Debreczeni L., Keresztúri J., Marthné Schill J. Nemzeti Élelmiszerlánc biztonsági Hivatal Élelmiszer- és Takarmánybiztonsági Igazgatóság Takarmányvizsgáló Nemzeti Referencia Laboratórium Budapest Takarmányokba kevert állatgyógyászati szerek laboratóriumi vizsgálata.
Gyógyszeres takarmányok használata Állat állományok kezelésére: Fertőzések (pl. baktériumok, protozoák, paraziták) - megelőzése - gyógykezelése Hozamfokozóként -antibiotikumok szubterápiás alkalmazása- tiltott (178/2002/EK) [2006-tól kitiltott antibiotikumok] Gyógyszeres takarmányok laboratóriumi kontrolljának jelentősége: Nagy tömegű gyógyszer felhasználás Nem megfelelő felhasználás esetén fokozódó potenciális veszélyforrások: - toxicitás érzékeny állatfajok esetén - megjelenik állati termékekben (hús, tojás, tej stb.) - rezisztancia révén humán és állategészségügyi kockázatot növeli - trágyából átjutva talajba, felszíni vizekbe, növényekre növeli a környezeti terhelést
Gyógyszeres takarmányok előállítása Csak engedélyezett hatóanyagokat tartalmazó, engedélyezett gyógyszeres premixekből, készíthető gyógyszeres takarmány Csak engedélyezett keverő üzemben állíthatóak elő Engedélyezés: takarmány adalékanyagként (2003/1831/EK): kokcidiosztatikumok és hisztomonosztatikumok. Jelenleg 11 db hatóanyag engedélyezett Szabályozás takarmányokban: - megengedett eltérés - jelölési értékhez képest (767/2009/EK rendelet) - MRL értékek, nemkívánatos anyagokként (2002/32/EK irányelv; 44/2003. (IV. 26.) FVM rendelet) állatgyógyászati készítményként (128/2009. (X. 6.) FVM rendelet): Szabályozás takarmányokban: - nincs megengedett eltérés deklarált értéktől - nincs számszerű MRL eltérő szabályozás EU tagállamokban (HU: 65/2012.(VII.4.) VM rendelet vizsgálati módszer LOD - vitás kérdés)
Laboratóriumi analitikai feladatok gyógyszeres takarmányokkal kapcsolatosan Üzem engedélyezéshez kapcsolódó vizsgálatok Terápiás célú gyógyszeres takarmányok hatóanyag szintjének vizsgálata Keresztszennyezés (átmosódás) vizsgálata Tiltott hatóanyagok vizsgálata
Takarmányok rendszere
Néhány specialitás gyógyszerek takarmányokban való analízisével kapcsolatosan Néhány takarmány analitikai specialitás gyógyszerek vizsgálatával kapcsolatosan: a mátrix nagy variabilitása: - azonos fajra, azonos korcsoportra szolgáló táp, de gyártónként eltérő összetétel(alapanyagok, adalékanyagok, premixek) védett, formulázott (mikrokapszulázott) gyógyszer: - védőanyagba ágyazva - oldhatóság extrakció során? - spikolás std porral vagy oldattal? amoxicillin szabad amoxicillin védett granulálás - darálás nagyon fontos (zárványok) - intenzív extrakció
Üzem engedélyezéshez kapcsolódó vizsgálatok Legkisebb és legnagyobb koncentrációban bekevert gyógyszer hatóanyagok vizsgálata Homogenizáló képesség vizsgálata Gyártási (keverési) tételenként a késztermékekből egyenletes elosztásban 10 10 db mintát kell venni laboratóriumi vizsgálatok céljára. - átlag és variációs koefficiens (CV) számítása (takarmánycsoportok maximális CV%- a szabályozott) Átszennyeződési vizsgálatok Az átöblítő mosató anyagból meghatározott helyeken maximum 5 db mintát kell venni. A legyártott új tételből 5- max. 10 db mintát kell venni. Mintánként meg kell mérni a hatóanyag maradék szintjét (MRL vagy LOD)
Terápiás célú gyógyszeres takamányok hatóanyag szintjének vizsgálata Cél: a garantált terápiás szint ellenőrzése - magasabb: - mérgező lehet - alacsonyabb: - várható hatás elmaradása - rezisztenciát okozhat - vegyületcsere Széles koncentráció tartomány vizsgálata - pl. premixeknél OTC 600000 mg/kg diclazuril 20 mg/kg - takarmány keverékben OTC 3000 mg/kg diclazuril 1 mg/kg Vizsgálati módszerek: - általában egyedi HPLC módszerek UV/VIS, DAD, FLD, MS, MS/MS detektálással [hatósági (152/2009/EK), szabvány, szakirodalmi, házi módszerek]
Keresztszennyezés (átmosódás) vizsgálata nem céltakarmányban Honnan származhat keresztszennyezés összetett takarmányok esetén: - Premixek, előkeverékek előállítása során - Alapanyagokból (pl. DDGS, halliszt stb.) - takarmány keverékek előállítása során - szállítás, tárolás, etetőkbe történő kiadagolás stb. során Lehetséges hatások: - nem célzott állatfajoknál toxicitás - mikrobiális rezisztancia - takarmányokból hatóanyag átjuthat állati eredetű élelmiszerbe (pl. befejező táp - nincs állategészségügyi várakozási idő, tojótáp, tejelő takarmány) Ahol nincs MRL- ellentmondás (milyen érzékenységű módszerrel, milyen célérték?- szabályozási probléma EU szabályozás készül Vizsgálati módszerek: - általában egyedi HPLC módszerek, de van HPLC-MS/MS csoportos és multimódszer is. - hatósági módszer nincs, szabványok most készülnek, szakirodalmi és házi módszerek.
