BIOTECHNOLÓGIAI FEJLESZTÉSI POLITIKA, KUTATÁSI IRÁNYOK Molekuláris biomérnöki tudomány Tárgyszavak: biomérnökség; molekuláris biotechnológia; fehérjemódosítás; nukleinsav-módosítás; génsebészet; gyógyszerkutatás. Mi a molekuláris biomérnöki tudomány? Molekuláris biomérnöki tudomány az a tudományág, amely a molekulák közötti kölcsönhatások jobb megértésére építve megpróbál ezen ismeretek birtokában jobb, a célnak megfelelő, biológiailag hatékony molekulákat előállítani. Tekintettel a kitűzött cél általános megfogalmazására, szükségszerűen interdiszciplináris területről van szó, amely felöleli a szokásos mérnöki tudományokat, de sokat hasznosít a biológia, kémia és fizika eredményeiből is. Az enzimek hatékonyságnövelésével régóta kísérleteznek, de ezt megnehezíti az aminosav-sorrend, a harmadlagos szerkezet és az aktivitás közti rendkívül bonyolult összefüggés, valamint a reakciósebesség és a specifikus jelleg közti ellentmondás (minél specifikusabb pl. az enzim, annál gyorsabb a reakció). Az informatikai és biokémiai technológiák gyors fejlődése lassan megteremti a racionális molekulaszerkezet befolyásolásának elméleti és kísérleti alapjait. Molekuláris szinten tulajdonképpen az általános vegyészmérnöki megfontolásokat (kinetikai és termodinamikai elveket) kell alkalmazni biokémiai reakcióciklusokra és hálózatokra. Javított tulajdonságú biomolekulákra a legkülönfélébb ipari, kutatási és gyógyászati alkalmazásokban lenne szükség amelyek mögött mind jól megfogható gazdasági vagy éppen társadalmi érdekek állnak. Egyre nő a lehetséges gyógyszermolekulák száma, de sok, bizonyos tekintetben hatékony molekula más vonatkozásokban távol áll az optimálistól. A monoklonális antitestek pl. sokszor kitűnő farmako-kinetikai tulajdonságokat és jó specificitást mutatnak, de az a tény, hogy immunválaszt váltanak ki a szervezetből, korlátozza gyógyászati alkalmazhatóságukat. Ilyen esetben pl. cél lehet az immunogén tulajdonságok visszaszorítása az egyéb, kedvező jellemzők megtartása mellett. A módosításhoz használt technológiát annak megfelelően kell megválasztani, hogy a változást genetikai vagy a fehérjeszinten kívánják végrehajtani. A módosítási stratégia sikere nagymértékben függ attól, hogy milyen gyor-
A biomérnöki tudományban alkalmazott módszerek és alkalmazási területeik 1. táblázat Alkalmazás Enzimkatalizált szerves reakciók Proteinhajtogatódási hozam javítása Új mikrobaellenes szerek kifejlesztése Monoklonális antitest terapeutikumok Antiszensz oligonukleotid terapetikumok Génterápia Tervezési kritérium reakciókinetika proteinstabilitás termékspecificitás hajtogatódás kinetikája protein stabilitás affinitás a célszervezet iránt fiziológiai eloszlás affinitás a célmolekula iránt célfelismerés kinetikája célspecificitás fiziológiai eloszlás affinitás a célmolekula iránt célfelismerés kinetikája stabilitás (nukleázokkal szemben) célspecificitás fiziológiai eloszlás stabilitás fiziológiai eloszlás Alapmolekula proteinek Módosítási módszer mutagenezis irányított evolúció kombinatorikus kémia Értékelési módszer funkcionális próba fág-kijelzés nagy teljesítményű szűrés proteinek mutagenezis funkcionális próba kötési próba peptidek kis szerves molekulák proteinek nukleinsavak nukleinsavak irányított evolúció fág-kijelzés kombinatorikus bioszintézis kombinatorikus kémia konjugáció (kimérák) mutagenezis konjugáció (genetikai és kémiai) kombinatorikus szintézis kémiai konjugáció kémiai módosítás irányított evolúció génsebészet molekuláris konjugáció fág-kijelzés nagyteljesítményű szűrés farmakológiai szűrés funkcionális próbák kötési próbák kötési próbák funkcionális próbák mikro-array teszt funkcionális próbák farmakológiai próbák
