DIPLOMATERV. Külső kutatóhely neve: Magyar Tudományos Akadémia Pszichológiai Kutatóintézete Külső kutatóhely címe: 1068 Budapest, Szondi u

Átírás

1 DIPLOMATERV Dolgozat címe: Idő- frekvencia moduláció elemző szoftver fejlesztése az alvás- ébrenléti ciklus spontán elektromos aktivitásának számítógépes vizsgálatára szabadon mozgó macskán Szerző neve: Dombovári Balázs Gábor Konzulensek neve: Dr. Karmos György Dr. Ulbert István Külső kutatóhely neve: Magyar Tudományos Akadémia Pszichológiai Kutatóintézete Külső kutatóhely címe: 1068 Budapest, Szondi u Leadás dátuma: 07. június 18. Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai Kar

2 Nyilatkozat Alulírott Dombovári Balázs Gábor, a Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai Karának hallgatója kijelentem, hogy ezt a diplomatervet meg nem engedett segítség nélkül, saját magam készítettem, és a diplomamunkában csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, melyet szó szerint, vagy azonos értelemben, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen a forrás megadásával megjelöltem. Budapest, 07. június 18. Dombovári Balázs Gábor

3 Tartalomjegyzék I. A dolgozat rövid összefoglalása... 4 II. Abstract... 6 III. Bevezetés... 8 IV. Biológiai áttekintés IV.1. Az EEG jel generátor struktúrái IV.2. Az EEG jel keletkezésének mechanizmusa IV.3. Az EEG jel frekvencia szerinti spektrális tartományai IV.4. A macska hallókérgének anatómiája és fiziológiája IV.5. Hippocampus felépítése IV.5.1. A hippocampus afferens és efferens kapcsolatai IV.6. Alvási oszcillációk V. Műtét, elvezetési módszer... V.1. A felhasznált elektródák... V.2. Az elektródák implantálása V.3. Elvezetési metódus VI. Matematikai áttekintés VI.1. Biológiai jelek megjelenítése VI.2. Wavelet transzformáció definíciója VI.3. Koherencia VI.4. Komoduláció VII. Számítógépes analízis VII.1. Az MCFA program bemutatása VII.2. Az MCFA működése, funkciók VIII. Biológiai eredmények VIII.1. A lassú hullámú alvás kortikális jellemzői VIII.2. A hippocampus altatás alatti mintázata VIII.3. A hippocampus és kéreg közötti kapcsolat altatásban VIII.3.1. Irodalmi adatok VIII.3.2. Adatfeldolgozás, eredmények IX. Összefoglalás, konklúzió Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék... 66

4 I. A dolgozat rövid összefoglalása Az elektroenkefalogram (EEG) keletkezéséért felelős agykérgi neuronális folyamatok csak invazív kísérletekben vizsgálhatók. Kutatásom témája macskákba krónikusan beépített agykérgi multielektródról és hippocampusból elvezetett spontán agyi aktivitások elemzése és ezen biológiai adatok feldolgozásához szükséges jelfeldolgozó módszerek fejlesztése és alkalmazása. A hallókéregből és a hippocampusból elvezetett jelek különböző hullámainak frekvencia teljesítmény analízise, valamint az időbeli változások idő- frekvencia analízissel történő nyomon követése pontosabb adatokat szolgáltat a neurális generátorstruktúrák megértéséhez. Az MTA Pszichológiai Kutatóintézetének Összehasonlító Pszichofiziológiai Laboratóriumában szabadon mozgó, multielektróddal krónikusan implantált macskákról, ketamin altatás alatt vezettük el a spontán agyi jeleket. Ezek változásait, tulajdonságait vizsgáltam többek között az általunk kifejlesztett szoftverrel. A dolgozat az EEG jelek keletkezési mechanizmusáról, az elvezetett agyi területek általános áttekintéséről, a felhasznált elektródák típusairól és részletesen a vizsgálatokhoz fejlesztett sokcsatornás idő- frekvencia elemző szoftver (Multiple Channel Frequency Analyser, MFCA) működéséről, végül pedig a kitűzött biológiai vizsgálatokról és azok eredményeiről szól. Mind a szoftverfejlesztést, mind pedig a biológiai vizsgálatokat átfogó irodalmi áttekintés előzött meg, amelyet a megfelelő részeknél ismertetek. Az MCFA program gyakorlati alkalmazását ketamin altatás alatti kérgi lassú oszcillációk elemzésén keresztül mutatom be. Dolgozatom biológiai részében összefoglalom az irodalomban található kortiko- hippocampális kapcsolat eddig vizsgált tulajdonságait, majd bemutatom az lassú hullámú alvás és altatás alatti hallókérgi up state és down state szakaszokat, valamint a hippocampális delta (1-4 Hz) sávba eső oszcillációk közötti, általam vizsgált összefügéseket. A kérgi up state - eket két esetben válogattam ki; első esetben akkor, amikor a hippocampus delta hullámai időben jelen voltak, a másik esetben pedig nem voltak jelen. Az előbbinél kb. 150 ms- mal eltolt, de hasonló jelkarakterisztikát kaptam a két agyi terület között, mind wavelet transzformációval, mind amplitúdó átlagokkal. A másik esetben a hippocampusban nem találtam jelentős teljesítmény változást, valamint a kéreg up állapotában is jelentős teljesítmény- és amplitúdóbeli csökkenés látszódott. 4

5 Mindezekből arra lehet következtetni, hogy lassúhullámú alvás alatt és altatás lassú hullámaiban a nagyobb teljesítményű és amplitúdójú up state - ek egyfajta transzfer funkciót indíthatnak be a kéreg és a hippocampus között, amely többek között fontos szerepet játszhat a memória konszolidációban is. 5

6 II. Abstract Cortical neuronal processes which are responsible for the genesis of the electroencephalographic signals can be investigated in invasive experiments. Our research goals were to develop and adjust different signal processing methods to analyse intracortical and hippocampal spontaneous activity derived from chronically implanted cat brain. Frequency- power analysis of different waves of the responses derived from the auditory cortex and hippocampus, as well as with time- frequency analysis provide us more exact information and helps to understand how different neuronal generators work. We recorded the spontaneous brain activity from chronically implanted cats under ketamine anaesthesia in the Comparative Psychophysiology Group of the Institute for Psychology of the Hungarian Academy of Sciences. I investigated the properties and changes of the neuronal activity with the newly developed software. This essay is about the genesis of EEG signals, the general structures of auditory cortex and hippocampus, the types of electrodes we used, and mostly about our own developed Multiple Channel Frequency Analyser (MCFA) software and finally about my biological studies and results. Previous to both studies and software engineering I introduce a comprehensive literary summary, which is presented at the corresponding chapters. I will present the practical application of the MCFA software through the analysis of the ketamine anaesthesia. In the biological part of my thesis, first the properties of cortico- hippocampal relationship are presented, followed by a summary about the slow oscillation in the auditory cortex. This is continued by the description of hippocampal delta (2-3 Hz) oscillations and its connections with cortical slow oscillation during anaesthesia. I used two types of selection of up states (depolarized state of the slow oscillation) in the auditory cortex. First when hippocampal delta waves were present, second when these waves were not present during cortical up states. At the former one I found hippocampal activity to be about 150 ms phase shifted, but with similar signal characteristic after wavelet transformation and amplitude averaging. With the second 6

7 selection I didn t find any significant power change in the hippocampus, but I found a notable power and amplitude decrease in cortical up states. From all of my experimental results the following hypothesis can be drawn, that under anaesthesia the increased power and amplitude of cortical up states induce a transfer function between cortex and hippocampus. This connection might be also very important in memory consolidation. 7

8 III. Bevezetés A Pázmány Péter Katolikus Egyetem Információs Technológiai Kara és az MTA Pszichológiai Kutatóintézetének Összehasonlító Pszichofiziológiai Laboratóriuma lehetőséget nyújtott számomra, hogy egy olyan multidiszciplináris területen végezhessem a diplomamunkámhoz szükséges kutatásokat, ahol a Kar két fő jellegzetessége, nevezetesen a (neuro)biológia és az informatika találkozik. Dolgozatom a laboratóriumban elsajátított műtéti, elvezetési és jelfeldolgozási technikákon kívül egy saját fejlesztésű szoftver bemutatásáról, valamint a program segítségével saját biológiai vizsgálatokról szól. A szoftver fejlesztését elsősorban az motiválta, hogy a piacon jelenleg kapható szoftverek nem rendelkeznek számunkra olyan fontos funkciókkal, mint pl. a bioelektromos jelek idő- frekvencia változásainak megjelenítése hőtérképpel, nem beszélve azok igen magas áráról. Ezért fejlesztettük ki Grand Lászlóval közösen a Multiple Channel Frequency Analyser (MCFA) programot, amely mind paraméterezhetőségében, mind az idő- frekvencia analízis megjelenítésében igen hatékony. Az intézetben töltött idő alatt a különböző vizsgálatokhoz számos adatfeldolgozó módszert fejlesztettünk ki, amelyek később beépültek az MCFA szoftverbe így az egy multifunkciós programmá nőtte ki magát. A szoftverek fejlesztéséhez mindig konkrét kísérletekben rögzített adatokat használtunk fel, mivel konzulenseimnek köszönhetően a kezdetektől lehetőség volt részt venni a kísérletekben. Az alapvető szoftverfejlesztési feladatunk - hogy Fourier és Wavelet analízist tudjon végrehajtani és a csatornák jelteljesítmény változásait közös kezelőfelületen, külön hőtérképekkel ábrázoljuk fokozatosan bővültek, jól paraméterezhetővé váltak, valamint különböző jelfeldolgozási módszerek és megjelenítési módokat kaptak. Mivel a szoftverek alapfunkcióinak megírása után aktívan használtuk őket a különböző kísérletekben, a fokozatosan beépített funkciókat az időről időre felmerülő újabb követelmények indukálták. A szoftverfejlesztésen kívül az elektrofiziológia és neurobiológia egyes területeivel is lehetőségem volt részletesebben megismerkedni. Az intézetben töltött három év alatt macska alvás- ébrenléti ciklusát vizsgáltam. A terület szakirodalmát folyamatosan megismerve saját témát kaptam, macska lassú hullámú alvása alatti, a hippocampus-ból és hallókéregből elvezetett spontán agyi aktivitásmintázatok közötti kapcsolatok vizsgálatát. Feladatomban a szoftvertervezésen kívül a vizsgált 8

