A redox-homeosztázis vizsgálati lehetoségei, jelentosége humán és állatkísérletes tanulmányokban (Thesis)

Átírás

1 A redox-homeosztázis vizsgálati lehetoségei, jelentosége humán és állatkísérletes tanulmányokban (Thesis) Kocsis Ibolya Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, II. Belgyógyászati Klinika Budapest, 2004 Készült: Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Klinikai Orvostudományok, 2/1. Ph.D. programjában Tudományági Doktori Iskola vezetoje: Prof. Dr. Tulassay Zsolt Programvezeto: Prof. Dr. Fehér János Témavezeto: Dr. Blázovics Anna

2 Áttekintés A szabad gyökök, az élettani, biokémiai elektronátviteli reakciókban játszott szerepükbol adódóan, részt vesznek a sejtek közötti szignál transzdukcióban, enzimek aktiválásában, gátlásában, a sejtciklus szabályozásában, az apoptozis és nekrózis folyamataiban. Az utóbbi öt évben a vizsgálatok új irányvonala sejtszinten kutatja az oxidációs-redukciós folyamatokat, a sejtek közötti jelátviteli mechanizmusra kifejtett, olykor szelektív hatást. Az 1990-es évek végére a Sellye-i "stressz, mint alapfogalom, a reaktív oxigén intermedierek szerepének további megismerésével nyert bizonyítékok révén, az oxidatív stressz fogalmává bovült, s szinte új értelmet nyert az élettani folyamatok magyarázatában, a betegségek kialakulásának, etiológiájának pontosabb megértésében A szervezet antioxidáns kapacitását erosítendo természetes növényi eredetu antioxidáns vegyületeket vizsgáltunk állatkísérletes körülmények között, mesterséges dislipidémia állapotát eloidézve. Célunk volt az oxidatív stressz következtében, a szervezetben meglévo, az egészséges redox-homeosztázist biztosító egyensúly megbomlásának vizsgálata, gyulladásos bélbetegségekben, alkoholos és nem-alkoholos eredetu steatohepatitis, valamint diabétesz betegségekben szenvedok állapotváltozásának monitorozása oxidációs paraméterekkel, valamint az eredmények összehasonlítása a hagyományos antioxidáns tulajdonságú metabolit paraméterek (albumin, húgysav) információtartalmával. A zsírdús diétát 10 napon át fogyasztó állatok májszövetében kialakuló steatózis mértékét befolyásoló hatásuk alapján értékeltük a Cichorium intybus (L.)(mezei katáng), és a Raphanus stivus (L.) var niger (fekete retek) növényekbol készült kivonatok, valamint a kereskedelmi forgalomban is kapható Beiqishen teakészítményt. A lipidanyagcsere változását a jellemzo metabolit-paraméterek spektrofotometriás meghatározásával vizsgáltuk. A redox homeosztázis jellemezésére a totál antioxidáns státusz, az össz-scavenger kapacitás, a szabad SH-csoportok, redukálóképesség meghatározásával nyert eredményeket használtuk fel. Továbbá mikroelem koncentráció-vizsgálatokat is végeztünk plazmaemissziós spektrometria alkalmazásával (ICP-OES) a tapasztalt hatás minél komplexebb megismerésének céljából. A májszövetet érinto elváltozásokat hisztokémiai és mikroszkópos vizsgálatok segítségével figyeltük meg. Az állatkísérletekben igazolható volt a fekete retek préslé komponenseinek a májszövetre kifejtett védo hatása, mely csökkentette a zsírdús diéta káros hatását. 2

3 A cikórium extraktum komponensei mérsékelten módosították a szérum lipidparamétereket. A cikórium kiegészítést kapott hyperlipidaemiás állatok szérummintáiban a mért enzimaktivitások nem csökkentek, valamint a szövettani vizsgálat is a zsírakkumuláció csak igen kismértéku csökkenését mutatta a májsejtekben. A növényi kivonattal kezelt állatok májhomogenizátum mintáiban tapasztalt elem-akkumuláció, - a fémeknek a szabadgyökök keletkezésével járó oxidatív folyamatokban bizonyított katalitikus szerepébol kiindulva - kiindulóponja lehet a máj redox homeosztázisában tapasztalt kedvezotlen változásoknak. A Beiqishen tea alkalmazása során tapasztalt eredményeink megkérdojelezték a készítménnyel kapcsolatban az irodalmi adatok által elozetesen ismertetett gyógyhatást. A teával kezelt állatok májszövetének megromlott oxidatív státusza hátterében a toxikus fémionok, szabadgyökök képzodését indukáló szerepét feltételezzük. A vizsgált hagyományos antioxidáns paraméterek és az össz-antioxidáns státusz valamint az össz-scavenger kapacitás jellemzésére kifejlesztett méromódszerek eredményei megfeleloen alátámasztották, illetve kiegészítették egymás diagnosztikai információtartalmát. Gyulladásos bélbetegségekben szenvedo betegek redox homeosztázisának változását vizsgálva sikerült kimutatni a colitis ulcerosa és a Crohn-betegségek közötti különbséget a betegségekben zajló gyulladásos folyamatok eltéro jellegének megfeleloen. A szabad SH-csoportok vizsgálata segítségével szignifikáns különbséget detektáltunk a nemek között, nem-alkoholos eredetu krónikus májkárosodásban. Az össz-scavenger kapacitás vizsgálati módszer révén szintén szignifikáns különbséget találtunk az alkoholos és a nem-alkoholos eredetu krónikus májkárosodásban szenvedo betegek antioxidáns státuszában. Kutatómunkánkat a Nemzeti Kutatási és Fejlesztési Program 1/016/2001 Széchenyi Program: "Komplex prevenciós kutatások a hazai egészségi állapot javítására" címu projekt keretében és támogatásával végeztük. 3

4 1. BEVEZETÉS A humán szervezetet érinto betegségek patomechanizmusáról szóló elméletek alapvetoen módosultak az oxidatív sejtkárosító biokémiai folyamatok pontosabb megismerése révén, foként az alkoholos és a nem-alkoholos eredetu krónikus májkárosodással, az atherosclerosis kialakulásával, a cardiovasculáris megbetegedésekkel, a gastrointestinális betegségekkel, elsosorban a gyulladásos reakciók talaján kifejlodo funciókárosodásokkal, valamint a máj és epeutak megbetegedéseivel kapcsolatban. Diabetesben, és annak késoi szövodményeiben humán vizsgálatok eredményei bizonyítják a redox homeosztázis megbomló egyensúlyát, a szövetek (pl. érendothel) antioxidáns kapacitásának, a szervezet össz-antioxidáns státuszának legyengülését. A szervezet megfelelo redox-homeosztázisa, az egészséges szöveti anyagcsere és muködés szempontjából alapveto feltétel, melyben az antioxidáns védekezo mechanizmus és a katalitikus szerepet betölto fémionok egyaránt fontos szerepet játszanak A szervezetben az esszenciális átmenetifémionok koncentrációja szigorúan, míg a toxikus nehézfémionok metabolizmusa gyengén szabályozott, és kiürülésük is lassú. A nehézfémek akkumulációja nagy koncentrációban gátolja az enzimaktivitásokat, befolyásolja az akut-fázis proteinek szintézisét. A d-mezo elemei egyfelol oxidatív stressz kiváltói (elosegítve a lipiperoxidáció egyes lépéseit), másfelol a szervezet antioxidáns védelmét biztosító enzimek alkotó elemei. A szabadgyök-károsodásokkal és az antioxidáns hatású vegyületek biokémiájával kapcsolatos kutatások eredményei igazolták, hogy az étrendi antioxidánsoknak alapveto jelentosége van számos megbetegedés prevenciójában, ill. regressziójábanaz antioxidáns vegyületek, valamint a fémionok szempontjából kontrollálatlanul alkalmazott kivonatokkal azonban jelentosen megromolhat a szervezet redox-homeosztázisa, amely ilyen körülmények között már nem tudja szabályozása alatt tartani a szabad gyökök képzodésével járó biokémiai folyamatokat. A szabad gyökök, mivel önmagukban igen rövid élettartamúak csak a nagyon érzékeny, speciális technika, az Elektron Spin Rezonancia (ESR) eljárás segítségével lehet keletkezésüket, jelenlétüket in vivo detektálni Az utóbbi évtizedben olyan egyszerubben kivitelezheto kolorimetriás, és immunreakción alapuló módszereket fejlesztettek ki, melyek során az adott paraméter (antioxidáns kapacitás, enzimaktivitás) meghatározása akár automatizálható, spektrofotometriás detektálás révén valósulhat meg. Így, viszonylag nagy számú vizsgálati minta (szérum, plazma, hemolizátum) egyideju, gyors és pontos analízise vált lehetové. Megteremtodtek a feltételek a kutatási célokat szolgáló vizsgálatok egyszerubb 4