san és specifikusan lehet kiszűrni a módosítások közül a sikereseket. Van, ahol ez megoldható egyszerű, in vitro módszerekkel, de pl. éppen a humán immunogenitást nagyon nehéz ilyen módon vagy akár állatkísérletekben is tesztelni. A molekuláris biomérnöki módszereket és alkalmazásaikat az 1. táblázat foglalja össze. A mérnöki szemlélet bevezetése felgyorsíthatja a potenciális gyógyászati hatóanyagok ipari bevezetését, ezzel is csökkentve a fejlesztés költségeit és idejét. A biomérnöki tevékenység tárgyai, a különféle természetes és mesterséges szerves molekulák. Az, hogy milyen típusú molekulára vonatkozik a módosító tevékenység, függ az elérendő céltól. Génterápia esetében csak nukleinsavakról lehet szó, gyógyászati célú alkalmazásban számításba jönnek nukleinsavak, proteinek vagy egyéb, kismolekulás szerves vegyületek is. Nukleinsavak A nukleinsavak rendkívül vonzó célt jelentenek a módosítások számára, mert ezek hordozzák a genetikai kódot, és már egy kis módosítás is jelentősen megváltoztathatja az expresszált fehérje szerkezetét vagy az expresszió mértékét. Attól függően, hogy milyen biokémiai környezetben valósul meg az expresszió, a fenotípus változása lehet egészen csekély vagy igen nagy mértékű. A nukleinsavak nagy stabilitása (az RNS kivételével) könnyebbséget jelent pl. a fehérjék módosításához képest, ami a változások tartósságát illeti. A legtöbb nukleinsav nem mutat katalitikus hatást és módosításához nincs szükség háromdimenziós szerkezeti információra, legtöbbször elég a szekvenciára vonatkozó, egydimenziós információ. A leggyakrabban módosított nukleinsavak a 15 25 bázisból álló oligonukleotidok, de sor kerülhet egész gének módosítására is. Az oligonukleotidok módosítása rendszerint szilárd hordozón történik, és rendkívül változatos lehet. A legtöbb in vitro oligonukleotidot módosítják pl. a nukleázokkal szembeni ellenállás növelésére pl. oly módon, hogy akár főláncukat, akár a nukleotidok cukorrészét megváltoztatják. Megoldották nukleotidok aranyrészecskékhez való hozzákötését is szenzorokban való alkalmazásra. A nukleotidok fizikai módosítása is ismert és alkalmazott módszer. Az oligonukleotidok egységes negatív töltése pl. lehetővé teszi, hogy pozitívan töltött kationos polimerekkel szorosan illeszkedő komplexeket alkossanak, ami elősegíti elhelyezésüket a liposzómákban. Mivel a semleges komplexek könynyebben bejutnak a sejtekbe, mint a töltöttek, a módszernek nagy jelentősége van terápiás és kutatási alkalmazásokban. Természetesen próbálkoztak a hibridizációban részt vevő bázisok összetételének és szekvenciájának módosításával is annak érdekében, hogy javítsák az oligonukleotidoknak a célmolekulákhoz való kötődését mind specificitás, mind affinitás szempontjából. Anti-
szensz alkalmazásokban a 15 25 bázisból álló oligonukleotidok bizonyultak optimálisnak abból a szempontból, hogy ezek már kellően erős és specifikus kötődést biztosítanak, de nem olyan hosszúak, hogy összekapcsolódjanak más, célba nem vett m-rns molekulákkal. A rekombináns DNS-technológia ma már viszonylag egyszerű és bevált lehetőséget kínál a génmanipulációra (ennek ismertetése most nem cél). Az indukálható promoterek fejlesztése, az anti-metabolitokat alkalmazó, módosított szabályozórendszerek, a nagy mennyiségű DNS bevitelére alkalmas vakcina vektorok és a bioszeparációra, valamint terápiás célra alkalmazható, tudatosan tervezett antitestek mind befolyásolták a biomolekulák előállításának és tisztításának módszereit. A gének kémiailag hasonlóak az ismertetett oligonukleotidokhoz, csak azoknál jóval hosszabbak. A gének esetében ugyancsak alkalmazható a pozitív kationos polimerekkel való semleges komplexképzés és a liposzómákba való becsomagolás, amelyet a nem-vírusos génterápiában egyre inkább alkalmaznak. Proteinek A proteinek módosítása és a génsebészet tulajdonképpen egyazon probléma két oldalát jelenti, hiszen a végcél mindkét esetben egy jobb tulajdonságokkal rendelkező fehérje előállítása. A fehérjék módosítása azonban jóval bonyolultabb, mint a nukleinsavaké, hiszen a háromdimenziós szerkezet miatt a módosítás hatása a fehérje működésére sokszor nem jósolható meg előre. A másik nehézséget a fehérjék kémiai érzékenysége jelenti, a módosítás során használt közegek, körülmények gyakran a fehérje denaturálódásához vezetnek. A fehérjék módosításának kézenfekvő módja a génsebészet, amelynek