9 biológiai folyamat is nagy szerepet kapott, ezért ezt a dolgozatomban részletesen tárgyalom. Diplomatervem felépítését tekintve először az EEG jel genezisét, valamint a macska hallókérgének és hippocampusának felépítését ismertetem. Ezek után rátérek a laboratóriumban használt elektródákra, műtéti eljárásra, valamint a jel elvezetésének és feldolgozásának módszereire. A feladathoz szorosan kapcsolódó jelfeldolgozási módszerek matematikai hátterét külön fejezetben tárgyalom, amit a tervezett szoftverek funkcióinak részletes bemutatása követ. Itt ismertetem az általunk használt piaci szoftverek idő- frekvencia analízis funkcióival kapcsolatos észrevételeimet is. Az altatás alatti lassú oszcilláció tárgyalása ezután következik, ahol a saját biológia feladatom ismertetése is történik. A dolgozat végén rövid összefoglalást adok az elvégzett munkáról, összefoglalom jelentőségét, valamint a további terveket és a részletes irodalomjegyzéket ismertetem. 9

10 IV. Biológiai áttekintés IV.1. Az EEG jel generátor struktúrái A központi idegrendszer (Central Nervous System- CNS) legfőbb alkotói az idegsejtek és gliasejtek. A neuronok általában réteges elrendeződésben helyezkednek el a kéregben. A glia sejtek a neuronok között találhatók. A neuron sejttestjéből különböző nyúlványok származnak. Ezek a nyúlványok alapvetően két osztályba sorolhatóak funkciójuk szerint. A legtöbb nyúlvány dendrit, mely elágazódásaival számos kis szövevényt alkot. Általában az idegsejt tartalmaz egy ún. axont is, mely több kollaterálisra is felbomolhat. Az axon teremti meg a kapcsolatot más neuronokkal, célszervekkel. Interneuronális kapcsolatok esetén a kontaktusokat szinapszisoknak hívjuk, melyek a dendritekre, a sejttestekre és axondombokra. Íly módon az idegsejtek akár több ezer szinapszist is kaphatnak. A glia sejtek az idegsejtek sejttestjei, axonjai és dendritjei közötti térben beágyazódva helyezkednek el. Általában rendelkeznek néhány nyúlvánnyal, melyek kapcsolatot teremtenek a neuronok sejttestjeivel és nyúlványaival, ill. a véredényekkel. Ez a hisztológiai elrendezés azt eredményezi, hogy az agyi extracelluláris tér nagyon szűk intercelluláris réseket tartalmaz. IV.2. Az EEG jel keletkezésének mechanizmusa Az EEG jel keletkezésének mechanizmusa a mai napig pontosan nem ismert. Valószínű, hogy több ezer neuron összesített elektromos aktivitását tükrözi, melyek az agykéreg felszíni részének megfelelően helyezkednek el. A mélyebb struktúrák aktivitása a szignál gyengülése miatt nem idézhet elő a fejbőrről elvezethető mikrovoltos nagyságú jelet. Tekintettel az EEG fokozatos jellegű változásaira, inkább a piramissejtek dendritnyúlványain lejátszódó küszöb alatti posztszinaptikus potenciálváltozások felelősek keletkezéséért, semmint a gyors, mindent vagy semmit jellegű akciós potenciálok. Elul klasszikus elképzelése szerint az EEG jel generálásában számos neuron kiterjedt dendritfáinak szinkronizált, összesített aktivitása játszik szerepet. Ezeket a több neuronhoz tartozó, de együttműködő kapcsolatokat nevezte szinaptikus funkcionális egységeknek. Az agy spontán ritmusának megfelelő és az adott ingerek függvényében számos átfedést mutató 10

11 funkcionális egység közül más és más csoportok mutathatnak szinkronizált aktivitást. Ez a mintázat időben dinamikusan változik. Az epilepszia alkalmával látható nagy amplitúdójú tüskék és hullámok a kóros aktivitású gócnak megfelelően elhelyezkedő sok idegsejt szinkronizált működését mutatják. A szinaptikus funkcionális egységek koordinációjában fontos szerepet tölthetnek be a kéreg alatti struktúrák, elsősorban a thalamus (Pléh és mtsai, 03). A szinkronizált elektromos aktivitáson felül fontos az agyi struktúrák geometriai konfigurációja is. Az EEG jel kialakulásának feltétele ugyanis, hogy a sok kis lokális elektromos változás felerősítse egymást. Az egymással párhuzamosan elhelyezkedő kérgi piramissejtek transzmembrán áramai ideálisan képesek összeadódni, ezt nevezzük open field elrendeződésnek. A neuronok véletlenszerű orientációja esetén a mikroáramok kioltják vagy nagyon lecsökkentik a jel erősségét, ezt closed field elrendeződésnek nevezzük. Míg az agykéreg szerveződésére az open field, addig az egyes mélyebben elhelyezkedő agytörzsi struktúrákra a closed field organizáció a jellemző (1. ábra). A párhuzamosan elhelyezkedő piramissejtek dendritjein végződnek az afferens rostok. Ingerület esetén a dendrit membránja depolarizálódik, a sejtbe pozitív töltésű ionok áramlanak be az extracelluláris térből. Emiatt az extracelluláris térben az ionok eloszlása megváltozik, mikroáramok kialakulásához vezetve. A párhuzamos (open- field) szerveződés következtében e mikroáramok összeadódnak, így a skalpon is mérhető potenciál alakul ki (1. ábra, A rész). Eseményfüggő potenciálok keletkezésekor számos, az adott eseményhez kapcsolódóan ingerületbe jött neuron mutat együttes aktivitást. Ez erős dipólusok kialakulásához vezet. A dipólus modellek szerint ezek képezik a skalpon regisztrálható hullámok forrását. Forrásanalízis során e hullámok jellemzőiből próbálunk visszakövetkeztetni a dipólusok agyi lokalizációjára. A zárt, vagy véletlenszerű (closed field) szerveződés esetén a mikroáramok kioltják egymást, így regisztrálható dipólus nem jön létre (1. ábra, B rész). 11

12 1. ábra Az agykéreg szerveződésére az open field, az agytörzsi struktúrákra a closed field organizáció a jellemző (Pléh és mtsai, 03). Az EEG jelet frekvencia és amplitúdóbeli különbségek alapján spektrális tartományokra osztjuk fel. A klasszikus nevezéktan szerint, ha a nagyobb amplitúdójú és kisebb frekvenciájú hullámot egy kisebb amplitúdójú és nagyobb frekvenciájú váltja fel, deszinkronizációról beszélünk. Ennek a folyamatnak az ellenkezője a szinkronizáció. IV.3. Az EEG jel frekvencia szerinti spektrális tartományai Történetileg az agyi oszcillációkat frekvenciájuk alapján kategorizálják. Az alábbi lista rövid bemutató csupán, amely az alvás- ébrenléti ciklus elektrofiziológiai vizsgálatához elengedhetetlenül szükséges. A képet árnyalja, hogy pontosan milyen állatban, annak is melyik agyterületén és pontosan milyen tulajdonságú egy adott frekvenciájú ritmus, de alapvetően a következő jellemző oszcillációk találhatók meg macskákban: Alfa: (8-13 Hz) Az alfa hullámok elalvás során másodperces "csomagok" formájában jelentkeznek. Ekkor az ún. alfa- orsók az egész agykéregben szinkron megtalálhatók. Állatok esetében irregulárisabb és a nyugodt ébrenlétre jellemző domináns 12