5 kivitelezhetoségén túl, akár a hazai lakosság egészségi állapotát felmérendo, szuro jellegu vizsgálatok kivitelezésének. A klinikai gyakorlat szempontjából az antioxidáns státusz vizsgálatára a protondonor vegyületek (C-vitamin, E-vitamin) koncentrációinak meghatározása, vagy az elektron-átviteli reakciókat katalizáló enzimek (szuperoxid dizmutáz, glutation reduktáz) aktivitásának mérése a szervezet általános redox-egyensúlyának megítélésében nyújthat segítséget. Antioxidáns státusz vizsgálati lehetoségei Spektrofotometriás és enzimatikus-kolorimetriás eljárások Szuperoxid dizmutáz (SOD): Intracellulárisan a citoplazmában Cu/ZnSOD és a mitokondriális MnSOD egyaránt megtalálható antioxidáns enzim. Az enzim aktivitásának meghatározása vörösvértestek lizátumából lehetséges. Glutation peroxidáz (celluláris GPX): Szelénium dependens enzim, amely 70%-ban a citoplasmában, 30%-ban a mitokondriumokban fordul elo. Szerepet játszik a szerves peroxidok és a H 2 O 2 eliminálásában. Az analitikai eljárás során a vizsgálati minta legtöbbször vörösvértest lizátum. Glutation reduktáz (GR): Alacsony enzimaktivitási szint esetén nem történik meg a szervezetben az oxidált glutation - mint az egyik legfontosabb antioxidáns- regenerációja funkcióképes redukált formává, vagyis megno a szervezetben az oxidatív stressz kialakulásának esélye Glutation (GSH) : A legnagyobb arányban a vörösvértestek tartalmazzák. Legfontosabb funkciója a redox-folyamatok egyensúlyának biztosításában az aszkorbinsav oxidált formájának (dehidroaszkorbinsav) visszaalakítása újra funkcióképes formává.az aminosav transzportban koenzim funkciót lát el, xenobiotikumok, karcinogén vegyületek eliminálásában vesz részt. Szöveti koncentrációjának csökkenése gyulladásos bélbetegségek esetén detektálható, jelzi a szöveti antioxidáns kapacitás kimerülését, Redukált/Oxidált glutation arány meghatározása (GSH/GSSG): A glutation (GSH) a sejtekben millimoláris, a plazmában mikromoláris nagyságrendu koncentrációban található. Oxidációja során diszulfid vegyületté alakul, így e két vegyület arányának meghatározásával módunkban áll a szövetek oxidatív státuszának meghatározása, például májbetegségekben Össz-antioxidáns kapacitás meghatározás (TAS) Információtartalmát tekintve, például daganatos betegségekben, segít a betegek antioxidáns tartalékainak megítélésében, lehetové teszi az alkalmazott terápia hatékonyságának nyomon 5

6 követését, kívánt ideig történo monitorozását. Különösen fontos lehet a beteg állapotának szoros követése, amikor az alkalmazott kemoterápiát olyan antioxidánsokkal egészítik ki, melyek egyrészt a terápia hatásosságát fokozzák, másrészt a kemoterápia mellékhatásainak csökkentésében, kivédésében játszanak szerepet. Fluoreszcens és lumineszcens detektáláson alapuló méromódszerek Az össz-scavenger kapacitás (TSC) luminometriás módszer segítségével történo vizsgálata nagymértéku érzékenységébol adódóan kedvezobb lehetoséget biztosíthat a szélesköru, általános egészségi állapot felmérését célzó, szuro jellegu vizsgálatok elvégzéséhez. A plazma össz-scavenger kapacitás a szervezet általános állapotáról valóban átfogó képet ad, figyelembe kell azonban vennünk, hogy a plazmában jóval több zavaró ágens befolyásolhatja a kemilumineszcenciás fényintenzitás detektálását, míg az erythrocyta összscavenger kapacitás érték, akár magas plazma-bilirubin szint mellett is alkalmazható. Az oxidatív károsodás vizsgálati paraméterei Lipidperoxidok, lipid-hidroperoxidok Lépésrol lépésre sikerült bizonyítani, hogy a tiobarbitursav reaktivitás, mint metodika, mennyire nem specifikusan csak a lipidperoxidációban keletkezo termékeket jelzi.a legutóbbi években is olvashatunk azokról a törekvésekrol, amelyek a különféle zavaró hatások kiküszöbölési lehetoségeit vizsgálják, növelendo a módszer specificitását. Izoprosztánok: 8-epi-Prostaglandin F 2a Crohn-betegségben szenvedok esetén végzett vizsgálati eredmények szignifikánsan magasabb isoprosztán F 2a koncentrációkról számolnak be az egészséges kontrollcsoporthoz hasonlítva, valamint pozitív korrelációt sikerült a szerzoknek kimutatni a plazma C-reaktív protein koncentrációkkal, ami rámutat a lipidperoxidáció és a gyulladásos folyamatok közötti kapcsolatra is DNS károsodás során keletkezo termékek A 8-OH-2 -dezoxiguanozin, a DNS oxidatív károsodásának egyik legfontosabb lebomlási terméke, amely vegyület, egészséges körülmények között is detektálható a sejtszintu repair mechanizmusok muködésének köszönhetoen. A vegyület analitikai vizsgálati lehetoségeinek fejlodése, lehetoséget teremtett olyan élettani kutatási eredmények és tapasztalatok megszerzésére, melyek szerint, a vizeletben nagy koncentrációban megjeleno 8- OH-2 -dezoxiguanozin, a szervezet sejtjeiben, szöveteiben zajló promutagén oxidatív folyamatok fokozott mértékét és kockázatát jelezheti. 6

