DOKTORI ÉRTEKEZÉS. A sejtszaporodás reakciókinetikai modelljei

DOKTORI ÉRTEKEZÉS A sejtszaporodás reakciókinetikai modelljei Novák Béla Budapesti Mûszaki Egyetem Mezõgazdasági Kémiai Technológia Tanszék 1998

T A R T A L O M Rövidítések és nomenklatúra 3 1. Bevezetés 5 2. A sejtciklus 8 2.1. A sejtciklus fiziológiája 8 2.1.1. Kromoszómás ciklus 8 2.1.2. Növekedési ciklus 10 2.1.3. A növekedési és kromoszómás ciklus összehangolása 11 2.1.4. Ellenõrzési mechanizmusok az eukarióta sejtciklusban 13 2.2. A sejtszaporodást szabályozó molekulák 14 2.2.1. Ciklin-függõ protein-kinázok és ciklinek 14 2.2.2. Az Anafázis Serkentõ Komplex (APC) 17 2.3. A DNS-replikáció két lépéses iniciációja 18 3. A matematikai leírás szükségessége 21 3.1. A reakciókinetika alkalmazhatósága 21 4. A primitív eukarióta sejt ciklusa 23 4.1. Hiszterézis a primitív eukarióta sejtciklus modellben 31 5. A sztöhiometrikus Cdk inhibitor szerepe 32 5.1. A sarjadzó élesztõ sejtciklusának modellje 37 6. A CDK foszforilezés szerepe 42 6.1. Az embrionális sejtciklus 46 6.2. Küszöbértékek, bistabilitás és hiszterézis mitózis kontrollban 52 6.3. Embrionális fejlõdésmenet 56 6.4. Ellenõrzési pontok az embrionális ciklusban 59 7. A CDK inhibitor és a CDK foszforilezés együttes hatása 62 7.1. A hasadó élesztõ sejtciklusának modellezése 62 7.2. Mitózis kontroll 67 7.3. A G1/S kontroll 71 7.4. S-fázisú ciklin szerepe 74 8. Emlõssejtek ciklusának modellje 78 9. Összefoglalás 90 10. Irodalomjegyzék 94 11. Köszönetnyilvánítás 101 2

Rövidítések és nomenklatúra Az értekezésben elõforduló néhány fontosabb rövidítés: ACT APC apoact AS ATP cdc Cdk CDK CEG CKI cut cyca cycb cyce DE DEG G1 fázis G2 fázis GF hus M fázis MPF pre-mpf prerc postrc Rb S fázis SCF TRI ts - az APC aktivátora - anafázis serkentõ komplex (Anaphase Promoting Complex) - az aktivátor (ACT) inaktív formája - aminosav - adenozin-trifoszfát - cell division cycle - Ciklin dependens kináz katalitikus alegysége - Cdk/ciklin komplex - Cyclin Egyensúlyi Görbe - sztöchiometrikus CDK inhibitor - korai szeptumképzés (cell untimely torn) - ciklin-a - ciklin-b - ciklin-e - differenciálegyenlet - Dimer Egyensúlyi Görbe - a sejtciklus mitózis és a DNS-szintézis közti szakasza - a sejtciklus DNS-szintézis és mitózis közti szakasza - növekedési faktor (Growth Factor) - hidroxi-urea sensitive - mitózis - M-fázist serkentõ faktor (M-phase Promoting Factor) - az MPF inaktív (tirozin fozforilezett) elõformája - pre-replikációs komplex - poszt-replikációs komplex - retinoblasztoma fehérje - DNS-replikáció szakasza - foszforilezett fehérje ubikvitinezésére specializálódott ligáz enzim; elnevezése a komponensei alapján: Skp1 - Cullin - F-box protein. - Cdk/ciklin/CKI hármas komplex (trimer) - temperature sensitive Reakciókinetikai nomenklatúra: Az egyes komponensek koncentrációját nem szögletes zárójellel, hanem a dõlt betûvel jelölöm. Ettõl csak akkor tértem el, amikor a komponenseket ikonok reprezentálják. 3