13 hullámforma. Kortiko- thalamo- kortikális pályák hozzák létre. A thalamus retikuláris sejtei periodikusan hiperpolarizálják a relésejteket, amit posztinhibitoros aktiválódás követ. Ez a ritmus adódik át a kérgi sejteknek. Theta: ( Hz) A theta hullámok elalvás és állatok explorációs viselkedése során jelentkeznek, azonban gyermekeken normálisan is megjelenik. A hippocampus piramissejtjeinek működése nyomán keletkező ú.n. RSA hullámok (Rhythmical Slow Wave Activity, ritmikus lassú hullámú aktivitás) is ebbe a hullámtartományba esnek. Ez patkányokon jól elvezethető a kéregről, mert a nagyméretű hippocampus csak néhány milliméterrel van az agyfelszín alatt. Delta: ( Hz) A delta hullám leggyakrabban mély alvás alatt jelentkezik. A delta ritmus akkor keletkezik, amikor a thalamus sejtjei egy adott hiperpolarizációs állapotba kerülnek. Béta: (13-30 Hz) A béta hullám jellemző az éber állapotra, valamint az alvás álomlátásos szakaszára, vagyis az alvás REM szakaszára. Gamma: (30-50Hz) A gamma hullám a béta tartomány nagyfrekvenciás része, intenzív figyelmi állapotban és REM alvás álomképei alatt. A deszinkronizált elnevezés nem helyénvaló, a neuronok gyors tüzelése ebben az esetben nagyon is szinkron, ezt a kéreg neuronhálózatai maguk (a thalamus nélkül) hozzák létre. Lassú hullámok: (0.1-1 Hz) Lassú hullámú alvás során látható kérgi mintázat. A kérgi sejtek lassú potenciálváltozása, mely kevéssé ismert szinkronizáló mechanizmussal mindkét agyféltekén egyidőben a kéreg egész területén regisztrálható. 13

14 IV.4. A macska hallókérgének anatómiája és fiziológiája A macska hallókérge az agy konvexitásán található és ezért viszonylag könnyen vizsgálható más pszichofiziológiai kísérletekben használt állatfajokhoz képest (pl. rhesus majmok). A hallókéreg AI areája az agy laterális felszínén, a gyrus ectosylvius dorzális részén helyezkedik el (2. ábra). A kísérletek arra utalnak, hogy a macskák ezen areája a primer hallókéreg, mely - úgy tűnik - megfelel a majmokban leírt AI-nek. Akárcsak majmokban, mikroelektródákkal vizsgálva tonotópiás szerveződést írtak le a macskák AI areáján is: a cochlea bázisa (magas frekvenciák) az area elülső részén, míg az apex (alacsony frekvenciák) a hátsó területen reprezentálódik. Ezt a tonotópiás szervezettséget korábbi vizsgálatok során kimutatták éber macskán az akusztikus eseményhez-kötött potenciál korai komponenseinek topográfiai viszonyait vizsgálva. 2. ábra: A macska hallókérgének területei és az elektródmátrix (lsd. később) elhelyezkedése. A sematikus ábrát a kísérleteinkben résztvevő macskák agyáról készült digitális fotók alapján készültek és ezek alapján lett rekonstruálva az elektródmátrix átlagos elhelyezkedése is. Az ábrán szerplő rövidítések: AI, elsődleges hallókérgi terület; AII, másodlagos hallókérgi terület (Lakatos, 01). A macska hallókérgén az AI area szomszédságában több hallókérgi területet (3. ábra) különítettek el, amelyek egy része szintén tonotópiásan szervezett, de mind anatómiailag mind funkcionálisan különböznek az AI területtől. A másodlagos AII areát citoarchitektóniai különbségek alapján lehet elkülöníteni az AI-től: az AII kérgének III. rétegében megnő a piramissejtek száma, az V. rétegben pedig nagy piramissejtek jelennek meg. Ezen terület tonotópiás szervezettsége vitatott, de egyre 14

15 többen találnak frekvenciafüggő reprezentációt. Ez a terület valószínűleg az ingerek feldolgozásának egy az AI után következő állomása. Megkülönböztetünk első és hátsó hallókérgi mezőket is (AAF és PAF), melyek szerepe vitatott de a legtöbb szerző asszociációs területként említi őket. Úgy tűnik, ezen areák szintén tonotópiás szerveződést mutatnak, de a mikroelektróddal elvezetett kezdeti sejtaktivitás latenciája hosszabb és időben kevésbé kötött az ingeradás időpontjához, a sejtek hangolási görbéje pedig szélesebb, mint az AI neuronoké. Egyes vizsgálatok arra utalnak, hogy e területek az akusztikus információfeldolgozás későbbi kognitív jellegű szakaszában vesznek részt, és talán részben megfeleltethetők a majmokban talált belt (AAF) ill. parabelt (PAF) régióknak. A különböző területek afferens és efferens kapcsolatait vizsgálva az AI-ből AII-be futó rostok topográfiás elrendeződést mutatnak. Az AI rosztrális részéből a rostok az AII caudális, míg caudális részéből az AII rosztrális részébe futnak. A ventrális AI a ventrális AII-vel míg a dorzális AI az AII dorzális részével áll kapcsolatban. Az AAF area az AII-ből kapja afferentációjának nagy részét, mégpedig - úgy tűnik - tonotópiás szervezettségben. A projekciók az AII-ből a PAF-ba ugyancsak tonotópiásan szervezettek. Az AII mellett az AAF is projiciál a PAF régióba, mégpedig az AII-ből jövő rostokkal konvergálva, tonotópiásan szervezetten, ami e terület integratív szerepére utalhat. IV.5. Hippocampus felépítése A hippocampusról először Arantius velencei anatómus egyik 1587-ben megjelent művében számol be, melyben leírja, hogy az oldalkamra alsó falának a medialis fallal való találkozásánál, annak egész hosszában egy hajlékony és változatos alakú képlet van, amely a Hippocampusra, vagyis a tengeri csikóhalra emlékeztet. A hippocampus az emlős agy filogenetikailag legősibb kéregterületéhez, az archicortexhez tartozik. Fontos szerepet játszik a tanulás és a memória folyamataiban, és ezeknek emóciók által befolyásolt módosulásaiban is. Sérülése esetén az újabb információk rögzülése zavart szenved. A hippocampus három fő részre osztható: a temporális lebeny csúcsa felé néző, kiszélesedő fej, a középső test és a corpus callosum alá felfelé, majd előrefelé és a középvonal felé hajló farok. A mediális oldalon fut végig a hippocampusból kimenő 15

16 és oda befutó rostokat tartalmazó fimbria fornicis, mely a farokrészt alkotó fornixba megy át. Az egymásba fonódó, U alakot képző két sejtréteg közül a mediális oldal fogazott struktúráját a gyrus dentatus, míg a hippocampus laterális görbületét az Ammon-szarv képezi. Ezek a struktúrák makroszkóposan is felismerhetőek a hippocampus hossztengelyére merőleges átmetszetben, de szövettani metszetekben is jól elkülönülnek egymástól. Az Ammon- szarv további három fő régióra osztható: CA1, CA2 és CA3 areákra (mivel az Ammon-szarv latin elnevezése Cornu Ammonis), melyeket a bennük elhelyezkedő principális sejtek morfológiája és kapcsolatrendszere alapján lehet elkülöníteni. A principális sejtek itt piramissejtek, melyek laza réteget alkotnak (3. ábra). A CA3 jelöli azt a piramissejt csoportot, amely a gyrus dentatushoz legközelebb található és rajtuk végződnek a szemcsesejtek moharostjai a sejttesthez közeli nagy dendrittörzsek komplex tüskéin. Az Ammon-szarv piramissejtjeinek dendritjei sűrűn borítottak tüskékkel úgy, hogy általában fél mikron távolságra esik egy tüske, de a tüskesűrűség a dendritek különböző vastagságú szakaszain jelentősen változik A CA1 terület az Ammon-szarvnak a gyrus dentatustól legtávolabb eső része, mely a subiculumba megy át, és amely egyben az Ammon-szarv kérgi kimenetét képezi. Az itt található neuronok piramis-típusú nagy idegsejtek, melyeknek apikális dendritjéből a sejttesttől kis távolságra oldalágak indulnak. A CA1 és CA3 között található kis sejtszámú terület a CA2, ami kevert terület, mert piramissejtjei leginkább a CA1 sejtekre emlékeztetnek, és a piramissejtek egy része anélkül kap moharost bemenetet, hogy dendritjeiken mohaszerű komplex tüskék lennének. Mind a CA1 és a CA3 is felosztható további három részre (a, b, c), de ezeket általában csak a kapcsolatok topográfiájának leírásakor használják. A gyrus dentatus sejttömegének több, mint 90%-át a szemcsesejtek adják, melyek viszonylag egyszerű szerkezetű serkentő sejtek. Többségüknek kerek és kis sejttestje van, melyek szorosan egymás mellett elhelyezkedve zárt réteget alkotnak. A szemcsesejtek dendritjei a sejtrétegre nagyjából merőlegesen egy irányba futnak a gyrus dentatus molekuláris rétegében. A szemcsesejtek axonját moharostnak, nagy axon- végződéseiket moha- terminálisnak hívjuk. A mohaterminálisok a hilus 16

17 mohasejtjeivel és az Ammon-szarv CA3 területének piramissejtjeivel létesítenek kapcsolatot. 3. ábra A hippocampus belső kapcsolatrendszere vázlatosan. CN nucleus caudatus, DG gyrus dentatus, ENT entorhinalis kéreg, Fx fimbria, Su subiculum. A gyrus dentatus hilusa kb. fele részben tartalmaz serkentő és gátló sejteket. A hilusban található izgató sejtek jellemző tulajdonsága, hogy olyan komplex és nagy tüskék borítják, amihez hasonló az idegrendszerben másutt nincs. E komplex tüskék úgy borítják a dendritek kezdeti szakaszát, mint a fák törzsét a mohák, innen ered a sejtek elnevezése (Amaral, 1978). Jellemzőjük, hogy serkentő kölcsönkapcsolatban vannak a szemcsesejtek nagy csoportjaival úgy, hogy a sejttestük közelében található szemcsesejtektől kapják az serkentő bemenetet (afferens), viszont axonjaik (efferens) ezekkel a sejtekkel nincsenek kapcsolatban, hanem az ezektől cranialisan és caudalisan elhelyezkedő szemcsesejteket idegzik be, amivel az ún. laterális serkentés lehetőségét teremtik meg. A gyrus dentatus gátló idegsejtjeinek túlnyomó többsége a hilusban van (Halász, 05). IV.5.1. A hippocampus afferens és efferens kapcsolatai Afferens kapcsolatok 17

