SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI ÉS INFORMATIKAI KAR ÁSVÁNYTANI, GEOKÉMIAI ÉS KŐZETTANI TANSZÉK A Hódmezővásárhelyi geotermikus visszasajtoló rendszer szűrőit eltömítő biológiai komponensek vizsgálata metagenomikai módszerrel KÉSZÍTETTE: Osvald Máté osimate@gmail.com Szeged 2014
Tartalom Tartalmi összefoglaló:...2 1. Geotermikus energia...3 1.1.1.Visszasajtolás...5 2. Hódmezőváráshely geotermikus közműrendszere...6 3. Biológia...8 3.1. Mikroorganizmusok...8 3.2. Metagenomika...11 3.3. Szekvenálás...14 3.3.1.Új- generációs szekvenálás...14 4. Mérési módszerek...15 4.1. Környezeti mintából való DNS kinyerés...16 4.2. Baktériumok megjelenésének lokalizációja...16 5. Eredmények...18 6. Következtetés...21 6.1. Vízkezelési lehetőségek...21 6.1.1.Fertőtlenítés sugárkezeléssel...21 6.1.2.Vízfertőtlenítés ózonos kezeléssel...21 6.1.3.Forróvizes fertőtlenítés:...22 Irodalomjegyzék...23 Mellékletek:...25 1.
Tartalmi összefoglaló: A hódmezővásárhelyi geotermikus rendszerben a kitermelő kutak vizét két kútba sajtolják vissza a felszín alá. Ezen visszasajtoló kutak közül az újabb építésű a régebbi kúthoz képest sokkal hamarabb eltömődik, emiatt sűrűbben kell cserélni a szűrőjét, ami gazdasági szempontból jelentős kiadás. A kutak üzemeltetőinek tapasztalatai és vizsgálatai alapján nem szervetlen anyagok tömítik el az új kút szűrőjét, hanem valamilyen biológiai rendszer játszik ebben szerepet. Vizsgálataim célja volt, hogy kiderítsem, milyen élőlények tömítik el a szűrőt ha valóban nem szervetlen komponensek ezek és miért csak az egyik visszasajtoló kútnál. Ehhez korszerű technológián alapuló, újszerű mérési módszerrel: metagenomikai szekvenálással határoztam meg a szűrőket eltömítő anyag összetételét. Összehasonlítva a két kút szűrőjéből kapott eredményeket arra jutottam, hogy a gyorsan eltömődő kút baktériumflórája nem olyan széles spektrumú, mint a jól működő kúté, hanem Magnetospirillum nemzetségbe tartozó fajok, melyek lényegesen dominánsabbá tudtak válni. Ennek a különös dominanciának az okát a kémiai vízvizsgálat magyarázta meg, ugyanis az új visszasajtoló rendszeren végig haladó víz két nagyságrenddel több fenolt tartalmaz, mint a régi visszasajtoló rendszer vize. A magas aromás vegyület-tartalom miatt voltak képesek megjelenni ilyen nagy számban a baktériumok. A probléma a kezelésére UV fénnyel történő vízfertőtlenítést javasoltam. Eredményeimet a jövőben létesítendő geotermikus rendszerek tervezésekor célszerű figyelembe venni, különösen azon esetekben, ahol a kémiai vízminőségtől függően számítani lehet a baktériumok megjelenésére Kulcsszavak: Baktérium, biológia, geotermia, metagenomika, szekvenálás, termálvíz, visszasajtolás. 2.
1. Geotermikus energia A geotermikus energia a Föld belső hőtartalékát jelenti, ami döntően a földkéregben koncentrálódó hosszú felezési idejű radioaktív elemek bomlási hőjéből származik. Ez a hő a Föld felszíne felé áramlik a felszín és a mélyebb zónák közötti hőmérséklet-különbség hatására. A hőenergia-áramlás kifejezője a földi hőáramsűrűség (röviden hőáram), amely az egységnyi földfelületen, egységnyi idő alatt átáramló hőmennyiség mutatója. Eloszlása a felszínen nem egyenletes, a kontinenseken 65 mw/m 2, az óceánok területén 101 mw/m 2 átlagértéket vesz fel. A geotermiában használt másik fontos mutató a geotermikus gradiens, amely a földkéregben az egységnyi mélységnövekedésre eső hőmérsékletnövekedés mérőszáma. Értéke földi átlagban 30 C kilométerenként, de eloszlása nem egyenletes. Magasabb a geotermikus gradiens azokon a helyeken, ahol a földkéreg vékonyabb, és az asztenoszféra anyaga közelebb van a földfelszínhez. Ilyen helyek a szubdukciós zónák ahol az egyik lemez a másik alá bukik és az óceánközépi hátságok, valamint az aktív vulkáni területek. A földhő tehát óriási mennyiségű, kimeríthetetlen energiaforrás, ami többé-kevésbé mindenütt jelen van. Hazánkban a geotermikus gradiens 40-60 C között van kilométerenként, így a geotermikus energia hasznosítására Magyarországnak európai, de nemzetközi viszonylatban is kiemelkedően jó adottságai vannak. (Mádlné, 2010) 3.
1. ábra: A felső-pannóniai rezervoárok elterjedése és energiasűrűsége (GJ/m 2 ) (Lorberer, 2004) Minden geotermikus rendszernek három fő eleme van: a hőforrás, a hő tározására alkalmas, jó vízvezető képességű kőzet és a magas hőmérsékletű szállító fluidum. A hő forrása eredhet vulkanikus tevékenységből, de a geotermikus gradiensből is. A hőforrás minden esetben természetes. A rezervoár maga a kőzet, amely vízáteresztő, a repedéseiben, pórusaiban nem csak tárolódik, de áramlani is képes a fluidum. Ez a fluidum általában víz, amely halmazállapota hőmérséklettől függően lehet folyadék, de gáz is. A geotermikus energia kinyeréséhez a hőszivattyúk kivételével vizet vagy gőzt kell kitermelni. Az alábbi módokon használhatjuk energiaforrásként a felszín alatt rejlő potenciált: (Mádlné et al., 2008) 1. hőszivattyúval segített hőhasznosítás, 2. közvetlen hőellátás, 3. kapcsolt villamosenergia és hőtermelés. 4.