7 Protein karbonil csoportok kimutatása és patofiziológai jelentosége Ezek a vegyületek elsosorban az aminosav oldalláncok (prolin, arginin, lysin) direkt oxidációja eredményeként keletkezo karbonil csoportot hordoznak. Kémiailag igen stabilak, ami elonyös tulajdonság egyrészt detektálásuk szempontjából, másrészt megkönnyíti a vizsgálati minták (plazma, szöveti homogenizátumok) tárolhatóságát is, mivel akár hosszas tárolás során sem bomlanak le. Kutatási eredmények a fehérjék oxidációs termékeinek, a protein-karbonilok emelkedett koncentrációjáról számolnak be olyan humán megbetegedésekben (akut respiratórikus elégtelenség, gyulladásos bélbetegségek, rheumatoid arthritis, diabetes, krónikus veseelégtelenség), melyek patomechanizmusában az oxidatív folyamatok szerepe jól ismert. A szabadgyök-antioxidáns egyensúly mérheto paramétereinek klinikai jelentosége A redox-homeosztázist jellemzo különféle paraméterek (antioxidáns vegyületek, oxidációs reakciókban keletkezo termékek, metabolitok) értékei a beteg szervezet általános állapotjelzoiként, a terápiás eljárások során alkalmazott gyógyszerek, (citosztatikumok) antioxidánsok (vitaminok, természetes eredetu, megfeleloen standardizált hatóanyagok) hatását, azaz az alkalmazott terápia sikerességét igazolhatják. Az orvostudomány szinte valamennyi szakterületén az immunológia, pulmonológia, neurológia, hepatológia, kardiológia, gastroenterológia, rheumatológia területén fellelheto tudományos szakirodalom számos olyan kutatási eredményrol számol be, amely a különbözo betegségek terápiájában a sebészi, vagy gyógyszeres eljárások kiegészítéseként antioxidáns tulajdonságú vegyületeket, hatóanyagokat alkalmaz, sikeresen. Az antioxidáns státusz változásának követése további segítséget nyújthat a különféle ischaemia-reperfúziós szövetkárosodások (májmutétek, transzplantáció, myocardiális infarctus terápiája, shock) minimalizálására való törekvésben is. A kutatók rendelkezésére álló egyre érzékenyebb és pontosabb analitikai módszerek megteremtették a lehetoségét az évezredes népgyógyászati tapasztalatok hátterében álló biokémiai folyamatok megfelelo tisztázásának, a különféle növényi eredetu hatóanyagokkal kapcsolatban korábban csak tapasztalati úton megismert, az emberi szervezetben kifejtett elonyös, betegség esetén, akár terápiás hatás igazolásának. Állatkísérletes tanulmányainkban az alábbi gyógynövények kivonatait vizsgáltuk: Raphanus sativus L. var.niger A népi gyógyászatban a hasi puffadás, teltségérzés, elégtelen emésztés kezelésére és megelozésére, valamint az epeko kialakulásának megelozésére, epetermelés fokozására használják A fekete retek préslé in vitro vizsgálata során megnyilvánuló össz-scavenger kapacitást növelo hatásában, jelentos flavonoid tartalma is szerepet játszhat. Az utóbbi 7

8 évtizedek kutatási eredményei számolnak be a flavonoidok LDL-oxidációt, valamint thrombocita aggregációt gátló hatásáról. Cichorium intybus (L.) A cikórium vagy katángkóró (Cichorium intybus L.) már a 17. században is hasznos gyógynövény volt májbetegségek és epepanaszok, illetve húgyúti fertozések kezelésére. A Cichorium endivia pörkölt gyökere pedig pótkávéként ismert, mivel a gyökér inulin (polifruktóz) tartalma a pörkölés során karamellizálódik, és ez eredményezi a jellegzetes aromás kávéízt. Gazzani és munkatársai a Cichorium intybus var. Silvestre antioxidáns és prooxidáns tulajdonságú komponenseit vizsgálta in vitro és ex vivo.vizsgálataik során az egyes frakciók antioxidáns tulajdonsággal rendelkezo vegyületei mind kémiai mind biológiai rendszerekben kifejtették hatásukat. A Beiqishen tea A Beiqishen tea gyártó által deklarált komponensei az Astragalus mongolicus, a Lycium barbarum, a Ganoderna lucidum és a Camellia sinensis. Az Astragalus mongholicus, Kína északi részén oshonos, a hagyományos kinai orvoslásban évszázadok óta jól ismert gyógynövény, a Kínai Gyógyszerkönyvben is hivatalosan jegyzett, drogja tonizáló, diurézist fokozó és daganatképzodést gátló hatással rendelkezik. A modern kínai orvoslásban terápiás célokra, mint immunstimuláns használatos. Az elsosorban szaponinokat (asztragallosidae I-II-III és fitoszterolokat (kampeszterol, sztigmaszterol, szitoszterol) tartalmazó növényi készítmény. Az antibiotikus és antioxidáns (szuperoxid-savenger) hatásért a növény által tartalmazott izoflavon vegyületek (kalikozin) a felelosek. A Lycium barbarum (kínai farkasbogyó), a Solanaceae (burgonyafélék) családba tartozó ritka növény, melyet Kínában mind gyógy-, mind élelmi növényként is alkalmaznak. A gyógyhatású drogot a növény termése adja, melyet már i.e idején is ismertek. A kellemes ízu, piros színu bogyótermés hatóanyagai közé tartoznak a ß-karotin, C-vitamin, a poliszacharidok, valamint 21-féle nyomelem is. Hatóanyagainak kémiai jellegét, hatását, alkalmazhatóságát napjainkban is kutatják. Utóbbiak közül kiemelkedik vérnyomás és vércukorcsökkento hatása. A Ganoderma lucidum (pecsétviaszgomba) (Basidiomycetes) gombát a kínai népgyógyászatban 4000 éve ismerik és alkalmazzák. A gomba mycéliumából és spórájából eloállított készítmények legjelentosebb hatóanyagai közé a poliszacharidok és a triterpének - mint hidrofób, ciklikus hidrokarbonok- tartoznak. Korábbi kutatások, a gomba poliszacharid vegyületeinek in vivo és in vitro immunmoduláns hatását igazolták. 8

9 2. CÉLKITUZÉSEK Kutatásaimat az NKFP 1/016 Széchenyi Project támogatásával végeztem, melynek címe: Komplex prevenciós kutatások a hazai egészségi állapot javítására. A projecten belül munkacsoportunk in vitro és in vivo állatkísérleteket és humán vizsgálatokat végzett a különbözo szövetek redox-homeosztázisának meghatározására abból a célból, hogy a klinikum számára új módszereket fejlesszünk ki, ill. vizsgálati protokollt állítsunk fel a hazai lakosság redox-homeosztázisának meghatározására, értékelésére. E kutatáson belül az volt a célom, hogy a népgyógyászatban évszázadok óta ismert, ill. számos tudományos közleményben is javasolt természetes eredetu, máj-és epebetegségekben alkalmazható növény kivonatát vizsgáljam állatkísérletben a szöveti redox-homeosztázis változására. A fekete retek préslével végzett kísérleteim szervesen kapcsolódtak a kutatócsoport korábbi tudományos vizsgálataihoz, a cikóriummal történo vizsgálatok pedig módszertanában is továbblépést jelentettek a kutatásban. A két növényi eredetu extraktum részleges fitokémiai és elemanalízisének ismeretében antioxidáns hatásukon kívül lipidszintcsökkento hatásuk is várható volt. A cikórium esetében az inulin élettani hatásával kapcsolatban ellentmondó megállapítások láttak napvilágot. Ennek tisztázására történo vizsgálatok azonban egy új iránt nyitottak meg, így szükségessé vált a fémionok meghatározása a májszövetben. A két különbözo növényi kivonat azonos és eltéro hatását kívántam vizsgálni a máj, a pankreász és a plazma paramétereire. Hisztológia vizsgálatokkal kívántam megerosíteni a májszövet szerkezeti változását antioxidáns kezelés hatására kísérletes hyperlipidaemiában. A Beiqishen tea vizsgálatával az volt a célom, hogy egy forgalomban lévo gyógyhatásúnak minosített teakészítmény komplex hatását figyeljem meg, patkányok általános anyagcsereállapotában, valamint a májmuködésben bekövetkezo változások megfigyelésén keresztül, mivel elozo kutatásainkból ismertté vált számos olyan adat, amely megkérdojelezte a tea szerteágazó gyógyhatását. E vizsgálatokat a primer prevenció szempontjából tartottam fontosnak. Humán tanulmányaimban különbözo betegségekben, mint steatohepatitis, gyulladásos bélbetegség és diabetes mellitus, az állatkísérletekben igazoltan jól muködo, újonnan fejlesztett metodikákat alkalmazva kívántam a klinikum számára hozzáférhetové tenni a redox-homeosztázis fogalmát és - mint diagnosztikus értéku paraméter - alkalmazhatóságát. Egészséges- és betegcsoportban határoztam meg a rutin laboratóriumi metabolit- és enzimparamétereket, majd összevetettem a redox-homeosztázis megítélésére alkalmazott metodikai eljárások eredményeivel. Az így kapott korrelációk segítségével megítélheto, hogy 9