18 A legegyszerűbb csoportosítás az, ha az afferenseket kérgi és kéreg alatti csoportra osztjuk. A hippocampális komplexhez valamennyi neokortikális multiszenzoros asszociációs területről érkeznek afferensek. Ezek zöme az entorhinális kéregbe fut, de van egy jelentős parahippocampális kérgi terület, amely direkt kapcsolatot létesít nemcsak az entorhinális kéreggel, hanem a subiculummal illetve a presubiculummal is. Ezek általában reciprok kapcsolatok és funkcionális jelentőségüket egyre inkább hangsúlyozzák a memória kialakítás folyamatában. Mindemellett meg kell említeni, hogy a gyrus dentatus és az Ammon-szarv fő kérgi bemenete az entorhinális kérgen keresztül valósul meg és amennyiben ez a kapcsolat sérül, annak súlyos funkcionális következményei vannak. A subkortikális bemenetben található olyan afferens pálya, amely gyakorlatilag a teljes gyrus dentatust, Ammon-szarvat és a subiculáris komplexet behálózza, mégpedig látható sűrűségbeli különbségek nélkül. A hippocampus afferens kapcsolatai között funkcionális szempontból fontossági rangsort felállítani nem lehet, mert a kérgi, pl. entorhinális lézió ugyanolyan súlyos következményekkel jár, mint a kéreg alatti terület, pl. septum roncsolása, vagy az Ammon-szarv kiterjedt sérülése. Efferens kapcsolatok A hippocampális komplex kimenő kapcsolatait ugyancsak kérgi, illetve kéreg alatti kapcsolatokra oszthatjuk. A hippocampus fő agykérgi efferens kapcsolata az entorhinális kéreg, mert az Ammon-szarv CA1 területe és a subiculáris terület egyaránt az entorhinális kéregbe küldi efferenseit. A hippocampus nagyszámú kéreg alatti agyterülettel létesít kapcsolatot, köztük a septummal (CA3-1 piramissejtjei), hypothalamussal és az amygdalával (mindkettő esetében a subiculum). IV.6. Alvási oszcillációk Az alvás- ébrenléti ciklusnak alapvetően három jól elkülöníthető stádiuma van: az éber, REM, ill. NREM állapotok (4. ábra). Az alvás két fő formáját- a REM (az angol Rapid Eye Movement- Gyors Szemmozgások kifejezésből), másnéven paradox alvás és a NREM (az angol Non REM- Nem REM-ből) alvást- különböző 18

19 neurofiziológiai folyamatok jellemzik. NREM alvás során a thalamo- kortikális interakció egy oszcilláló üzemmódra vált, melynek során az érzékszervi bemenetet ritmikus hiperpolarizációk gátolják (Bódizs, 02). A REM alvást erőteljes neurális aktivitás jellemzi, ami a pons cholinerg struktúráiból ered és gátolja a thalamokortikális oszcillációt. Az agytörzsi monoaminerg és cholinerg sejtcsoportok kölcsönhatása a NREM és a REM alvás váltakozását szabályozza. Az alvás, mint egész a homeosztatikus és a cirkadián folyamatok együttes kontrollja alatt áll. Jóllehet számos funkcionális hipotézis áll rendelkezésre, a NREM és a REM alvás pontos szerepe nagyrészt ismeretlen. Hipnagóg hallucinációk, gondolat- szerű élmények és élénk álmodás jellemzik az elalvás, a NREM alvás és a REM alvás állapotait. Alvásnak nevezzük az élőlényeknek azt a majdnem az egész élővilágban általános tulajdonságát, hogy bizonyos periodicitással, a környezettel való kapcsolatuk és motoros aktivitásuk nagymértékben lecsökken és valamilyen alváspozíciót vesznek fel. Mindez reverzibilis, a különböző élőlényeknél különböző időtartam után ismét éber állapotnak adja át helyét (Bódizs, 00). 4. ábra Poligráfiás alvásfázisok EEG- Elektroenkefalogram, HIPP- hippocampus elektróda jele, EMG- Elektromiogram, EOG- Elektrookulogram, ECG- Elektokortikogram Dolgozatom biológiai áttekintésében törekedtem átfogóan, de korántsem részletesen ismertetni a munkámhoz elengedhetetlenül szükséges neurobiológiai ismereteket. 19

20 A következő részben leírom az általunk használt elektródákat és elvezetési módszereket. V. Műtét, elvezetési módszer V.1. A felhasznált elektródák Az MTA Pszichológiai Kutatóintézetben a műtétek során háromféle elektróda került beültetésre a macskák agyába: Fine wire elektróda: 25 mikrométer átmérőjű, polyimid szigetelésű platina-iridium drótok, melyek egycsatornás elvezetést tesznek lehetővé. A végükről a szigetelést lekaparva kapjuk az elvezetési kontaktust. Wire elektróda: mm átmérőjű acélból készült makroelektródok, melyekkel az agykéreg felszínéről vezetjük el az aktivitást. Rétegelektróda: 24 elvezetési kontaktus található rajta, az egyes csatornák között mikrométer távolság van. Az elektróda vastagsága 350 mikrométer, benne 24 db polyimid szigetelt platina-iridium drót fut, amelyek egyenként 25 mikrométer vastagságúak, és ezek átmetszett része adja az elvezetési kontaktust. A rétegelektróda a 5. ábrán látható. Az 6. ábrán a térbeli elhelyezkedését mutatom be. 5. ábra Rétegelektróda

21 6. ábra A rétegelektróda térbeli elhelyezkedése V.2. Az elektródák implantálása A kísérletekhez használt macskák a Szegedi Egyetemtől kifejezetten erre a célra tenyésztett állatok közül származtak, a kísérletek a Fővárosi Állategészségügyi és Élelmiszerellenőrző Állomás jóváhagyásával történtek. A macskákat a műtét előtt hónapokig szoktattuk az elvezető ketrechez annak érdekében, hogy az állat a műtét után minél otthonosabban érezze magát, megkönnyítve ezzel az elvezetést. A kísérleti macskáknál krónikusan beültethető implantátumokat használtunk. A műtét előtt barbituát származékkal, Nembutállal ( mg/kg i.p.) altattuk őket, a műtét után pedig antibiotikumot (Cobactant) kaptak. A műtét közben a testhőmérsékletet és a légzési szaporaságot monitoroztuk. A macska stereotaxiás agyi atlaszának (Snieder és Niemer, 1961) segítségével meghatároztuk az elektródák kívánt pozícióját, majd stereotaxiás készülék segítségével témavezetőnk, Dr. Karmos György professzor úr implantálta azokat (7. ábra). 21

22 Az elektródák pontos helyének meghatározásához szükség volt a műtét alatti agyi aktivitás monitorozásához is. Ahhoz, hogy az adott agyi struktúra megfelelő pontjára tegyük az elektródát, időnként el kell vezetni az ottani aktivitást és kiértékelni, hogy valóban jó helyen járunk-e. Utóbbit konzulensem, Dr. Ulbert István által fejlesztett mintavevőrendszerrel valósítottuk meg. A megfelelő helyek megtalálása után az egyes elektródákat fogászati cementtel rögzítettük a koponyacsonthoz. A műtétet körülbelül tíznapos lábadozási időszak követte, amely során az állatokat gyakori sebkörnyéki fertőtlenítéssel és antibiotikum beadásával folyamatosan megfigyeltünk, csak ezután kezdődhettek a kísérletek. 7. ábra A műtét közben készült felvételen négy darab, egycsatornás, implantált elektróda látszik. V.3. Elvezetési metódus A dolgozatban a 2-as számú macskáról elvezetett adatokból nyert eredményeket mutatom be, azonban már több macskán is folyamatban vannak a regisztrátumok feldolgozásai. Az elvezetett csatornák sorrendje a következő: 2: 1-24 csatornák: Rétegelektróda csatornái 25-32: Jobb hallókéreg 33-38: Bal hallókéreg 39: Jobb motoros kéreg : Jobb látókéreg 41-42: Jobb Hippocampus 43-44: Bal Hippocampus 45-46: Electrooculogram (jobb és bal) 47-48: Nyaki izom aktivitás (jobb és bal) 22