2. ábra: A Kárpát-medence és a környező területek hőáramtérképe (Dövényi, 2008) 1.1.1. Visszasajtolás A geotermikus energia megbízható és környezeti szempontból kedvező energiaforrás, melyet számos országban széleskörűen használnak áramfejlesztésre és direkt hőhasznosítási célokra, amihez jelentős gazdasági és környezeti előnyök társulnak. Bár a geotermikus energia a megújuló energiaforrások közé tartozik, nem kimeríthetetlen. Túltermelés esetén a rezervoárok kimerülhetnek. A rezervoárok hosszú távú fenntartható használatához optimális üzemeltetés, illetve a geológiai, hidrogeológiai és a geokémiai jellemzők alapos ismerete szükséges. Az optimális üzemeltetés megvalósításának legtöbbször elengedhetetlen feltétele a visszasajtolás, mert a kitermelt, forró termálvíz a hőtartalmának leadása után lehűl. (Malate, 2003; Szanyi, 2013) Az ilyen módon elhasznált fluidum rezervoárba történő visszasajtolása eredetileg csak elhelyezési eljárás volt. Azonban elméleti tanulmányok és gyakorlati tapasztalatok azt mutatták, hogy a visszasajtolással a felszín alá juttatott fluidum megnöveli a rezervoár élettartamát, illetve a kinyerhető energiamennyiséget. Több évtizedes kutatási és üzemeltetési gyakorlatnak köszönhetően ma az elhasznált fluidum visszasajtolása nem csupán elhelyezési eljárás, hanem a geotermális energia felhasználásának esszenciális része. Az elhasznált termálvíz felszíni elhelyezésével a geotermikus energia nem lenne hosszútávon fenntartható, megújuló energiaforrás. Így 5.
napjainkban a modern rendszereket már kútpáronként tervezik, ami azt jelenti, hogy egy kitermelő kúthoz minden esetben terveznek legalább egy visszasajtoló kutat is, ami annak vizét újra a felszín alá juttatja. (Stefánsson, 1996) 2. Hódmezőváráshely geotermikus közműrendszere (Szanyi et al., 2012 nyomán) A hódmezővásárhelyi geotermikus közműrendszer Magyarország egyik legjelentősebb energiahordozó kincsének, a geotermális energia komplex hasznosítására nyújt példát. Itt az első termálkút 1954-ben mélyült, az akkori fürdő medencéinek termálvíz ellátására. Ezután 1968-ban építettek ki újabb kutat, a városi kórház fűtésének szolgáltatására. Ezen kutak üzemeltetésének tapasztalata és haszna miatt 1994-ben megkezdődött a hódmezővásárhelyi geotermikus közműrendszer építése. A rendszer építésének nem csupán a használati melegvíz előállítás volt a célja, hanem a fűtési rendszerbe való bekapcsolódás is, úgy, hogy a már nem hasznosítható, lehűlt vizet a feltárás rétegéhez közeli rétegbe sajtolják vissza. Ennek az építési projektnek az első része (három termelő és egy visszasajtoló kút (I. számú)) 1998-ra készült el. 2007-re megépült még egy visszasajtoló kút (II. számú). Így a teljes rendszer 3000 lakás egyenértékű lakossági és közületi fogyasztót, valamint 9 közintézményt lát el használati melegvízzel. A fűtési rendszer egyik ágának kiinduló pontja a Hódtói 2014 m talpmélységű termálkút, amely téli időszakban 60 m 3 /h, nyári időszakban 25-30 m 3 /h, 80 C hőmérsékletű fűtővizet szolgáltat. A szigetelt tárolóból továbbító szivattyúk nyomják a vizet a Hódtói fűtőműbe, ahol a használati melegvíz teljes cirkulációs hővesztesége kerül belőle pótlásra. Innen az Oldalkosár úti fűtőműbe kerül a fluidum, ahol a használati melegvíz cirkulációs hőpótlása mellett a fűtési rendszer hőellátásában is szerepet vállal a termálenergia. Végül a részben már lefűtött termálvíz a kórházi körzet intézményeit látja el direkt módon a szükséges hőenergiával. A rendszer végpontja a városi uszoda területe, ahol az immár többször lefűtött termálvíz (40-45 ºC) maradék hőtartalma még kielégíti a sportmedence fűtését, majd a termál medencék szükség szerinti vízutánpótlását, míg a fennmaradó vízmennyiség (télen 40, nyáron 25 m³/h) a régi visszasajtoló rendszer puffer tárolójában köt ki. A másik fűtési termálhálózat kiindulópontja a Mátyás utcai 2300 m talpmélységű termálkútnál van. A kút télen 60 m³/h, nyáron 3-4 m 3 /h 86 ºC-os fűtési közeg búvárszivattyú kitermelésével elégíti ki 6.
a Mátyás utcai lakótelep 600 db, 90/70 ºC hőlépcsőjű távfűtött lakás állományának hőszükségletét és használati melegvíz cirkulációs hőpótlását. Az így többször lefűtött fluidum az uszoda körüli járda jégmentesítése után az új visszasajtolómű puffertárolójában köt ki. A Pannon homokkőbe való tartós és gazdaságos vízvisszasajtolás kiváló referenciájaként tizedik éve sikeresen működő I. számú visszasajtoló kútba napjainkig több mint 2,3 millió m³ lehűlt fluidum került visszatáplálásra. 3. ábra: Hódmezővásárhely II. számú visszasajtoló rendszerének szűrői 7.