Genetikai és molekuláris biológiai nomenklatúra 1 : Az egyes gének és mutánsok jelölése mindig három, dõltbetûs kóddal történik, amit általában egy szám követ. A sarjadó és a hasadó élesztõ genetikai nomenklatúrája azonban eltérõ: - a vadtípusú gént a hasadó élesztõ esetében "" felsõ index (ezt az egyszerûség kedvéért elhagytam), a sarjadzó élesztõnél pedig csupa nagybetûs kód jelöli. - a hasadó élesztõ recesszív mutánsainak jelölése "-" felsõ index-vel, míg a sarjadzó élesztõnél kisbetûs kóddal történik. Egy adott gén hiányát görög (deléció) jelöli. Az egyes géntermékeket ugyanúgy jelöljük, mint a megfelelõ gént, de a kód nem dõltbetûs és nagybetûvel kezdõdik. Alábbiakban összefoglalom az értekezésben elõforduló legfontosabb géntermékeket (fehérjéket): Cdc18 Cdc2 Cdc25 Cdc28 Cdc6 Cdk2 Clb2 Cln2 Cln3 Mik1 Rum1 Sic1 Wee1 - a DNS replikáció kezdetét szabályozó engedély fehérje a hasadó élesztõben - a hasadó élesztõ ciklin függõ (dependens) protein kináza (Cdk1) - Cdc2-t aktiváló tirozin-foszfatáz a hasadó élesztõben - a sarjadzó élesztõ ciklin függõ (dependens) protein kináza (Cdk1) - a DNS replikáció kezdetét szabályozó engedély fehérje a sarjadzó élesztõben - magasabbrendû eukarióták második Cdk alegysége - a sarjadzó élesztõ legfontosabb mitózisos ciklinje - a sarjadzó élesztõ G1 fázisú ciklinje - a sarjadzó élesztõ G1 fázisú ciklinje - Cdc2-t inaktiváló tirozin-kináz a hasadó élesztõben (ld. Wee1) - a hasadó élesztõ G1 fázisban mûködõ Cdk inhibitora (Replication uncoupled from mitosis) - a sarjadzó élesztõ G1 fázisban mûködõ Cdk inhibitora - Cdc2-t inaktiváló legfontosabb tirozin-kináz a hasadó élesztõben 1 Egyes cikkek címeiben a szerzõk ortográfiája eltér az itt alkalmazott és azóta kialakított jelölésmódtól, ezért az irodalomjegyzékben eltérések tapasztalhatók ettõl a nomenklatúrától. 4

1. Bevezetés 1. Bevezetés Az élet strukturális alapegysége a sejt és az élet lényege a sejtek önreprodukáló képességén alapul. A sejtbiológia ezen két alaptételének tükrében az élet szempontjából alapvetõ jelentõségû az a folyamat, amelyen a sejtek keresztül haladnak születésüktõl osztódásukig. Ez a folyamat a sejtszaporodás alapreakciója, mely szerint egy sejt tápanyagok felhasználása révén reprodukálja önmagát (1. ábra). Természetesen ez egy bonyolult többlépéses reakció és mindazon folyamatokat, melyek egy szaporodó sejt két egymást követõ osztódása között bekövetkeznek sejtciklus 2 kifejezéssel szokás összefoglalni (Mitchison, 1971). tápanyagok salakanyagok 1. ábra: A sejtszaporodás mint kémiai reakció. Sejtszaporodási reakcióknak a sebességét a mindennapi életben gyakran kell befolyásolni: amikor nem kívánatos (rákos) sejtszaporodással állunk szemben, akkor a reakció megfékezése a cél. Amikor viszont a sejteket egy biotechnológiai folyamatban saját céljaink elérése érdekében használjuk, akkor a reakciót a maximumig szeretnénk gyorsítani. Történetileg két alapvetõ szakaszt különböztethetünk meg a sejtciklus biológiai kutatásában. A korai (fiziológiai) szakaszban a sejtciklust szabályozó rendszer élettana került igen alapos megfigyelések és mérések tárgyává. A jelenleg is tartó molekuláris szakaszban pedig a szabályozási rendszer molekuláris részleteit tárják fel genetikai analízissel, gén-klónozással és szekvenálással. 2 A Földön található élõsejtek mindegyike két nagy csoport egyikébe sorolható: prokarióta (elõsejtmagvas: baktériumok és kékalgák) és eukarióta (valódi sejtmagvas: növény, gomba és állat) sejtek. Ebben a dolgozatban csak az eukarióta sejtek sejtciklusával foglalkozom.

