/11 1. RENDELTETÉS

PLATELIA LYME IgG 1 lemez 96 72952 BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO ELLENI IgG ANTITESTEK KVALITATÍV MEGHATÁROZÁSA ENZIM IMMUNOASSAY MÓDSZERREL HUMÁN SZÉRUMBÓL, PLAZMÁBÓL VAGY LIQUORBÓL 883689 2015/11 1. RENDELTETÉS A Platelia Lyme IgG egy ún. immunocapture eljárás a Borrelia burgdorferi sensu lato elleni IgG antitestek minőségi meghatározására humán szérumból, plazmából vagy liquorból. 2. KLINIKAI JELLEMZŐK A Lyme borreliosis (vagy Lyme kór) olyan fertőző megbetegedés, amelyet a spirocheták családjából származó baktérium okoz, nevezetesen a Borrelia burgdorferi, és amelyet az Ixodes ricinus kullancs terjeszt (2). Különböző állatok lehetnek a baktérium gazdaszervezetei, és az emberek fertőződése a kullancscsípéssel történik. A fertőződés veszélye arányos a csípés időtartalmával. A Lyme kór előfordulási gyakorisága magas az északi félteke mérsékelt és hideg időjárású országaiban, Kínától Észak Amerikáig, és Skandináviától, Észak Afrikáig. Évente mintegy 17 000 esetről számolnak be az Egyesült Államokban (3), és valószínűleg több mint 50 000 eset fordul elő Európában, nyugatról kelet felé növekvő számban (4). Mára egyértelműen bebizonyosodott, hogy a Borrelia burgdorferi, amelyet 1984-ben még egyedi baktériumfajként írtak le, valójában több fajból áll, amelyek közül öt az emberekre nézve patogén: a Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss) (szoros értelemben vett), a Borrelia garinii, a Borrelia afzelii, a Borrelia spielmanii és a Borrelia bavariensis (7,8). Két másik faj potenciálisan patogén: a a Borrelia valaisiana és a Borrelia lusitaniae. A hét faj Európában terjedt el, míg az Egyesült Államokban csak a B. burgdorferi sensu stricto van jelen. A Lyme kór klinikai tünetei változatosak és felismerésük néha bonyolult (6). A betegség klinikai megjelenésében három megkülönböztethető szakasz van. A korai szakasz (I. szakasz) tünetmentes lehet és influenzaszerű tünetegyüttes jellemzi. Az esetek 50-80%-nál több nappal vagy héttel a kullancscsípés után, tipikus lokalizált kiütés jelenik meg a bőrön, körkörös terjedéssel, amelyet erythema migransnak nevezünk (EM). Kezelés nélkül a Borrelia hematogén terjedése miatt néhány héttel később ízületi gyulladás, idegrendszeri vagy agyhártyagyulladás valamint bőr vagy szívtünetek jelenhetnek meg. (II. szakasz). Több hónap vagy év után, a betegség idült szakaszba megy át, különböző súlyosságú acrodermatitis chronica atrophicans, encephalopathia, agyvelő-gyulladás és idült ízületi gyulladás megjelenésével (III. szakasz) (1). Minden Borrelia burgdorferi fajnak megvan a saját tropizmusa. Az Erythema migrans az I. szakaszban mindhárom fajhoz egyformán társul. Mindazonáltal, a neurológiai szövődmények gyakrabban társulnak a B. garinii fertőzéssel, ízületi gyulladás gyakrabban társul a B. burgdorferi ss fajjal, míg az acrodermatitis chronica atrophicans specifikus a B. afzelii fajra. A Lyme kór diagnózisát megerősíti a beteg kórelőzményeinek a vizsgálata, klinikai és biológiai szempontok és a kullancscsípés megléte. A direkt kimutatás, a tenyésztés ill. a molekuláris biológiai módszerek alkalmazási nehézségei miatt, a szerológia kulcsfontosságú maradt a Lyme kór diagnosztikájában(1,5,9). Az IgM antitestek a Borrelia burgdorferi ellen 3-6 héttel a fertőződés után jelennek meg és megmaradhatnak a betegség kifejlődése alatt, míg az IgG antitestek később jelennek meg és maximumuk csak hónapok, vagy akár évek múlva következik be. Bár a szerológiai vizsgálat kevésbé hasznos a korai szakaszban, lényegesebb a szekunder és tercier szakaszokban, különösen ha nincs erythema migrans. Ha a szerológia negatív a jellemző klinikai állapot ellenére, 3 héttel az eredeti vizsgálat után meg kell ismételni. A specifikus IgM antitestek jelenléte nem okvetlenül jelent friss fertőzést. Hasonlóan, a specifikus IgG antitestek jelenléte nem mindig egy régi fertőzés nyoma. Lyme-neuroborreliosis gyanúja esetén a diagnózis felállítását segítheti még a Borrelia burgdorferi sensu lato elleni specifikus IgG antitestek intrathecalis szintézis indexének meghatározása (10,11,12). Azokat az antigéneket és antitesteket, amelyeket a Platelia Lyme IgG (Ref. 72952) és Platelia Lyme IgM (Ref. 72951) vizsgálatokban használnak, úgy választották ki hogy lehetővé tegyék specifikus IgG, illetve specifikus IgM antitestek kimutatását a különböző amerikai és európai Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii) fajokban. 3. A VIZSGÁLAT ELVE A Platelia Lyme IgG kvalitatív teszt a Borrelia burgdorferi sensu lato elleni IgG antitestek kimutatására humán szérumból, plazmából vagy liquorból indirekt ELISA immuno-enzimatikus módszerrel. Inaktivált Borrelia burgdorferi antigénnel vonják be a mikrolemezt. Egy monoklonális, peroxidázzal jelölt antitestet használnak konjugátumként, amely specifikus a humán gamma láncokra (anti-igg). A teszt lépései a következők: 1

