Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata- B szint

Átírás

1 Szegedi Tudományegyetem ÁOK Sebészeti Műtéttani Intézet december 06-december 15. Referencia szám: AA1.0/2015; AB1.0/2015 Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata- B szint Core modul 1/2 Állatkísérletek jogi szabályozásának gyakorlata I. Dr. Kaszaki József SZTE Sebészeti Műtéttani Intézet I. szemeszter

2 II. FEJEZET: A KÍSÉRLETBEN FELHASZNÁLHATÓ ÁLLATOKRA VONATKOZÓ RENDELKEZÉSEK

3 Ávt. 2. b) Az alapok Ávt. A törvény hatálya kiterjed: A kutatási-kísérleti célra szolgáló állatokra, a diagnosztikai vizsgálat és az oltóanyag-termelés céljából tartott állatokra, a génbankként kezelt állatokra, a géntechnológiával módosított gerinces állatokra, a tudományos ismeretterjesztés és az oktatási demonstráció céljából tartott állatokra. i) A veszélyes állatokra, a háziasított állatok gazdátlan egyedeire (kóborállat), az állatkertekben, a vadaskertekben és a vadasparkokban élő (tenyésző) állatokra, továbbá a vadon élő fajok bármilyen célból fogva tartott egyedeire, ha külön jogszabály másként nem rendelkezik.

4 Mit nevezhetünk kísérleti állatnak? 1. 40/2013 Korm. Rendelet (1) E rendelet hatálya alá a kísérletek során felhasznált vagy ilyen felhasználásra szánt, valamint a kifejezetten szerveik vagy szöveteik tudományos vagy oktatási célra történő felhasználásáért tenyésztett, szaporított a) élő gerincesek, beleértve aa) az önállóan táplálkozó lárvaállapotú állatokat, valamint ab) az emlős magzatokat rendes fejlődésük utolsó harmadában; b) élő lábasfejűek tartoznak. (2) E rendelet előírásai mindaddig alkalmazandók, amíg a rendelet hatálya alá tartozó állatot le nem ölik, újból ki nem helyezik, vagy vissza nem juttatják egy megfelelő élőhelyre vagy állattartási rendszerbe.

5 1. 40/2013 Korm. Rendelet (4) E rendelet előírásai nem alkalmazandók az állatgyógyászati készítmény forgalomba hozatalának engedélyezéséhez szükséges állatorvosi klinikai vizsgálatra és az elismert állattartási gyakorlatra. Az elismert állattartási gyakorlat, nem kísérleti jellegű mezőgazdasági vagy állatorvosi tevékenységnek minősül.

6 Kísérleti célra tenyésztett állatfajok 3. 40/2013 Korm. Rendelet (1) Az alább felsorolt fajok egyedét csak akkor lehet kísérlet során felhasználni, ha azt kifejezetten e célra tenyésztették: a) egér (Mus musculus), b) patkány (Rattus norvegicus), c) tengerimalac (Cavia porcellus), d) szíriai aranyhörcsög (Mesocricetus auratus), e) kínai törpehörcsög (Cricetulus griseus), f) mongol futóegér (Meriones unguiculatus), g) nyúl (Oryctolagus cuniculus), h) kutya (Canis familiaris), i) macska (Felis catus), j) a főemlős állatok összes faja, k) dél-afrikai karmosbéka (Xenopus laevis), nyugati karmosbéka (Xenopus tropicalis), gyepi béka (Rana temporaria), északi leopárdbéka (Rana pipiens), l) zebradánió (Danio rerio). (2) A megyei kormányhivatal Élelmiszerlánc-biztonsági és Állategészségügyi Igazgatósága tudományos indokok alapján mentességet adhat az (1) bekezdés a)- i), illetve k)-l) pontjai alól.