1. Bevezetés A fiziológiai szakaszban a kontroll rendszert úgy tekintették mint egy fekete dobozt és a doboz megzavarása után annak válaszát vizsgálva hipotézisek születtek a láthatatlan belsõ szerkezet mûködésére vonatkozóan. A fiziológiai vizsgálatok feltárták a sejtciklus szabályozásának legfontosabb törvényszerûségeit. A molekuláris szakaszban a fekete dobozt részeire szedték a laboratóriumi asztalokon és a molekuláris analízis eredményeként megtudtuk, hogy az eukarióta sejtciklus különleges protein-kinázok szabályozása alatt áll (Murray & Hunt, 1993). A molekuláris sejtbiológia talán egyik legnagyobb sikere az eukarióta sejtciklust szabályozó molekulák felfedezése és általános elõfordulásuk felismerése az eukarióták világában az élesztõktõl a humán sejtekig. Ez azonban bizonyos ellentmondást eredményez, mert molekulák tekintetében a szabályozási rendszer törzsfejlõdésileg konzervált ugyan, de fiziológiai szinten alapvetõ eltérés mutatkozik az egyes sejttípusok között sejtciklusuk szabályozását illetõen. A sejtciklus szabályozás megértésével kapcsolatban egy másik probléma is szembeötlõ. A szabályozási rendszer nagyon sok elemû, és ezek a szabályozási szignálok igen komplex hálózatában állnak egymással kölcsönhatásban, ezért a szabályozási rendszer mûködésének megértése nem könnyû feladat. Éppen ezért a kémiai reakciókinetika egy természetes eszköz ezen komplikált sejtciklus szabályozó mechanizmusok vizsgálatára. A sejtciklus kutatás egy elkövetkezõ szakaszában ugyanis a molekuláris darabokból kiindulva rekonstruálnunk kell majd az intakt szabályozó rendszert és igazolni, hogy a molekuláris mechanizmus valóban magyarázatot tud adni a sejtciklus minden fiziológiai tulajdonságára. Figyelembe véve a sejtciklus szabályozásának bonyolultságát ez az ún. szintetikus szakasz könnyebb és precízebb lesz a molekuláris hálózat matematikai modelljeinek kidolgozásával, mert a molekuláris gépezet és az intakt sejtek fiziológiája közti szakadék így áthidalható. Kutatómunkám szinte tudományos pályafutásom kezdete óta a sejtosztódási ciklus szabályozásának vizsgálatára irányul. Ebben a témában készítettem és védtem meg egyetemi doktori és kandidátusi értekezéseimet, valamint habilitációs téziseimet. Az 1990-es évek elején azonban jelentõs változás következett be az általam alkalmazott megközelítési módszerben. Az addig szinte kizárólagos kísérletes vizsgálódást fokozatosan felváltotta a matematikai modellezés módszere. Ebben az irányváltoztatás-ban alapvetõen a sejtszaporodást szabályozó molekuláris hálózatokról alkotott ismereteink rohamos fejlõdésnek indulása és a kvantitatív leírás szükségességének felismerése játszott szerepet. Ebben a dolgozatban a sejtszaporodást irányító molekuláris hálózatok reakciókinetikai leírásával kapcsolatos eredményeimet foglaltam össze. 6

1. Bevezetés A fentieknek megfelelõen az alábbiakban röviden ismertetem az eukarióta sejtciklus legfontosabb élettani ismérveit és a sejtciklust szabályozó molekulákat 3. Ezt követõem pedig röviden összefoglalom az elmúlt évek alatt általam kidolgozott matematikai sejtciklus modelleket. A modellek ismertetése nem a publikációk kronológiáját követi, hanem az egyszerûbb modellektõl halad a bonyolultabbak irányába. Ez azt jelenti, hogy a modellek tárgyalási sorrendje megegyezik a sejtciklus szabályozás fejlõdésének (evolúciójának) általam feltételezett irányával. 3 Az irodalmi hivatkozások számát megpróbáltam bizonyos korlát (kb. 120) alatt tartani, ezért ahol csak lehetett összefoglaló cikkekre hivatkoztam, amit a szövegben az elsõ szerzõ neve elõtt ld. jelöléssel tüntettem fel. 7

2. A sejtciklus 2. A sejtciklus 2.1. A sejtciklus fiziológiája A sejtek molekulákból épülnek fel, és a sikeres sejtreprodukció alapvetõ feltétele a sejtet alkotó molekulák számának megduplázása (növekedés) és térbeli szétosztása (osztódás). A sejtet alkotó molekulák között információ tároló szerepe miatt kitüntetett szerepe van a genetikai örökítõ anyagnak, a dezoxiribonukleinsavnak (DNS). Éppen ezért a sejtszaporodási folyamat legfontosabb eseményei a dezoxiribonukleinsav (DNS) mennyiségének megduplázásával és felezõ osztásával kapcsolatosak. 2.1.1. Kromoszómás ciklus A genetikai információt hordozó DNS a sejtek többségében (haploid sejtek) csak egyetlen példányban van jelen. A genetikai információ utódsejtekbe történõ pontos átvitele megköveteli a DNS molekula pontos lemásolását és a másolatok precíz elosztását az utódsejtek között. A DNS mennyiségének pontos megduplázódását a molekula templát-irányított szintézise (replikációja) biztosítja. A DNS replikációja a molekula meghatározott pontján indul meg (replikációs origó), és onnan egyszerre két ellentétes irányban halad. Az egyszerûbb prokarióta sejtekben egyetlen (kör alakú) DNS molekula található egyetlen replikációs kezdõponttal. Ezzel szemben a valódi sejtmagvas (eukarióta) sejtekben a jóval nagyobb DNS mennyiség több kromoszóma között oszlik meg. Eukarióta sejtekben még így is annyi DNS jut egyetlen kromoszómába, hogy annak korlátozott idõ alatt történõ lemásolása (replikációja) megkívánja, hogy a másolás több ponton (replikációs origók) induljon el. A DNS-replikáció a sejtciklusnak csak egy részére korlátozódik, és ezt a szakaszt eukarióta sejteknél S fázisnak szokás nevezni. A DNS lemásolását követõen kerül sor a kromoszóma másolatok (ún. leánykromatidák) szétválasztására (szegregálására). Ez a folyamat a magosztódás (mitózis vagy M fázis) alatt (illetve pontosabban annak egy része, ún. anafázisa, során) történik. Eukarióta sejtekben a leánykromatidák térbeli szétválasztását a sejt belsõ vázát alkotó dinamikus mikrotubulusok végzik. Mivel az eukarióta sejtek több kromoszómát tartalmaznak, ezért azok szegregációját csak egyszerre és csak a DNS-replikáció befejezõdését követõen szabad elkezdeni. Amennyiben ez a szabály nem érvényesül, annak az utódsejtekre nézve kromoszóma vesztés a 8