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására Cél : az engedélyezett 11 féle kokcidiosztatikum egymás melletti meghatározása keresztszennyezés szintjén Az engedélyezett kokcidiosztatikumok hatóanyagai és legkisebb megengedett MRL szintje (44/2003. (IV. 26.) FVM rendelet): hatóanyag min. MRL mg/kg Dekokvinát 0,40 Diklazuril 0,01 Halofuginon-hidrobromid 0,03 Lazalocid-A-nátrium 1,25 Maduramicin-ammóniumalfa 0,05 Monenzin-nátrium 1,25 Narazin 0,70 Nikarbazin 1,25 Robenidin-hidroklorid 0,70 Szalinomicin-nátrium 0,70 Szemduramicin-nátrium 0,25
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására - minta előkészítés extrakció 5g minta bemérése 50 ml-es centrifugacsőbe +10 ml 10%- os Na 2 CO 3 átnedvesítés +15 ml Acn Rázatás 30 perc 3x 5 ml bepárlás 50 o C, N 2 extraktum összegyűjtése 50 ml-es mérőlombikba centrifugálás 20 perc, 2000 ford/perc, 5 o C Maradék feloldása 5 ml Acn/H2O=80/20 szűrés 1. oldat: szűrlet 2. oldat: szűrlet 50x hígítva - injektálás
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására mérési paraméterek HPLC Agilent 1200 oszlop: GROM-Sil 120 ODS-5 ST, 250x4,6 mm, 5 µm oszlop 35 o C hőmérséklet: áramlás: 0,7 ml/perc injektálás: eluens: 25 ml A: víz+0,1%(v/v) hangyasav B: metanol+0,1%(v/v) hangyasav gradiens elúció: 0 perc 50% A 50% B lineáris 5 perc 50% A 50% B 15 perc 5% A 95% B 40 perc 5% A 95% B 41 perc 50% A 50% B 48 perc 50% A 50% B MS-MS Agilent 6410 gáz hőmérséklet 300 C gáz áramlás 7 l/perc porlasztó kapilláris feszültség 35 psi 2500 V
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására kromatogram
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására - kalibrációs egyenesek 2 nagyságrendet átölelő 6 pontos, nullán átmenő kalibrációs egyenesek illeszkedési koefficiense minden komponensre nagyobb 0.995-nél. (R 2 >0,995)
Jártassági vizsgálat 2014 Tárgya: a 11 kokcidiosztatikum azonosítása, mennyiségi meghatározása Szervező: EURL-FEED ADDITIVE-CONTROL 4 db takarmány minta - 1 db. minta: diclazuril terápiás szint környékén - 3 db minta: lehetséges 11 komponens a keresztszennyezés (MRL) körüli szinteken.
Jártassági vizsgálat 2014 Eredmények összefoglalása:
Tiltott, nem engedélyezett hatóanyagok vizsgálata Hatósági ellenőrzési feladat Honnan származhatnak tiltott antibiotikumok: - harmadik országból származó alapanyagok, adalékanyagok (pl. kloramfenikol vitaminban) - harmadik országba szállító hazai keverőből keresztszennyezéssel (karbadox, avilamicin) - tiltott, szándékos hazai felhasználásból Néhány egyedi hatósági módszer, szakirodalmi, házi HPLC-MS/MS módszerek Multi- szűrőmódszerek (HPLC-MS technika) módszerek kifejlesztése a cél - tiltott és engedélyezett komponensek együttes vizsgálata minél nagyobb számban a keresztszennyezés szintjén (a terápiás szint 0,1-1%-a) - jelenlét esetén kvantitálás egyedi módszerrel - jelenleg a szűk műszerkapacitás a gátja a fejlesztéseknek.
Debreczeni L., Keresztúri J., Marthné Schill J. Nemzeti Élelmiszerlánc biztonsági Hivatal Élelmiszer- és Takarmánybiztonsági Igazgatóság Takarmányvizsgáló Nemzeti Referencia Laboratórium Budapest Köszönjük figyelmüket