7 Kedvtelésből tartott fajok kísérleti felhasználása 4. 40/2013 Korm. Rendelet Amennyiben tudományos okból szükséges, ismert tartóval rendelkező kedvtelésből tartott állatok is felhasználhatók, kizárólag enyhe besorolású kísérletben. A felhasználáshoz a tartó előzetesen írásban tett tájékozott beleegyező nyilatkozata szükséges.

8 Háziasított állatfaj kóbor egyedeinek felhasználása kísérleti célra Ávt. 30. TILOS (4) Háziasított állatfaj kóbor egyedét, valamint vadon befogott állatot a (6) bekezdésben foglalt kivétellel kísérlet céljára felhasználni nem szabad. (6) Az állatvédelmi hatóság e törvény végrehajtására kiadott rendeletben meghatározott feltételek fennállása esetén, mentességet adhat a (4) bekezdés alkalmazása alól.

9 Háziasított állatfaj kóbor egyedeinek felhasználása kísérleti célra 5. 40/2013 Korm. Rendelet Az élelmiszerlánc-biztonsági és állategészségügyi igazgatóság az Ávt. 30. (6) bekezdése szerinti jogkörében eljárva a kísérlet engedélyezése során erre irányuló kérelemre mentességet adhat a háziasított állatfajok kóbor egyede vonatkozásában, amennyiben: a) alapvető szükség van ezen állat egészségére és jólétére vonatkozó tanulmányokra, vagy jelentős veszély áll fenn a környezetre, vagy az emberi vagy állati egészségre vonatkozóan; és b) tudományos indokok alapján a kísérlet kizárólag gazdátlan vagy elvadult állat felhasználásával vezethet eredményre.

10 Főemlősök felhasználása kísérleti célra Ávt. 30. (2) Az emberszabású majmok kísérleti célú felhasználása tilos. (3) Nem emberszabású főemlősök kísérleti célú felhasználása csak e törvény végrehajtására kiadott rendeletben meghatározott feltételek fennállása esetén engedélyezhető.

11 Főemlősök felhasználása kísérleti célra 6. 40/2013 Korm. Rendelet (1) Nem emberszabású főemlős állatok egyedeinek kísérletben való felhasználása kizárólag abban az esetben engedélyezhető, ha: a) a kísérlet megfelel az alábbi feltételek egyikének: aa) a kísérlet célja alapkutatás, és a felhasznált állat fogságban tenyésztett állat utóda, ab) a kísérlet célja transzlációs vagy alkalmazott kutatás, és a kísérletre károsító vagy potenciálisan életveszélyes emberi klinikai állapotok elkerülése, megelőzése, diagnózisa vagy kezelése érdekében kerül sor, továbbá a felhasznált állat fogságban tenyésztett állat utóda, ac) a kísérlet célja fajok megőrzésére irányuló kutatás; b) tudományos indokok alapján a kísérlet a főemlősökön kívül más állatfaj felhasználásával nem vezetne eredményre; és c) az állatot korábban nem tartották állatkertben. A fentiek a közönséges makákó (Macaca fascicularis) és a rhesusmajom (Macaca mulatta) kísérletben való felhasználására is vonatkoznak.

12 Mezőgazdasági haszon állatok, mint kísérleti állatok (1) Kísérlet céljára a laboratóriumi állatokon kívül a) a folyamatos állat-egészségügyi ellenőrzés alatt álló tenyészetből, telepről származó gazdasági haszonállatok és társ-állatfajok egyedei használhatók fel. baromfi; sertés, juh, kecske, szarvasmarha, ló (2) Az állatkísérleti engedély nem terjedhet ki háziasított állatfaj kóbor egyedeire, beleértve a kóbor kutyát és macskát.