2. A sejtciklus következménye. Ezen elv érvényesülése érdekében a lemásolt DNS-eket ún. kohéziós faktorok (ragasztó fehérjék) tartják össze a szegregáció megkezdéséig (Michaelis et al., 1997). A genetikai állomány állandó értéken tartása megköveteli, hogy a DNS lemásolását követõen illetve a kromoszómák szegregációját megelõzõen újabb DNS-replikációra ne kerüljön sor. Fenti két szabályból következik, hogy eukarióta sejtekben a DNS-replikáció és a kromoszóma szegregáció mindig felváltva kell, hogy bekövetkezzék (2. ábra). Egyik esemény sem következhet be újra, mielõtt a másik le nem játszódott. A sejtciklus kutatás egyik kulcskérdése, hogy ez a két folyamat milyen - feltehetõen különbözõ - jelek hatására indul el, és mi az a mechanizmus ami e két folyamat alternálását biztosítja? DNS replikáció kromoszóma szegregáció 2. ábra: Kromoszómás ciklus. A DNS replikáció és a kromoszóma szegregáció (mitózis) mindig alternálva következnek be a mitózisos ciklus alatt. Az egyszerûség kedvéért csak egyetlen kromoszóma van feltüntetve (piros vonal) és azon is csak két replikációs origó. A zöld vonal és folt a sejtvázat (citoszkeleton) jelöli. 9

2. A sejtciklus A DNS-replikáció és kromoszóma szegregáció váltakozásának szabálya csak az ún. mitózisos ciklusra érvényes és ezen szabály alól két fontos esetben adódik kivétel (Murray & Hunt, 1993): 1. az ún. endoreplikációs ciklusok alatt periódusos DNS-szintézis történik kromoszó-ma szegregáció nélkül, ami a genetikai állomány feldúsulásához vezet. 2. Két egymást követõ kromoszóma szegregáció lejátszódhat közbeesõ DNS-replikáció nélkül diploid sejtek meiózisa során 4. A DNS-replikáció és kromoszóma szegregáció alternálásának szabálya azt jelenti, hogy a DNS újra replikációja (re-replikáció) gátolt kell legyen a DNS-replikáció megkezdésétõl a kromoszómák szegregációjának befejezéséig. 2.1.2. Növekedési ciklus Bár a sejtszaporodás legfontosabb eseményei a sejtmagban játszódnak le, ezek szigorú kölcsönhatásban állnak a citoplazmában végbemenõ folyamatokkal (Mitchison, 1971). A citoplazma nagysága határozza meg a sejt méretét ill. tömegét. A citoplazmát a sejtek sejtosztódáskor osztják el az utódsejtek között és a sejtosztódásra mindig a sejtmagosz-tódást követõen kerül sor. A citoplazmát alkotó molekulák többsége nagy példányszám-ban van jelen, ezért sejtosztódáskor bekövetkezõ szétosztásuknál nincs szükség különösebb precizitásra, ezért az véletlenszerû folyamat. E molekulák általában folyamatosan szintetizálódnak két egymást követõ osztódás között és mennyiségük nem feltétlenül duplázódik meg pontosan ez alatt az idõ alatt. Ez nem is szükségszerû, amennyiben hosszú távon az átlagos értéktõl való eltérések kompenzálják egymást. A citoplazmát alkotó molekulák folyamatos szintézise eredményeként a citoplazma tömege és a sejt térfogata növekszik, sejtosztódáskor pedig csökken (növekedési ciklus 5 ). Mivel a folyamatosan szaporodó sejtek egy meghatározott átlag érték körül tartják tömegüket (térfogatukat és méretüket), ezért feltételezhetõ a citoplazma növekedését a sejtosztódással összehangoló mechanizmus létezése. 4 A diploid, kétszeres DNS tartalommal (2n) rendelkezõ sejtek DNS replikációt követõen négyszeres DNS tartalommal (4C) rendelkeznek, ami két egymáskövetõ magosztódásban csökken az egyszeres (1C) értékre. 5 A növekedési ciklus (sejtnövekedés és sejtosztódás) nem olyan esszenciális része a sejtciklusnak mint a kromoszómás ciklus: vannak ugyanis olyan sejtciklusok (embrionális), melyek alatt a sejtek nem növekednek, sõt bizonyos esetekben (Drosophila) még a sejtosztódás is elmaradhat. 10