1. lépés A betegből származó mintát (szérumot vagy plazmát) és a kontrollt 1:101 arányban hígítják. A liquor-mintákat 1:2 arányban hígítják. Ezután a hígított mintákat szétosztják a mikrolemez lyukaiba. Egy órás 37 C hőmérsékleten történő inkubálás alatt a jelenlévő Borrelia burgdorferi elleni IgG antitestek a mikrolemez lyukaiban az antigénhez kötődnek. Az inkubálás után, a nem kötődött nem specifikus antitesteket és egyéb szérum fehérjéket mosással távolítják el. 2. lépés A konjugátumot (peroxidázzal jelölt monoklonális antitest, amely specifikus a humán gamma láncokra) bemérik a mikrolemez lyukaiba. Egy órás 37 C hőmérsékleten történő inkubálás alatt a jelenlévő Borrelia burgdorferi elleni IgG antitestek az antigénhez kötődnek. A nem kötődött konjugátumot sorozatos mosással távolítják el az inkubálás végén. 3. lépés Az immun-komplexek jelenlétét (Borrelia antigén, IgG antitestek a Borrelia burgendorferiellen, anti-igg konjugátum) enzimes előhívó oldattal mutatják ki. 4. lépés Az inkubálás után szobahőmérsékleten (+18-30 C), az enzimreakciót 1N kénsavoldat bemérésével állítják le. Az optikai sűrűség értéke amelyet spektrofotométerrel mérnek 450/620 nm hullámhosszon, arányos a mintában lévő Borrelia burgdorferi elleni IgG antitestek mennyiségével. 4. TERMÉKTÁJÉKOZTATÓ A mellékelt reagensek mennyiségét úgy számítottuk ki, hogy 96 teszt vizsgálatát tegyék lehetővé, maximum 6 sorozatban. A reagensek kizárólag in vitro diagnosztikai vizsgálatokhoz használhatók. Komponens Tartalom Kiszerelés R1 Microplate Mikrolemez (használatra kész)96 tesztlyukú 12 csík 8 letörhető, bevonva inaktivált Borrelia antigénnel R2 Concentrated Washing Tömény mosóoldat (20X) Solution TRIS-NaCl puffer (ph 7.4), 2% Tween 20 (20x) Tartósítószer : 0,04 % ProClin 300 R3 Negative Control Negatív kontroll Negatív humán IgG Borrelia burgdorferi ellen, és negatív HBs antigén, anti-hiv1, anti- HIV2 és anti-hcv vonatkozásában is. Tartósítószer: 0,15 % ProClin 300 R4 Cut-off Control Cut-off kontroll Humán pozitív szérum a Borrelia burgdorferi elleni IgG antitestekre, és negatív HBs antigén, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti- HCV vonatkozásában. Tartósítószer: 0,15 % ProClin 300 R5 Positive Control Pozitív kontroll Humán pozitív szérum a Borrelia burgdorferi elleni IgG antitestekre, és negatív HBs antigén, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti- HCV vonatkozásában. Tartósítószer: 0,15 % ProClin 300 R6 Conjugate (51x) Konjugátum (51x) Patkány anti human monoklonális IgG peroxidázzal jelölve. Tartósítószer: 0,16 % ProClin 300 R7 Diluent Hígító mintákhoz és konjugátumhoz (használatra kész) Tris-NaCl (ph 7,7) puffer, magzati borjúszérum, 0,1% Tween 20 és fenolvörös Tartósítószer: 0,15 % ProClin 300 R9 Chromogen TMB Kromogén (használatra kész) 3,3.5.5 tetrametil-benzidin (< 0,1%), H 2O 2 (<1%) R10 Stopping Solution Leállító oldat (használatra kész) 1N kénsavoldat A tárolási körülmények és lejárati dátum a csomagoláson vannak feltüntetve. 1 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,7 ml 2 x 65 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml 5. FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK Az eredmények megbízhatósága függ a Helyes laboratóriumi gyakorlat következő elveinek a tiszteletben tartásától: Ne használjunk lejárt reagenseket. Ne keverjünk össze más készletekből származó, más gyártási számú reagenseket. 2

A mosóoldat (R2, címkeazonosító: 20x, zöld színű), kromogén (R9, címkeazonosító TMB, türkiz színű) és a leállító oldat (R10, címkeazonosító 1N, piros színű) esetében, lehetséges a készletben nem lévő gyártási számú reagens-tételek használata, feltéve, hogy ezek a reagensek szigorúan azonosak. Használat előtt 30 percig tartsuk a reagenseket szobahőmérsékleten melegedni (+18-30 C). Gondosan hígítsuk a reagenseket, hogy elkerüljünk bármilyen befertőződést. Ne végezzük a vizsgálatot reaktív gőzök (savak, lúgok, aldehidek) vagy por jelenlétében, mivel ezek befolyásolhatják a konjugátum enzimaktivitását. Használjunk ioncserélt vízzel alaposan kimosott és kiöblített edényeket vagy, lehetőleg egyszer használatos eszközöket. A mikrolemez mosása az eljárás kritikus lépése: tartsuk tiszteletben az ajánlott mosóciklusok számát, és biztosítsuk minden tesztlyuk teljes