13 Vadon élő állatok, mint kísérleti állatok Vadászgörény Könnyen kezelhető, barátságos, kíváncsi. Jól alkalmazkodik laboratóriumi körülményekhez, barátságos

14 Vadon élő állatok, mint kísérleti állatok??? Az oposszumok érdekes módon immunisak a kígyóméreggel szemben. Az 1990-es években egy kutatócsoportnak sikerült azonosítaniuk egy szérumfehérjét, amely képes semlegesíteni a kígyómérget. A kutatók kígyóméreggel mérgezett egereken tesztelték az általuk előállított fehérjét, és azt tapasztalták, hogy védelmet nyújt az Egyesült Államokban honos nyugati gyémántcsörgőkígyó és a pakisztáni Russellvipera mérge ellen.

15 Vadon élő állatok, mint kísérleti állatok 7. 40/2013 Korm. Rendelet (1) Az Élelmiszerlánc-Biztonsági és Állategészségügyi Igazgatóság mentességet biztosíthat a vadon befogott állat vonatkozásában, amennyiben tudományos indokok alapján az adott kísérlet, tenyésztett állatokon vagy folyamatos állat-egészségügyi ellenőrzés alatt álló tenyészetből, telepről származó állatokon végezve nem vezetne eredményre. 4) Természetvédelmi oltalom alatt álló faj egyedei esetében az (1) bekezdés szerinti mentesség kizárólag a természetvédelmi hatóság tartásra és hasznosításra vonatkozó engedélyének megléte esetén adható (4) A természetvédelmi oltalom alatt álló vagy nemzetközi természetvédelmi egyezmény hatálya alá tartozó állatfaj egyedén kísérlet elvégzése akkor engedélyezhető, ha a kísérlet természetvédelmi érdeket szolgál. A kísérlet engedélyezhető olyan lényeges orvosi kutatások esetében is, amikor legalább második generációs tenyésztett állatokat használnak fel, és a kísérlet célja más módon nem biztosítható nem emberszabású főemlősök.

16 Melyek a törvény hatálya alá tartozó kísérleti állatok? ecetmuslica pióca a 12 napos patkány embrió a 20 napos patkány embrió nyolckarú polip ebihal

17 Génmódosított állatok, mint kísérleti alanyok A kérelmezőnek állatkísérleti engedélyt kell kérnie a tenyésztésükre. A géntechnológiai hatóság engedélye nem megfelelő erre a célra, mert azt egy más jogszabály előírása és más szempontrendszere alapján adják ki. Tartásuknál az alábbi szempontokat kell figyelembe venni: o hogyan pároztatnak (heterozigóta-heterozigóta)? o káros-e a heterozigóta állat fenotípusa? Igényel-e különleges bánásmódot? o mi történik a KO genotípusú szaporulattal, ha nem használják fel kísérletben? o hogyan látják el az állatokat, meddig hagyják életben őket? o a refinement követelményeknek megfelelően milyen erőfeszítéseket kívánnak tenni a knockout állatok egészségi állapotának megőrzése érdekében a kísérletekben való felhasználásukat megelőzően.

18 Genetikailag módosított kísérleti állatok esete káros fenotipus esetén "An animal with a harmful phenotype for the purposes of this Directive and in context of genetically altered animals is to be understood as an animal who is likely to experience, as a consequence of the genetic alteration pain, distress, suffering or lasting harm equivalent to, or higher than that caused by the introduction of a needle in accordance with good veterinary practice. Példa: Idős kori neurodegeneráció jeleit viselő transzgenikus egér törzset kívánnak tenyészteni. A törzs dupla mutációt hordoz, jellemzően 6-9 hónapos korban amiloid plakkok jelennek meg, és 7 hónapos kortól memória zavarok figyelhetők meg az állatokon. Káros fenotipus? IGEN

19 Genetikailag módosított kísérleti állatok esete káros fenotipus esetén Külön engedélyt kell kérni a génmódosított állatok esetében a fenntartó tenyésztésre, hogyha az állatok szándékoltan káros fenotípusúak, mivel ebben az esetben az Állatvédelmi törvény alapján ezek tenyésztése is kísérletnek minősül. Az ilyen állatokat felhasználó kísérletek engedélyezése során a fenntartó tenyésztés engedélyezése előfeltétele a kísérlet engedélyezhetőségének.