2. A sejtciklus 2.1.3. A növekedési és kromoszómás ciklus összehangolása A citoplazma növekedésének üteme a sejttömeg megduplázódásához szükséges idõvel jellemezhetõ (duplázódási idõ). A citoplazma tömeget (sejtméret) úgy lehet egy állandó érték körül tartani, ha két egymást követõ sejtosztódás közt a sejttömeg duplázódás idejével azonos idõ telik el (Fantes & Nurse, 1981). A két idõtartam azonosságának nem szükségszerû minden egyes sejtciklus alatt fennállnia, de hosszú távon érvényesülnie kell. A növekedés és a sejtosztódás összehangolását kifejezõ szabály ilyetén történõ megfogalmazása figyelembe veszi az egyedi sejtek ciklusidejében tapasztalható különbségeket és csak azt követeli meg, hogy a populáció átlagos ciklusideje (generációs idõ) legyen azonos a sejttömeg duplázódás idejével. A szaporodó sejtek átlagos sejttömegének állandósága a kromoszómás és a növekedési ciklus összehangoltságára utal (Mitchison, 1971). Mivel sejtosztódásra mindig csak a kromoszómák szegregációját követõen kerül sor, ezért a kromoszómás ciklus periódus ideje is azonos a sejttömeg duplázódás idejével. Hogyan tudják a sejtek összehangolni a kromoszóma replikáció és szegregáció folyamatát a citoplazma növekedésével? A legkülönbözõbb sejttípusok vizsgálata azt mutatja, hogy a DNS-replikáció és magosztódás (mitózis) együttes ideje (kromoszómás ciklus) sokkal kevesebb idõt vesz igénybe mint a citoplazma mennyiségének megduplázása (ld. Johnston et al., 1977). A kromoszómás ciklus tehát gyorsabban tud lejátszódni, mint a növekedési ciklus. A két ciklus összehangolt mûködése alapján feltételezhetõ, hogy a lassabb növekedési ciklus lefékezi a gyorsabb kromoszómás ciklust. Ez a fékezõ hatás számos sejttípussal végzett precíz fiziológiai kísérlet alapján az lehet, hogy a sejteknek egy kritikus citoplazma tömeget kell elérniük ahhoz, hogy a kromoszómás ciklus egy bizonyos eseménye: DNS-replikáció (Killander & Zetterberg, 1965) vagy mitózis (Fantes & Nurse, 1977) lejátszódhasson (3. ábra). Valószínûleg mind a DNS-replikáció mind a kromoszóma szegregáció megkezdése egy kritikus sejttömeg eléréséhez van kötve minden eukarióta sejtben (Fantes & Nurse, 1981). A kritikus sejtméret elérésének sebesség-meghatározó volta miatt a kromoszómás ciklus eseményei között szünetek tapasztalhatók (4. ábra): G1 fázis a mitózis és a DNS-replikáció között, G2 fázis a DNS-szintézis és az azt követõ magosztódás között. Fontos megjegyezni, hogy a sejtek fejlõdésük során a sejtnövekedés és sejtosztódás összehangolásának szabályától jelentõsen eltérhetnek (Murray & Hunt, 1993). Így például: 11

2. A sejtciklus 1. a petesejtek elõalakjait reprezentáló oociták fejlõdésük során (oogenezis) jelentõsen növelik citoplazmájuk méretét anélkül, hogy osztódnának, aminek eredményeként a szomatikus (testi) sejteknél sokkal nagyobb méretet érnek el. 2. Az elõzõ folyamat ellensúlyozásaként pedig a petesejt megtermékenyítését követõen a korai embrióban gyors sejtosztódások játszódnak le (embrionális sejtciklus) citoplazma növekedés nélkül, aminek eredményeként a sejtek mérete visszaáll a testi sejtekre jellemzõ értékre. 2 sejttömeg növekedés 1 2 DNA sejtmag - - sejtosztódás 1 G1 S G2 M 3. ábra: A kromoszómás és a növekedési ciklus összehangolása. A két ciklus összehangolása úgy valósul meg, hogy a lassabb növekedési ciklus fékezi (illetve megállítja) a gyorsabb kromoszómás ciklust méretkontroll mechanizmusok révén. Ennek eredményeként szünetek (gap) keletkeznek az S és M fázisok között: G1 fázis az M és S fázisok, valamint G2 fázis az S és M fázisok között. Természetesen a fenti kivételek nem a sejtnövekedés és az sejtosztódás összehangoltságára vonatkozó szabály érvényességét vonják kétségbe, hanem csak az azt szabályozó mechanizmus átmeneti felfüggesztésére utalnak. 12