feltöltését, majd teljes ürítését. A szabálytalan mosás, pontatlan eredményekhez vezethet. Ne hagyjuk kiszáradni a mikrolemezt a mosási ciklusok befejezése és a reagensek bemérése között. Soha ne használjuk ugyanazt az edényt a konjugátum és az előhívási oldat beméréséhez. Az enzimreakció nagyon érzékeny fémre vagy fémes ionokra. Következésképpen, ne hagyjunk semmi fémet érintkezni a különböző oldatokkal, amelyekben konjugátum vagy kromogén van. A kromogén oldat (R9) színtelen. Kék szín megjelenése azt jelzi, hogy a reagens nem használható és le kell cserélni. Minden mintához használjon új pipettahegyet. Ellenőrizze a pipetták és egyéb eszközök pontosságát és szabályos működését. Egészségvédelmi és biztonsági előírások A reagensek elkészítésére használt humán eredetű anyagot megvizsgálták és negatívnak találták hepatitis B felszíni antigén (HBs Ag), hepatitis C vírus antitest (anti-hcv) és (HIV-1 és HIV-2) tekintetében. Mivel egyetlen tesztelési módszer sem tudja teljes mértékben kizárni a fertőző anyagok jelenlétét, a humán eredetű és a betegmintákat fertőző anyagként kell kezelni. Bármely anyag, beleértve a mosóoldatokat, amely közvetlenül érintkezik humán eredetű anyagokkal és reagensekkel, potenciálisan fertőző betegségek terjesztőjének tekintendő. Viseljen kesztyűt a minták és reagensek kezelése során. Ne pipettázzon szájjal. Kerülje a minták és mintákat tartalmazó oldatok fröcskölését. A kiömlött anyagot 10%-ra hígított klórtartalmú szerrel kell leöblíteni. Amennyiben sav fröccsen ki, először semlegesíteni kell nátrium-bikarbonáttal, majd fel kell tisztítani 10% hígítású hipoklorit oldattal és szűrőpapírral felszárítani. A tisztításhoz használt minden anyagot a szennyezett hulladékok tárolójába kell helyezni. A betegmintákat, humán eredetű anyagot tartalmazó reagenseket, valamint a szennyezett anyagokat és termékeket csak fertőtlenítés után szabad eldobni: - 5% nátrium-hipoklorit oldatba 30 percig tartva, - vagy autoklávozással 121 C hőmérsékleten legalább 2 órán keresztül. FIGYELEM: Ne tegyen nátrium-hipoklorit tartalmú oldatokat az autoklávba Kerülje a kromogén, és leállító oldat érintkezését a bőrrel, és nyálkahártyákkal (toxicitás, irritáció és égés veszélye). A vegyi és biológiai hulladékok kezelését és ártalmatlanítását a Helyes laboratóriumi gyakorlat elvei szerint kell végezni. A készlet minden reagense kizárólag in vitro diagnosztikai vizsgálatokhoz használható. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: www.bio-rad.com. 6. MINTAVÉTEL ÉS TÁROLÁS 1. Szérum, plazma (EDTA, heparin vagy citrát) és liquor az ajánlott vizsgálati minta. 2. Tartsuk tiszteletben a következő ajánlásokat a vérminták kezelése, feldolgozása és tárolása során: Minden vérmintát a vérvételeknél általánosan alkalmazott elővigyázatossági szempontok tiszteletben tartásával vegyünk le. Szérum esetében, hagyjuk a mintákat teljesen megalvadni centrifugálás előtt. A csöveket mindenkor tartsuk bedugaszolva. Centrifugálás után, válasszuk el a szérumot vagy plazmát az alvadéktól vagy vörösvérsejtektől. A mintákat +2-8 C hőmérsékleten lehet tárolni, amennyiben a vizsgálatot 7 napon belül végzik el. Amennyiben a tesztet nem végzik el 7 napon belül, vagy szállítják, fagyasszuk le a mintákat -20 C vagy alacsonyabb hőmérsékleten. Ne használjuk fel azokat a mintákat, amelyeket több mint ötször felengedtek és visszafagyasztottak. Az előzőleg fagyasztott mintákat alaposan meg kell keverni a kiolvasztás után és a vizsgálat előtt. 3. A 90 g/l albumint vagy 100 mg/l nem konjugált bilirubint tartalmazó szérum vagy plazma minták, a 36 g/l trioleint (trigliceridet) tartalmazó lipémiás minták, és a maximum 10 g/l hemoglobint tartalmazó hemolitikus minták, nem befolyásolják az eredményeket. 4. Ne melegítse a mintákat. 5. Az intrathecalis IgG szintézis igazolására használjon a szérum vagy plazmamintával azonos időpontban, a liquorból gerinccsapolással levett mintát. Vegye figyelembe a liquor-mintákra általános érvényes ajánlásokat. Különösen fontos, hogy ne használjon szemmel láthatóan heterogén, zavaros mintákat (ebben az esetben centrifugálás után használja inkább a felülúszót), valamint erősen hemolizált mintákat. A liquort közvetlenül a mintavétel után kell a vizsgálatnak alávetni. Ha későbbi vizsgálat céljára a mintát tárolni kell, akkor rövid időre 4-8 C-on, hosszú időre pedig -20 C-on tárolható (11). 3