10 a gyakorlatban hogyan lehet az oxidatív státusz monitorozásán keresztül nyomon követni egyes beavatkozások terápiás hatásának fokozatos kifejlodését. A vizsgálati eljárások segítségével igazolható egyes vegyületek, hatóanyagok antioxidáns tulajdonsága, mely révén e hatóanyagok részét képezhetik az oxidatív stressz talaján kifejlodött betegségek terápiájának, segíthetik a szervezet redox-homeosztázisának, egyensúlyának visszaállítását. 3. MÓDSZEREK, ANYAGOK Kémiai analitikai módszerek Szabadgyök-reakciók vizsgálatára alkalmazott módszerek? Össz-scavenger kapacitás vizsgálata luminometriával A mérés során a luminol, szabad gyökök hatására gerjesztodik és fényt bocsát ki, melyet a luminométerben lehet detektálni. A fényintenzitás gyökfogó vegyületek hatására csökkentheto. Az eredményeket relative light unit (RLU) egységben adtuk meg.? Redukálóképesség meghatározása A redukáló-képességet Oyaizu (1986) szerint 700 nm-en határoztuk meg (159). A Fe 2+ -Fe 3+ átalakulást mértük és aszkorbinsav ekvivalensben adtuk meg az értéket.? H-donor-aktivitás meghatározása A H-donor aktivitást Blois (1958) módszerének kis módosítása (Lugasi és mtsai 1998) alapján 1,1-difenil-pikrilhidrazil stabil gyök jelenlétében mértük 517 nm-en spektrofotometriásan. Az eredményt gátlás %-ban adtuk meg.? Totál antioxidáns státusz A meghatározásokat a Randox által forgalmazott és automatizált analitikai eljárás céljára kifejlesztett TAS diagnosztikai készlettel végeztük.? Diénkonjugátum meghatározás A megfeleloen elkészített, szövetnedves májhomogenizátumot ötszörös mennyiségu izo-oktánnal 2 percig intenzíven extraháltuk Vortex készülékkel, majd szobahomérsékleten 12 órán keresztül levegotol elzárva, sötét helyen tároltuk. A minta izo-oktános fázisát fotometráltuk 232 nm-en.? Szabad szulfhidril-csoportok A szabad SH-csoportok mennyiségének meghatározása Ellman és Lysko módszere alapján történt, Ellman (5,5-ditiobisz-nitrobenzoesav, SERVA) reagenssel ph 7,4 Na-foszfát pufferben 512 nm-en. (50 Ellman, 1967.) 10

11 A szükséges anyagokat, vegyületeket (1,1-diphenil-picrilhidrazil-dithiobisnitrobenzoesav, luminol, mikroperoxidáz) a SIGMA (St.Luis, USA) cégtol, a haemisol reagenst a HUMAN oltóanyaggyártótól (Gödöllo), minden egyéb reagenst a REANAL (Budapest) gyártó és forgalmazó cégtol vásároltuk. Anyagcsereállapotváltozást jelzo metabolitok és enzimek Az enzim és metabolit meghatározások Hitachi 717 automata kémiai analizátor segítségével történtek, spektrofotometriás méromódszerek alkalmazásával. Egyéb meghatározások Biológiai minták fehérjetartalma A fehérjetartalmat Lowry módszerével határoztuk meg fotometriás módszerrel 650 nm-en. Vörösvértest hemolizátum hemoglobin tartalma A vörösvértest hemolizátumok hemoglobintartalmát ciánhemoglobin formában Hemisol standard és hemisol reagens segítségével határoztuk meg, mindketto a Human Oltóanyagtermelo és Gyógyszergyártó Rt. (Gödöllo) gyártmánya. Fitokémiai analízisek Összpolifenol-meghatározás Az összpolifenol-tartalom a VII. Magyar Gyógyszerkönyv (Ph. Hg.VII.) eloírása szerint került meghatározásra, az eredményt pirogallolként fejeztük ki. Flavonoidtartalom A flavonoidtartalom a Német Gyógyszerkönyvben (DAB 10) leírt módszer alapján került meghatározásra, savas hidrolízist követo spektrofotometria segítségével 420 nm-es hullámhossz alkalmazása mellett. Kávésavmeghatározás A növényi kivonatban mérheto kávésav származékok koncentrációját spektrofotometriás eljárással 325 nm-es hullámhossz alkalmazása mellett végeztük. HPLC -vizsgálat A kivonat minoségi összetételét HPLC (ABL & JASCO) segítségével analizáltuk, PU- 980 grádiens pumpa, valamint Rheodyne 7725 (20 µl) injektor alkalmazása mellett. Hypersil ODS (5µm) reverz fázisú C-18 oszlopot használtunk, amely egy azonos anyagú elooszloppal volt védve. A HPLC kromatográfia jellemzo paraméterei: a mozgó fázist acetonitril (A oldat), és 2%-os ecetsav vizes oldata (B oldat) alkották, áramlási sebesség: 1 ml/perc, a detektálás 11