2. A sejtciklus sejtosztódás mitózis (M fázis) G1 G2 DNS replikáció (S fázis) 4. ábra: Az eukarióta sejtciklus. 2.1.4. Ellenõrzési mechanizmusok az eukarióta sejtciklusban A DNS-replikáció és a kromoszóma szegregáció felváltva történõ bekövetkezése, valamint a kromoszómás ciklus ezen folyamatainak a citoplazma növekedésével történõ koordinálására az eukarióta sejtek ún. ellenõrzési mechanizmusokat ( surveillance mechanisms ) használnak (Nasmyth, 1996b). Három ilyen ellenõrzési mechanizmust ismerünk az eukarióta sejtciklusban: 1. A G1 ellenõrzési mechanizmus segítségével a sejtek eldöntik, hogy a környezet megfelelõ-e a sejtciklus végrehajtására és méretük elegendõ nagy-e a DNS-replikáció megkezdéséhez. Amikor e feltételek mindegyike teljesül, akkor a sejtek végérvé-nyesen elkötelezik magukat a sejtciklus végrehajtására és a DNS-replikáció megkez-désével befejezik a G1 fázist. A sejtciklus ezen irreverzibilis lépését alacsonyabbrendû eukariótákban (élesztõk) Start-nak (Hartwell et al., 1974), míg emlõs sejteknél restrikciós pontnak (Pardee, 1989) nevezzük. 2. A G2/M átmenet ellenõrzési mechanizmusa a DNS-replikáció sikeres befejezõdésének (nem replikált DNS esetén a sejtek nem lépnek mitózisba), valamint annak ellenõrzésére szolgál, hogy a citoplazma nagysága megfelelõ-e a mitózis megkezdéséhez. 3. A meta/anafázis ellenõrzési mechanizmus a kromoszómák magorsó fonalakhoz való tapadásának ellenõrzésére szolgál. Amennyiben a sejtben egyetlen kromoszóma is szabad tapadási hellyel (kinetokór) rendelkezik, úgy a leánykromatidák szétválasz-tása (anafázis) elmarad illetve késlekedik. 13

2. A sejtciklus 2.2. A sejtszaporodást szabályozó molekulák A sejtek szaporodását egy komplikált molekuláris mechanizmus szabályozza, aminek számos részlete még ma sem ismert. De mint minden más összetett kémiai reakciómecha-nizmus esetén különös jelentõsége van a sebesség-meghatározó lépések ismeretének. Az elmúlt 10 évben a molekuláris biológiai módszerek alkalmazásának köszönhetõen fény derült azon molekulákra, melyek képzõdése sebesség-meghatározó a sejtszaporodás szempontjából. 2.2.1. Ciklin-függõ protein-kinázok és ciklinek A molekuláris vizsgálódás eredményeként megtudtuk, hogy a sejtszaporodást irányító komplikált biokémiai reakciórendszer legfontosabb elemei más fehérjéket foszforilezõ ún. protein kinázok. Ezek olyan enzimek, melyek ATP (adenozin-trifoszfát) segítségével más fehérjéket foszforileznek, és ezáltal azok tulajdonságait (pl. aktivitás) megváltoztatják. A protein-kinázok által foszforilezett fehérjékrõl pedig protein foszfatázok távolítják el a foszfátcsoportot. A sejtciklus szabályozásában különleges protein-kinázok vesznek részt, melyek csak akkor aktiválódnak, ha hozzájuk egy ciklinnek nevezett szabályozó (regulációs) alegység kapcsolódik (5. ábra). Éppen ezért ezeket a protein-kinázokat összefoglalóan ciklin-függõ protein-kinázoknak (Cyclin dependent protein kinase) vagy röviden Cdk-nak nevezzük (Morgan, 1995). A sejtszaporodás (sejtciklus) egy komplikált soklépéses folyamat, amelynek szabályozásában több Cdk/ciklin komplex is részt vesz a sejt fejlettségétõl függõen. Minden eukarióta sejtre érvényes szabály azonban, hogy mind a DNS-replikáció mind a mitózis megindítása Cdk aktivitást igényel. A magasabbrendû eukarióta sejtekben több különbözõ Cdk alegység is található, melyek különbözõ ciklinekkel alkotott komplexei irányítják a sejtciklust (Sherr, 1996). Ezzel szemben alacsonyabbrendû eukariótákban (pl. az élesztõgombák) csak egyféle Cdk alegység található és az elégséges a sejtciklus szabályozáshoz (Stern & Nurse, 1996). Az élesztõkben elsõként felfedezett, de az eukarióta sejtekben általánosan elõforduló Cdk-t, Cdk1-nek nevezzük, míg a többi Cdk-t egynél nagyobb arab számmal jelöljük (Cdk2, Cdk3 stb.). 14

2. A sejtciklus ciklin Cdk P A P P P A P P ciklin A P P P Cdk 5. ábra: A ciklin függõ protein kináz (Cdk) ciklinnel alkotott komplexe bizonyos fehérjéket foszforilez ATP felhasználása mellett. A katalitikus Cdk alegység (sárga) csak ciklin (kék) kapcsolódása esetén képes a szubsztrátfehérje (rózsaszín) foszforilezésére. 15