MEGJEGYZÉS: A liquor-minták stabilitását 4-8 C-on, -20 C-on valamint többszöri fagyasztási és felolvasztási ciklusok után, illetve a fenti 3. pontban felsorolt zavaró komponensek jelenlétében nem vizsgálták. 7. A MÉRÉS MENETE 7.1 Szükséges, de nem biztosított anyagok Vortex keverő Mikrolemez leolvasó, 450nm és 620nm szűrőkkel felszerelve (*). Mikrolemez inkubátor 37±1 C hőmérsékletre (*). Automata, félautomata vagy manuális mikrolemez mosó (*). Steril desztillált vagy ioncserélt víz. Eldobható kesztyűk. Védő vagy biztonsági szemüveg. Nedvszívó papír. Automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított, pipetták vagy multi-pipetták, amelyek alkalmasak 10 µl és 1000 µl, illetve 1 ml, 2 ml és 10 ml térfogat bemérésére. 25ml, 50 ml, 100 ml és 1000 ml kapacitású mérőhengerek. Nátrium-hipoklorit (klórozószer) és nátrium-bikarbonát. Biológiai veszélyt jelentő anyagok tárolására alkalmas hulladékkonténer. Eldobható csövek. (*) Kérje ki műszaki részlegünk tanácsát az ajánlott berendezések részleteiről 7.2 A reagensek oldása R1: Felnyitás előtt hagyjuk 30 percig szobahőmérsékleten (+18-30 C) a zacskót. Távolítsuk el a lemeztartót, a felhasználatlan csíkokat tegyük vissza azonnal a zacskóba, és ellenőrizzük a nedvszívó szer meglétét. Gondosan zárjuk vissza a zacskót és tároljuk +2-8 C hőmérsékleten.. R2: Hígítsuk 1/20 az R2 mosóoldatot desztillált vízzel: például 50 ml R2 és 950 ml desztillált víz. Ha manuálisan mos, készítsen el 350 ml hígított mosási oldatot egy 12 tesztcsíkú lemez számára. R3, R4, R5: Hígítsuk 1/101 az (R7) hígítóval (példa: 10 µl R3 + 1 ml R7). R6+R7: A konjugátum (R6) 51x tömény és homogenizálni kell használat előtt. Hígítsuk 1/51 hígítóval (R7). Egy lemezhez, keverjünk össze 0,5 ml konjugátumot (R6) 25 ml hígítót (R7). 7.3 Felnyitott és/vagy beoldott reagensek tárolása és használati ideje A készletet +2-8 C hőmérsékleten kell tárolni. Amikor a készletet +2-8 C hőmérsékleten tárolják felnyitás előtt, minden komponens a készlet külső címkéjén jelölt lejárati dátumig használható fel. R1: Felnyitás után, a csíkok stabilak maradnak maximum egy hónapig, ha +2-8 C hőmérsékleten tárolják, ugyanabban a gondosan lezárt tasakban (ellenőrizze a szárítószer jelenlétét). R2: Hígítás után, a mosóoldatot 2 hétig lehet tárolni +2-30 C hőmérsékleten. A tömény mosóoldat amelyet +2-30 C hőmérsékleten tárolnak, befertőződés nélkül stabil a címkén feltűntetett lejárati dátumig. R3, R4, R5, R6, R7: Felnyitás után, és ha nincs befertőződés, a +2-8 C hőmérsékleten tárolt reagensek maximum egy hónapig stabilok. R6+R7: Hígítás után, a konjugátum munkaoldat 8 órán át stabil szobahőmérsékleten (+18-30 C) vagy 24 órát a +2-8 C hőfokon. R9: Felnyitás után, és ha nincs befertőződés, a +2-8 C hőmérsékleten tárolt reagens maximum 2 hónapig stabil. R10: Felnyitás után, és ha nincs befertőződés, a +2-8 C hőmérsékleten tárolt reagens a címkén feltűntetett lejárati ideig stabil. 7.4 Eljárás a szérumból vagy plazmából származó minták esetén Szigorúan kövesse az ajánlott protokollt és a Helyes laboratóriumi gyakorlat irányelveit. Használat előtt hagyja a reagenseket szobahőmérsékletre melegedni (+18-30 C). 1. Gondosan készítsen tervet a kontrollok és a betegminták azonosítására. 2. Készítse el a hígított mosóoldatot (R2) [lásd a 7.2 részt]. 3. Távolítsuk el a lemeztartót és a tesztlyukcsíkokat (R1) a védőtasakból [lásd a 7.2 részt]. 4. Hígítsa az R3, R4, R5 kontrollokat és betegmintákat (S1, S2 ) az (R7) hígítóval 1/101 arányban: 10 µl minta és 1,0 ml hígító (R7). Vortex keverővel keverje a hígított mintákat. 5. Szigorúan kövesse az alábbi sorrendet, és mérjen minden tesztlyukba 200µl hígított kontrollt és betegmintát: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 4

6. Fedje le a mikrolemezt öntapadó fóliával, ezután nyomja rá határozottan a lemezre, hogy biztosítsa a szabályos lezárást. Inkubálja a mikrolemezt vízfürdőn vagy száraz inkubátorban 1 óra ±5 percig 37 C ± 1 C hőmérsékleten. 7. Az első inkubálási szakasz végén, vegye le a lemezfóliát. A tesztlyukak tartalmát a biológiailag veszélyes anyagok hulladéktartályába (amely nátrium-hipokloritot tartalmaz) ürítse. Mossa a mikrolemezt 4x 350 µl mosóoldattal (R2) és gyengéden ütögesse itatóspapírhoz. 8. Készítse el a hígított mosóoldatot (R6+R7) [lásd a 7.2 részt]. Mérjen 200 µl konjugátum munkaoldatot (R6+R7) minden lyukba. Használat előtt az oldatot gyengéden fel kell rázni. 9. Fedje le a mikrolemezt öntapadós lemezragasztóval. Inkubálja a mikrolemezt vízfürdőn vagy termosztátban 1 óra ± 5 percig 37 C ± 1 C hőmérsékleten. 10. A második inkubálási szakasz végén, vegye le a lemezfóliát. A tesztlyukak tartalmát a biológiailag veszélyes anyagok hulladéktartályába (amely nátrium-hipokloritot tartalmaz) ürítse. Mossa a mikrolemezt 4x 350 µl mosóoldattal (R2) és gyengéden ütögesse itatóspapírhoz. 