technikái már kialakultak, és lehetővé teszik, hogy ne kelljen minden, a módosítandó fehérje 3D szerkezetére vonatkozó adatot összegyűjteni. Ez jól alkalmazható olyan, egy alegységből álló fehérjékre, amelyet egyetlen gén kódol, de nehezebb a több gén által meghatározott molekulakomplexek esetében. A fehérjék manipulálhatósága számos más módszer kifejlesztéséhez is vezetett. Az a tény, hogy az állati szervezetek fehérjék behatolásakor specifikus antitesteteket képeznek, számos természetes és rekombináns antitest kialakítását eredményezte. A fehérjék szintézisük után kémiailag is módosíthatók, pl. karboxil-, amino-, hidorxil-, szulfhidril- és egyéb csoportjaikon keresztül. Helyspecifikus módosításra ilyen módszerekkel azonban csak időnként nyílik lehetőség. A biomérnöki tervezés szempontjai A tudatos módosítást egyrészt a módszerek, másrészt az informatika rohamos fejlődése teszi lehetővé. Meg kell tanulni összekapcsolni a komplex
eredményt (pl. terápiás hatékonyságot) olyan mérhető paraméterekkel, mint a biológiai felezési idő, affinitás stb. A különféle sejtek, szövetek közötti információáramlást sok esetben a molekuláris felismerés biztosítja. A kötés erősségére a szabad és megkötött molekulák mennyiségének arányából lehet következtetni. Sok komplex biológiai választ ilyen, specifikusan megkötött molekula indít el. A membránhoz kötött receptorok aktiválása erre jó példa. Az affinitás módosításával az ilyen biológiai válasz felerősíthető vagy gyengíthető. Az antitestek és antigének kölcsönhatásának erősödése in vitro kísérletekben a terápiás hatás erősödéséhez vezet. Vannak azonban arra is példák, hogy a biológiai válasz erőssége nincs közvetlen összefüggésben az affinitással (pl. az emberi növekedési hormon esetében a nagyobb affinitású változatok nem eredményeztek arányosan erősebb sejtosztódási aktivitást). A kölcsönhatás erősségét pl. fehérjemolekulák között számos fizikai-kémiai tényező befolyásolja, így a molekulák hidrofób jellege, elektrosztatikus kölcsönhatások, a molekulafelületek geometriai hasonlósága stb. Kis számú kivételtől eltekintve (mint amilyenek a fémionok vagy a szén-monoxid) a természetes ligandumok szerves molekulák, amelyek kötődésének erőssége összefügg többek között a molekulamérettel is. A kötési szabadenergia eleinte viszonylag gyorsan, később lassabban nő a molekula nem hidrogén atomjainak számával. A receptor általában valamilyen üreg vagy zsebszerű bemélyedés a fehérjemolekula felszínén, ezért a molekula mérete mellett az alakja is fontos. A kötés erősségének meghatározásában általában fontosabb szerepet játszanak a van der Waals kötések, mint a poláris vagy ionos kölcsönhatások (az ionokat pl. deszolvatálni kell, mielőtt kölcsönhatásba lépnének), de időnként előfordul, hogy egy optimálisan elhelyezkedő ionpár erősíti a kölcsönhatást. A molekuláris kölcsönhatás speciális esetét jelentik a nukleinsav-kölcsönhatások, ahol a bázispárok geometriai komplementaritása és a nagy számú, párhuzamos hidrogénhíd különösen erős kötést biztosít. A kölcsönhatás termodinamikai hajtóerejét az affinitás (illetve a kölcsönhatás szabadentalpiája) írja le, de azt, hogy ebből a gyakorlatban mennyit figyelhetünk meg, a kölcsönhatás kinetikája szabja meg. A biomérnöki tudomány szempontjából három folyamattípus kinetikájának van kitüntetett szerepe: az önszerveződés (pl. RNS- vagy fehérjehajtogatódás), a makromolekuláris asszociáció és az enzimreakciók kinetikájának. A fehérjék önszerveződési kinetikájának a rekombináns proteinek termelésében van jelentősége. A helyesen (biológiailag funkcionálisan) és helytelenül hajtogatódott fehérjemolekulák arányát sok tényező befolyásolja, pl. a molekula mérete, a különböző módon hajtogatódott molekulák szabadentalpiája egymáshoz képest, a rögzítő diszulfidhidak száma stb. Mivel az egyensúlyi viszonyok kialakulása időt vesz igénybe, a kinetika tervezett megváltoztatásával befolyásolható az adott időpontban jelenlevő biológiailag működőképes molekulák száma, és így pl. az enzimaktivitás.