23 49: Indifferens csatorna 50: Föld A kísérletek végén az állatokat túlaltatták és perfundálták az agyukat. Ezt követően az elektródák szúrt csatornájának pontos helye hisztológiai vizsgálatok során derült ki. A 8. ábrán a 221- es macska rétegelektródjának elhelyezkedése látható. 8. ábra A 221- es macskába helyezett rétegelektróda az A1 electrode felirat alatt látható fekete vonal által meghatározott helyre került a hallókéregbe. A hisztológiai vizsgálatokat Wittner Lucia végezte. A fenti csatornakiosztásnál két ún. trigger csatornát alkalmaztunk, ezek a 24 és 48-as elektródok szignáljai helyett jelzik az állatnak adott hangingerek idejét. Az agyhullámok megfelelő minőségű rögzítéséhez szükséges a jelek előerősítése. Az előerősített jeleket differenciálerősítővel erősítjük és szűrjük, majd A/D kártyával és a konzulensünk által fejlesztett LabView alapú mintavevővel digitalizáljuk. Az átalakítás során kétféle szűrési eljárás következményeként egy időben kétfajta jel jön létre. Az egyiket x@e.cnt fájlnak nevezzük, és a mezőpotenciált tartalmazza; a másikat x@u.cnt nek és a multiunit aktivitást tartalmazza (9. ábra). Utóbbit a neuronális szinten történő sejttüzelést, az egyes sejtek akciós potenciálja adja meg. Mindkettő folytonos fájl, mégis alapjában véve különbözőek a szűrési folyamat miatt. A mezőpotenciál esetén a bemenő analóg jelet Hz-es sáváteresztő szűrővel szűrjük, és 2 khz-es mintavételi frekvenciával mintavételezzük; míg a multiunit aktivitást 300 Hz 5 khz es sáváteresztő szűrővel szűrjük, és khz-el mintavételezzük (Ulbert, 01). A sokcsatornás jelek ezek után megjeleníthetők a 23

24 NeuroScan programcsomaggal vagy a későbbiekben bemutatandó, általunk fejlesztett MCFA-val. 9. ábra A rétegelektródáról elvezetett mezőpotenciál (bal) és soksejt aktivitás (jobb) VI. Matematikai áttekintés VI.1. Biológiai jelek megjelenítése A Fourier transzformáció (a későbbiekben FT) használható nem stacionárius jelekre, amennyiben arra vagyunk kíváncsiak, hogy milyen spektrális komponenseket tartalmaz a jel, de arra nem, hogy mikor történnek azok. Azonban, ha pl. meg szeretnénk tudni, hogy mely spektrális komponensek, időben (intervallumban) mikor történtek, akkor az FT erre a feladatra nem a legjobb választás. Ezen probléma megoldásához egy olyan transzformációt kell alkalmaznunk, amely reprezentálja a jel idő- frekvencia térképét. A Wavelet transzformáció többek között alkalmas erre a feladatra, tehát megadja egy jel idő- frekvencia felbontását (Léteznek másfajta eljárások is, úgymint Short Time Fourier transzformáció, Wigner eloszlás, stb.). Jelen diplomatervben részletesen a Wavelet transzformációval foglalkozom, mivel ezt az eljárást alkalmaztuk az MCFA programunkban. VI.2. Wavelet transzformáció definíciója 24

25 A Wavelet röviden megfogalmazva egy olyan időben korlátozott tartamú hullámforma, amelynek zérus átlaga van. A szinuszhullámok tartama nincs időben korlátozva: mínusz végtelentől plusz végtelenig terjednek. Ezenkívül a szinuszhullámok simák és szabályosak, a waveletek aszimmetrikusak és szabálytalanok. A Fourier analízis egy jel különböző frekvencia összetevőkre bontását jelenti. A wavelet analízis ehhez hasonlóan egy jel olyan összetevőkre bontását jelenti, amely összetevők egy eredeti ψ(t) (ún. anya) wavelet eltolt és átskálázott változatai. Az anya waveletet mindig a feladatnak megfelelően kell választani. Több ablak kipróbálása után programunkhoz a Matlab-ban előre beépített Hanning anya waveletet használtuk. Matematikailag az anya wavelet skálázása és eltolása a következőt jelenti: ahol ψ(t) az anya wavelet, b az eltolás, a a skála paraméter. Világos, hogy amint az a skála paraméter értéke csökken, úgy a wavelet is egyre jobban lokalizálódik spektrális tartományban, egyre inkább alkalmas a magas frekvenciás jelek elemzésére. Egy wavelet a frekvencia- idő síkot Δf *Δt méretű cellára bontja. Ebben a spektrális tartományban a szokásos idő- és frekvenciatartománybeli ábrázolás egy olyan speciális felbontásként fogható fel, amikor az adott cella egyik irányban végtelen kiterjedésű lesz (pontosabban lefedi a teljes megfigyelt spektrumtartományt ill. az egész megfigyelési időt) (10. ábra). 25

26 10. ábra Egy adott jelre jellemző területek a frekvencia-idő síkon (Csákány és Bagoly) Természetesen a fázissíkon végtelen számú felbontással kísérletezhetünk. A waveleteket ezek közül az emeli ki, hogy miközben frekvenciájuk viszonylag jól meghatározott, eközben időbeli helyzetük is korlátozott. Ez a két feltétel - a kvantummechanikai határozatlansági relációhoz hasonló elvi okok miatt - nem elégíthető ki tetszőleges pontossággal egyszerre. A jeleket ún. ortogonális bázisfüggvények szerint fejthetjük ki. Ha ezek a Dirac-delta függvények, akkor a szokásos amplitúdó- idő leíráshoz jutunk, ha ezek a szinusz és koszinusz függvények, akkor ez a Fourier leírás. A 11. ábrán e két leírás mellett más lehetséges waveletbázisok néhány alapfüggvényét tüntettem fel. 26

27 11. ábra Különböző jelek leírására használható bázisfüggvények alakja (Csákány és Bagoly) Az ábrákon a 0, 1, 2, 3 jellel jelölve a időintervallumban választható függvények különböző tagjai láthatóak: az amplitúdó bázis a szokásos amplitúdó- idő leírást jelenti (ennek bázisfüggvényei a Dirac- delták). A Haar bázis az ún. Haar függvényekből, a Walsh bázis a Walsh függvényekből áll. A wavelet csomag bázis a DAUB4 (Daubechies) függvényeket használja, a helyi szinusz bázis alapja egy adott frekvenciájú, de időben Gauss- függvénnyel korlátozott idejű szinuszjel- csomag. A Fourier bázist különböző amplitúdójú szinusz- és koszinuszfüggvények alkotják. A wavelet transzformációk alapstruktúrája rekurzív szűrésekből és (az FFT CT algoritmusánál is megismert) páros- páratlan tagok szétválogatásából áll. A waveletek viszonylag alacsony (az FFT-vel összemérhető) számítási kapacitást igényelnek. A diszkrét wavelet transzformáció (DWT) az FFT-hez viszonyítva is viszonylag gyors műveletsor, amely a 2 N méretű bemenő vektort (adatsort) egy ugyanilyen méretű kimeneti vektorba transzformál át. Ezért mind az FFT, mind a DWT egy forgatásnak fogható fel az amplitúdó- idő tartományból a frekvencia- idő 27

28 térbe, és mindkettő egy- egy mátrix segítségével is megadható (Csákány és Bagoly, ELTE Egyetemi jegyzet). VI.3. Koherencia Legyen K xy az x és y jel koherenciája, amely egyenlő az átlagos keresztteljesítmény spektrummal, a P xy- nal és a következő képlet alapján számítható ki: K xy = P xy 2 / (P xxp yy). A koherencia megméri két jel közötti lineáris összefüggés erősségét minden frekvencián. Mértéke 0 és 1 között változhat és megadja annak fokát, hogy a fázisok egy általunk kiválasztott frekvencián mennyire szétszórtak. K xy = 0 azt jelenti, hogy a fázisok random módon szétszórtak az összes epoch között. K xy = 1 pedig azt jelenti, hogy az x és y jelek fázisai megegyezők minden epochban, például két szignál teljesen fáziszárt azon a frekvencián. Ez a szimmetrikus mérés az EEG epoch-ok kollekciójából van számítva, amelyeket folyamatos, ún. nyers CNT fájlból mintavételezünk. VI.4. Komoduláció Amíg a koherencia megmutatja két jel között a fázisbeli hasonlóságot, addig a komoduláció esetünkben megmondja két EEG szignál amplitúdóbeli kapcsolatának mértékét. Tehát a kapott [-1 1] mennyiség megmutatja, hogy egy csatorna adott jelének X frekvenciáján a teljesítmény megváltozása mennyire koherens egy másik csatorna Y frekvenciáján történő teljesítményváltozással (X=Y is lehet) (Welch és mtsai, 1967). 28