11. Gyorsan mérjen minden lyukba fénytől védve 200 µl kromogén oldatot (R9). Hagyja a reakciót kifejlődni a sötétben 30 ± 5 percig szobahőmérsékleten (+18-30 C).). Ennek az inkubációs lépésnek az ideje alatt, ne használjon tapadófóliát. 12. Állítsa le az enzimreakciót, 100 µl leállító oldat (R10) bemérésével. 13. Gondosan törölje le a lemez alját. Olvassa le az optikai sűrűséget 450/620 nm hullámhosszon lemez-leolvasóval 30 percen belül a reakció leállítása után. Leolvasás előtt a csíkokat, mindig fénytől védve kell tárolni. 14. Az eredmények értékelése előtt, ellenőrizze a kontrollok és a minták azonosítási tervének egyezését. 7.5 Eljárás liquorból származó minták esetén MEGJEGYZÉS: Az anti-lyme IgG antitestek intrathecalis szintézisének meghatározása a Reiber-képlet alkalmazásán alapszik. Minden olyan beteg esetén, akinél Lyme neuroborreliosis gyanúja merül fel, egyszerre kell mintát venni a szérumból/plazmából és a liquorból. A két mintát egyszerre kell a vizsgálatnak alávetni. A liquor-mintákból a Hígítóval (R7) készítsünk 1:2 arányú oldatot: 150 µl liquor-mintához 150 µl Hígítót adjunk. A szérumból és plazmából származó minták hígításánál, a liquor-mintáktól eltérően, mindig szigorúan kövessük a fent leírt eljárásrendet. 8 SZÁMÍTÁSOK ÉS AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE 8.1 Cut-off érték kiszámítása (CO) A cut-off (CO) megfelel az optikai sűrűség (OD) átlagos értékének a metszésérték kontroll duplikátumok esetében (R4): CO = R4 átlagos OD (abszorbancia) 8.2 Mintaarány kiszámítása (szérum vagy plazma) A minta eredményét a következő képlettel állapítják meg: Mintaarány = minta OD/CO 8.3 Minőség-ellenőrzés Ne feledkezzünk meg a kontrollokról minden mikrolemeznél, minden sorozatnál, és elemezzük a kapott eredményeket. A vizsgálat validálásához, a következő szempontokat kell teljesíteni: Optikai sűrűség értékek: - CO > 0,200-0.80 x CO < OD R4 replikátum 1 < 1,20 x CO - 0.80 x CO < OD R4 replikátum 2 < 1,20 x CO (A cut-off kontroll (R4) átlagértéke 20%-nál többel nem térhet el a CO értéktől). Optikai sűrűség arányok: - Arány R3 (OD R3 / CO) < 0,5 - Arány R5 (OD R5 / CO) > 2,0 Ha a minőségellenőrzési szempontok nem teljesülnek, a vizsgálatot meg kell ismételni 5

8.4 Az eredmények értelmezése (szérum vagy plazma) Minta arány Eredmények értelmezése Arány < 0,80 Negatív 0,80 Arány < 1,2 Kétes Arány 1,2 Pozitív A mintát negatívnak tekintik a Borrelia burgdorferi sensu lato elleni IgG antitestek szempontjából. A mintát kétesnek tekintik a Borrelia burgdorferi sensu lato elleni IgG antitestek szempontjából. Ajánlatos egy másik minta vizsgálata 3 héttel az első vizsgálat után. A mintát pozitívnak tekintik a Borrelia burgdorferi sensu lato elleni IgG antitestek szempontjából. Ha fertőzést gyanít, kiegészítő szerológiai tesztet kell elvégezni, például az IgM anti-borrelia antitestek hasznosak a diagnózis megerősítésében. Ha a szerológiai eredmény pozitív vagy kétes, ajánlott a mintát Western-Blot módszerrel (9) is megvizsgálni. 8.5 Az intrathecalis szintézis meghatározására szolgáló számítások Az intrathecalis szintézis az IgG antitest index (AI IgG) kiszámításával, a Reiber-képlet alkalmazásával határozható meg (10,11,12). Minden egyes összetartozó szérum- és liquor-minta pár esetében meghatározzuk azok OD értékeit (OD IgG Serum, OD IgG CSF) és megvizsgáljuk, hogy ezek az OD értékek 0,000 és 3,000 közé esnek-e. FIGYELEM! Ha a szérum OD értéke (OD IgG Serum) vagy a liquor OD értéke (OD IgG CSF) nem a fenti tartományba esik, akkor a mintát újra meg kell vizsgálni a készletben megtalálható R7 Hígítóval végzett nagyobb hígításban. A hígítást követően a minta OD értékének 0,000 és 3,000 között kell lennie. Ebben az esetben az alkalmazott hígítási faktort vesszük figyelembe az intrathecalis IgG szintézis indexének kiszámításakor. Minden egyes vizsgált szérumra vonatkozóan meghatározzuk a következő adatokat: Albumin (g/l) = Albumin szérum Össz IgG (g/l) = Össz IgG szérum Minden egyes vizsgált liquorra vonatkozóan meghatározzuk a következő adatokat: Albumin (mg/l) = Albumin liquor Össz IgG (g/l) = Össz IgG liquor A különféle hányadosokat az alábbi képletek alapján számoljuk ki: Q Alb = Albumin liquor / [Albumin szérum x 1000] Q lim(igg) = 0,93 x [Q Alb 2 + (6 x 10-6 )] 1/2 1,7 x 10-3 Q IgG = Össz IgG liquor / [Össz IgG szérum x 1000] Q Spec(IgG) = OD IgG liquor / [OD IgG szérum x 50,5] FIGYELEM! Ha például a liquor- és a szérummintát 1:5 illetve 1:10 arányban hígítottuk ahhoz, hogy az OD értékük a 0,000 és 3,000 közé essen, akkor a liquor OD értékét (OD IgG CSF) 5-tel, a szérum OD értékét (OD IgG Serum) pedig 10-zel kell megszorozni a Q Spec(IgG) kiszámítási képletének használata előtt. Az IgG antitest indexet (AI IgG) az alábbi két képlet egyikével határozzuk meg: AI IgG = Q Spec(IgG) / Q IgG [ha Q IgG < Q lim(igg)] vagy AI IgG = Q Spec(IgG) / Q lim(igg) [ha Q IgG > Q lim(igg)] 8.6 Az antitest index (AI IgG) értékelése az intrathecalis szintézis meghatározására A Reiber-képlet nem használható az IgG antitest index meghatározására az alábbi helyzetekben: liquor-minta arány < 0,50 (*) a liquor-minta arány 0,50, de a szérum/plazma arány < 0,50 (*) (*) arány = OD / átlagos R4 6