12 325 nm-es hullámhosszon történt, a beinjektált mennyiség 20? l, a homérséklet 25 o C. A kromatográfiás csúcsok autentikus standardok mellett kerültek kiértékelésre, a retentiós idoknek és az UV abszorbanciáknak megfeleloen Mikroelemtartalom meghatározása A meghatározások során induktív gerjesztésu plazma optikai-emissziós spektrometria módszerét alkalmaztuk. (Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP- OES)). A növényi kivonatok és májhomogenizátum minták elemtartalmának meghatározását, az Atom Scan 25 spektrométer (Thermo Jarrell Ash Co.) muszerrel végeztük. A készülékben 2kW teljesítményu rádiófrekvenciás generátor (27,12 MHz) által indukált o K-os argonplazma gerjesztodik. Optikai rendszerében Czerny-Turner vákummonokromátor és két fotoelektron sokszorozó (R 427 és R 889) található. A mérési tartomány 160 nm-tol 850 nmig terjed. A készülék standardizálásához Merck atopmabszorciós és ICP standardokból készült oldatokat használtunk. A mintákból mg-ot mértünk be teflonbombába, majd 5 ml 65 %-os salétromsav és 2 ml hidrogénperoxid elegyében roncsoltuk. A roncsolás eredményeként kapott terméket 25 ml-re hígítottuk ionmentes vízzel. Minden mintából három párhuzamos bemérés történt. Növényi extraktumok készítése Fekete retek préslé A préslé gyártása és standardizálása a Semmelweis Egyetem Gyógyszerésztudományi Kar Farmakognóziai Tanszékének felügyeletével történt. A feldolgozás során az elozetesen huvös helyen tárolt, megtisztított gumókat, megfelelo aprítás után a rostos gyümölcslevek készítéséhez használatos gyártósoron préselték, majd szurték. A préslevet további felhasználásig fagyasztószekrényben tárolták. Cikórium kivonat Hazánkban, a vadon növo Cichorium intybus (L.) (Asteraceae) Budapest környékén, virágzáskor gyujtött herbájából, aprítás után készült 40%-os alkoholos oldata került koncentrálásra, majd liofilezésre. A liofilizátum 2g/testsúly kg-nak megfeleloen számított mennyiségét desztillált vízben feloldottuk, majd az oldott kivonatot az állatoknak a normál, illetve a zsírdús diéta kiegészítéseként naponta egyszer, azonos idoben adagoltuk, szondán keresztül. 12

13 Beiqishen tea A Beiqishen tea kereskedelmi forgalomból származik (Daxing anling Beiqishen Healthy Food Co, Ltd., Permission number No. 022; 1998) Forgalmazó: Egészséges Élet Kft. Engedélyek: OÉTI 50060/ ; KERMI 99/ A teából forrázatot készítettünk, melyet az állatok kezeléséhez alkalmaztunk Állatkísérletek Állatkísérleteinkben hím Wistar és Fisher patkányokon végeztünk vizsgálatokat. Az alkalmazott diétás állatcsoportok Alkalmanként 20 állat alkotta a normál diétás, és 20 állat a zsírdús diétás csoportot. Az állatok testsúlya g között változott. Az elso csoportba tartozó állatok mindegyikének normál tápot (CRLT-N, Biopharm Prompt Kft.) adagoltunk, mely összetételét tekintve 36% szárazanyag-tartalommal rendelkezett, ezen belül 19% fehérje, 4,5% zsír, valamint 40% egyéb vitamin és ásványianyag-tartalommal. A második fo állatcsoport zsírdús diétát kapott, az alábbi összetételben: 20% napraforgó olaj, 2% koleszterin, 0,5% kólsav elegyével kiegészített normál táp. Kezelések Kezelés fekete retek préslével A fekete retek préslé vizsgálatakor a két fo diétás állatcsoportot alkotó állat közül random elkülönített állat esetében alkalmaztuk a növényi kivonatot a kétféle (normál és zsírdús) diéta kiegészítéseként Az állatok a préslevet ad libitum fogyasztották ivóvíz helyett, 150 ml/testsúly kg mennyiségben, 10 napig. Az állatok testtömegét naponta mértük és rögzítettük. Kezelés cikórium kivonattal A kísérletekhez g testtömegu hím Wistar patkányokat használtunk. Négy csoportot képeztünk, csoportonként állatot kezeltünk. Mind a normolipidaemiás, mind a hyperlipidaemiás állatok standardizált liofilizált cikórium extraktumot is kaptak. (normáltáp: CRLT-N, BIOPHARM PROMPT Kft, Budapest) A hyperlipidaemiás csoport zsírdús tápot kapott. (20 % napraforgó olaj, 2 % koleszterin, 0,5 % kólsav lett a tápba keverve) A cikórium fozetet tartalmazó oldatot (4 g/100 ml desztillált vízben oldva), szondán keresztül adagoltuk az állatoknak, 2 g/testsúly kg dózisban, 10 napig. Az állatok testtömegét naponta mértük és rögzítettük. Kezelés Beiqishen tea készítménnyel A kísérlet során g-os hím Wistar patkányokat ad libitum kezeltünk 14 napig, napi 2 g teadrog/ttkg-nak megfelelo 30 perces forrázattal. 13

14 Szervek elokészítése vizsgálatokra Az állatokat narkózisban a vena cava kanülálásával elvéreztettük és szerveiket a vizsgálatokhoz elokészítettük. A vért a további vizsgálatokhoz vákuumcsövekben felfogtuk. Szérum, plazma és vörösvértest hemolizátum készítése A biokémiai paraméterek meghatározásához a nem alvadásgátolt vérbol nyert szérumot használtuk. A kemilumineszcenciás mérésekhez heparinnal alvadásgátolt vérbol nyert plasmát alkalmaztunk. Mind a szérum, mind a plasma esetében a vér alakos elemeit 2800 RPM-en, 10 percig történo centrifugálással távolítottuk el. Centrifugálás után a sejtmentes felülúszót elkülönítettük, a kémiai anlízisek kivitelezéséig 25 o C-on tároltuk. Az alvadásgátolt vérminta esetében a maradék vörösvértest masszát a fehérvérsejtek és thrombocyták eltávolítása érdekében három alkalommal mostuk hutött, izotóniás sóoldattal. Az egyes mosások után, 10 percig tartó, 2800 RPM-en történo centrifugálást végeztünk. Az így kapott tiszta masszát hemoglobinra nézve (1g%-ra) azonos koncentrációjúra állítottuk be. Máj-és pankreász-homogenizátumok készítése A szövetek homogenizálását Potter-Elvehjem készülékkel jeges hutés mellett végeztük. A májhomogenizátumok fehérjetartalmát 10 mg/ml-re állítottuk be, 0,15 M KCloldattal, Lowry szerint (127). A pankreász-homogenizátumból 10 percig történo 3000 RPM melletti centrifugálás után a tiszta felülúszó oldat fehérjetartalmát 5 mg/ml-re állítottuk be, 0,15 M KCl oldattal. Az enzimmeghatározásokat ebbol a tiszta oldatból végeztük. Morfológiai vizsgálatok A fagyasztott májszövetmintákból készült 5 µm-es metszetek direkt festése O-red olajjal történt. A 4%-os formalinban fixált májszövetmintákból paraffinba ágyazás segítségével, 5 µm vastagságú metszetek készültek, melyek hematoxilin-eozinnal történo megfestés után kerültek mikroszkópos kiértékelésre. 14