2. A sejtciklus A ciklineknek is több típusa ismeretes. Az elsõként felfedezett A és B-típusú ciklinek a mitózis szabályozásában játszanak szerepet (Evans et al., 1983). Az egyes ciklinek csak meghatározott Cdk alegységekkel lépnek kapcsolatba, és a különbözõ Cdk/ciklin komplexek eltérõ fehérjék foszforilezésére képesek és eltérõ sejtkompartmentekben találhatók (Nigg, 1995). Így például a B-típusú ciklinek Cdk1-gyel alkotott komplexe felelõs a magosztódás elindításáért minden eukarióta sejtben, ezért MPF-nek (M-phase Promoting Factor) nevezzük (Nurse, 1990). A ciklin és a Cdk kapcsolódásával kialakult aktív Cdk/ciklin komplex képes a sejtciklus egy bizonyos eseményének elindítására 6. Az esetek többségében a Cdk alegység koncentrációja nem vagy csak keveset változik a sejtciklus alatt. Ezzel szemben a ciklinek koncentrációja általában periodikusan változik a sejtciklus alatt, ezért is kapták a ciklizáló fehérje elnevezést 7. Mivel a ciklin kapcsolódása elengedhetetlenül szükséges a Cdk aktiválódásához, ezért a ciklin mennyiségének (koncentrációjának) szabályozásával a Cdk aktivitása befolyásolható. A ciklin fehérje koncentrációja pedig mind képzõdésének (szintézis), mind lebomlásának (degradáció) sebességével szabályozható. A sejtek tehát egyrészt a regulációs alegység (ciklin) koncentrációjának változtatásával tudják szabályozni az aktív Cdk/ciklin komplex koncentrációját (6. ábra). A Cdk aktivitása azonban nemcsak a ciklinek koncentrációján keresztül szabályozódik (6. ábra). A Cdk-k aktív centruma foszforilezhetõ treonin és tirozin oldalláncokat tartalmaz, melyek foszforilezése más protein-kinázok hatására gátolja a Cdk-t szubsztrátjainak (foszforilezendõ fehérje és ATP) megkötésében (Morgan, 1995). Az aktív centrum foszforilezett aminosavainak defoszforilezése protein foszfatáz hatására pedig aktiválja a Cdk/ciklin komplexet. Az Cdk/ciklin komplex átmeneti inaktiválása nemcsak a katalitikus alegység kovalens módosításával (foszforilezés) történhet, hanem gátló (inhibitor) fehérje kapcsolódásával is (6. ábra). Az utóbbi években felfedezett ún. ciklin dependens kináz inhibitorok (CKI) a Cdk/ciklin komplexhez történõ kapcsolódásukkal gátolják annak kináz aktivitását. 6 Tulajdonképpen a Cdk és a ciklin kapcsolódásának eredményeként még nem alakul ki az aktív dimer, mert ahhoz elõbb a Cdk alegység egy treonin oldalláncának foszforilezõdnie kell (Solomon, 1993). Tekintve azonban, hogy ez a foszforilezés nem szabályozott és nagyon gyorsan lejátszódik a komplex képzést követõen, ezért ennek figyelembevételétõl az egész dolgozatban eltekintek. Számos eredeti munkánkban (Novák & Tyson, 1993b; Novák & Tyson, 1995) található olyan modell, amelyben nem éltünk ezzel az egyszerûsítõ feltételezéssel. 7 Ma már ismerünk olyan ciklin fehérjéket is, melyek koncentrációja nem változik periódusosan a sejtciklus alatt, de szekvenciájuk hasonlóságot mutat a többi ciklin fehérjével (pl. Cln3 a sarjadzó élesztõben és Puc1 a hasadó élesztõben, valamint a D-típusú ciklinek emlõs sejtekben). Mivel ezeket a fehérjéket is ciklinnek nevezzük, ezért az eredeti nomenklatúrát kiterjesztették egy rokon szekvenciát mutató fehérjecsaládra, mely mind periódusos mind nem periódusos fehérjéket is tartalmaz (Hunt, 1991). 16