A liquor értékeket az alábbi algoritmus szerint értékeljük: Liquor arány meghatározása Liquor arány < 0,50 Liquor arány 0,50 liquor IgG negatív Szérum arány meghatározása szérum arány < 0,50 szérum arány 0,50 Liquor arány < 0,80 Liquor arány 0,80 Reiber-képlet a liquor eredménye nem értékelhető liquor IgG pozitív IgG antitest index értelmezése Az IgG antitest index meghatározásának algoritmusa, Platelia Lyme IgG kit használatával Az intrathecalis IgG szintézist bizonyítja, ha az IgG antitest index 1,30 feletti. Ha az IgG antitest index 0,70 feletti, de nem nagyobb 1,30-nál, akkor nincs intrathecalis IgG szintézis. Az eredmény nem tekinthető érvényesnek, ha az IgG antitest index nem haladja meg a 0,70-et (eljárási hiba, nem azonos napon levett szérum és liquor, fertőzött liquor stb). Az AI IgG értékelése Pozitív AI IgG > 1,30 Negatív 0,70 < AI IgG 1,30 Érvénytelen eredmény AI IgG 0,70 8.7 Hibaforrások Nem validálható vagy nem reprodukálható reakciók kiváltó okai gyakran az alábbiak: Nem megfelelő mikrolemez mosás. Negatív minták kontaminációja magas antitest tartalmú szérummal vagy plazmával Az előhívó oldat szennyeződése kémiai oxidálószerekkel (klórozószer, fémes ionok, stb.). A leállító oldat befertőződése. 8.8 Számítási példa (szérum vagy plazma) Megjegyzés: A következő adatokat példaként adjuk meg és nem szabad a felhasználó eredményei helyett használni. Kontrollok és betegminták OD (450/620 nm) Arány Eredmény R3 0 144 0,29 Negatív R4 0,502 / / R4 0,498 / / R5 1,440 2,88 Pozitív 1. sz. minta 1,650 3,30 Pozitív 2. sz. minta, stb. 0,120 0,24 Negatív 7

Cut-off érték : - CO = (0,502+0,498)/2 = 0,500 Optikai sűrűség értékek : - OD CO = 0,500 (N > 0,200) - OD R4 replikátum 1 = 0,502 (0,80 x OD CO < OD R4 replikátum 1 < 1,20 x OD CO) - OD R4 replikátum 2 = 0,498 (0,80 x OD CO < OD R4 replikátum 2 < 1,20 x OD CO) Optikai sűrűség arányok : - Arány R3 (OD R0 / CO < 0,5) - Arány R5 = 2,88 (N > 2,0) Minőség-ellenőrzés: Elfogadva 9 TELJESÍTMÉNY 9.1 Elterjedtség A Borrelia burgdorferi sensu lato elleni IgG antitestek előfordulását humán szérumban, 295 észak franciaországi véradótól nyert vérmintával becsülték meg. A következő eredményekre jutottunk: 291 negatív, 1 kétes és 3 pozitív szérum. A Platelia Lyme IgG teszttel meghatározott elterjedtség 1,02% (3/295). 9.2 Specifikusság 9.2.1. SPECIFIKUSSÁG NEM ENDÉMIÁS TERÜLETEN A specifikusságot 279 észak franciaországi, nem endémiás területen élő egészséges véradótól nyert mintával becsülték meg. A mintákat kereskedelmi EIA teszttel negatív eredményt adó minták közül válogatták ki. Ezt a tesztet Európában használják (CE jelzést visel) és referenciának tekintik. 9.2.2. SPECIFIKUSSÁG ENDÉMIÁS TERÜLETEN A specifikusságot endémiás területen élő 193 kelet franciaországi véradótól nyert szérummal becsülték meg, akiknél nem fordultak elő a Lyme kórra jellemző tünetek (nem jelentkeztek a borreliosis klinikai tünetei, nem fordult elő kullancscsípés). A mintákat kereskedelmi EIA teszttel negatív eredményt adó minták közül válogatták ki. Ezt a tesztet Európában használják (CE jelzést visel) és referenciának tekintik. Az eredmények az alábbi táblázatban láthatók: Szérumsorozat Negatív Kétes (1) Pozitív (2) Specifikusság Nem endémiás terület (n=279) Endémiás terület (n=193) 278 1 0 190 2 1 (278/278) [98,9% ] 99,5% (190/191) [97,1% 99,9%] (1) A kétes eredményeket nem vettük figyelembe a specifikusság kiszámításánál. (2) A Platelia Lyme IgG vizsgálattal pozitívnak talált minta, negatívnak bizonyult Western blot módszerrel. IC 95%: 95% konfidencia intervallum. 8