4. ábra: Hódmezővásárhely termálrendszereinek térképe 3. Biológia 3.1. Mikroorganizmusok A mikrobák az élet esszenciális alappillérei. Habár szabad szemmel nem láthatók, még az emberi test egészséges működéséhez is nélkülözhetetlenek. Így, az élet sem alakulhatott volna ki apró parányok nélkül. Valamilyen mértékben a bioszféra összes folyamata érintett a mikrobák végtelen változatos átalakító képessége által. Az élet kulcs elemeit mint a szén, nitrogén, oxigén, illetve kén szintén mikroorganizmusok alakítják más élőlények által felvehető formába. Minden növény és állat szoros együttélésben van mikroorganizmusokkal, amelyek számukra nélkülözhetetlen tápanyagokat, fémeket és vitaminokat tesznek elérhetővé. Apró élőlények milliárdjai lakják a humán bélrendszert is, ezzel elősegítve a táplálék emésztését, toxinok lebontását és a kórokozók elleni harcot. A környezetünk szennyeződéstől való megtisztításában szintén segítségünkre vannak apró élőlények, például a különböző kémiai szennyeződések eltávolításában, olaj- és vegyszerkiömlések környezeti kármentesítésében bioremediációval. Az összes fenti folyamat mikrobák komplex közössége által végzett, amely közösség bonyolult, ám ugyanakkor kiegyensúlyozott egység, amely gyorsan és rugalmasan adaptálódik a megváltozott környezethez. Számos mikrobiális rendszert 8.
több ezer különböző, önálló faj alkot. Ezek nem csupán résztvevők a környezet stabilitásának fenntartásában és a növények, állatok életében; hanem számos képviselőjük olyan extrém környezeti feltételek mellett is tud élni, ahol semmilyen más organizmus nem képes. A szélsőségesen magas vagy éppen alacsony hőmérséklet, rendkívüli nyomás és ph tűrésére különböző fajok számtalan túlélési stratégiát fejlesztettek ki. Pontosan ezt az alkalmazkodóképességet és stratégiát használjuk ki akkor, amikor baktériumokkal termeltetünk különböző anyagokat. Magas hőmérsékleten is működő enzimek (például mosóporban), antibiotikumok, különböző fermentált ételek (savanyú káposzta, kovászos uborka) és italok (sör, bor, kefir) előállítása nem történhetett volna meg a mikrobák megértése, és bizonyos tulajdonságaik kihasználása nélkül. A víz visszasajtolása során nem csupán a szervetlen anyagok kölcsönhatása hangsúlyos, hanem a biológiai komponensek szerepe is. A vízben előforduló élő vagy élettelen biológiai komponensek lehetnek akár néhány tíz nanométeresek, vagy akár sok száz mikrométeresek is. Evolúciós hovatartozásukat tekintve lehetnek vírusok, baktériumok vagy gombák. A rendkívüli biológiai sokféleség miatt vizsgálatukkor lehetetlen minden paramétert figyelembe venni, ezért választanunk kell, hogy milyen szemszögből szeretnénk a rendszert bővebben taglalni. Tekintsük most csak a baktériumokat: A termálvízben előforduló baktériumok mérete általában egy és tíz mikrométer közötti. Ez azt jelenti, hogy fénymikroszkóppal már láthatók. Morfológiájuk szintén változatos, előfordul kokkusz, pálcika és spirillum alakú is. Nem meglepő, hogy a számunkra jelentős baktériumok többsége termofil, azaz meleg kedvelő; anyagcseréjük 50-60 C között a legintenzívebb, vagy mezofil, 20-40 C a hőmérsékleti optimumuk, szobahőmérsékleten tenyészthetők (Taylor és Vaisman, 2010). Több baktérium fontos tulajdonsága a spóraképzés, amely a környezeti körülmények megváltozására alakul ki. A spóra nem egy szaporító, hanem egy ellenálló képlet, amely segítségével a baktérium egészen extrém körülményeket is képes túlélni. Így például a kedvezőtlen magas hőmérsékletet, magas só koncentrációt nagyon hosszú ideig képes a baktérium átvészelni, és amikor újra kedvező körülmények érik, kicsírázik, és folytatja anyagcseréjét, szaporodását. Ilyen ellenálló spóra látható a 5. ábrán, amely még a világűrbeli viszonyokat is képes túlélni. 9.
5 ábra: Bacillus anthracis spóra (Fox et al. 2003) A termálvíz kitermelésekor is jelen vannak mezofil baktériumok, de a fent említett spóra formájában. Így anyagcseréjük nem jelent problémát a kitermelés során. Azonban, ahogy a víz hőtartalmát kihasználjuk, és az lehűl, a körülmények megváltoznak, és ideálissá válnak a mezofil mikroorganizmusok számára. A 30-35 C hőmérsékletű visszasajtolandó vízben elszaporodnak, ahol elsősorban nem maga a baktérium, hanem az anyagcseretermékeik jelentik a legnagyobb gondot. Az ilyen körülmények között élő baktériumok 90 százaléka képes biofilmet képezni. A biofilm jól szerveződött bakteriális kolóniákból épül fel, olyan nedves környezetben, amely elegendő táplálékot szolgáltat számára. Nedves, nyálkás, egybefüggő társulás, amely a felszínen jól megtapad. A mikrobáknak ez előnyös kapcsolat, így a gyakorlatban is igen sokszor találkozunk ilyen nyálkás anyaggal, ami legtöbbször a szűrőkön tapad meg. (Valójában a csővezetékrendszer pangó részeinél és a tartályoknál is előfordul biofilm, de itt nem szoktuk észrevenni őket, mert nehezen hozzáférhető helyen vannak.) A baktériumok biofilm képzésének négy fő oka van: (Jefferson, 2004) 1. Védelem: A ph változásokkal, antibiotikumokkal és fizikai hatásokkal szemben ellenállóbbak. 2. Kedvező körülmények: Le tudnak tapadni olyan számukra kedvező helyen is, ahol egyedül nem tudnának. 3. Közösség: Metabolikus terheket meg tudják osztani, illetve együtt olyan felületaktív anyagokat képesek termelni, amelyeket egyedül nem. (Buckling et al, 2007) 4. Életforma: Számos mikrobának a biofilm a primer életformája. Korábban a mikrobák tanulmányozása túlnyomórészt laboratóriumban tenyésztett, tiszta fajokra irányult, így a teljes mikrobiális közösség megértésére való törekvés elmaradt az egyes fajok vizsgálata mögött. Csak a közelmúltban váltak 10.