29 VII. Számítógépes analízis A macskák agyából elvezetett analóg bioelektromos jelek A/D konverzió után kerültek a számítógép winchesterére. Az adatok feldolgozása (válogatás, szűrés, átlagolás, stb.) részben a Neuroscan Edit programcsomag segítségével, részben a bevezetőben említett saját fejlesztésű MATLAB alapú programcsomag segítségével történt. Legelőször a nyílt forráskódú, ingyenesen letölthető Matlab alapú EEGlab programcsomagot ( használtuk, amely grafikus felhasználói környezettel rendelkező, elektrofiziológiai adatok analízisére szolgáló szoftver. A program sok funkciója közül számunkra a leginkább hasznos az EEG regisztrátum egy kiválasztott csatornáján végrehajtható Fourier- vagy Waveletanalízis. Ezzel egy csatornára az Event Related Spectral Perturbation (ERSP), valamint az Inter Trial Coherence (ITC) is megbízhatóan kiszámítható. Grand Lászlóval készítettük a Multiple Channel Frequency Analysis (MCFA), Matlab alapú programcsomagot, amely Rövid idejű Fourier vagy Szinuszoid Wavelet analízisét tudja kiszámítani több csatornának egy időben, amelynek eredményét egy kezelőfelületre teszi, ezáltal könnyítve meg az elvezetett sokcsatornás jelek idő- frekvencia teljesítményeinek nyomonkövetését, összehasonlítását. Többféle idő- frekvencia elemzési módszert építettünk be, amelyeket a következőkben részletesen fogok bemutatni. Az MCFA ezen kívül jól használható koherencia, komoduláció vizsgálatára; jelteljesítmény-analízisre, áramsűrűség-eloszlás (Current Source Density: CSD) vizsgálatára, különböző frekvenciájú hangsorozatok által kiváltott potenciálok elemzésére, valamint sokcsatornás EEG- vagy CNT- jel megtekintésére. Az említett Neuroscan és NeuroEdit szoftverekkel az MTA- Pszichológiai Kutatóintézetében dolgozhattam. A NeuroScan sokféle funkcióval rendelkező szoftvercsomag, amelyet agyi aktivitás felvételére és feldolgozására fejlesztettek. Fejlesztése 1986-tól folyamatos, de számos olyan funkció van, amely számunkra nélkülözhetetlen és ebben nem található meg, vagy nem az általunk kívánt formában használható. Ilyen - többek között - a beépített, kezdetleges idő- frekvencia analízise is. Jó idő- frekvencia analízist végző szoftverrel az EEGlab-on kívül kevéssel találkoztam, egy volt csak, ami reményt keltett bennem. Egyrészt azért, mert 29

30 jónéhány agyi aktivitást elemző szoftver funkciói között ez nem szerepelt, másrészt ha be is volt építve egy adott szoftverbe, az nem a számunkra megfelelő módon működött. Ez utóbbira példa a NeuroScan, ahol a paraméterek nem állíthatók, valamint az ábrázolási forma sem a megkívánt hőtérkép, hanem grafikon. Ez utóbbi ára körülbelül dollár, hasonlóan a többi nagy cég által forgalmazott termékhez. Problémát jelent az is, hogy a különböző cégek termékei sokszor csak a saját mintavételezőjükkel felvett fájlok adatformátumát támogatják, így az esetünkben saját fejlesztésű mintavételezővel - felvett jel nem kompatibilis azokkal. A tudományos folyóiratok cikkeihez idő- frekvencia analízist végző programok nagy része saját fejlesztésű, Matlab alapú, de ezek - érthető okok miatt nem elérhetők az adott kutatócsoport tagjain kívül. Lehetőségem volt még a Matlab- ban eredetileg rendelkezésre álló Wavelet és Fourier függvényeket kipróbálni, de ezek sem voltak jól paraméterezhetőek, így nem használtam tovább őket. A NeuroGuide ( próbaváltozatával sem voltam megelégedve, mert sem az ábrázolási forma, sem a kizárólagos egycsatornás megjelenítése sem kielégítő. Ezek után meglepetést okozott a Borland Delphi-ben Windows operációs rendszerhez fejlesztett LetsWave programcsomag. Ez mind megjelenítésben, mind a funkciók sokszínűségében hozta azt, amit szerettem volna, és ráadásul ingyenesen letölthető. Problémát csak az jelent, hogy az általa használt adatformátum más, mint amit mi rögzítünk a mintavételezőnkkel, így a felvételeink nem analizálhatók vele, csak hosszadalmas konverzió után. VII.1. Az MCFA program bemutatása A Multiple Channel Frequency Analyser funkcióinak segítségével hatékonyabban vizsgálhatjuk a generátorstruktúrákat, olyan összefüggéseket deríthetünk fel, amely szabad szemes vizsgálódáskor nem láthatók a jelben. Így nemcsak az idő- frekvencia analízisét tudjuk megnézni egy jelnek, hanem a jelek időfrekvencia és fázis változásainak folyamatát videón is követhetjük, vizsgálhatjuk a komodulációt, a CSD térképet valamint a Variable Inter Stimulus Interval paradigmát (VISI) feldolgozó analízisek segítségével a hallókéreg különböző frekvenciájú ingerekre adott válaszaiból is fontos következtetéseket vonhatunk le. Ezeken kívül a 30

31 különböző statisztikák számítása mellett az elvezetett jelek megjelenítésére is módunk van. A funkciók részletes leírását ebben a fejezetben ismertetem. A következő fogalmak megértése az idő- frekvencia analízis számításánál rendkívül fontosak: ERSP: Event Related Spectral Perturbation: eseményhez kötött potenciál spektrális perturbációja. Megmutatja az EKP- nál kialakult teljesítményváltozásokat egy alapvonalkoz képest (Delorme és Makeig, 04). ITC: Inter Trial Coherence: az epoch -ok közötti koherencia mértékét mondja meg. Segítségével megmutatható, hogy az ERSP térképen kapott eredmény mennyire azonos az összes epoch-ot tekintve. Ahol az ITC térképen a koherencia értéke magas, ott az összes epoch- on hasonló jelteljesítmény található (Delorme és Makeig, 04). Az esemény által kiváltott spektrális perturbációt a következő képlet alapján számoljuk ki: ERSP n 1 ( f, t) n ( f, t) k 1 F k 2 Ahol n db epoch- ra, ha F k(f,t) a k. epoch (f. frekvencián és t. időben) spektrális becslése. Itt F k(f,t) kiszámításához kétféle analízist használtunk. Először a Fourier transzformáció továbbfejlesztett változatát, a Gábor Dénes féle ún. Rövid idejű Fourier transzformációt (angolul Short Time Fourier Transformation, röviden STFT) használtuk, majd annak egy továbbfejlesztett változatát, az ún. Szinuszoid wavelet transzformációt. Az STFT- t azért használtuk először, mivel programozástechnikailag könnyebb megvalósítani a változó ablakméreteket használó wavelet transzformációnál. Ez a Fourier- transzformáció adaptált változata, mellyel a jelnek egyszerre csak egy rövid szakaszát elemzik ezt az eljárást a jel ablakolásának nevezik. Ez a jelet egy kétdimenziós idő- frekvencia diagramra képzi le. Az STFT egyfajta kompromisszumot képvisel egy jel idő- és frekvencia alapú nézőpontjai között. Mindkettőről közöl tehát információt, hogy mikor és milyen frekvenciájú jel esemény történt. Viszont csak korlátozott pontossággal képes szolgáltatni ezt az információt és a pontosság az ablak méretétől függ. Az STFT legfőbb hátránya, hogy miután kiválasztottunk egy ablak méretet az idő változó tekintetében, ez az összes frekvenciára ugyanaz marad. Sokfajta jel ennél rugalmasabb megközelítést kíván olyat, amikor változtathatjuk az ablak méretét akár az idő, akár a frekvencia pontosabb meghatározása céljából. 31

32 A következő logikus lépés tehát a wavelet- transzformáció (WT): változó méretű ablakokkal történő analízis. Ekkor az ablak méretét nagyobbra vehetjük az alacsony frekvenciás rész elemzéséhez, de kisebb méretű ablakot használhatunk a magas frekvenciás információ előállításához. Az 12. ábra összefoglalóan mutatja az idő, frekvencia, STFT és WT transzormációk nézőpontját, ahonnan a jelet szemléljük. 12. ábra A wavelet analízis evolúciója A waveletek alkalmazásának egyik fő előnye az, hogy lokális elemzést tesznek lehetővé azaz egy kiterjedtebb jel kisebb részének az elemzését. A következőkben nagyon leegyszerűsítve bemutatom a wavelet transzformáció lényeges kódrészletét Matlab környezetben. Először kiszámítjuk az ablakméreteket. Mivel tudjuk, hogy egy epoch hány pontot tartalmaz (frame), ezért az ablakméret a Matlab beépített függvényei segítségével egyszerűen kiszámítható. A nextpow2 függvény segítségével meghatározzuk, hogy az adott frame (ami egy szám), kettő hányadik hatványához van legközelebb. Ebből kivonunk hármat, így biztosítjuk a megfelelően kicsi ablakméretet, amely szám kettő hatványa lesz. Tehát az ablakméret a következőképp néz ki Matlab-ban: ablakméret = max(pow2(nextpow2(frame)-3),4); % frame: egy epoch pontjainak száma Ezek után meghatározzuk a wavelet frekvenciafelbontását, amely a már ismert mintavételi frekvencia, ciklus, ablakméret, valamint az ún. padratio (horizontális frekvencia felbontás) segítségével az alábbiak szerint könnyen kiszámítható: frekvenciák = mintavételi_frekvencia * ciklus / ablakméret * [2 : 2/padratio : ablakméret] / 2; 32

