KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA - MT 2017

Átírás

1 KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA - MT 2017 Innovatív és alternatív környezettoxikológiai módszerek Molnár Mónika Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

2 INNOVATÍV ELJÁRÁSOK A KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIÁBAN

3 INNOVATÍV ELJÁRÁSOK Innovációk célja Érzékenység növelése mikro-szennyezőanyagok Gyors és korai válaszok Krónikus hatások Környezeti relevancia Megoldások Szubletális/fiziológia hatások vizsgálata Gyorstesztek Korai figyelmeztető rendszerek Hosszú távú hatások tesztelése Szabadföldi (in situ) vizsgálatok Page 3

4 MICROBIOTESZTEK Page 4 Alacsonyabb rendű élőlényeket tartalmaznak tartósított formában Gyors válasz Korai figyelmeztetés költséges analitikai vizsgálatok

5 KLOROFILL IN SITU MEGHATÁROZÁSA Chlorophyll Concentration Meter Mért paraméterek: abszorbancia két hullámhosszon: 653nm (Chlorophyll) & 931nm (Near Infra-Red) Mérési felület: ~ 10 mm sugarú kör Detektor: szilikon fotodióda belső sokszorozóval Alkalmazhatóság: környezeti stresszhatás, tápanyagellátottság, peszticidek hatása, fény hatása Page 5

6 DAPHNIA TOXIMÉTER Biomonitoring Daphnia tesztorganizmussal Forrás: Page 6

7 DAPHNIA TOXIMÉTER Biomonitoring Daphnia tesztorganizmussal Forrás: Page 7

8 INNOVATÍV ELJÁRÁSOK TOVÁBBI PÉLDÁK Tetrahymena pyriformis Méret, deformitás, kemotaxis, fagocitózis Daphnia magna Méret, szívritmus, táplálkozási aktivitás, szaporodásgátlás Heterocypris incongruens Mozgásképesség Haltesztek Molekuláris biomarkerek (vitellogenin), deformitások + glutation, glutation-reduktáz, glutation S-transzferáz, szuperoxid-dizmutáz Page 8

9 ÁLLATKÍSÉRLETEK KIVÁLTÁSÁT CÉLZÓ ELJÁRÁSOK A KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIÁBAN

10 Vegyi anyagok emberi egészségkockázata Szennyező forrás Hatás vizsgálat Az eloszlás modellezése PEC Extrapoláció Szennyezőanyag felvétel a környezetből. Mérés vagy modellezés. ÁND RfD, TDI HRQ=ÁND/ADI Page 10

11 ÁLLATKÍSÉRLETEK Seventh Report from the Commission to the Council and the European Parliament on the Statistics on the number of animals used for experimental and other scientific purposes in the member states of the European Union COM(2013)859/final Európa, 2007 ~12,5 millió gerinces állat Európa, 2011 ~11,5 millió gerinces állat Page 11

12 ÁLLATKÍSÉRLETEK Seventh Report from the Commission to the Council and the European Parliament on the Statistics on the number of animals used for experimental and other scientific purposes in the member states of the European Union COM(2013)859/final Page 12

13 ÁLLATKÍSÉRLETEK - Magyarországon Kísérleti állatok száma Magyarországon egyéb emlős 0,0% farmállat 0,3% kutya, macska 0,6% patkány 23,0% nyúl 4,0% madár 7,4% többi rágcsáló 4,3% 2002 hüllő, kétéltű 0,7% hal 1,1% egér 58,7% farmállat 0,5% madár 13.2% 2011 kétéltű 0.3% hal 1.9% kutya, macska 0,3% egér 52,1% Az állatkísérletek állatvédelmi szabályozása - dr. Gyertyán István az Állatkísérleti Tudományos Etikai Tanács (ÁTET) elnöke Page 13 patkány 25,7% egyéb emlős 0,0% nyúl 2,7% többi rágcsáló 3,4%

14 KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA ELJÁRÁSOK - ÁLLATKÍSÉRLETEK KIVÁLTÁSÁRA Page 14

15 Állatkísérletek - Draize-féle irritációs teszt Az irritációs teszt - egy teljesen tudatánál lévő, mozgásában korlátozott állat - csipeszekkel kipeckelt szem A tesztanyagok szembe juttatását követően bizonyos intervallumokban 12, 24, 48 óra stb. a kísérletet végző személy feljegyzi a szem finom szövetei roncsolódásának fokát amely lehet ödéma, bevörösödés, fekélyképződés, bevérzés vagy vakság. A károsodás fokát egy irritációs skálán személyes becslés alapján határozzák meg. Ugyanazzal a szerrel más laboratóriumban más és más eredményt kaphatunk! Page 15