A biomolekulák asszociációját két tényező befolyásolja: a diffúzióval szabályozott ütközési sebesség (amelyből 10 9-10 10 M -1 s -1 sebesség adódna) és az alakfaktor vagy orientációs faktor, amelynek hatására csak 10 5 M -1 s -1 körüli sebességek adódnak. Tekintetbe véve a tipikus sejtkoncentrációkat ez kb. 100 s-os asszociációs időket eredményez, ami megegyezik pl. a megfigyelt indukciós időkkel. Ez jelentősen lerövidíthető, ha pl. hosszú távú elektrosztatikus erőket is alkalmaznak az asszociáció kialakításához. Az antigén antitest kölcsönhatások mutációs módosítására végzett tanulmányok kimutatták, hogy elektrosztatikus kölcsönhatások hiányában a homológ speciesek közti affinitáskülönbséget inkább a disszociációs, mint az asszociációs különbségek határozták meg. A nukleinsavak asszociációs sebessége is hasonló nagyságrendbe esik, és rövid szakaszok esetében inkább a disszociációs, mint az asszociációs sebességek a meghatározók. Hosszabb antiszenszmolekulák kapcsolódása esetében azonban van értelme az asszociációs sebesség alapján történő szelekciónak. Az affinitás és kinetika közti összefüggésre klasszikus példa az enzimreakció Michaelis Menten egyenlete, ahol a bruttó sebességet befolyásolja nemcsak maga a katalizált reakció sebessége, hanem a szubsztrátum adszorpciós és deszorpciós sebessége is. A termodinamikai és kinetikai szempontok mellett a hosszú távú hatékonyság szempontjából nagyon fontos a létrehozott molekula stabilitása, ellenállása különféle vegyi (oxidációs, deaminálódási, degradációs) folyamatoknak, fizikai és biológiai (pl. enzimatikus) behatásoknak. A stabilizációs próbálkozásoknál figyelembe kell venni azt a termodinamikai alapelvet, hogy makromolekuláknál az energetikailag kedvező változások (pl. új kötések kialakítása) nem föltétlenül vezet eredményhez, mert az entalpiaváltozást túlkompenzálhatja az ellenkező irányú entrópiaváltozás (csökkenő flexibilitás, kisebb konformációs szabadsági fok), tehát az eredő szabadentalpia-változás éppen a kívánttal ellentétes lehet. Egy represszor fehérje esetében pl. konkrétan is kimutatták, hogy egy diszulfidhíd bevezetése éppen hogy csökkentette az adott molekula denaturációval szembeni ellenállását annak ellenére, hogy a hőstabilitás önmagában nőtt. A stabilitás mindig annak a környezetnek is függvénye, ahol az adott molekulát alkalmazzák. A biotechnológia enzimalkalmazási körülményei jelentősen eltérhetnek a sejten belül uralkodó viszonyoktól, ezért annak érdekében, hogy egy adott enzim az alkalmazás jóval durvább körülményei között is stabil maradjon, sokszor jelentősen módosítani kell szerkezetét. Szelektív térhálósítással pl. 15 20 C-kal is növelni lehet az enzimek dentaurálódási, széthajtogatódási hőmérsékletét. Egyéb aminosav-szubsztitúciós eljárásokkal is javítható az enzimek stabilitása. Az antiszenszközvetített modulációs génexpresz-sziónál az oligonukleotidok stabilitását az oligonukleotidok egy nukleozidok főláncának módosításával lehet javítani. Külön témát jelent a
gyógyszer-hatóanyagok stabilitásának növelése a kezelés és tárolás körülményei között, hiszen azokat gyakran hónapokig tárolják, mielőtt alkalmaznák. A specificitás (az enzimreakcióktól a DNS-szálak kapcsolódásán keresztül az antigén antitest felismerésig) a biológiai folyamatok megkülönböztető jegye. Az enzimekre igen nagy specificitás jellemző, amely azonban módosítható, ezzel megváltoztatva a szubsztrátumként számításba jövő molekulák körét (feltéve, hogy a módosítással az aktivitás nem változott meg lényegesen). A specificitás csökkentése adott esetben hasznos is lehet, pl. fehérjékbe be lehet vinni a természetben elő nem forduló aminosavakat is. A szubsztrátumspecificitás mellett biomérnöki módszerekkel befolyásolni lehet a koenzim- vagy a termékspecificitást is. Ebbe a témakörbe tartozik az enzimatikus aktivitással rendelkező antitestek kifejlesztése, vagy az antitestek specificitásának tervezett megváltoztatása az elkülönítési tisztítási technológiákban. A biomérnöki tevékenység célmolekuláinak módosításakor azonban figyelni kell arra a tényre, hogy ezek a molekulák egy szélesebb fiziológiai környezetben jelennek meg és hatnak. A