9.3 Érzékenység A Platelia Lyme IgG vizsgálat érzékenységét kiszámítottuk és közöltük a Platelia Lyme IgM vizsgálat eredményeivel együtt (Ref. 72951), 70 mintából álló sorozat esetében, amelyeket a Lyme kór különböző klinikai szakaszaiban lévő betegektől vettünk. Az eredményeket az alábbi táblázatban tüntettük fel, és összehasonlítottuk az Európában kereskedelmi forgalomban lévő EIA vizsgálatok érzékenységével, amelyek a CE jelzést viselték és referenciának tekintettük: Klinikai szakasz Szérumok száma Platelia Lyme (1) Referencia Európa (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM Erythema migrans (I szakasz) 17 66,7% [38,4% 88,2%] 58,8% [32,9% 81,6%] 82,4% [56,6% 96,2%] 93,3% [68,1% 99,8%] Neuroborreliosis (II szakasz) 33 96,9% [83,4% 99,9%] 36,7% [19,9% 56,1%] 96,9% [83,4% 99,9%] 97,0% [84,2% 99,9%] Acrodermatitis chronica atrophicans (III szakasz) 5 [54,9% ] 20,0% [0,05% 71,6%] [54,9% ] [54,9% ] Lyme arthritis (III szakasz) 15 [81,9% ] 0,0% [0,0% 18,1%] (1) A kétes eredményeket nem vettük figyelembe az érzékenység kiszámításánál. IC 95%: 95% konfidencia intervallum. [81,9% ] [81,9% ] A Platelia Lyme IgG vizsgálat érzékenységét a CDC (Center for Disease Control) által rendelkezésre bocsátott mintasorozattal is ellenőriztük, és összehasonlítottuk az Európában (CE jelzésű) és az Egyesült államokban (FDA által engedélyezett) forgalmazott EIA tesztekkel, amelyeket referenciának tekintettünk. Az eredmények megtekinthetők az alábbi táblázatban: Klinikai szakasz Erythema migrans Szérumok száma 28 Platelia Lyme (1) Referencia Európa (1) Referencia Egyesült Államok (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM IgG + IgM 38,5% [20,2% 59,5%] 73,7% [48,8% 90,9%] 86,4% [65,1% 97,1%] 70,4% [49,8% 86,3%] 87,0% [66,4% 97,2%] Arthritis / Ízületi fájdalom 6 [60,7% ] 40,0% [5,3% 85,3%] [60,7% ] [60,7% ] [60,7% ] Ismeretlen szakasz 4 [36,8% ] [0,05% ] [47,3% ] (1) A kétes eredményeket nem vettük figyelembe az érzékenység kiszámításánál. IC 95%: 95% konfidencia intervallum. [19,4% 99,9%] [36,8% ] 9

9.4 Az IgG antitest index kiszámítása az intrathecalis szintézis meghatározására Külső vizsgálat történt 104 mintapáron, melyek Lyme neuroborreliosisban nem szenvedő (n=19) betegektől, valamint Lyme neuroborreliosis gyanús (n=29), valószínű (n=36) vagy igazolt jelenléte (n=20) mellett kerültek levételre. Az egyes kategóriákra vonatkozó részletes adatokat az alábbiakban közöljük: Állapot Összesen A liquor nem értékelhető A liquor negatív A liquor pozitív AI IgG index pozitív AI IgG index negatív AI IgG index érvénytelen Nincs LNB 19 0 18 1 0 0 0 LNB gyanús 29 0 11 0 14 4 0 LNB valószínű 36 1 6 2 22 4 1 LNB igazolt 20 0 0 0 17 2 1 Állapot Összesen Pozitív (liquor arány vagy AI IgG) Negatív (liquor arány vagy AI IgG) Nem értékelhető (liquor arány vagy AI IgG) Nincs LNB 19 1 (5,3%) 18 (94,7%) 0 (0,0%) LNB gyanús 29 14 (48,3%) 15 (51,7%) 0 (0,0%) LNB valószínű 36 24 (66,7%) 10 (27,8%) 2 (5,5%) LNB igazolt 20 17 (85,0%) 2 (10,0%) 1 (5,0%) 9.5 Pontosság Vizsgálatsorozaton belüli pontosság (ismételhetőség): Annak érdekében, hogy értékelni lehessen a vizsgálatsorozaton belüli ismételhetőséget, egy negatív és három pozitív mintát vizsgáltak 30x ugyanazon sorozaton belül. Az arányt (minta OD / CO) minden mintára meghatározták. Az átlagos arány, szórás (SD) és variációs koefficiens (%CV) mind a négy mintára vonatkozóan az alábbi táblázatban van feltüntetve: Vizsgálatsorozaton belüli pontosság (ismételhetőség) N=30 Negatív minta Gyengén pozitív minta Pozitív minta Magas pozitív minta Arány (minta OD / metszésérték) Átlag 0,10 0,95 1,38 6,31 SD 0,007 0,082 0,116 0,134 %CV 6,0% 8,6% 8,4% 2,1% Sorozatok közötti pontosság (reprodukálhatóság): A sorozatok közötti reprodukálhatóság értékelésére, egy negatív, egy kétes és két pozitív mintát duplikátumban vizsgáltak napi két sorozatban, 20 napon keresztül. Az arányt (minta OD / CO) minden mintára meghatározták. Az átlagos arány, szórás (SD) és variációs koefficiens (%CV) mind a négy mintára vonatkozóan az alábbi táblázatban van feltüntetve: Sorozatok közötti pontosság (reprodukálhatóság) N=80 Negatív minta Gyengén pozitív minta Pozitív minta Magas pozitív minta Arány (minta OD / metszésérték) Átlag 0,19 0,85 3,92 6,67 SD 0,032 0,115 0,335 0,650 %CV 17,3% 14,8% 8,4% 9,7% 10

9.6 Keresztreaktivitás A Platelia Lyme IgG vizsgálattal teszteltünk 384 olyan vérmintát, amelyeknek jellemzői nem specifikus reakciót okozhattak volna. