók kialakulását tapasztaltuk. Számos eae + törzs nem rendelkezett további ismert adhezinnel. Az A/E léziók kialakulását két nyúl EPEC törzs esetében elektron mikroszkóppal is igazoltuk. Ezen törzsek egyike O153:H7 szerotípusú volt és nem rendelkezett ismert nyúl vagy humán fimbria génnel. Elképzelhetınek tartjuk, hogy az ilyen EPEC törzsek a jellegzetes fimbriák hiányában csupán a LEE specifikus termékek segítségével tapadnak a célsejtekhez. A megvizsgált 23 törzs közül egy O73 törzs in vitro adhezióját mutattuk ki, amely törzs nem rendelkeztt az eae génnel. 8

10 TÉZISEK 1. Elsıként végeztünk fenotípusos és genotípusos vizsgálatokat líbiai eredető törzsekkel, melyek hasmenéses és nem-hasmenéses gyermekektıl származtak. Vizsgálatainkkal EPEC és EAEC törzseket azonosítottunk, mely patotípusoskról korábban még nem számoltak be Líbiában. 2. Szignifikánsan több EPEC törzset azonosítottunk a hasmenéses gyermekek esetében, mint a nem hasmenéses kontrollok között. EAEC vonatkozásában viszont a két csoport között nem volt szignifikáns az eltérés, azonban egyetlen kontroll eredető EAEC törzs sem rendelkezett adhezin, vagy toxin génnel, de egy ilyen O75 törzs konzekvens módon aggregatív mintázattal tapadt a HeLa sejtekhez. 3. A legtöbb EPEC törzs klasszikus EPEC szerocsoportokba (O55, O114, O127) tartozott és tipikusnak (eae +, EAF +, bfp + ) bizonyult. Egy atipusos EPEC azonban citotoxin gént (pet) hordozott, ami az EAEC jellemzıje, viszont EPEC esetében szokatlan. Ellentétben az EPEC törzsekkel az EAEC törzsek nagyobb genetikai heterogenitást mutattak. Mind az EPEC mind az EAEC jellegzetes módon, lokalizált ill. aggregatív mintázatot adva tapadt a HeLa sejtekhez. Mindkét patotípusban számos érdekes virulencia gén és genetikai sziget kombinációt azonosítottunk. 4. Hasonló genotípusos és fenotípusos módszerekkel közép-európai hasmenéses és nemhasmenéses választási nyulakból származó E. coli törzs között mindkét csoportban csak EPEC patotípusú törzseket azonosítottunk. A hasmenéses eredető nyúl törzsek között az F4(K88)/CS31A-szerő és a plazmid által kódolt ralg fimbria gének dominanciáját tapasztaltuk. 5. Ezen EPEC törzsek közül számos (O153:H7 és O157:H2) törzs nem rendelkezett az AF/R1, AF/R2 vagy Ral fimbriával, de jól tapadt a HeLa sejtekhez és attaching és affacing léziót okozott nyulakban, ami azt mutatja, hogy az ilyen EPEC törzsek rendelkeznek eddig még nem azonosított adhezinekkel. 9

11 KÖZLEMÉNYEK Dow MA, Tóth, I, Alexa P, Davies M, Malik A, Oswald E, Nagy B Predominance of afr2 and ral fimbrial genes related to f4(k88)/cs31a in enteropatogenic Escherichia coli (EPEC) isolated from rabbits with post weaning diarrhoea in Central Europe. J Clin Microbiol. 43: (IF: 3,489) Dow MA, Tóth I, Malik A, Herpay M, Nógrády N, Ghenghesh KS, Nagy B Phenotypic and genetic characterization of enteropatogenic Escherichia coli (EPEC) and enteroaggregative E. coli (EAEC) from diarrhoeal and non-diarrhoeal children in Lybia. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 29: (IF: 1,015) Malik A, Tóth I, Beutin L, Schmidt H, Taminiau B, Dow MA, Morabito S, Oswald E, Mainil J, Nagy B Serotypes and intimin types of intestinal and faecal strains of eae + Escherichia coli from weaned pigs. Vet. Microbiol. 114: (IF: 1,93) Tóth I, Schmidt H, Dow MA, Malik A, Oswald E, Nagy B Transduction of porcine enteropathogenic Escherichia coli with a derivative of a Shiga toxin 2-encoding bacteriophage in a porcine ligated ileal loop system. Appl. Environ. Microbiol. 69: (IF: 3,82) KONGRESSZUSI ÖSSZEFOGLALÓK Dow MA, Tóth I, Fekete PZs, Alexa P, Nagy B. Characterization of enteropathogenic Eschrichia coli from rabbits. Abstract, Jubilany, Congr. Hung. Soc. Microbiol., Balatonfüred, October, 2001, p. 38 Dow MA, Herpay M, Ghenghesh KS, and Tóth I. Characterization of Escherichia coli isolated from diarrhoeal children in Libya. Congr. Hung. Soc. Microbiol., Balatonfüred, October, 2002 Dow MA, Tóth I, Fekete PZs, Alexa P, Davies M, Oswald E, Nagy B. Virulence characters of rabbit enteropathogenic Escherichia coli (REPEC) in Hungary and Czech Republic. 1 st FEMS Congress of European Microbiologist, Ljubljana, June, p. 267

12 Tóth I, Schmidt H, Dow MA, Malik A, Oswald E, Nagy B. In vivo transduction of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) with Shiga toxin 2-encoding bacteriophage. Abstracts of 14th Intern. Congr. Hung. Soc. Microbiol., Balatonfüred, 2003, lecture, B-33. Tóth I, Schmidt H, Dow MA, Oswald E, Nagy B. Transduction of Shiga toxin encoding phages of enterohaemorrhagic Escherichia coli under different conditions. 1 st FEMS Congress of European Microbiologist, Ljubljana, June, p.58 Tóth I, Schmidt H, Dow MA, Malik A, Oswald E, Nagy B. Transduction of enteropathogenic Escherichia coli with a derivative of a Shiga toxin 2-encoding bacteriophage in the porcine ligatedileal loop model. 5 th International Symposium on Shiga toxin (Verocytotoxin)- producing Escherichia coli Infection, Edinburgh, June, p. 159