Toxicological Research Center

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Toxicological Research Center"

Lajos Vass
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 IN VIVO ÉS IN VITRO GENOTOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATI MÓDSZEREK TAPASZTALATAI A VÁLTOZÓ MÓDSZERTANI KÖVETELMÉNYEK ÉS JOGSZABÁLYOK TÜKRÉBEN Vértesi Adél, Béres Erzsébet, Sebestyén István, Hirka Gábor, Toxi-Coop Kutatóközpont Zrt., Balatonfüred

2 Áttekintés - Genotoxikológiai vizsgálataink célja - Nemzetközi irányelvek (OECD, EC, EPA, ICH, ISO, EMEA, etc.) - OECD irányelvek (Organisation for Economic Cooperation and Development: Nemzetközi Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, OECD) - Genotoxikológia a TOXI-COOP ZRT-ben: - Baktériumokon végzett reverz mutációs vizsgálat Ames teszt (OECD 471) - Emlőssejteken végzett in vitro génmutációs vizsgálatok (OECD 476) - In vitro kromoszómaaberrációs vizsgálat (OECD 473) - In vivo emlős eritrocita mikronukleusz teszt (OECD 474)

3 Ames teszt (OECD 471) - Auxotróf mutáns baktériumok (indikátorszervezetek) - Salmonella typhimurium, Escherichia coli WP2 uvra - Reverz mutáció - Génmutációk

4 In Vitro Génmutációs Vizsgálatok - Kulcs-enzimek a purinbázisok mentési reakciójában (salvage reakciók) Timidin-kináz (Mouse Lymphoma Assay, MLA) - Egér limfóma L5178Y TK +/ C - Toxikus bázisanalóg: Trifluorotimidin (TFT) Hipoxantin-guanin-foszforibozil transzferáz (HPRT) - Kínai aranyhörcsög ovárium CHO-K1, vagy tüdő fibroblaszt V79 - Toxikus bázisanalóg: 6-tioguanin (6-TG)

Kromatid-, és kromoszómaszintű strukturális aberrációk:

5 In Vitro Kromoszómaaberrációs Vizsgálat - Kínai aranyhörcsög ovárium CHO-K1, vagy tüdő fibroblaszt V79 - Kromatid-, és kromoszómaszintű strukturális aberrációk: törések, átrendeződések, deléciók - Numerikus: endoreduklikáció, poliploidia

In Vivo Emlős Eritrocita Mikronukleusz Teszt - NMRI BR egerek csontvelői polikromáziás eritrocita - Mikronukleált polikromáziás eritrociták számának emelkedése a kezelt állatokban a kontrollhoz

6 In Vivo Emlős Eritrocita Mikronukleusz Teszt - NMRI BR egerek csontvelői polikromáziás eritrocita - Mikronukleált polikromáziás eritrociták számának emelkedése a kezelt állatokban a kontrollhoz képest - A mikronukleuszt tartalmazó polikromáziás eritrociták megemelkedett száma kromoszómaaberrációkra utal: acentrikus kromoszóma, visszamaradt kromoszóma fragmentumok, teljes kromoszómák - Az in vivo mikronukleusz teszt klasztogén és aneugén anyagok kimutatását is lehetővé teszi.

7 Az OECD Irányelvek Változásai I. - változások a genotoxikológia területén; - ismeretanyag, tapasztalat gyűlt össze az irányelvekben foglalt módszerek alkalmazása során; - változások gazdasági területen; - szabályozó, korlátozó rendeletek (pl.: REACH rendelet életbe lépése 2007-ben); - állatvédelmi szempontok a genotoxikológia területén: - más toxicitási tesztekkel való kombináció lehetősége, - pozitív kontroll állatok számának indokolt csökkentése. A teszteknek hatékonyabbaknak, gyorsabbaknak, és olcsóbbaknak kellene lenniük, ugyanakkor az érzékenységüknek, és specifitásuknak nem szabad csorbát szenvednie.