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Mintasorozat Minták száma Kétes (1) Pozitív Keresztreaktivitás % Szifilisz 83 4 1 1,3% (2) CMV 50 1 1 2,0% (2) EBV 22 1 0 0,0% Leptospirosis 15 1 1 7,1% (2) Malária 20 1 1 5,3% (2) Anti nukleáris antitestek (ANA) 22 0 0 0,0% Heterofil antitestek (HAMA) 10 0 0 0,0% Reumatoid faktor 44 1 1 2,3% (2) HSV 30 0 0 0,0% Toxoplazmózis 38 0 0 0,0% Kanyaró 10 0 0 0,0% Kanyaró 10 0 0 0,0% Mumpsz 10 0 0 0,0% HIV 10 0 0 0,0% VZV 10 0 0 0,0% ÖSSZESEN 384 9 5 1,33% (1) A kétes eredményeket nem vettük figyelembe a keresztreaktivitás kiszámításánál. (2) Nem szignifikánsan különböző az endémiás terület esetében észlelt gyakoriságtól (Fisher teszt, p>0,05). A 2 CMV és maláriás szérum, amely pozitívnak bizonyult a Platelia Lyme IgG vizsgálattal, ugyancsak pozitív eredményt adott az Európában forgalmazott EIA teszttel (CE jelzésű), de az eredményeket nem igazolta a western blot módszer. A Platelia Lyme IgG vizsgálattal pozitívnak bizonyult reumatoid faktort tartalmazó szérum, ugyancsak pozitív eredményt adott az Európában forgalmazott EIA teszttel és a western blot módszerrel is. A leptospirosisos szérum, amely pozitívnak bizonyult a Platelia Lyme IgG vizsgálattal, kétes eredményt adott az Európában forgalmazott EIA teszttel (CE jelzésű), de a negative eredményt igazolta a western blot módszer. A Platelia Lyme IgG vizsgálattal pozitívnak bizonyult szifiliszes szérum, negative eredményt adott az Európában forgalmazott EIA teszttel és western blot módszerrel is. 10 AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A Borrelia burgdorferi fertőzés bizonyítását csak a klinikai és biológiai adatok kombinálásával lehet elvégezni. Az IgG anti- Borrelia burgdorferi antitestek egyetlen teszttel való kimutatása nem képez elég bizonyítékot a Borrelia burgdorferi sensu lato fertőzés diagnózisának felállítására. Ha a szerológiai eredmény pozitív vagy kétes, ajánlott a mintát más módszerrel is vizsgálni, például a Western-Blot módszerrel (9). A Lyme neuroborreliosis diagnózisát csak a beteg klinikai és biológiai adatainak együttes elemzése alapján állíthatjuk fel. A liquor vizsgálatának jelen protokoll szerinti eredményei és értékelése önmagukban nem elegendőek és nem szolgáltatnak elég bizonyítékot a diagnózis igazolására. Az IgG antitest index jelen protokoll szerinti, a Reiber-képlet használatával történő kiszámítása nem érvényes, amennyiben nem vettük figyelembe az összes egyéb biológiai adatot (Albumin szérum, Albumin liquor, Össz IgG szérum, Össz IgG liquor, OD IgG szérum, és OD IgG liquor) Az is fontos, hogy a fenti képlet szerinti megfelelő mértékegységeket használjuk. Jelen protokollt kizárólag a Borrelia-elleni IgG antitestekre dolgoztuk ki. Nem vizsgáltuk az érvényességét a Borrelia-elleni IgM antitestekre valamint egyéb IgG antitestekre sem. A protokoll csak a liquor vizsgálatára vonatkozik. Nem vizsgáltuk az érvényességét egyéb testnedvekre vonatkozóan (synovialis folyadék stb). 11

11 A GYÁRTÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉSE Minden gyártott reagenst minőségi rendszerünknek megfelelően készítünk, a nyersanyag átvételétől kezdve a végső termék forgalmazásáig. Minden gyártási tételt minőségellenőrzésnek vetnek alá, és csak akkor szabadítják fel forgalmazásra, amikor megfelel az előre meghatározott minőségi szempontoknak. Minden reagens gyártásával és ellenőrzésével kapcsolatos feljegyzést a Bio-Rad cégen belül megőrzi. 12 REFERENCIÁK 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G. 2005. Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: 484-509. 2. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P. 1982. Lyme disease a tickborne spirochetosis? Science. 216: 1317-1319. 3. Center for Disease Control and Prevention. 2004. Lyme disease United States, 2001-2002. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: 365-369. 4. Hubalek, Z., Halouzka, J. 1997. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: 951-957. 5. Reed, K. D. 2002. Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: 319-324. 6. Stanek, G., Strle, F. 2003. Lyme borreliosis. Lancet. 362: 1639-1647. 7. Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J. 1999. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: 633-653. 8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L. 2011. Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): 123-128. 9. Wilske, B. 2003. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3: 215-227. 10. Bednarova, J. 2006. Cerebrospinal-Fluid profile in neuroborreliosis and its diagnosis significance. Folia Microbiol. 51: 599-603. 11. Deisenhammer F., Bartos A., Egg R., Gilhus N.E., Giovannoni G., Rauer S., Sellebjerg F. 2006. Guidelines on Routine Cerebrospinal Fluid Analysis. Report from EFNS Task Force. Europ. Journ. of Neurol. 12. Reiber H., Lange P. 1991. Quantification of Virus-Specific Antibodies in Cerebrospinal Fluid and Serum: Sensitive and Specific Detection of Antibody Synthesis in Brain. Clin. Chem. 37: 1153-1160. 12

13

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2015/11 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 883689 www.bio-rad.com 14