elérhetővé olyan eszközök, amelyekkel a mikroorganizmusokat természetes, komplex közösségében tudjuk vizsgálni, így megérteni, hogy mire képesek és hogyan dolgoznak (közösségként). A hagyományos mikrobiológiai megközelítések már megmutatták, hogy a mikrobák milyen hasznosak tudnak lenni, ám az új metagenomikai megközelítés nagymértékben kiterjeszti a kutatók lehetőségét a mikrobiális képességek további felfedezésre és az új gyakorlati alkalmazások keresésére. A lehetőség, amely ma a mikrobiológusok előtt áll, hasonló a mikroszkóp újra feltalálásához abban a tekintetben, hogy ez is új perspektívát nyit a kutatásban. 3.2. Metagenomika Genomikán az élőlények genomjainak szerkezetével, változékonyságával, sokszorozódásával, kifejeződésével, az életműködésre és a betegségek kialakulására való hatásaival, továbbá a fentiek tanulmányozásának és felhasználásának módszertanával foglalkozó tudományterületek összességét értjük. A genomika napjaink egyik leggyorsabban fejlődő tudomány- és iparága, amely az élőlények genetikai információtartalmának együttes kvalitatív és kvantitatív vizsgálatán alapszik. Az elmúlt másfél évtized egyik legjelentősebb tudományos áttörése különböző élőlények, köztük az ember genomjának a megismerése. A genom egy élő szervezet teljes örökítő anyagát jelenti, ami a sejtekben DNS ( dezoxiribonukleinsav) formájában van jelen. Az örökítő anyag tartalmazza mindazokat az utasításokat, amelyeket a sejt felépítéséhez és működtetéséhez, illetve ezen keresztül a többsejtű szervezetek esetében a szervezet felépítéséhez és működtetéséhez szükségesek. Az új módszer a mikrobiális világ vizsgálatára nem csupán megváltoztatja a modern mikrobiológiát, de meg van benne a lehetőség arra, hogy forradalmasítsa az egész élővilág megértését. A metagenomikában a nélkül vizsgálhatjuk a minta teljes genomját, hogy izolálnánk az egyes tagjait a közösségnek. Ez az új megközelítés, és az ezt követő technológiák rá fognak világítani apró közösségek olyan eddig nem ismert képességeire, amelyek a bolygó energiáját biztosítják, anyagcsere folyamatait működtetik, fenntartják a lakói életét, és az élet evolúcióját formálják. Ezen felül olyan tudást nyújt majd a metagenomika a mikrobák együttműködéséről, amely az emberi élet, az élelmiszeripar, a környezetvédelem, az éghajlatkutatás és az energiatermelés területein, de bizonyos betegségek diagnosztikájára is hasznosítható lesz. 11.
A metagenomika a genomika erejét, a bioinformatikát és a rendszerbiológiát ötvözi. Új hozzáférést biztosít a mikrobák világához, mert a mikroorganizmusok túlnyomó többsége laboratóriumban nem növeszthető, így a klasszikus módszerekkel nem vizsgálható, annak ellenére sem, hogy a mikrobiális fiziológia nem újdonság a mikrobiológiában. A lehetőség, hogy a genomika erejét a közösségek vizsgálatára fordítsuk, példátlan. Habár a közösség szintű ökológia nem újdonság a mikrobiológiában, az a képesség, hogy a genomika erejét vigyük a közösségek tanulmányozásába, egyedülálló lehetőséggel kecsegtet. Annak ellenére, hogy a metagenomika egy teljesen új vizsgálati módszer és kutatási terület, már most rengeteg új ismeretet nyújtott a mikrobiális világról a radikálisan új mikrobiológiai szemlélete miatt. Minden ilyen irányú kísérlet első lépése (a mintavétel után) az, hogy az adott vizsgálandó területen élő összes mikrobáknak ki kell vonni az örökítőanyagát. Mivel a természetben élő parányok többnyire nem elkülönülten, hanem közösségben élnek, a környezeti minta preparálásakor vírusok, baktériumok, archeák és eukarióták örökítő anyaga keverten, eltérő dominanciával van jelen. Az általunk vizsgált metagenomikai módszerhez azonban meg kell tisztítani a DNS-t, nem csak a szervetlen komponensektől, hanem az eukarióta fajok örökítő anyagától is, mert az ő DNS-ük mennyisége meghaladja a szekvenálás, és a későbbi számítógépes feldolgozás kapacitását is. Az ilyen módon tisztított kevert DNS minta már akár közvetlenül szekvenálható. A művelet eredménye attól függően, hogy milyen céllal történt a vizsgálat, kétféleképpen használható. A szekvencia alapú metagenomika célja a teljes genetikai szekvencia kiderítése: a négy különböző nukleotid (A: adenin, C: citozin, G: guanin, T: timin) mintázata a DNS szálban. Ilyen módon az eredmény többféleképpen használható. Például, egy közösség szekvenciája alapján meg lehet határozni az egyes fajok teljes genomját; vagy ez az eredmény használható teljes egészként is, így betekintést nyerve a közösség ökológiájába és evolúciójába. A másik lehetőség a funkció alapú metagenomika. Ilyen módon olyan termékek felfedése válik lehetővé, amit a mikrobák közösségben termelnek. Így azonosítani lehet olyan eddig ismeretlen funkciókat is, amelyeket a laboratóriumban tenyészthető mikroorganizmusok rendkívül kis száma eddig korlátozott. Ilyen megközelítéssel a kutatók már új rezisztencia mechanizmusokat és új antibiotikumokat fedeztek fel. A funkció alapú metagenomika és néhány új technológiai lehetőség ötvözése által 12.
biztosított az, hogy a mikrobiális közösségből közvetlenül kivonhatók és azonosíthatók újfajta fehérjék és anyagcseretermékek. A metagenomika megismerése és használata előtt összetett mikrobiológiai közösségek, amelyek majdnem minden környezetben és élőlényben megtalálhatóak, lényegében láthatatlanok voltak. Ezzel a módszerrel a mikrobák világának megdöbbentő genetikai és anyagcserebeli változatosságaira egyre inkább fény fog derülni. Számos, potenciálisan gyümölcsöző, különböző tudományterületek közti együttműködést alakított már ki a metagenomika a levegő-, a talaj- és a víz mikrobiológiai vizsgálata, geológiai, orvosi, állatorvosi, mezőgazdasági tudományok, valamint a környezet- és biomérnökség kapcsán. 13.