sejtválaszt általában megelőzi egy ligandum kötődése egy receptorhoz, amelyet katalitikus folyamatok követnek. Ezért eltérő dózis válasz összefüggések állapíthatók meg a ligandum kötődésére és magára a sejtválaszra. A génterápiában a hatékonyság nagymértékben függ a sejtbe való bejutástól, a sejten belüli mozgékonyságtól és végül az expressziótól és a gazdaszervezet genomjába való beépülés hatékonyságától. Az oligonukleotid-terápia alacsony hatékonyságát az első két tényező gyenge hozzájárulása okozza. A biológiai hatékonyság növeléséhez tehát egyszerre több, egymástól független tényező szerencsés vagy tudatos optimálására van szükség. A biológiailag aktív molekulákkal kapcsolatban elterjedt az a megközelítés, hogy egyetlen molekulán belül több részlet többféle funkcióval rendelkezhet (multifunkcionalitás), ami lehetővé teszi, hogy egyszerre többféle funkciót is optimáljanak a korrelációk figyelembevételével. Erre példa a nem vírusos gén- és oligonukleotid transzfer végrehajtása multifunkcionális, ún. kiméra molekulák segítségével, amelynek egyes részletei arra szolgálnak, hogy a DNS-sel komplexet képezzenek, mások a célhelyhez kötődnek, ismét mások megakadályozzák a molekula lebomlását stb. A kiméra molekulákat sikeresen alkalmazzák a vakcinafejlesztésben, az immunterápiában, valamint a kutatásban is. A molekuláris biomérnöki tudomány technológiai módszerei A génsebészet kapcsán számos új módszert dolgoztak ki és fejlesztettek tovább annak érdekében, hogy hatékonyan, nagy mennyiségben lehessen biológiailag aktív molekulákat előállítani. Ma már tudnak enzimeket, antiteste
ket, peptideket, nukleinsavakat és egyéb molekulákat génszinten vagy proteinszinten is módosítani olyan módszerekkel, mint a mutagenezis, az irányított evolúció vagy a molekuláris konjugáció. A különféle genetikai és kémiai módszereket a 2. táblázat foglalja össze. Biológiailag aktív makromolekulák módosításának módszerei 2. táblázat A módosítás módszere Helyre irányuló mutagenezis Genetikai/kémiai DNS szekvencia kell? Proteinszerkezet kell? genetikai igen nem, de a szerkezeti információ hasznos lehet Véletlen genetikai nem nem igen mutagenezis Irányított evolúció genetikai igen nem igen Fág-display genetikai igen nem, de a szerkezeti igen információ hasznos lehet Kombinatorikus bioszintézis genetikai igen nem igen Biológiai kimérák genetikai igen nem nem Kombinatorikus kémia kémiai nem nem, de a szerkezeti információ hasznos lehet Létrejön variánskönyvtár? nem igen Kémiai kimérák kémiai igen nem nem Szerkezetalapú gyógyszertervezés kémiai nem igen nem A fehérjék szerkezetének módosítását gyakran a szintézisük alapjául szolgáló DNS szerkezetváltoztatásával célszerű kezdeni. Ha egy adott helyen kívánják módosítani a bázissorrendet, akkor helyspecifikus mutagenezisről beszélünk. Ennek akkor van értelme, ha ismerjük a megváltoztatni kívánt fehérje szerkezetét, hatásmechanizmusát, és jó okunk van feltételezni, hogy az egyik aminosav másikra való kicserélése előre jelezhető javulást hoz a működésben. Az ilyen szisztematikus vizsgálatok nagyban hozzájárulhatnak az aminosav-sorrend és a működés közti összefüggésre vonatkozó ismeretekhez. Ilyen módszerrel sikerült pl. a természetesnél jobb tulajdonságokat mutató szuperoxid-diszmutáz és izocitrát-dehidrogenáz enzimeket kialakítani. Az ilyen ismeretháttér azonban a legtöbb enzim esetében hiányzik, és viszonylag ritkán lehet egyetlen aminosav cseréjével a kívánt hatást elérni. A véletlensze
rű mutációval előállított enzimváltozatoknál gyakran észleltek módosult enzimaktivitást olyan esetekben is, amikor a molekuláris modellezés szerint jelentéktelen aminosav cserélődött ki. Ezért aztán sokszor célszerűbb rögtön a véletlenszerű mutációval próbálkozni, és ezek közül kiválasztani a sikeres variánsokat. A több helyen bekövetkező mutációk gyakran szinergetikus hatást mutatnak, pl. egy ribonukleáz enzim esetében három mutáció összességében 40-szeres aktivitásnövekedést eredményezett. A véletlenszerű mutációnál persze a mutánsok óriási többsége nem hoz változást, vagy éppen aktivitáscsökkenést okoz, és nagyon sok változatból kell kiválogatni az eredetinél jobbakat. Ez komoly