20 A szövetkivétel nem minősül kísérletnek az évi XXVIII. törvény az állatok védelméről és kíméletéről 3. (9) pontja alapján: "nem min sül állatkísérletnek a nem kísérleti jelleg, "nem minősül állatkísérletnek a nem kísérleti jellegű, mezőgazdasági vagy állatorvosi tevékenység, illetve az állatok leölésének vagy megjelölésének a természettudományok által elfogadott korszerű, kevéssé fájdalmasnak tartott módszereinek alkalmazása, valamint az állatnak kizárólag a szervei vagy szövetei felhasználása céljából történő leölése";

21 A 3 R elve és a Törvénykezés

22 A 3 R elve - William Russell és Rex Burch (Principles of Humane Experimental Technique, 1959) (a) Finomítás - Refinement: az állati fájdalom és szenvedés csökkentése: kevesebb szenvedést okozó módszerek alkalmazása (b) Csökkentés - Reduction: a kísérletekben felhasznált állatok számának csökkentése, a lehetőségek határáig (c) Helyettesítés - Replacement: az állati modellek helyettesítése más módszerekkel, modellekkel

23 Csökkentés (Reduction) lehetőségek A kísérlet megfelelő tervezése Megfelelő statisztikai módszerek A vizsgálatokhoz szükséges minimális csoportlétszám statisztikai meghatározása A nyert kísérleti eredmények folyamatos statisztikai elemzése megfelelő statisztikai módszerekkel (ha a tervezettnél kevesebb állat felhasználása esetén is statisztikailag megfelelő adatok állnak rendelkezésre, további állatot már nem szabad feláldozni) A megfelelő kísérleti modell (állat) kiválasztása Beltenyésztés (a variabilitás sok állatot igényel és bizonytalan) Genetikai módosítás (kevesebb állatot igényel, célzottabb és biztosabb) Kísérleti állatok egészségi állapota (!) és állati jóllét (a variabilitás, elhullás elfed/eltorzít) Egy állatból nyerhető minták többirányú vizsgálata

24 Finomítás (Refinement) lehetőségek Oktatás (kutatók és gondozók képzettsége) Megfelelő állattartási körülmények Az állatok szoktatása, tanítása, (handling) Nyugtatás, érzéstelenítés, fájdalomcsillapítás Nem-invazív vizsgálati módszerek alkalmazása A végpontok körültekintő meghatározása és pontos betartása a kísérlet NE az állat kimúlásával fejeződjön be! Megfelelő eutanázia

25 Helyettesítés (Replacement) lehetőségek In vitro módszerek, sejt, szövet és szerv kultúrák Nem- vagy kevésbé érzőképes élőlények, alacsonyabb rendű szervezetek (baktériumok, gombák) Fizikai-kémiai módszerek, technikák Számítógépes (in silico) eljárások, rendszerek, matematikai modellezés Mechanikus modellek, oktatófilmek Emberkísérletek, önkéntesek

26 Helyettesítés (Replacement) lehetőségek Langendorff-féle preparátum Primer sejttenyészet vizsgálata HeLa immortalizált sejtvonal Szövet szuperfúzió Multiphoton fluorescence image of cultured HeLa cells with a fluorescent protein targeted to the Golgi apparatus (orange), microtubules (green) and counterstained for DNA (cyan). Nikon RTS2000MP custom laser scanning microscope.