3.3. Szekvenálás (Nyitray, 2013 nyomán) A DNS molekula felfedezését követően intenzíven foglalkoztatta a tudományt, hogy a különböző fajok vagy fajon belüli egyedek örökítő anyaga milyen mértékben mutat egyezést vagy eltérést. A kutatók választ szerettek volna kapni arra is, hogy mi az, ami befolyásolhatja különböző tulajdonságok megjelenését, illetve betegségek kialakulását. Ezért egyre fontosabbá vált olyan módszerek kifejlesztése, amelyek segítségével meg lehet határozni a DNS szekvenciáját. Ezekre a kérdésekre a választ kereső vizsgálati módszer a DNS szekvenálás, ami egy DNS molekula nukleotid sorrendjének meghatározását jelenti. Napjainkban a DNS szekvenálás a molekuláris biológia egyik legmeghatározóbb eszközévé vált. 3.3.1. Új- generációs szekvenálás Az új generációs szekvenálások közé tartoznak azok a módszerek, amelyek párhuzamosan sok mintát képesek szekvenálni, azaz nagy áteresztőképességű módszerekről van szó (angolul más néven deep sequencing-nek, mély szekvenálának és massively paralel sequencing-nek is hívják az új módszereket). Az új-generációs módszerek mind a láncszintézis, mind a detektálás terén lényegileg térnek el a hagyományos Sanger-féle szekvenálástól. Használatukhoz fejlett robottechnika és igen nagy számítógép-kapacitás szükséges. Hátrányuk, hogy valamivel több hibát ejtenek és egy reakció során viszonylag rövid (néhány 100 bázis) DNS -darabot szekvenálnak, igaz, hogy párhuzamosan akár 1 milliót is. Az új-generációs módszerek bevezetésével robbanásszerűen megnövekedett a DNS-alapú vizsgálatok hatékonysága és csökkent a fajlagos költsége. Egy új-generációs szekvenáló berendezéssel pár hét vagy akár pár óra alatt szekvenálni lehet akár az emberi genomot is. Elsősorban a funkcionális és a környezeti genomika (metagenomika), valamint a tr anszkriptomok vizsgálata területén alkalmazzák őket. A vizsgálataink során Ion Torrent szekvenáló berendezést használtunk, a Szegedi Biológiai Kutatóközpont Bay Zoltán Alkalmazott Kutatási Közalapítvány Mikrobiális Genomika Csoport intézetében, Dr. Maróti Gergely közreműködésével. 14.
4. Mérési módszerek Munkám során a korábban tárgyalt hódmezővásárhelyi geotermikus rendszer két visszasajtoló kútját vizsgáltam. Ezek két, egymástól független geotermikus kaszkádrendszer legvégén helyezkednek el, az elhasznált hőtartalmű termálvíz megfelelő rezervoárba történő visszajuttatását biztosítják. Működésük során azt figyeltük meg, hogy az újonnan megépült (II. számú) visszasajtoló rendszer felszíni szűrői sokkal hamarabb eltömődnek, mint a már régebb óta üzemelő (I. számú) rendszer szűrői. Az eltömődés ráadásul annyira agresszív, hogy a szűrőként használt kb. 30 µm pórusméretű polipropilén szövet nem tisztítható, és nem használható újra. Egy ilyen szűrőt mutat a 6. ábra, használat előtt és után. A kutak üzemeltetőinek tapasztalatai és vizsgálatai alapján a két egyébként jól működő rendszer szűrőinek eltömődése nem szervetlen anyagok lerakódása miatt történt, hanem inkább szerves komponensek voltak észlelhetők nagy számban. Annak kiderítésére, hogy milyen élőlény rakódik le a szűrőkön, mintát vettünk mindkét szűrőt eltömítő anyagból, és ezeket a mintákat megtisztítottuk úgy, hogy csak az összes genomi DNS maradjon meg. 6. ábra: Szövetszűrő használat előtt (balra) és után (jobbra) 15.
4.1. Környezeti mintából való DNS kinyerés A begyűjtött mintákat extraháltuk 800 μl extrakciós pufferral (100 mm Tris-HCl, ph 8.0, 100 mm EDTA, ph 8.0, 1.5 M NaCl, 100 mm nátrium foszfát, ph 8.0, 1% CTAB). Figyelmes összerázás után 4.3 μl, 20.2 mg/ml koncentrációjú proteináz K-t adtunk hozzájuk. Ezután az eppendorf csöveket 37 C-ra rázógépbe tettük 45 percre, majd 160 μl, 20%-os SDS-t adtunk a mintákhoz. Tizenöt percenkénti keverés mellett 60 C-on inkubáltuk a mintákat, 1 óra hosszáig. Az inkubáció után 13300 fordulat/perc fordulatszámon centrifugáltuk 5 percig. A művelet után a felülúszót új eppendorf csövekbe helyeztük. A maradék pelletet 400 μl extrakciós pufferral, 60 μl 20%-os SDS-sel kezeltük, majd 60 C-ra helyeztük 15 percre, 5 percenkénti keveréssel. A felülúszót összegyűjtöttük, és a saját térfogatukkal megegyező mennyiségű fenol kloroform és izoamil-alkohol (25:24:1) elegyével extraháltuk; háromszor. A vizes fázist elválasztottuk, és kicsaptuk 900 μl izopropanollal (szobahőmérsékleten). 15 percig tartó, 13300 fordulat/perces fordulatszámon történő centrifugálás után a DNS pelletet 900 μl, 70%-os etanollal mostuk. Ezután 30 C-on vákuumcentrifugában szárítottuk, majd 60 μl TE pufferral (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0) reszuszpendáltuk. A mennyiségét NanoDrop ND-1000 spektrofotométerrel ellenőriztük (NanoDrop Technoligies, USA). A DNS tisztaságát agaróz gélelektroforézissel teszteltük. A folyamat végére tiszta (A260/A280 = 1.8) és elegendő mennyiségű kromoszómális DNS-t kaptunk a szűrőmintákból. Ez az extrahált és tisztított DNS nem csak a mintavételkor élő mikrobák örökítőanyaga, hanem azoké is, amelyek már a mintavételkor a szűrőn nem éltek. A folyamat eredményeként kapott DNS-t Ion Torrent típusú berendezéssel szekvenáltuk. 4.2. Baktériumok megjelenésének lokalizációja Miután meghatároztuk a szűrőkön domináns élőlényeket, kiderítettük, hogy ezek a csővezetékrendszer mely szakaszán jelennek meg. Ennek érdekében ahol csak lehetett, vízmintát vettünk a rendszerből, és ezeket a vízmintákat LB táptalajra cseppentettük, és vártuk, hogy telepek nőjenek. Meg kell jegyezni, hogy jelen esetben ez a módszer nem arra ad választ, hogy milyen baktériumok nőnek ki, hanem arra, hogy milyen számban jelennek meg. Azért, mert a táptalajon csak olyan baktériumok nőnek, amik a 16.