követelményeket támaszt az elválasztási és szűrési módszerekkel szemben. Valószínűleg a leghatékonyabb a szerkezeti modelleken alapuló lokális, és a véletlenszerű mutációk kombinációja. Sikerrel alkalmazták a mutációs stratégiát biológiailag aktív hatóanyagok baktériumok általi előállításánál is, ahol nem elsősorban a hatóanyag funkcióját, hanem hozamát próbálták javítani. Egy Rhodococcus törzshöz tartozó baktérium esetében pl. sikerült kiküszöbölni a gyógyászati köztitermékként használt indán-diol mellől a zavaró melléktermékeket. Az irányított evolúció, vagy DNS-keverés módszere úgy javít a véletlen mutáción, hogy egy gént vagy egy rokon géncsaládot véletlenszerűen fragmentálnak, majd ezeket a fragmentumokat polimeráz láncreakcióval elszaporítják, végül a mutáns géneket baktériumokban klónozzák. A módszer a darwini evolúció in vitro változatának tekinthető, és sok helyen sikerrel alkalmazták pl. enzimaktivitás növelésére, vagy extrém körülmények között is működőképes enzimek kialakítására. Az irányított evolúciót szívesen alkalmazzák rokongének csoportjára is, mert ezzel is gyorsítható a sikeres módosításhoz szükséges idő a teljesen véletlenszerű mutációhoz képest. A módszer korlátját jelenleg a hatékony szűrési módszerek jelentik, hiszen minden egyes ciklusban több ezer mutáns keletkezik, amelyek közül ki kell választani a leghatékonyabbakat. A fág-display módszer egy szálas bakteriofág felületén expresszált fehérjekönyvtárakat hasznosít célmolekulák azonosítására. A peptidek fizikailag is össze vannak kötve az őket kódoló DNS-sel, ezért viszonylag könnyű az egymáshoz tartozó részletek azonosítása. A fág-display módszerét leginkább gyógyászati célmolekulák optimálásában hasznosították. Bár a fág-display elsősorban szűrési módszer, használható proteinek módosítására is. Ha a fehérjemolekulát nem egymás melletti helyeken módosítják is, a hajtogatódás után a molekula egymástól távolabbi részei is egymás mellé kerülhetnek a molekula felszínén, és pl. új kötőhelyeket alakíthatnak ki. Ezt kombinálva a fág-display módszerrel sikerül javítani bizonyos fehérjék kötési affinitását. A mikroorganizmusok által előállított gyógyászatilag hatékony anyagok fejlesztésekor gyakran alkalmazzák a hagyományos mutációs eljárásokat bizonyos gének elnémítására vagy a DNS-rekombinációs módszert más gének expressziójának fokozására. Az utóbbi módszer segítségével ma már arra
is van lehetőség, hogy természetesen előforduló bioszintetikus utak rekombinációjával új antibiotikumokat állítsanak elő. A különböző bioszintézisutak kombinatorikus manipulációjával új antibiotikumok egész könyvtárát sikerül előállítani. 4 bioszitetikus út és 4 antibiotikum-gén kombinációjával akár 256 különféle rekombináns mikroorganizmus is előállítható. Itt is nehéz azonban a szűrés, de a szerkezeti genetikai ismeretek előrehaladásával valószínűleg csökkenthető lesz a fejlesztés véletlen jellege. Az antibiotikum-kémián túl a módszert sikeresen alkalmazzák pl. optikailag aktív intermedierek szintézisénél is. Az új antibiotikumok fejlesztésében az is nehézséget jelent, hogy maga a baktérium sem mindig rezisztens azzal az antibiotikummal szemben, amelyet a mutáció után termel. A rágcsálókban előállított monoklonális antitestek nagy gyógyászati potenciállal rendelkeznek, problémát jelent azonban az immunválasz, amelyet emberi szervezetben kiváltanak. Ezt próbálják meg kiküszöbölni az ún. kiméra antitestek, amelyekben rágcsáló és emberi eredetű elemek kombinálódnak. Ennek egyik lehetősége, hogy a rágcsáló antitest változó részét kódoló géneket kombinálják az emberi antitestek állandó részét kódoló génekkel egy plazmid vektorban. Ezt a módszert tovább tökéletesítették akkor, amikor kiderült, hogy elegendő bizonyos antigénkötő hurkok átvétele a rágcsálókból, az antitest többi részét át lehet venni a humán állományból még tovább csökkentve az immunválasz veszélyét. Az ezen a téren elért eredmények azonban még mindig nem elegendőek, a rákterápiában kipróbált humanizált antitestek még mindig a páciensek több mint 60%-ánál váltottak ki immunválaszt. A proteinek tudatos szerkezetmódosításával sikerült igen hatékony, kis méretű