15 Az oxidatív stressz vizsgálata néhány betegségben (humán tanulmányok) Gyulladásos bélbetegségben (IBD)szenvedo betegek A vizsgálatban részvevok közül 16 egészséges kaukázusi egyén alkotta a kontroll csoportot (átlagéletkor: 35,8 ± 7,5 év). A gyulladásos bélbetegségben (Inflammatory bowel diseases, IBD) szenvedo betegeket a betegség típusa szerint két csoportra osztottuk, 30 beteg Crohn-betegségben (átlagéletkor: 37,6 ± 10,0 év), 11 beteg pedig colitis ulcerosa betegségben szenvedett (átlagéletkor: 37,5 ± 7,1 év). Nem-alkoholos steatohepatitisben (NASH) szenvedok A vizsgálatba 28, nem alkoholos statosisban szenvedo beteg került bevonásra, a nemek megoszlása: 12 férfi, (átl.életkor: 43,8 ± 11,1 év), 16 no, (átl.életkor: 53,9 ± 8,4 év), átlagtestsúly: 80 kg ± 12,93, átlag BMI: 28,04 kg/m 2 ± 3,02. Laboratóriumi vizsgálatokkal az egyéb krónikus májbetegséget okozó faktorok kizárásra kerültek, valamint az anamnézis során az alkoholfogyasztást, valamint más toxikus májkárosodást okozó tényezoket (gyógyszer-, vegyszerártalom) szintén kizártunk. Diabéteszben szenvedo betegek A betegség hosszú ideju fennállásának, a redox paraméterek változására történo hatásának vizsgálatában, a kontrollcsoportot 15 egészséges önkéntes alkotta. A betegség fennállási idejének alapján, 42 fo kielégíto glikémiás kontrollal rendelkezo beteget (HBA1C < 7 %) két csoportra osztottunk. A 1. csoportot 25 fo alkotta, akiknél kevesebb, mint 10 éve, a 2. csoportba pedig 17 beteg tartozott, akiknél 10 évnél hosszabb ideje állt fenn a cukorbetegség. Matematikai statisztikai analízis A mérési eredmények statisztikai analíziséhez lineáris regressziót, valamint a Studentféle egy- és kétmintás t-próbát alkalmaztuk STATISZTIKA 6.0 számítógépes programcsomag felhasználásával. Az átlagértékek közötti különbségeket p < 0,05 esetén értékeltük szignifikáns különbségként. 15

16 4. EREDMÉNYEK A dolgozatomban bemutatásra kerülo vizsgálati módszerek és a segítségükkel nyert információk mind az állatkísérletes modellekben, mind a humán tanulmányokban a redox homeosztázis változásainak nyomon követését szolgálták. Hazánkban még nincsenek nagyszámú populációt vizsgáló, átfogó tanulmányok az antioxidánsok, polifenolok és flavonoidok humán hatásáról. Jelenleg még nem gyakorlat a redox-státusz monitorozása, annak ellenére, hogy nagy igény van rá, hiszen az utóbbi évtizedben szinte valamennyi humán betegség kialakulásával kapcsolatban megszülettek a káros oxidatív reakciókon alapuló patofiziológiai magyarázatok. Gyógynövényi kivonatok állatkísérletes vizsgálatai során tapasztalt eredmények A dolgozatban szereplo állatkísérletes modellekben a lipidanyagcsere valamint az oxidatív státusz változását vizsgáltuk olyan növények kivonatának alkalmazása során, melyek hatóanyagairól a korábbi irodalmi adatok alapján is feltételezheto volt a zsíranyagcserére gyakorolt hatásuk, de az oxidatív státuszban eloídézett változásokról csak kevés számban megjeleno irodalmi adatok számolta be. Fekete retek préslé alkalmazása során tapasztalt eredmények A fekete retek préslé hatásának vizsgálatakor, a lipidparaméterek és a májfunkciót tükrözo enzimaktivitások szignifikáns csökkenése a zsírdús diétát fogyasztó állatcsoportban a lipidanyagcserére kifejtett elonyös hatást, valamint a máj zsíros degenerációjának enyhébb fokú kifejlodését tükrözi. A kemilumenszenciás mérések alapján a préslé zsíros degenerációt csökkento hatása, összefügg a préslében található komponensek össz-scavenger kapacitásával. Kevésbé romlanak a májfunkciót tükrözo enzimaktivitások is ebben a csoportban, összehasonlítva azokkal az állatokkal, akik nem fogyasztottak préslét a zsírdús diéta mellett. Ebben az állatkísérletben tehát igazolható volt a fekete retek préslé komponenseinek a májszövetre kifejtett védo hatása, mely csökkentette a zsírdús diéta káros hatását. Cikórium kivonat alkalmazása során tapasztalt eredmények A Wistar patkányok különbözo diétás állatcsoportjaiban tapasztalt metabolit eredmények a növényi kivonat lipidanyagcserére kifejtett elonyös hatását jelezték. Sejtszintu károsodást nem tapasztaltunk, mivel az alkalikus foszfatáz átlagos aktivitási értékei a kivonattal kezelt állatok szérummintáiban lecsökkentek. A májszövet hisztológiai vizsgálata a normál diétát fogyasztó, kivonattal kezelt állatok csoportjában a metszeti képen néhány sejt/sejtcsoport esetében enyhe gyulladásos folyamat jelenlétét igazolta. A hyperlipidaemiás állatcsoportban a cikórium kivonat hatására javulást tapasztaltunk a lipidparaméterek értékeiben, a trigliceridek átlagértéke szignifikánsan csökkent a szérumban. A glükóz 16

17 szérumszintje is csökkent a kivonattal kezelt zsírdús diétát fogyasztó állatokban, mely hatást korábbi kutatási eredmények is alátámasztanak. A máj szövettani vizsgálatában a zsírdús diétát fogyasztó állatok májszövetében jól látható elváltozások jelzik a máj zsíros degenerációját, mely a sejtekben történo zsírakkumuláció, lipidvakuolumok jelenléte révén valósul meg. A kivonattal kezelt állatok szövettani mintáiban ezek az elváltozások kisebb mértékben alakultak ki, a zsírakkumuláció csökkentebb mértéke figyelheto meg a sejtekben. A máj antioxidáns státusza a cikórium kivonat, normál diéta mellett történo alkalmazása során, kismértékben gyengült. A zsírdús diéta antioxidáns státuszra kifejtett nagymértéku gyengíto hatását a cikórium kezelés nem tudta közömbösíteni. A növényi kivonattal kezelt állatok májhomogenizátum mintában tapasztalt elem-akkumuláció, a fémeknek, a szabadgyökök keletkezésével járó oxidatív folyamatokban megnyílvánuló bizonyított katalitikus szerepébol kiindulva, kiindulóponja lehet a máj redox homeosztázisában tapasztalt kedvezotlen változásoknak. A cikórium fozet hatásának vizsgálatakor tapasztalt elváltozások Fisher patkányok esetében enyhe májvédo hatást igazoltak, de csak a normál diétát fogyasztó állatcsoportban. A cikórium kiegészítést kapott hyperlipidaemiás állatok szérummintáiban a mért enzimaktivitások nem csökkentek, és mivel a szövettani vizsgálat sem mutatott a májsejtekben kisebb mértéku zsíros elfajulást, megállapítható, hogy a zsírdús diéta májfunkcióra kifejtett káros hatását a diéta kiegészítése cikórium herbából készült kivonattal, nem volt képes kivédeni, vagy csökkenteni ebben a dózisban. A pankreász szöveti homogenizátumában, a luminometrás mérések eredményei a cikórium kezelés hatására elonyös irányban változtak, ami alapján többek között feltételezheto a fozet hatóanyagainak határozott mértéku feldúsulása a pankreászban. Ezért további vizsgálatokat kívánunk végezni ennek a feltételezésnek az igazolására. Következtetések a Beiqisen tea állatkísérletes vizsgálata kapcsán Tanulmányoztuk a Kínából származó Beiqishen tea hatását a szérumparaméterek alakulására, tekintettel arra, hogy a megelozo in vitro vizsgálatokból kitunt, a várt kedvezo hatás megkérdojelezheto a tea fogyasztása kapcsán. A tea számos komponese közül a toxikus fémionok is komoly veszélyt jelenthetnek, ha a fogyasztás kontrollálatlan marad. A Beiqishen tea 14 napos fogyasztása alatt szignifikánsan megnott a máj As, Mo és Ni tartalma, de a Cd és Pb is megjelent a májban. A Cd és Pb koncentrációfüggoen májkárosító hatású. E fémek a máj és az epe szabadgyök-paramétereinek változását, a redox-homeosztázis kibillenését és a metabolikus utak gátlását okozzák. A teafogyasztás hatására az állatok 17