mintavételkor is életképesek voltak. Így ez a módszer torzít, mert szelektív, de mindig ugyanolyan mértékben. A 7. ábrán láthatóak a kinőtt telepek. 7. ábra: A termálvízből LB táptalajon kinőtt baktériumok száma Az 1. minta a visszasajtoló rendszer puffertartálya előttről származik, a fürdőből. Ezen összesen 1 telep számolható. A 2-es és 3-as számú minta a szivattyúk előtti puffertartályból származik, ezeken a táptalajokon nagyon sok telep nőtt. Az utolsó két minta már mind a rendszer tartály utáni pontjairól ered, a 4-es a szűrő előtt, itt 11 telepet látunk; az 5-ös a szűrő után, itt már újra csak 1 telepet számolhatunk. A biológiai vizsgálatokon kívül végeztünk kémiai vízminősítést is, különös tekintettel a fenolindex meghatározására (ami egy extrakciós eljárás) és a BTEX vegyületekre (benzol, toluol, etil-benzol, xilolok). 17.
5. Eredmények A szűrőkből vett mintából kivont DNS szekvenálás eredményét az 1. melléklet mutatja, és a 8. ábra szemlélteti. Szembetűnő, hogy a két minta baktérium flórája jelentősen eltérő. A gyorsan eltömődő (2 -es számú) szűrőn szokatlanul nagy százalékban vannak jelen Magnetospirillum nemzetségbe tartozó fajok. 8. ábra: Metagenomikai szekvenálás eredménye A metagenomikai szekvenálás eredménye arra mutat rá, hogy a gyorsan eltömődő szűrőn található egyedek kisebb változatosságot mutatnak, ellenben sokkal jobban dominánssá tudtak válni, mint a másik szűrő esetében. A kontroll (lassabban eltömődő) rendszer szűrőjén nagyon széles spektrumban találtunk fajokat, változatos nemzetségekből, azonban egyik faj sem tudott különösen dominánssá válni. A 2-es szűrőn talált baktériumok közül a négy legdominánsabb fajból három a Magnetospirillum nemzetségbe tartozik. Ezek Gram negatív, mikroaerofil (normál légközi oxigénnél kevesebb oxigénigényű), magnetotaktikus, spirillum morfológiával rendelkező baktériumok. A mágneses baktériumok jellemző tulajdonsága, hogy magnetoszómákat tartalmaznak. A magnetoszóma egy ferromágneses (állandó mágneses) nanokristályból és az ezt körülvevő biológiai membránból áll. A magnetoszómák rendszerint láncba vagy láncokba rendeződnek, de akadnak szétszórt kristályokat tartalmazó sejtek is. A baktériumsejt a benne lévő mágneses kristálylánc miatt úgy viselkedik, mint egy iránytű, azaz a Föld mágneses tere az erővonalakkal 18.
párhuzamos irányba forgatja az egész sejtet. A környező mágneses tér csak a sejt passzív irányulását biztosítja, a baktérium mozgását nem. (Pósfai, 2009) Jellemző továbbá, hogy anyagcseréjük során aromás vegyületeket bontanak. A közösség legdominánsabb tagjai között van a Dechloromonas aromatica is, amely ahogy a neve is mutatja szintén aromás vegyületek bontásából jut energiához. A Petri-csészén való szélesztés azt mutatta, hogy mindkét rendszer esetében a baktériumok a visszasajtoló kút előtti puffertartályban jelennek meg igen nagy számban, és a tartály utáni szakaszokon szintén kimutathatók. Az akkreditált laboratórium által végzett kémiai vízminősítés eredménye az 9. ábrán látható. 9. ábra: Kémiai vízminősítés eredménye A fenolindex értéke az 1-es szűrő vizének 15 µg/l, míg a 2-es szűrő vizének 2238 µg/l. Ugyanígy, a kémiai oxigénigénye, EPH, TPH értéke és a BTEX vegyületek mennyisége is jóval magasabb a 2-es szűrőn áthaladó fluidumnak, mint az 1-es visszasajtoló kút vizének. Ennek a kémiai vízvizsgálatnak a fényében azt állapítottuk meg, hogy a víz aromás vegyület tartalma alapvetően meghatározza a visszasajtoló rendszer felszíni berendezésein megjelenő flórát. Ha a fluidum kémiai oxigénigénye, fenolindexe, BTEX vegyület tartalma magas, bizonyos baktériumok teret tudnak nyerni más baktériumokkal szemben, így dominánssá tudnak válni, és akár biofilmet is képesek képezni. A 19.