antitesteket kialakítani (ún. egyláncú antitestek), amelyeket könnyebb szaporítani, mint a teljes méretű verziókat. A rekombináns géntechnológiával olyan szekvenciák is beépíthetők pl. fehérjékbe, amelyek elválasztásuknál hasznosíthatók, de ugyanígy beépíthetők fluoreszcens jelzési kötőhelyek vagy enzimatikus hasadást elősegítő helyek stb. Előállíthatók olyan, kémiailag kötött kiméra fehérjék is, amelyek normál állapotban több, különálló peptidláncból épülnek egybe az élő szervezetben. Az oligopeptidekkel széles körben kísérleteznek vakcina-hatóanyagként, terápiás vagy antimikrobiális alkalmazásokban. A molekulák kis mérete azonban gyors kiürüléshez és gyenge immunválaszhoz vezet, amin pl. úgy lehet segíteni, hogy azt baktériumfehérjékkel vagy pl. toxinokkal kapcsolják össze. A gyógyszerhatóanyag-fejlesztés hagyományos módja az, hogy előállítanak egy nagyobb molekulacsoportot (könyvtárat), ezek közül választanak, majd módosításokkal javítják tovább az előszűrt molekulák hatékonyságát. Ezzel az a probléma, hogy nem elég molekulát szintetizálnak, és kérdéses a szűrés hatékonysága is. A molekulák számát az utóbbi időben szilárd fázisú szintézissel, kombinatorikus módszerekkel próbálják meg növelni, ami pl. nukleotidok, aminosavak, szénhidrátok és polimerjeik esetében automatikus módszerekkel megtehető. A kombinatorikus biokatalitikus módszerekben en
zimes és sejtes folyamatokat gyorsítanak és hajtanak végre szisztematikus módszerekkel, ezzel a biológiai evolúciót utánozva, de a molekulák jóval szélesebb körén kísérletezve. A biokatalitikus reakciók között szerepelhet halogénezés, hidroxilezés, oxidatív és reduktív átalakítás, foszforilezés, glikozilezés stb. Ezzel a módszerrel számos, nukleozidokból, flavonoidokból és poliketidekből kiinduló gyógyszer-hatóanyagot fedeztek fel. A szűk keresztmetszetet a kombinatorikus kémiai módszereknél is a szűrés jelenti. A biomolekulák közül pl. a nukleinsavakat és a fehérjéket kémiai módszerekkel módosítani, kapcsolani (konjugálni) lehet. A nukleinsavak esetében jól ismert a polikationokkal vagy kationos lipidekkel való komplexálás a bevitel hatékonyságának javítása érdekében. Ligandum-specifikus receptorok kapcsolásával javítani lehetett oligonukleotidok és plazmidok specifikus kötődését és célba juttatását. Leírták dextránok, poliglutaminsav és heparin oligomerek konjugálását proteinekkel is, farmakológiai jellemzőik vagy szövetspecifikus bejuttatásuk érdekében. A molekuláris biomérnöki tevékenység termékeinek szűrése és értékelése Mint korábban többször is láthattuk, a különböző kombinatorikus módszerek igen nagy számban generálnak új molekulákat, amelyek közül ki kell választani a különböző szempontok alapján leghatékonyabbakat, és sokszor ez a legnehezebb lépés. Mivel sok esetben egy-egy hasonló anyagcsalád könyvtárai alakulnak ki a szintézis során, egyre gyakrabban használnak biológiai és biokémiai próbákat kiértékelésükre, ezek között is egyre divatosabbak a szilárd fázisú enzimes próbák. A fenotípusos, növekedésre épülő próbák különösen a véletlen mutációknál gyakran félrevezető eredményt adnak. A modern módszerek között szerepelnek kötődési, farmakológiai, fág-display és mikro-array módszerek. A kötődési vizsgálatokat inkább fehérjéknél könnyű felhasználni, bár nukleinsavakra kidolgozott módszerek is léteznek (pl. antiszensz oligonukleotidok kiválasztása mrns segítségével). A kötődési vizsgálat különösen releváns ott, ahol antitest antigén vagy ligandum receptor kölcsönhatásokra vagyunk kíváncsiak. A gyógyszerfejlesztés kritikus lépése a farmakológiai és toxikológiai előszűrés, hiszen a fejlesztés előrehaladottabb stádiumaiban egyre több molekulát kell elutasítani nem megfelelő farmako-kinetikai vagy toxikus tulajdonságai miatt. A felszívódási, metabolizációs és kiürítési vizsgálatokat először sejtkultúrákon célszerű elvégezni. Az in vitro vizsgálatok célja sokszor nem is az in vivo szituáció lemásolása vagy szimulációja, hanem az olyan molekulák kiszűrése, amelyeket eleve nem érdemes gyógyszerré továbbfejleszteni. Az in vitro vizsgálatokkal előszűrt molekulákat érdemes állatkísérletekben (elsősorban rágcsálókon) tovább vizsgálni.