33 A Hanning ablakokat egy már meglévő diszkrét Fourier filter függvény (dftfilt.m) segítségével számítottuk ki: win = dftfilt(ablakméret,maximális_frekvencia / mintavételi_frekvencia,ciklus, padratio,ciklusfaktor); Ahol a (szimmetrikus) Hanning függvény a következő: w =.5*(1 - cos(2*pi*(1:n/2)'/(n+1))); w = [w; w(end:-1:1)]; Majd az idő felbontás értékeinek kiszámítása következik. Először az ablak időablak minimumától számított kezdő pozíciót határozzuk meg a mintavételi frekvencia, valamint az ablakméret ismeretében: wintime = 0 / mintavételi_frekvencia * (ablakméret / 2); A pontos időbeli felbontás értékei az alábbiak szerint kerülnek kiszámításra: időpontok = [időablak_minimum) + wintime:(időablak_maximum - időablak_minimum -2 * wintime) / (időbeli_felbontás - 1) : időablak_maximum - wintime]; A fentiekben megfogalmazott idő, illetve frekvencia felbontások ismeretében kiszámíthatjuk a lépésközt, amely megadja a wavelet transzformáció során az ablak ugrásainak méretét. Majd kér for ciklus segítségével kiszámítjuk az összes epoch teljesítményét időbeli felbontásuk szerint az összes frekvencián. A fent megadott ERSP(f,t) képlet alapján a kapott F k(f,t) eredményeit, amelyet az alábbi kódban tmpadat-ként definiáltam, szummázzuk és négyzetre emeljük az egyedi epoch-ok összegét. Így megkapjuk egy teljes EEG csatorna teljesítményét. lépés = (frame-ablakméret)/(időbeli_felbontás-1); for k=1:epoch for t=1:időbeli_felbontás tmpadat = Adat ([1:ablakméret] + floor((t-1) * lépés) + (k - 1) * frame); 33

34 end tmpadat = tmpadat - mean(tmpadat); % kivonjuk az átlagot tmpadat = transpose(ablak) * tmpadat(:); ERSP(:, t) = abs(tmpadat).^2; end A kapott ERSP teljesítmény mátrixot ezek után ábrázoljuk egy színes hőtérképen. Amennyiben szükséges, akkor megadhatunk egy alapvonalat, amihez képest megjelenítjük az adatot. VII.2. Az MCFA működése, funkciók Az MCFA legújabb verziója feltételezi a Matlab 7-es változatának rendelkezésre állását a számítógépen. A parancssorba mcfa -t beírva a következő kezelőfelület jelenik meg (13. ábra): 13. ábra Az MCFA kezelőfelülete Dolgozatom ezen fejezetében a szoftverben található menüket és almenüket hierarchikus sorrendben fogom tárgyalni az esetlegesen odatartozó biológiai és jelfeldolgozási fogalmak ismertetésével. A szemléltető ábrák nagyrésze ugyanabból a mintafájlból készült, az egy csatornás ábrázolások az egyszerűség kedvéért mindig az ötös csatornát mutatják. 34

35 FILE menü: - Open NeuroScan AVG file: A NeuroScan-ben átlagolt fájlok betöltése - Open NeuroScan CNT file: A rögzített, nyers CNT fájlok betöltése - Open NeuroScan EEG file: A NeuroScan-ben EEG-vé alakított (epoch) fájlok betöltése - Load Sweeps for Loadeeg: Az EEG fájlok betöltésénél megadhatjuk a betölteni kívánt sweepek számát egy tól ig korláttal. - Load Dataset: Dataset beolvasása - Save Dataset: A betöltött adat dataset-ként elmentése - Quit: Kilépés a programból A CNT fájl folytonos adatfájl, amely header résszel és adat résszel is rendelkezik. Nem más, mint az analóg jel szűrt és diszkretizált változata, amely az V.3 alfejezet végén ismertetettek alapján tartalmazhatja a multiunit vagy a mezőpotenciál aktivitásokat. A folytonos fájl nagy méretű, sok csatorna aktivitását tartalmazza. A NeuroScan szoftverrel sokféleképpen dolgozhatjuk fel a CNT fájljainkat és hozhatunk létre a mezőpotenciált tartalmazó CNT- ből úgynevezett EEG fájlokat. Az EEG időablakokban (sweep vagy epoch) tartalmazza az eredeti CNT aktivitást, például egy szekundumos CNT- t 4 darab 5 szekundumos sweepre bontva szét. Ez természetesen eseményekhez párosított időablakok kialakítását jelenti. Az EEG egyes sweepjeiben található aktivitásokat átlagolva kapjuk meg az AVG (average) fájlokat, ami az összes sweep alapján képezett jelátlagot tartalmazza. TOOLS menü: Time-Frequency Analysis almenü: - Multiple Channel Frequency Analysis: az idő- frekvencia analízist több csatornára nézve a következő paramétereket adhatjuk meg (14. ábra): 35

36 Csatornák száma Az időablak minimuma (ms) Az időablak maximuma (ms) Wavelet / Fourier transzformáció( 0=FFT) Egy epoch időfelbontása Az eredmény ábrázolása db-ben vagy V-ban Szignifikancia szint (alapból nem definiált) EEG fájl tulajdonságait írja ki a hőtérkép fölé A hőtérképet elmenti.fig kiterjesztésben A hőtérkép minimuma A hőtérkép maximuma Számításba vett legnagyobb frekvencia (Hz) Frekvencia felbontás finomítása Alapvonal kezdőpontja (ms) Alapvonal végpontja (ms) Átlagos teljesítmény kirajzolása külön ablakban 8x8- as elrendezésben rajzolja ki az eredményt 14. ábra A sokcsatornás idő- frekvencia analízis paraméterablaka 36

37 A többcsatornás idő- frekvencia analízist a megfelelő paraméterekkel beállítva kapjuk a csatornánkénti idő- frekvencia analízisek térképeit (15. ábra), valamint a különböző csatornák frekvencia- átlagteljesítmény grafikonjait (16. ábra). A frekvencia- átlagteljesítmény grafikonokat egy ablakban is ábrázolhatjuk (17. ábra). Filename: 24@e_dow ns.eeg Epochmin: -500 Epochmax: 500 ERSPmin: 10 ERSPmax: 70 Maxfreq: Bootstrap: NaN Baseline min: NaN Baseline max: NaN ábra Az MCFA-val 23 csatornára számított idő-frekvencia analízis eredménye. Az x tengely az időt, az y a frekvenciákat ábrázolja. A hőtérképek jobb oldalán szerepel a db szerinti színskála. A piros szín teljesítmény növekedést, a kék teljesítmény csökkenést jelez az adott időpontban az adott frekvencián. 16. ábra Az átlagteljesítmények (db) csatornánként a frekvencia (Hz) függvényében 37

38 Average Power (db) Frequency (Hz) 17. ábra A csatornánkénti átlagos teljesítmények (db) a fekvencia függvényében egy ablakban. A hőtérképes ábrákon bármely csatorna frekvencia térképére kattintva megnézhetjük nagyított változatát, bele is nagyíthatunk, valamint az egy időponthoz vagy frekvenciához tartozó teljesítményeket pontosan ki is olvashatjuk (18. ábrán fehér négyzet). X: Y: Index: 53.1 RGB: 1, 0.719, ábra Idő-frekvencia analízis egy csatornára (ötös csatorna) 38

39 Multiple Channel Inter Trial Coherence: Az időablakok közti (fázis) koherenciát (ITPC) a következő képlet alapján számítottuk ki: 1 ITPC( f, t) n F ( f, t) n k k 1 Fk ( f, t) Az ITC mértéke egy 0 és 1 közötti szám. A 0 az EEG adat és az időhöz kötött esemény között lévő szinkronizáció hiányát, míg az 1 a teljes szinkronizációt jelenti. Az ITPC kiszámításához először normalizáljuk minden egyes időablak- aktivitás vektor hosszát egyre, majd vesszük ezek komplex átlagát. Így a kapott információ csak az időablakok spektrális becslésének fázisait tartalmazza. A többcsatornás ITC paraméterezése hasonló az esemény által kiváltott spektrális perturbációnál bemutattakhoz, azzal a különbséggel, hogy nincs értelme a μv- db átváltásnak. (19. ábra). 19. ábra Az MCFA-val 21 csatornára számított Multiple Channel Inter Trial Coherence (ITC) Mind az ERSP, mind az ITC számításánál sokféle paraméter állítható be, amelyeknek helyes értéke legkönnyebben tapasztalati úton sajátítható el. A sokcsatornás analízis mellett lehetőség van az egycsatornás ERSP és ITC analízisekre is. Ezek szintén jelentős vizsgálati eszközök, a szoftver menürendszerében azért lett 39

40 alacsonyabb szintre helyezve, mert ritkábban használjuk, mint a sokcsatornás változatot. - Single Channel ERSP: egycsatornás ERSP vizsgálat. A sokcsatornás változathoz képest a paraméterezésében nincsen különbség. A megjelenítésnél a hőtérkép alján nyomon követhetjük a legalacsonyabb és legmagasabb átlagteljesítmények értékeit az idő függvényében (alsó grafikonon a kék és zöld görbék), valamint az átlagteljesítményeket a frekvencia függvényében a hőtérkép bal oldalán (. ábra) (Baudry és mtsai, 1996; Delorme és Makeig, 04).. ábra Egycsatornás ERSP számításakor az átlagteljesítmény az idő (alsó grafikon) és a frekvencia (bal oldali grafikon) függvényében. Az ábra az ötös csatornát ábrázolja. - Single Channel 3D ERSP: a kétdimenziós ábrázoláshoz képest ez három dimenzióban ábrázolja az aktivitást, ahol a harmadik dimenzió a teljesítmény. Egy csatorna idő- frekvencia aktivitását figyelhetjük meg vele. A komponensek teljesítménye közötti különbségeket még jobban láthatjuk a 3D-s reprezentációval (21. ábra).