megjelenő biofilm pedig képes eltömíteni a csővezetékrendszer és a visszasajtolómű szűrőit. Továbbá, amikor kisebb a vízfelhasználás, és ezért a visszasajtolás is lassabb ütemben zajlik, több időt tartózkodik a fluidum a felszíni rendszerekben. Ilyen esetben a megnövekedett tartózkodási idő miatt a baktériumoknak több idejük van szaporodni, illetve biofilmet képezni a szűrőkön. Emiatt akár naponta többször is szűrőt kell cserélni, mert a szűrő annyira eltömődik, hogy sokkal nagyobb nyomásra van szükség a fluidum keresztüláramoltatásához. A legtöbb esetben az elhasznált szűrőt nem lehet tisztítani és nem lehet újra felhasználni, mert annyira agresszív az eltömődés. Így tehát a vizet kell kezelnünk, fertőtlenítenünk. Tanszékünk laboratóriumában lehetőségem volt az ultraibolya sugárzás termálvízben élő baktériumokra gyakorolt hatásait vizsgálni. A kísérlet során termálvizet cseppentettem LB táptalajra. A Petri-csészéket páronként 25 C, 40 C és 55 C-on inkubáltam, 48 óráig. Minden hőmérsékleten történő inkubálás előtt az egyik Petri-csészét 5 másodpercnyi UV sugárzásnak tettem ki. Így meg tudtam figyelni, hogy különböző hőmérsékleten tapasztalható-e telepszámban tapasztalható csökkenés. A 40 C-on inkubált lemezek láthatók a 10. ábrán. Az UV kezelés nélküli lemezen nagyon sok telep számlálható (100-nál több), a kezelt lemezen ezzel szemben csupán csak 7. 10. ábra: 40 C-on inkubált lemezek. UV kezelés nélküli (balról) és 5 másodperces UV kezelésű (jobbról) A kísérlet eredménye az, hogy hőmérséklettől függetlenül az ultraibolya sugárzásnak jelen esetben is effektív, általános antibakteriális hatása van. 20.
6. Következtetés A víz felszínen való tartózkodását a lehető legrövidebbre kell fogni és a geotermikus rendszerek tervezésénél figyelemmel kell lenni, hogy ne alakuljanak ki a rendszerben pangó vizes zónák. A tartózkodási időn kívül meglehetősen fontos szerepe van a kitermelt víz kémiai összetételének is. Mivel a víz nem csak élettér a mikrobák számára, hanem a tápanyagaik forrása is, nem meglepő, hogy egy olyan termálvízben, amely magas koncentrációban tartalmaz aromás vegyületeket (benzol, fenol), olyan baktériumokat találtunk meglehetősen nagy számban, amelyeknek ezen aromás vegyületek a táplálékaik. A jövőben létesítendő geotermikus rendszerek tervezésekor célszerű figyelembe venni a kitermelt víz kémiai tulajdonságait is, különösen azon esetekben, ahol számítani lehet a baktériumok megjelenésére. Ez azt is jelenti, hogy a megjelenő biológiai komponensek eltüntetésére megoldást kell találnunk, amely könnyebb, ha a tervezéskor számításba kerül, és nem utólag kell módosítani a rendszert. A megjelent baktériumok eltávolítására a rendszerből valamilyen vízkezelési módszerrel tudunk reagálni. 6.1. Vízkezelési lehetőségek (Halász et al., 2012 alapján) 6.1.1. Fertőtlenítés sugárkezeléssel A rendszerben elhelyezett UV lámpákból kilépő ultraibolya sugárzás a vízben gyököket generál, ami elpusztítja a mikroorganizmusokat. Előnye, hogy semmilyen vegyi anyagot nem juttatunk a vízbe. Nem szelektív módszer, azaz mindenféle élőlényt elpusztít, de drága és csak helyi hatású. A kezelés helyétől távolabb már nem hatásos. 6.1.2. Vízfertőtlenítés ózonos kezeléssel Nagyhatékonyságú oxidációs eljárás. Az ózon környezeti hőmérsékleten reagál a vízzel, ennek során oxidatív gyökök keletkeznek. Ezek erélyes oxidálószerek, a vízben előforduló összes oxidálható anyagot képesek átalakítani, úgy, hogy a végtermék CO 2 és H 2 O. Így a környezet és az ember számára is ártalmatlan komponensek jönnek létre. 21.
A módszer hátránya, hogy ózont nem lehet tárolni, így helyben kell előállítani, ami drága; és a csöveket is károsíthatja. 6.1.3. Forróvizes fertőtlenítés: Vízminőségtől független, megbízható eljárás. Az épületgépészetben bevett módszer, hogy havonta az egész fűtési rendszert 75 C fölé melegítik, csírátlanítás céljából. Meglehetősen nagy az energiaigénye, de lévén, hogy geotermikus energiáról van szó, előfordulhat, hogy ez kézenfekvő opció. Az olyan módszerek, amelyeknél valamilyen nehézfémet, vagy klórt, esetleg más vegyi anyagot használunk a tisztításra, szóba sem jöhet, mert nem szennyezhetjük a visszasajtolandó vizet, sem környezetünket. Van olyan módszer is, ahol meghatározzák a legnagyobb mértékű szennyezést okozó baktériumot, és célzottan az ellen kezelik a rendszert. Ha például olyan baktérium okozza a legnagyobb gondot, amely obligát anaerob (szigorúan oxigénmentes környezetben él), akkor megoldható a vízkezelés buborékoltatással. Azonban jelen esetben, a rendszer biológiai komplexsége miatt figyelembe kell venni a kezeléskor, hogy ha egy célzott probléma (baktérium) ellen teszünk lépéseket, akkor ezzel esetleg teret adhatunk a korábban háttérbe szoruló másik baktériumoknak. 22.