A hatékony szűrővizsgálatok egy részét automatizálták, és alkalmassá tették nagy hatékonyságú és egyben viszonylag gazdaságos sorozatmérésekre. A legegyszerűbb változatokban 96 férőhelyes, sejtmentes vizsgálati lemezeket (array) alkalmaznak nem radioaktív (rendszerint fluoreszcens vagy kemilumineszcens) detektálással. A fluoreszcens detektálás tárházában ott szerepel a fluoreszcens rezonancia energiatranszfer, a fluoreszcens polarizáció és az időfelbontásos fluoreszcencia módszere, amelyek vagy a jelölést teszik egyszerűbbé, vagy a detektálást specifikusabbá. A fluoreszcencia mellett a hatékony szűrőmódszerekben szívesen alkalmazzák az ELISA (enzimmel kombinált immunszorpciós próba) detektálási technikáját. A korábban már említett fág-display módszer hatékony lehetőséget kínál proteinváltozatok és protein ligandum kölcsönhatások szűrésére. A módszert kidolgozták bektériumokra és élesztőkre is, amelyek 10 9-10 13 tagú könyvtárak tesztelésére is alkalmasak. Ilyen módszerekkel választottak ki hatékony inhibitorokat, receptorokat és hatékony fehérjetisztító szereket. A kölcsönhatások erősségének vizsgálata mellett a fág-display alkalmas hőstabilitás vizsgálatára is. Az átfolyásos fluoreszcens citometriával kombinálva a fág-display alkalmas a kötődés kinetikájának követésére is. A genetikai vizsgálatokban egyre jobban elterjed a micro-array módszer, amely egyetlen tárgylemezen több ezer nukleotid vizsgálatát is lehetővé teszi. A génexpresszió kimutatására alkalmas módszer különösen nagy lehetőségeket rejteget a gyógyszerfejlesztési és a diagnosztikai alkalmazásokban. A módszer külön előnye, hogy az adott molekula hatását több génre (adott esetben a teljes genomra) egyidejűleg lehet vizsgálni. Az expressziós profilt többféle szövetre megvizsgálva és ismert toxinokkal összehasonlítva el lehet dönteni, hogy egy adott vegyület milyen toxikus tulajdonságokkal rendelkezik aminek előnye a gyógyszerfejlesztésben nyilvánvaló. Az elmondottakból látható, hogy a biológiailag aktív molekulák szerkezet/funkció viszonyainak jobb megértése, a befolyásolásukra alkalmas (főként kombinatorikus) módszerek, valamint a vizsgálatukra alkalmas szűrési módszerek folyamatos fejlődése egyre inkább lehetővé teszi, hogy az újabb, biológiailag aktív vagy gyógyászatilag jelentős molekulákat ne véletlenszerűen, hanem egyre tudatosabban, mérnöki módszerekkel állítsák elő. (Bánhegyiné Dr. Tóth Ágnes) Jayaraman, A.; Yarmush, M. L.; Roth, C. M.: Molecular bioengineering. = Industrial and Engineering Chemistry Research, 41. k. 3. sz. 2002. febr. 6. p. 441 455. Kurimoto, A.; Tanabe, T. stb.: Thiolated dermal bovine collagen as a novel support for bioactive peptides Conjugation with lysozymes. = Journal of Biotechnology, 86. k. 1. sz. 2001. p. 1 8. Shusta, E. V.; Holler, P. D. stb.: Directed evolution of a stable scaffold for T-cell receptor engineering. = Nature Biotechnology, 18. k. 6. sz. 2000. p. 754 759.
EGYÉB IRODALOM Patthy L.: A genomkorszak bioinformatikája. = Magyar Tudomány, 47. k. 5. sz. 2002. p. 575 581. Kosztolányi Gy.: A genomika kölcsönhatásai a medicinával és az egyetemes tudománnyal. = Magyar Tudomány, 47. 5. sz. 2002. p. 567 574. Szathmáry E.; Pál Cs.: Genomtan és evolúció. = Magyar Tudomány, 47. k. 5. sz. 2002. p. 582 588. Raskó I.: Populációgenomika. (Kapocs az evolúció és az orvosi genetika között.) = Magyar Tudomány, 47. k. 5. sz. 2002. p. 589 594. Arányi P.: Farmakogenetika és gyógyszergyártás. = Magyar Tudomány, 47. k. 5. sz. 2002. p. 595 600. Kampis Gy.: A gén halott, éljen a gén! = Magyar Tudomány, 47. k. 5. sz. 2002. p. 601 614. Sándor J.: Genomika és jog. = Magyar Tudomány, 47. k. 5. sz. 2002. p. 615 625. Frigyesi V.; Nyeste L.: A biotechnológia fejlődésének történelme és hatásai. = Valóság, 44. k. 11. sz. 2001. p. 68 83. Hantos G.; Kováts T. stb.: A biotechnológia szerepe a Richter Gedeon Rt. történetében. = Magyar Kémikusok Lapja, 56. k. 12. sz. 2001. Szabó M.; Bátki Zs.: A genetikailag módosított organizmusokra vonatkozó Európai Uniós és hazai jogi szabályozás változásai II. r. = Élelmezési Ipar, 55. k. 12. sz. 2001. p. 357 363.