18 szérumában az anyagcseretermékek közül a glükóz, és húgysav átlagértéke jelentosen, míg a koleszterinérték enyhén emelkedett. A májhomogenizátum minták össz-scavenger kapacitásának, H-donor aktivitásának és redukálóképességének meghatározásakor kapott eredmények egyöntetuen a máj redox-homeosztázisának, azaz antioxidáns kapacitásának romlását jelzik, míg ezt a plazmában nem tapasztaltuk. Mivel a szervezet redoxhomeosztázisa biztosítja a szabad gyökök kontrollált részvételét a jelátviteli mechanizmusokban, a sejtosztódásban, sejtpusztulásban, miden olyan készítmény, amely radikálisan eltolja az oxidatív egyensúlyt, károsan befolyásolhatja az élo szervezet valamennyi biokémiai anyagcsere folyamatát. A redox homeosztázist jellemzo vizsgálatok jelentosége (humán tanulmányok) Gyulladásos bélbetegségek redox-homeosztázisa Vizsgálataink eredményei, kapcsolódva a gyulladásos bélbetegségek pathomechanizmusának oxidatív elméleti alapjaihoz, jól tükrözik a Crohn-betegek és a colitis ulcerosában szenvedok megváltozott (károsodott) redox-homeosztázisát. A totál antioxidáns státusz (TAS) paraméter segítségével lehetoség nyílik mind a diagnózis alátámasztására, mind az alkalmazott terápia eredményességének, a beteg állapotváltozásának monitorozásán keresztül történo megítélésére. Mivel az IBD kétféle betegségtípusában az átlagértékek nem különböztek szignifikánsan, a TAS paraméter jelen vizsgálatunkban nem rendelkezett differenciál diagnosztikai értékkel. Az albumin és a húgysav metabolitok -mint antioxidáns tulajdonságú plazmakomponensek- közül, az albumin esetében találtunk figyelemre méltó informatív értéket, mivel az IBD ben szenvedok esetében az átlagértékek szignifikánsan alacsonyabbaknak mutatkoztak. A colitis ulcerosában szenvedo betegek közül, azoknál, akiknél az antioxidáns tulajdonsággal rendelkezo metabolitok (albumin, húgysav) szérumértékei magasabbak voltak, a szoros, pozitív korrelációs összefüggések alapján, jobb totál antioxidáns kapacitás értékekkel rendelkeztek. Ebbol is látható, hogy ebben a betegcsoportban különbségek voltak a betegek között a bélbetegség súlyossági fokának szempontjából. A Crohn-betegek esetében azonban a magas albumin és a húgysavértékek nem jelentették az antioxidáns kapacitás javuló tendenciáját, amint az a gyenge korrelációkból is látható. Az össz-scavenger kapacitás vizsgálatának során kitünt a Crohn-betegcsoport viszonylagos jobb redox státusza a colitises betegekhez hasonlítva. Összességében, az oxidatív paraméterek alapján, az általunk vizsgált 18

19 Crohn-betegek kiegyensúlyozott redox homeosztázissal rendelkeztek az alkalmazott terápiának köszönhetoen. Oxidatív egyensúly vizsgálata nem-alkoholos steatohepatitis betegségben Vizsgálatainkban összehasonlítottuk a vörösvértestek össz-scavenger kapacitását nem alkoholos, valamint alkoholos májbetegségben szenvedokben. A NASH betegek esetében tapasztalt alacsonyabb kemilumineszcens fényintenzitás a májban nagyobb arányban jelen levo redukáló equivalensek jelenlétével magyarázható. Ebbol adódhat, hogy a gyulladásos válaszreakcióval járó immunfolyamatok a májbetegségnek ebben a formájában kisebb intenzitással zajlanak. A plazmában mért jobb össz-scavenger kapacitás hátterében a szabad SH-csoportok szignifikánsan magasabb átlagértéke áll, az alkoholos májkárosodásban szenvedo betegek átlagértékeivel összehasonlítva. A NASH betegcsoport jobb redox homeosztázisa hátterében feltételezhetoen szerepet játszanak azon biokémiai folyamatok, amelyek a nagy mennyiségu redukált NADH keletkezéséhez vezetnek, mely folyamatok azonban a szabad zsírsavak oxidációjának csökkenését, fokozott zsírsavszintézist, valamint a zsírok akkumulációját eredményezik a májban. Az általunk vizsgált NASH betegcsoport tagjainál a kapott szoros korrelációs összeüggések alapján azt tapasztaltuk, hogy a magasabb antioxidáns tulajdonságú metabolitértékekkel (albumin, húgysav) rendelkezo betegek esetében a plazmában mért kemilumineszcens fényintenzitásértékek szignifikásan csökkeno, illetve a redukáló képesség mért értékei szignifikánsan emelkedo tendenciát mutattak, azaz ezeket a betegeket egyértelmuen jobb redox hoemosztázis jellemezte. Diabetes oxidatív monitorozási lehetoségei A betegség mikrovaszkuláris szövodményeinek kialakulásában és progressziójában a leglényegesebb faktor a hyperglycaemia. E szövodmények megelozésének legfontosabb eszköze a vércukorszint szoros kontrollja. Ebbol az epidemiológiai vizsgálatokkal alátámasztott ténybol kiindulva, a vércukorszint monitorozása önmagában elégséges eszköz lenne a cukorbetegek glycaemiás egyensúlyának ellenorzéséhez. Tekintve, hogy a klinikai tapasztalatok szerint sajnos a vércukorszint szempontjából a legszorosabb kontroll alatt tartott betegek esetében is példák igazolják a szövodmények kialakulását, bovíteni szükséges az anyagcsereállapot monitorozási eszköztárát. Számos közleményben megjeleno vizsgálati eredmény támasztja alá a diabetes mellitus betegségben megromló redox homeosztázis fennállását, a vaszkuláris szövodmények kialakulásában résztvevo reaktív oxidációs termékek jelenlétét, szerepüket a szövetkárosító folyamatok beindításában. Ezen oxidációs folyamatok 19

20 egyes lépéseiben szerepet játszó faktorok, (enzimek, antioxidánsok) biokémiai analízise teheti lehetové a szénhidrátanyagcsere egyensúlyának további diagnosztikai monitorozási lehetoségeinek bovülését. Korábbi kutatásainkban vizsgáltuk a szuperoxid dizmutáz (SOD), a glutation-peroxidáz (GPX), a kataláz (CAT), valamint az általános redox egyensúly megítélésére alkalmas totál antioxidáns státusz (TAS) paraméterek változásait megfeleloen kontrollált anyagcsere-állapotban levo betegekben, valamint a diabetes fennállási idejével összefüggésben. Eredményeink megmutatták, hogy a kiegyensúlyozott, jó anyagcsereállapotú cukorbetegek vérmintáiban mért redox paraméterek nem különböztek szignifikánsan az egészségesek értékeitol. A tíz évnél hosszabb ideje fennálló diabéteszben szenvedok esetében, a SOD, GPX, valamint a TAS paraméterek értékei szignifikánsan különböztek azoknak a betegeknek az értékeitol, akiknél a betegség fennállási ideje kevesebb volt, mint tíz év. Ezek a paraméterek annak ellenére változtak, hogy a betegek mindkét csoportjában a HBA1C értékek megfelelo glikáltsági szintet jeleztek. Vizsgálva a totál antioxidáns státusz mért értékeit a betegség fennállási idejével összfüggésben, az évek számának növekedésével a TAS értékek folyamatos csökkenése, azaz az antioxidáns státusz fokozatos romlása volt detektálható. 20