27 Fizikai-kémiai módszerek sejtmentes rendszerek Protokoll:5mLreakcióelegy (XOR puffer) ph= muxo 200 µmno µmnadh Inkubáció 37 C-on 10 perc buborékoltatás/küvetta Áramlás: ml/min 21% O 2 79% N 2 2,2% CH 4 21% O 2 76,8% N 2

28 Önkéntes ember kísérletek (ETIKAI engedéllyel!) Alsó testfélre kifejtett negatív nyomás - Lower Body Negative Pressure (LBNP) Vérminta Vérgáz Centrális Vénás Nyomás (CVP) Mikrokeringés mérés Centrális Vénás Katéter(CV) Vákuumkamra FINAPRESS Nem- invazív artériás nyomás mérés 0 Hgmm Kontroll - 20 Hgmm - 40 Hgmm 0 Hgmm Visszatérés

29 Melyik R teljesül a Te kísérletedben? Csökkentés? Finomítás? Helyettesítés?

30 Helyettesítésre további példák EpiSkin, EpiDerm, SkinEthic: mesterséges humán bőr irritációs tesztekre. Bovine Corneal Opacity and Permeability Test: szem-irritációs teszt Isolated Chicken Eye Test: szem-irritáció meghatározására. 3T3 NRU (Neutral Red Uptake) Phototoxicity Test: fototoxicitás teszt Reduced Local Lymph Node Assay: allergia teszt; állat-felhasználás 75%-os csökkentése Fish Threshold Method: 70%-os csökkenés az állat-felhasználásban. EYETEX Screen Test: a Draize teszt (nyúlszem-irritáció) kiváltására: protein oldathoz (bab) adott kemikália az oldat optikai tulajdonságainak változásához vezet

31 Draize történet: szem irritáció korrózió (in vivo Draize eye irritation test; J Pharmacol Exp Ther 82: 1944 ) Kísérleti állat: albino nyúl, 3 állat / csoport 0,1 ml folyadék vagy 100 mg finom por, spray a szem conjunctiva zsákjába Leolvasás: 1, 24, 48, 72 óra = grading Cornea: átlátszóság, elváltozás kiterjedése Iris: vérbőség, ödéma, reakcióképesség Conjunctiva: vörösség, ödéma, váladék Alternatív módszerek ATET/Somfai Zsuzsanna ábrái

32 Szem irritáció/korrózió ALTERNATÍV módszerek súlyos szemkárosodító hatás felderítésére OECD-TG-437 Bovine Corneal Opacity and Permeability Test (BCOP) Rövidtávú túlélő cornea: fiziologiai és biokémiai tulajdonságok megtartva átlátszóság fényáteresztés permeabilitás- fluorescein Borjúszemek vágóhídról nem kell kísérleti állat Hanks oldattartóba, 32 fok Expozició 10 perc mosás post expo inkubálás 2 óra mosásflourescein 90 perc Értékelés: opacitométer + spektrofotométer 3 cornea/anyag Nem vizsgál : conjunctivát, írist, reverzibilitást Validálás: 113 anyag keverék Megegyezés: 79%(150/191) Fals pozitiv: 25% (32/126) Fals negatív: 14% (9/65) Alternatív módszerek ATET/Somfai

33 Szem irritáció/korrózió ALTERNATÍV módszerek súlyos szemkárosodító hatás felderítésére OECD-TG-438 Isolated Chicken Eye Test Method Csirkeszemek vágóhídról nem kell kísérleti állat - 2 órán belül 3 szem/csoport fluorescein + réslámpa: cornea vastagság, felszín intakt, átlátszóság Lefektet, kezel: 0,03 ml / g, Értékelés: 30, 75, 120, 180, és 240 perc grading: Cornea duzzadása homály Fluorescein retenció Validálás: 72 anyag + 80 keverék Megegyezés: 86%(120/140) Fals pozitiv: 6% (7/113) Fals negatív: 48% (13/27) szem Alternatív módszerek ATET/Somfai

34 A HET-CAM teszt (Hen's Egg Test Chorioallantoic Membrane assay)-1 Luepke(1985, 1987) A megtermékenyített tojásokinkubátorban, 37 C 60-70%-os relatív páratartalom rotálva 10 napig keltetik (a chorioallantois membrán ekkorra éri el a megfelelő fejlettségi állapotot, idegszövet, fájdalomérzés még nincs.) Óvatos felnyitás Kezelés a membránon: 0,3 ml; Megfigyelés, értékelés 5 perc: ér-lízis, vérzés, intra- és/vagy extravaszkuláris koaguláció alapján az irritáció mértéke becsülhető; Számítógépes program segítségével számszerűsíthető, és a Számszerű érték alapján irritációs kategóriába sorolható Alternatív módszerek ATET/Somfai