16 Állatkísérletek kiváltására alkalmas toxikológiai tesztek A vegyi anyagok potenciális toxikus hatásának meghatározására elsősorban élő állatokat használnak (használtak) a toxikológusok. Ma az állatkísérleteket helyettesítő alternatív módszerek szükségesek Az elsődleges szempont az állatok szenvedését kiküszöbölő eljárások létrehozása. (EU-s törekvések) Tudomány, Etika, Költség-Haszon Page 16

17 Alapelvek állatkísérletek kiváltása 3R Refine, replace, reduce alapelv állatkísérletekre A 3 R elve - William Russell és Rex Burch (Principles of Humane Experimental Technique, 1959) EVCAM European Centre of Validation for the Alternative Methods Page 17

18 FINOMÍTÁS (REFINEMENT) Oktatás - a kutatók és gondozók képzettsége Megfelelő állattartási körülmények Az állatok szoktatása, tanítása Nyugtatás, érzéstelenítés és fájdalom-csillapítás A végpontok körültekintő meghatározása és pontos betartása Megfelelő eutanázia Page 18

19 HELYETTESÍTÉS (REPLACEMENT) In vitro módszerek, sejt, szövet és szerv kultúrák Nem- vagy kevésbé érzőképes élőlények, alacsonyabb rendű szervezetek (baktériumok, gombák, gerinctelenek) Fizikai-kémiai módszerek, technikák Számítógépes (in silico) eljárások, rendszerek, matematikai modellezés Mechanikus modellek, oktatófilmek Emberkísérletek, önkéntesek Az eredmény nem változhat! Page 19

20 CSÖKKENTÉS (REDUCTION) A kísérlet megfelelő tervezése Megfelelő statisztikai módszerek A megfelelő kísérleti modell (állat) kiválasztása Beltenyésztés (a variabilitás sok állatot igényel és bizonytalan) Genetikai módosítás (kevesebb állatot igényel, célzottabb és biztosabb) Page 20

21 ADATBÁZISOK EUROECOTOX Adatbázis alternatív, állatkísérletek kiváltására alkalmas módszerekről Cél: módszerfejlesztések, kutatások támogatása ALTTOX Információs felület nem állati tesztorganizmusokat alkalmazó módszerekről Cél: 3R alapelv érvényesítése EU, USA tudományosan igazolt módszerek Page 21

22 Innovatív és alternatív eljárások a környezettoxikológiában

23 Állatkísérletek kiváltásának lehetőségei Néhány alternatív módszer: - sejt-, szövet- és szervtenyészetek használata állatok helyett - számítógépes szimulálás (modellezés) és számítógép alkalmazása, mint adatbank - boncolás és biopszia (mintavétel) - mikroorganizmus-tenyészet használata - bioszenzorok - klinikai és járványügyi tanulmányok végzése embereken - statisztikák használata Page 23

24 EMBERI BŐR MODELL TESZT (OECD 431) In vitro bőr roncsolódási teszt vegyi anyagokra A vázlatot készítette: Névery Dorottya; április

25 BŐR RONCSOLÓDÁS A bőr visszafordíthatatlan károsodása. Roncsoló az az anyag, amely a bőrrel érintkezve 4 órán belül látható szövetkárosodást vagy szövetelhalást okoz a felhámon keresztül az irhában is. Fekélyek, vérzések, gennyes sebek, hegek, színelváltozás stb. Page 25 25

26 BŐRKORROZIÓ VIZSGÁLATA - TESZTTÍPUSOK In vivo in vivo = élőben Élő szervezet(ek)en végzett vizsgálat Általában állatkísérleteket jelent In vitro in vitro = üvegben Izolált szerv(ek)en, sejt- vagy szövettenyészet(ek)en vagy biokémiai rendszereken végzett laboratóriumi vizsgálat Page 26 26

27 EMBERI BŐR MODELL A modell előállítható a tesztelő laboratóriumban vagy kereskedelmi úton is hozzá lehet jutni (pl. EpiDerm, EpiSkin modellek) EpiDerm modell EpiSkin modell Page 27 27