41 uv Freq. (Hz) Filename: ns.eeg Epochmin: -500 Epochmax: 500 ERSPmin: 10 ERSPmax: 70 Maxfreq: Bootstrap: NaN Baseline min: NaN Baseline max: NaN ábra Egycsatornás, 3 dimenziós idő-frekvencia-teljesítmény ábrázolás - Single Channel ITC: paraméterezése annyiban különbözik a sokcsatornás változattól, hogy ennél nem kérhető alap ábrázolásmód, így a megjelenített hőtérkép alján lévő grafikon az eredeti jelet ( V) mutatja az idő függvényében, a bal oldali grafikon pedig a különböző frekvenciákhoz tartozó szignifikanciát (22. ábra) @e d owns.eeg ITC ERP Time (ms) 22. ábra Egycsatornás ITC analízis 0 41

42 - Multiple Channel 3D Average Power: sok csatorna frekvencia- teljesítmény függvényét követhetjük nyomon ennek a funkciónak a segítségével. A három dimenziót itt a csatornaszám-frekvencia-teljesítmény dimenziók adják (23. ábra). 23. ábra Sokcsatornás, háromdimenziós átlagteljesítmény ábrázolás - Significance between two channels: Az MCFA szoftverbe már korábban bekerült a sokcsatornás idő- frekvencia analízis bootstrap szignifikancia vizsgálata. Ez annyit jelent, hogy előre megadhatunk a programnak egy p valószínűségi értéket, amely a kiszámolt átlagteljesítmény értékek bootstrap szignifikancia - szintjét vizsgálja az alapvonalhoz (baseline) képest. Ha ezek az értékek a p számnál nagyobbak, akkor az adott helyeken a teljesítménymátrix hőtérképe semleges színt kap (esetünkben zöld színnel). A későbbiek során szükség volt kettő vagy több külön elektródáról elvezetett mezőpotenciál közötti szignifikanciavizsgálatra is. Ehhez a feladathoz nem elég a fenti átlagteljesítmény- értékeket használni, így a több külön csatornáról történő elvezetéseket sweep- enként szükséges összehasonlítani. Kiszámítjuk a sweep- enkénti teljesítményeket, megkapjuk a beadott csatornákkal 42

43 megegyező számú 3 dimenziós mátrixokat. Ezek a tömbök tartalmazzák az egyes sweep- ek teljesítményeit minden frekvencián és időpillanatban a wavelet, ill. FFT analízis felbontásától függően. Minden csatorna, minden sweep- ének azonos pontjában lévő értékein elvégezzük a Kruskal- Wallis nemparametrikus egyirányú variancia analízist (Gibbons, 1965; Hollander és mtsai, 1973). Ezáltal kapjuk meg a csatornák közti statisztikai értékeket kétdimenziós mátrixban, melynek mérete megegyezik az egyes csatornák teljesítménymátrixával. Ha ezen mátrix értékei nagyobbak a megadott p valószínűségi számnál, akkor ez azt jelenti, hogy abban a pontban a csatornák teljesítményértékei nem szignifikánsak, így a bootstrap analízishez hasonlóan ezek az értékek kinullázódnak, de nem az eredeti átlagteljesítmény mátrixban, hanem a csatornák teljesítményeinek különbségmátrixában. Végeredményül egy olyan mátrixot kapunk, amelyet hőtérképpel megjelenítve csak a két csatorna idő- frekvencia teljesítmény különbségének statisztikailag szignifikáns részeit láthatjuk. (24. ábra) 24@e h ippo c ort a zon d.eeg - 24@e h ippo c ort d iff d.eeg stat.' ' Ep.min: -21 Ep.max: 21 ERSPmin: -10 ERSPmax: 10 Maxfq: Sign.: 0.01 Blmin: Blmax: ábra Két csatorna teljesítménykülönbségeinek statisztikailag szignifikáns részei A Tools menü Time-Frequnecy Analysis almenüjébe tartozik továbbá három videókészítő funkció is. Ezek a következők: 43

44 - Time-Frequency Analysis Moviemaker: paraméterezése az ERSP- nél megszokott, de kimenete egy videófájl, amiben a csatornákra számított idő-frekvencia hőtérképeket látjuk egymás után a képkockákban. Lejátszva látványos folyamatot kapunk a csatornák idő- frekvencia teljesítményváltozásairól. Lényeges, hogy egy fájlból származó adatokat használ fel. - Time Frequency Analysis 3D Moviemaker: azon az elven működik, mint az előző funkció, de itt a videó a csatornák idő- frekvencia- teljesítmény háromdimenziós képeit teszi egymás után képkockába. - Time-Frequency Analysis Moviemaker (Multiple File): több bemeneti fájlból kétdimenziós videót készít. A funkció lényege, hogy bizonyos folyamatoknál különböző időtartományban (fázisban) adva az ingert, a várt komponens különböző teljesítmény- és frekvenciaintenzitással jelentkezik. Több fájlt hozunk létre attól függően, hogy mikor adtuk az ingert, és ezeket a fájlokat adjuk meg bemenetként. Végeredményként pl. olyan videót kapunk, ahol az inger egyre közelebb van a kiváltott komponenshez, így jól látszik, hogy az ingert mely fázisban adva kapjuk a legnagyobb kiváltott aktivitást. - Time Frequency Difference Analysis: két fájlt és tetszőleges számú csatornát megadva kiszámítja a csatornák idő- frekvencia teljesítmény különbségeit. Segítségével könnyen meghatározható a két fájl csatornáinak időfrekvencia teljesítmény analízisében felfedezhető különbségek. Comodulation Analysis almenü A komoduláció matematikai ismertetése a VI.4. fejezetben található. Az alap Matlab függvény Kenneth D. Harris professzor úrtól származik. 44

45 - Auto Comodugram: ezzel a funkcióval egy fájlból több csatornát kiválasztva (akár az összeset), az összes többi általunk kiválasztottal hasonlítja össze. Ablakonként növekvő frekvenciasávokat ábrázolva a csatornák közti komodulációt kapjuk eredményül. Ablakonként a beadott csatornák közötti komoduláció értékeit az adott frekvenciasávon látjuk. Paraméterezése lényegesen eltér az eddig látottaktól, ezért ezt az alábbiakban bemutatom (25. ábra). A sok frekvenciaablakot tartalmazó eredményből a 26. ábrán a nagyjából 4-6 Hz közötti tartományt mutatom be, ahol a fájlban lévő 21 csatornát hasonlítottuk össze mind a 21-el. Összehasonlítandó csatornák száma Összehasonlított csatornák száma Színskála be/ki Mintavételezési fekvencia (Hz) Figyelembe vett legkisebb frekvencia (Hz) Az eredménykép ábrázolási módja (négyzet vagy háromszög) A színskála minimuma A színskála maximuma A Fourier transzformáció pontjainak száma Figyelembe vett legnagyobb frekvencia (Hz) Az eredménykép felbontása 25. ábra Az autokomoduláció paraméterablaka 45

46 Scalemin: 0 Scalemax: 1 nfft: 512 Sampling Freq.: 0 Resolution: Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz Hz ábra Autokomodulációs térképek Természetesen a diagonál feletti rész ugyanazt adná eredményként, mint a diagonál alatti, ezért a program ha nem kérjük külön (Plotting mode/square) ezt nem ábrázolja. - Comodugram (2 channels): segítségével két csatorna közti komodulációt számíthatjuk ki. Ha ugyanazt a csatornát adjuk meg összehasonlítónak és összehasonlítottnak, akkor autokomodulációt kapunk. Ez esetben, a főátlóban ugyanazon csatorna ugyanazon frekvenciás komponenseit hasonlítjuk össze, amelyeknek komodulációja természetesen egy, így azok piros színűek (27. ábra) ábra Komoduláció két csatorna között. Az ábra az ötös csatorna önmagával mutatott komodulációját (autokomoduláció) mutatja. 46

47 - Comodugram 3D (2 channels): az előzőleg leírt funkció háromdimenziós megvalósítása (28. ábra). 28. ábra Két csatorna közötti komoduláció 3D megjelenítéssel. Az ábra az ötös csatorna önmagával mutatott komodulációját (auto-komoduláció) mutatja. Valóságban forgatható. - Comodugram (multiple channels): míg az autocomodugram különböző frekvenciasávokban ábrázolja a csatornák közötti komodulációt, addig ez a funkció egy csatorna aktivitását hasonlítja össze az általunk megadottakkal, eredményként pedig egy felületre teszi az x. és y. csatornák komodulációs térképeinek ablakait. Ha tehát az 11-es csatornát a fájlban található 48 csatornával összehasonlítjuk, akkor az eredmény 48 ablak lesz. A 29. ábrán a 11- es csatorna 48 csatornával összehasonlított sokcsatornás komoduláció analízisének egy részlete látható. A képen megfigyelhető, hogy mivel a felső 10- es csatorna a rétegelektródon szomszédos a 11- es csatornával, így a két elektródról elvezetett jel nagymértékben komodulál egymással, ellenben a 11- es és 42- es csatorna jelei között kisebb komoduláció van. 47

48 Frekvencia (Hz) Komod csatorna csatorna Frekvencia (Hz) ábra A 11. csatorna komodulációja a 10- es és 42- es csatornával - Comodugram 3D (multiple channels): az előzőleg bemutatott funkció háromdimenziós megjelenítővel. Az egyes és ötös csatornák komodulációjának nagyított változatát mutatom be a sok ablak közül (30. ábra). 30. ábra A sokcsatornás háromdimenziós komodulációból az 1- es és 5- ös csatornák komodulációja. 48