8 Az OECD Irányelvek Változásai II. Életbe lépés Felülvizsgálat 471 Bacterial Reverse Mutation Assay In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests using the Hprt and xprt genes) / 2014 / / 2014 / / 2015 / In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests Using the Thymidine Kinase Gene

Mini-Ames Screening Salmonella typhimurium TA98

TA1535 Salmonella typhimurium TA1537 Escherichia coli

9 Mini-Ames Screening Salmonella typhimurium TA98 Salmonella typhimurium TA100 Salmonella typhimurium TA1535 Salmonella typhimurium TA1537 Escherichia coli WP2 uvra 4-Nitro-1,2- phenylenediamine, NPD Sodium azide, SAZ 9-Aminoacridine, 9AA Methyl methanesulfonate, MMS 2-aminoanthracene, 2AA Dimethyl sulfoxide Water Test Item

koncentráció: 10 mm vagy 2 mg/ml vagy 2 μl/ml Párhuzamosok száma: 2 / koncentráció Párhuzamosok száma: 4 / koncentráció 2

10 OECD 476: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test using the Hprt and xprt genes 3-6 óra + és -S9 Mix 20 óra, -S9 Mix 3-5 óra: + és -S9 Mix Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: 10 mm vagy 5 mg/ml vagy 5 μl/ml Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: 10 mm vagy 2 mg/ml vagy 2 μl/ml Párhuzamosok száma: 2 / koncentráció Párhuzamosok száma: 4 / koncentráció 2 x 4 millió / koncentráció 4 x 10 millió / koncentráció Történelmi kontroll: min-max tartomány Történelmi kontroll: C-Chart szerint

11 Történelmi kontroll adattábla (C-Chart)

OECD 473: In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: relatív túlélés alapján (RCC %) Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: RPD (%) vagy RICC (%)

12 OECD 473: In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: relatív túlélés alapján (RCC %) Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: RPD (%) vagy RICC (%) alapján metafázis (koncenrációnként, párhuzamosonként) metafázis (koncenrációnként, párhuzamosonként) Történelmi kontroll: min-max tartomány Történelmi kontroll: C-Chart szerint

13 OECD 474: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test PCE/MCE arány: 200 sejt PCE/MCE arány: 500 sejt Állatonként 2000 PCE Állatonként 4000 PCE Történelmi kontroll: min-max tartomány Történelmi kontroll: C-Chart szerint

14 OECD 489: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay - sejtek agaróz gélbe ágyazása - lízis - DNS denaturáció - elektroforézis - neutralizálás - festés, értékelés 14

15 OECD 489: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay - érzékeny; - egyszerre két vagy több szövettípus vizsgálata; - viszonylag kevés sejtet igényel; - minden olyan szövettípuson elvégezhető, melyből jó minőségű sejtszupenzió állítható elő; - könnyen kombinálható más toxikológiai vizsgálatokkal. 15

16 csóvahoszz (µm) % csóva DNS OTM OECD 489: In Vivo Mammalian Comet Assay gyomor vékonybél máj 5 0 gyomor vékonybél máj gyomor vékonybél máj 16

17 Összefoglalás - A vizsgálatok tervezése - OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris

18 Köszönöm a figyelmet! Béres Erzsébet Biermanné Major Erika Buda Tamás Fekete Mónika Fekete Stella Frank Zoltánné Hirka Gábor Jurácsikné Sereg Kornélia Kékesiné Forintos Anita Kurdiné Pongrácz Nóra Mesterháziné Kővári Edi Sebestyén István Szabóné Lennert Mariann Vértesi Adél

Hasonló dokumentumok

Genotoxikológia TOXIKOLÓGIA ÉS ÖKOTOXIKOLÓGIA IX. Genotoxikus anyagok. Kémiai mutagének 2012.11.23.

Genotoxikológia TOXIKOLÓGIA ÉS ÖKOTOXIKOLÓGIA IX. Genotoxikus anyagok. Kémiai mutagének 2012.11.23. TOXIKOLÓGIA ÉS ÖKOTOXIKOLÓGIA IX. Genotoxikológia és környezetvédelem. Karcinogén, mutagén és teratogén hatású kemikáliák. Genotoxikológiai tesztek, Aimes teszt, testvérkromatid eljárás Genotoxikológia