28 Page 28 B Ő R S Z Ö V E T 28 K I T E N Y É S Z T É S E

29 EpiSkin teszt Bőrirritáció vizsgálata Rekonstruált humán epidermisz használata Végpont: a sejtek életképessége Mitokondriális dehidrogenáz enzim aktivitás csökkenésével van összefüggésben detektálás MTT-vel MTT - egy sárga színű tetrazólium sóoldat, a dehidrogenáz enzim kék színűvé képes redukálni. Szövetdarabkák kezelése vegyi anyaggal (1 perc, 1 óra és 4 óra) OD mérés sejtek életképességét. Forrás: /dermal_docs/cwgfinal02/07cdp rot.pdf MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide Page 29

30 Szem irritáció vizsgálata A csirke-szaruhártyán okozott károsodás a szaruhártya megduzzadásának mértékéből, az opacitásból és a fluoreszcein visszatartó képességből határozzák meg. A szemeltávolítás után a szemet a lehető legrövidebb időn belül (max. 2 óra) a laboratóriumba kell juttatni. Alapmérések inkubálás után (45-60 min)- szaruhártyára felviszik a vizsgálandó anyagot (10s) öblítés mérés időközönként- irritációs érték OECD teszt pdf Page 30

31 BIOSZENZOROK

32 SZENZOR - BIOSZENZOR BIOSZENZOR Bioszenzor= receptor (biológiailag aktív anyag, szelektív reakció a mérendő anyaggal) + transzducer (információhordozó jelet generál) Receptor Biológiailag aktív anyag (Enzim, antigén, antitest, DNS, mikroorganizmusok, élő szövet) Szelektív reakció a mérendő anyaggal Transzducer Információhordozó jelet generál Page 32

33 Bőrkorrózió vizsgálat - Transzkután elektromos rezisztencia vizsgálat Bőrkorrózió: a bőr dermisz és epidermisz részét is visszafordíthatatlan károsodás éri, (az érintett sejtek halála következik be). In vitro tesztek A TER teszt:a hasi bőrszövetet vizsgálata, előtte finoman megtisztítják a zsírszövettől. 24 órán keresztül az epidermisz felőli oldalát kiteszik a korrozív anyag hatásának. A kezelés utáni roncsolódás mértékét elektromos ellenállás méréssel állapítják meg, majd a kiindulási adatokhoz viszonyítják. Page 33 Források: L:2008:142:0001:0739:HU:PDF

34 Levegőszennyezettség mérése állati tesztorganizmusokkal Patkánykísérletek A benzol toxicitásának vizsgálata patkány, tengerimalac és nyúl kísérletekben. Állatok érintkeztetése héten át folyamatosan napi 7 órában ppm ( mg/m 3 ) benzolos levegővel szervi elváltozások Kóros elváltozások az ivari mirigyekben és a here, herevezeték Page 34

35 Bioszenzor levegőszennyezettség Rekombináns E. coli baktérium biolumineszcens gént (lac::luxcdabe) tartalmaz. A toxikus gázokkal közvetlen érintkezésbe kerülve a biolumineszcencia intenzitása csökken. A szenzor teljes sejteket tartalmaz agarban immobilizálva. A sejtek közvetlenül érintkezhetnek a mérendő gázokkal, illetve az agar a tápanyag utánpótlást is biztosítja. Page 35

36 IRODALOM, FORRÁSOK Dr. Boros Mihály: Állatkísérletek az Orvostudományban. Sebészeti Műtéttani Intézet, SZTE ÁOK graduális oktatás 2012 / 2013 / 2 Ember István (szerkesztő): Környezet-egészségtan (Dialóg Campus Tankönyvek) Dialóg Campus Kiadó, Budapest-Pécs 2006 EUROECOTOX adatbázis: Gruiz, K., Horváth, B. és Molnár, M. (2001) Környezettoxikológia, Vegyi anyagok hatása az ökoszisztémára, Műegyetemi Kiadó, Budapest Körinfo adatbázis: OECD tesztek adatbázisa: Test Guidelines for the Testing of Chemicals OKBI: REACH. Országos Kémiai Biztonsági Intézet - William D. Stanfield: Genetika. Elmélet és gyakorlat. Panem-McGraw-Hill, 1997 Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Guideline for the testing of chemicals No In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Page 36

37 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!