35 A HET-CAM teszt (Hen's Egg Test Chorioallantoic Membrane assay)-2 Kezelés előtt Lízis és vérzés kezelés után

36 A HET-CAM teszt (Hen's Egg Test Chorioallantoic Membrane assay)-3 Előnyei: Élő membrán, mint a conjunctiva Gyors Érzékeny (fals pozitív inkább) Könnyű kivitelezni Relatíve olcsó Hátrány: Inter-laboratory szórás nagy Szubjektív Nem szelektál anatómiai részletek között (cornea, iris) Alternatív módszerek ATET/Somfai

37 A KÍSÉRLETRE VONATKOZÓ ÁLTALÁNOS SZABÁLYOK - A 3 R (csökkentés, finomítás helyettesítés) ALAPJÁN

38 Az állatkísérletek TERVEZÉSÉNEK szabályai (a 3R szellemében) (1) Nem engedélyezhető és nem végezhető állatkísérlet abban az esetben, ha ismert olyan más tudományosan megfelelő és a várt eredményt szolgáltató módszer, amely állat használata nélkül megvalósítható, illetve végrehajtható. (2) Az állatkísérletek szükségtelen megismétlésének elkerülése érdekében a kérelmezőnek és az engedélyezőnek törekednie kell a témához kapcsolódó, már elvégzett kísérletek eredményeinek megismerésére. (Ávt. 26. ) (1) Az állatkísérlet során felhasznált állatok számát a feltétlenül szükséges mértékre kell csökkenteni. Azt a vizsgálati módszert kell választani, amely előreláthatóan a legkisebb fájdalom okozásával, illetőleg legkisebb élettani, idegi vagy viselkedésbeli károsodás mellett végezhető el. (3) Minden kísérletet úgy kell megtervezni, hogy elkerülhetô legyen a szükségtelen fájdalom, szenvedés, tartós nélkülözés, illetve maradandó károsodás okozása.(ávt. 27. )

39 Az állatkísérletek TERVEZÉSÉNEK szabályai (a 3R szellemében) (folyt.) (1) Minden állatkísérletet általános vagy helyi érzéstelenítés mellett kell végezni, kivéve, ha ez - arra tekintettel, hogy a kísérlet nem jár fájdalommal, illetôleg szenvedéssel - nem szükséges, illetve az érzéstelenítés a kísérleti állat számára nagyobb megterheléssel járna, mint maga a kísérlet, vagy a kísérlet eredményét értékelhetetlenné tenné. (2) Ha az érzéstelenítés nem lehetséges, akkor fájdalomcsillapítást, vagy egyéb megfelelő módszert kell alkalmazni annak biztosítása érdekében, hogy az állatnak a lehető legkevesebb fájdalmat, szenvedést, tartós nélkülözést vagy károsodást okozzák, valamint egyetlen esetben se legyen az állat jelentôs fájdalomnak, szenvedésnek vagy tartós nélkülözésnek kitéve. (3) Ha a kábítás után az állat fájdalomérzete visszatér - és a kísérlet célja ezt nem zárja ki - újabb fájdalomcsillapítást kell alkalmazni, vagy ha ez nem lehetséges, az állat életét azonnal, megengedett módon ki kell oltani. (4) Az állaton végzett ismételt kísérletnek szintén meg kell felelnie az e törvényben foglaltaknak. Az (1)-(3) bekezdés szerinti módszerek alkalmazása nélkül végzett, tartós vagy súlyos szenvedéssel járó kísérlet ugyanazon az állaton ismételten nem végezhetô. (Ávt. 28. )

40