21 5. ÖSSZEFOGLALÁS Állatkísérletes tanulmányok Vizsgálatainkban a fekete retek és a cikórium kivonat jelentosen befolyásolta az állatok szénhidrát- és lipidanyagcseréjét, kísérletes hypelipidaemiában a koleszterin és a trigliceridek esetében tapasztaltunk kedvezo változást. Megállapítottuk, hogy a cikórium extraktum növeli a szöveti antioxidáns kapacitást a pankreászban. Meghatároztuk a cikórium extraktum és a májminták fémiontartalmát is induktíven csatolt plazma optikai emissziós spektrometriával (ICP-OES). A cikórium fogyasztás következtében szignifikáns mennyiségu vas halmozódott fel a májban. Megállapítható volt továbbá, hogy megnott a normolipidaemiás kezelt állatok májában a Ca, K, Na, P és S koncentrációja is. A hyperlipidaemiás állatok májában a kezelés következtében szignifikánsan több Ca Cu, Fe, K, Na, P, S és Zn volt kimutatható, mint a nem kezelt állatokban. A növényi kivonatok fémiontartalma jelentosen módosíthatja a polifenolok, flavonoidok scavenger aktivitását, különösen igaz ez toxikus fémion szennyezettségnél. A fémionok, ahogy azt a Beiqishen teával végzett vizsgálataink esetében tapasztaltuk, jelentosen befolyásolják a szöveti szabadgyök képzodést, a szöveti össz-scavenger kapacitást. A szervezet redox egyensúlyáról tájékoztató oxidatív paraméterek közül a gyulladásos bélbetegségekben szenvedok esetében vizsgálataink alapján, a totál antioxidáns státusz, az össz-scavenger kapacitás, és az albumin paraméterek értékei megfeleloen kiegészítették, alátámasztották egymás információértékét. Colitis ulcerosában szoros korrelációt kaptunk a totál antioxidáns státusz és az albumin, valamint a totál antioxidáns státusz és a húgysav paraméterek között. Nem-alkoholos steatohepatitisben szenvedok esetében az emelkedo szérumhúgysav értékek, és a redukálóképesség javuló tendeciája között kaptunk szoros összefüggést. A vörösvértestek össz-scavenger kapacitásának meghatározása során kapott átlagértékek alapján megítélheto volt az alkoholos és a nem alkoholos májbetegségekben kifejlodo sejtszintu károsodás jellege közötti különbség, melynek hátterében az eltéro mértékben zajló gyulladásos válaszreakció folyamata állhat. A szabad SH-csoportok vizsgálatával szintén egyértelmu különbséget tudtunk tenni az alkoholos és a nem-alkoholos májkárosodásban szenvedo betegcsoportok között. A nem 21

22 alkoholos eredetu májkásosodásban a szabad SH-csoportok meghatározása alkalmas lehet állapotváltozás monitorozására, az alkalmazott terápia hatásának ellenorzése folyamán. A diabetes mellitus hosszú távú klinikai fennállása esetében a betegek megromlott redox homeosztázisa, az antioxidáns státuszt jelzo paraméterek szignifikánsan alacsonyabb értékei alapján, egyértelmuen megítélheto. Ezt támasztja alá a totál antioxidáns státusz paraméter csökkeno értékei, valamint a betegség fennállási ideje közötti szoros korreláció. A kereskedelmi forgalomban kapható Totál Antioxidáns Státusz (TAS) méromódszer és a hazai fejlesztéssu Össz-scavenger kapacitás (TSC) meghatározására kifejlesztett kemilumineszcenciás módszerrel a szervezet redox-homeosztázisa különbözo betegségekben jól monitorozható. A TAS fotometriás és a TSC kemilumineszcenciás módszerrel végzett összehasonlító vizsgálataink eredményei azt mutatták, hogy a kemilumineszcenciás módszer során nyert értékek szélesebb intervallumban változtak, mely tény a méromódszer érzékenyebb jellegét támasztja alá. Gyulladásos bélbetegségben szenvedok esetében a TSC módszerrel végzett meghatározások eredményei alapján különbséget tudtunk tenni a Crohn-betegek és a colitis ulcerosaban szenvedo betegek redox-homeosztázisának mértéke között, valamint megítélheto volt a betegségek eltéro súlyossági foka. Az antioxidáns kapacitás szempontjából a nemek között azonban nem igazoltunk különbséget. 22

23 PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Kongresszusi poszterek, eloadások, folyóiratokban megjeleno kivonatai : 1. Somogyi, A., Prechl, J., Blázovics, A., Pusztai, P., Kocsis, I., Szucs, N., Fehér, J.: Természetes scavenger kapacitás vizsgálata cukorbetegeken. Magyar Diabetes Társaság XII. kongresszusa, Gyor, Somogyi A., Szaleczky E., Farkas K., Sármán B., Kocsis I.: Antioxidant status of type I. diabetics under intensive insulin treatment. 5 th Free Radical Research Conference, Gödöllo, Békési, G., Magyar, Z., Kakucs, D., Sprintz, D., Kocsis, I., Székács, B., Fehér, J.: The changes in the Myeloperoxidase activity of human neutrophil granulocytes and in the amount of enzyme deriving from them under the effect of oestrogen. IV. European Congress on Menopause, Vienna, Hofburg Prechl, J., Somogyi, A., Blázovics, A., Pusztai, P., Kocsis, I., Szucs, N.: Assesment of free radical scavenging capacity of erytrocytes by chemiluminescent technique in diabetic and hyp+erlipoproteinemic subjects. Second International Congress of WHMA, Budapest, Prechl, J., Somogyi, A., Pusztai, P., Kocsis, I., Blázovics, A., Boros, I.: Evaluation of free radical reactions in liver and erythrocytes of streptozotocyn diabetic young rats Zeitschrift für Gastroenterology, XXXIII/ Szaleczky, E., Somogyi, A., Prechl, J., Pusztai, P., Kocsis, I., Fehér, J.: A szérum lp(a) szint cukorbetegeinkben. Hypertonia and Nephrologia, Suppl Hagymási, K., Kocsis, I., Bárkovits, S., Kaján, A., Blázovics, A.: Plasma, szérum redox státuszának vizsgálata egészségesekben. 28. Membrán-Transzport Konferencia Sümeg Lugasi, A., Blázovics, A., Kocsis, I., Kéry, Á., Dworschák, J., Fehér, J.: Black radish : possible antioxidant in alimentary hyperlipidaemia. Magyar Gastroenterológiai Társaság 41. Nagygyulése Szaleczky, E., Sármán, B., Kocsis, I., Somogyi, A.: Adequate antioxidant defence in type i. Diabetes. Diabetologia 41, Suppl Molnár J., Sármán B., Pusztai P., Kocsis I., Somogyi A. : Intenzív Inzulinkezelésben részesülo I. típusú cukorbetegségben megbetegedettek szérum szelén koncentrációja. Diabetologia Hungarica 6, Suppl