Irodalomjegyzék 1. BUCKLING, A., HARRISON, F., VOS, M., BROCKHURST, M. A., GARDNER, A., WEST, S. A., GRIFFIN, A. (2007) Siderophore-mediated Cooperation and Virulence in Pseudomonas aeruginosa FEMS Microbiology Ecology, 62: p. 135-141. 2. DÖVÉNYI P., DRAHOS D., LENKEY L. (2001) Magyarország geotermikus energia -potenciáljának feltérképezése a felhasználás növelése érdekében. Hőmérsékleti viszonyok. Jelentés a Környezetvédelmi Alap Célelőirányzat részére. ELTE, Geofizikai Tanszék 1-10. o. 3. DÖVÉNYI P. (2008) A Kárpát-medence geotermikus és hévízföldtani adottságai. IV. kisteleki szakmai fórum 4. FOX, A., STEWART, G. C., WALLER, L. N., FOX, K. F., HARLEY, W. M., PRICE, R. L. (2003) Carbohydrates and glycoproteins of Bacillus anthracis and related bacilli: targets for biodetection, Fig.1 Journal of Microbiological Methods, 54: p. 143-152. 5. HALÁSZ J., HANNUS I., KIRICSI I. (2012) Környezetvédelmi technológia. JATE Press, Szeged 6. IMRE L., BITAI A., HECKER G. (2001) Megújuló energiaforrások. Egyetemi jegyzet, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Budapest 7. JEFFERSON, K. K. (2004) What drives bacteria to produce a biofilm? FEMS Microbiology Letters, 236: p. 163-173. 8. LORBERER Á. (2004) A geotermális energiahasznosítás hazai fejlesztési koncepciója 2010-ig. Jelentés a Környezetvédelmi és Vízügyi Minisztérium részére, VITUKI, 97. o. 9. MÁDLNÉ SZŐNYI J. (2010) A geotermikus energia. Grafon kiadó 10. MÁDLNÉ SZŐNYI J., LENKEY L., HÁMOR T., RYBACH L., ZSEMLE F. (2008) A geotermikus energiahasznosítás nemzetközi és hazai helyzete, jövőbeni lehetőségei Magyarországon Ajánlások a hasznosítást előremozdító kormányzati lépésekre és háttértanulmány. 11. MALATE, R. C. M. (2003) Management of geothermal resources: PNOC-EDC experience. IGC2003 Short Course. The United Nation University. Geothermal Training Programme. Reykjavík, Iceland. p. 153 183. 23.
12. MARÓTI G., KONDOROSI É., BÍRÓ T. (2011) Biomassza-alapú energiák innovációjának genomikai megközelítései. Gazdálkodás, 55. évfolyam, 2011. 6. szám, 589-594. o. 13. NATIONAL RESEARCH COUNCIL, COMMITTEE OF METAGENOMICS (2007) The new Science of Metagenomics: Revealing the Secrets of Our Microbal Planet. The National Academies Press, Washington DC, USA 14. NYITRAY L. (2013) Géntechnológia és fehérjemérnökség. Elektronikus jegyzet, Eötvös Loránd Tudományegyetem, Budapest 15. PATTANTYÚS Á. G. (1983) A gépek üzemtana. Műszaki könyvkiadó, Budapest 16. PÓSFAI M. (2009) Mágneses baktériumok Fizikai Szemle, 2009/5. 174. o. 17. STEFÁNSSON, V. (1997) Geothermal Reinjection Experience. Geothermics, 26: p. 99-139. 18. SZANYI J., KÓBOR B., KURUNCZI M., MEDGYES T. (2012) BAROSS-DA 07-DA-INNO-17-2008- 0001 számú pályázat zárójelentés. GEKKO Alapítvány, Kézirat 19. SZANYI J., KÓBOR B., KURUNCZI M., MEDGYES T. (2013) Korszerű technológiák a termálvíz visszasajtolásban Kutatási eredmények és gyakorlati tapasztalatok. InnoGeo Kft., Szeged 20. TAYLOR, T. J., VAISMAN, I. I. (2010) Discrimination of thermophilic and mesophilic proteins Computational Structural Bioinformatics Workshop, 2009, Washington DC, USA 24.
Mellékletek: Species Abundancia (%) 1-es szűrő 2-es szűrő Acidovorax avenae 0,514000 0,162319 Acidovorax citrulli 0,605172 0,195044 Acidovorax sp. JS42 0,602089 0,270967 Aeromonas hydrophila 0,007047 0,332164 Albidiferax ferrireducens 0,658906 0,211407 Alkalilimnicola ehrlichii 0,473919 0,422486 alpha proteobacterium BAL199 0,314478 0,489901 Aromatoleum aromaticum 0,976467 1,041326 Azoarcus sp. 0,869439 1,330619 Azoarcus sp. BH72 1,023154 1,459558 Azospirillum sp. 0,199962 0,751050 Azospirillum sp. B510 0,180142 0,674146 Candidatus Accumulibacter phosphatis 0,410935 1,542353 Chromobacterium violaceum 0,281004 0,396633 Cupriavidus metallidurans 0,578305 0,266386 Dechloromonas aromatica 0,693701 5,129397 Erythrobacter litoralis 1,430126 0,052361 Erythrobacter sp. 1,545963 0,024871 Erythrobacter sp. NAP1 1,647265 0,022908 Halothiobacillus neapolitanus 0,135657 0,746469 Janthinobacterium sp. Marseille 0,624992 0,455866 Leptothrix cholodnii 1,536713 0,202571 Magnetospirillum gryphiswaldense 0,278802 18,287998 Magnetospirillum magneticum 0,423268 10,181234 Magnetospirillum magnetotacticum 0,218461 2,634076 Methylibium petroleiphilum 2,052475 0,219261 Methylobacillus flagellatus 0,439124 0,369471 Methylococcus capsulatus 0,781350 0,669891 Novosphingobium aromaticivorans 1,395330 0,075923 Parvibaculum lavamentivorans 0,465551 0,380270 Polaromonas sp. JS666 0,888818 0,151519 Pseudomonas aeruginosa 0,455861 0,511827 Ralstonia solanacearum 0,827156 0,475502 Rhodobacter sphaeroides 0,888818 0,259841 Rhodopseudomonas palustris 1,105517 0,851518 Rhodospirillum centenum 0,361606 1,061616 Rhodospirillum rubrum 0,289813 1,864700 25.
Roseomonas cervicalis 0,624111 0,305984 Sphingomonas wittichii 0,591077 0,591077 Sphingopyxis alaskensis 0,600767 0,083777 Thauera sp. MZ1T 0,857547 1,192518 Thioalkalivibrio sulfidophilus 0,395960 0,695744 Thiobacillus denitrificans 0,506072 0,657783 unassigned 12,745163 8,591429 Variovorax paradoxus 0,649657 0,145301 Verminephrobacter eiseniae 0,708236 0,147265 1. melléklet: A leggyakrabban előforduló fajok (betűrendben) 26.