2. A sejtciklus aminosavak szintézis ciklin degradáció Cdk ciklin ATP P Cdk ciklin kináz foszfatáz Cdk ciklin ATP Cdk ciklin inaktív CKI ADP P CKI Cdk ciklin inaktív 6. ábra: A Cdk/ciklin komplex aktivitásának szabályozása. 2.2.2. Az Anafázis Serkentõ Komplex (APC) A mitózisos sejtciklus normális lejátszódásához a Cdk/ciklin komplexeken túlmenõen szükség van az Anafázis Serkentõ Komplex (APC) is (Irniger et al., 1995). A magosztódás alatt a két pólusról kiinduló mikrotubulusok által a kromoszómákra kifejtett húzóerõk kiegyenlítik egymást és a leánykromatidák nem válnak szét az összetartó ( ragasztó ) fehérjék következtében (Murray & Hunt, 1993). A leánykromatidák szétválását ezen összetartó fehérjék hirtelen lebontása váltja ki. E fehérje lebontását a proteoszóma végzi, ami ubikvitinezett (pontosabban poliubikvitinezett) fehérjéket ismer fel. Az ubikvitin fehérjékhez történõ kapcsolása egy három lépéses folyamat eredménye, melynek utolsó lépését a fehérjére specifikus ubikvitin ligáz végzi (Hershko, 1997). A leánykromatidákat összetartó ragasztófehérjéket ubikvitinezõ ligáz enzimkomplexet Anafázis Serkentõ Komplexnek (APC = Anaphase Promoting Complex) nevezzük, mivel aktiválódása a leánykromatidák szétválását (anafázis) váltja ki (Zachariae et al., 1996). Az APC egy nagyon bonyolult fehérjekomplex, amelynek komponenseit (alegységeit) eddig sarjadzó és hasadó élesztõn kívül, kagyló és humán sejtekben is jellemezték (ld. King et al., 1996). Ezek összehasonlító vizsgálata arra a korántsem meglepõ eredményre vezetett, hogy az APC komponensei is konzerváltak az evolúció során. 17

2. A sejtciklus 2.3. A DNS-replikáció két lépéses iniciációja Amint azt korábban láthattuk, az eukarióták mitózisos ciklusának sikere megköveteli, hogy a DNS-replikáció és a kromoszóma szegregáció felváltva következzenek be. Ebbõl a követelménybõl pedig egyenesen következik, hogy a DNS-replikáció kezdõpontjai két egymást követõ kromoszóma szegregáció között egyszer és csakis csak egyszer aktiválódhatnak. Milyen mechanizmus biztosítja az origók egyszeri aktiválódását? Az eukarióta DNS-replikáció szabályozására korábban kidolgozott licensing factor modellt (Blow & Laskey, 1988) az elmúlt években felváltotta az iniciáció két lépéses modellje (Wuarin & Nurse, 1996), aminek lényege a következõ. A replikációs origó aktiválódásának az alábbi két feltétele van (7. ábra): 1. Az origón kialakuljon egy ún. pre-replikációs komplex (prerc), ami tulajdonképpen engedélyt jelent egy elkövetkezõ replikációra, valamint 2. Cdk aktivitás hatására a replikáció elindul, és egyúttal a prerc-k poszt-replikációs komplexé (postrc) alakulnak. A modell legfontosabb állítása azonban, hogy a prerc-k kialakulását a Cdk aktivitás gátolja. A Cdk aktivitás tehát szükséges a replikáció megindulásához és a prerc postrc lépéshez, de gátolja a postrc-k visszaalakulását prerc-kké. Ebbõl következik, hogy a DNSreplikáció megindulásához a Cdk aktivitás szükséges ugyan, de nem elégséges. A replikáció iniciációját megelõzõen ugyanis a Cdk aktivitásnak le kell csökkennie, hogy a prerc-k kialakulhassanak (Stern & Nurse, 1996). Amikor pedig a Cdk aktivitás növekedésnek indul és kritikus értéket ér el, akkor a replikáció elindul az origók aktiválódása következtében. A Cdk aktivitás tehát gátolja a DNS-replikáció iniciációjának elsõ lépését, de serkenti a másodikat, ezért ez a mechanizmus a DNS komplett replikációját eredményezi, mert a Cdk aktivitás jelenlétében minden origó csak egyszer aktiválódik. A pre- és postrc-t nagyon sok fehérje alkotja (Rowles & Blow, 1997), de az itteni tárgyalás szempontjából csupán annak a fehérjének van jelentõsége, amely megkülön-bözteti ezeket a komplexeket. Ez az ún. engedély fehérje (licensing factor) ugyancsak konzervált az evolúció során: a sarjadzó élesztõben a Cdc6, míg a hasadó élesztõben Cdc18 fehérjék feleltethetõk meg az engedély fehérjének (Stillman, 1996). Mindkét fehérje gyorsan bomlik Cdk aktivitás jelentében, mert a Cdk hatására foszforilezõdnek (ld. Jallepalli & Kelly, 1997) és foszforilezett formáikat egy SCF-nek 8 nevezett komplex ubikvitinezi, majd pedig a proteoszóma által gyorsan lebomlanak. Cdk aktivitás hiányában viszont mindkét fehérje stabil. A Cdk aktivitás tehát az engedély fehérje degradációjával gátolja meg a DNS újrareplikálását. 8 Az SCF ubikvitin ligáz a sarjadzó élesztõben felfedezett komponenseirõl kapta a nevét: Skp1, Cdc53 és F-box fehérje (pl. Cdc4 és Grr1). Ez a komplex foszforilezett fehérjéket jelöl meg ubikvitinezéssel lebontás céljából (ld. Krek, 1998). 18

2. A sejtciklus prerc postrc P LF P P Origó LF P P P LF P P P Cdk Ciklin P - 7. ábra: A DNS replikáció két lépéses iniciációjának modellje. Az egyszerûség kedvéért csak egyetlen replikációs kezdõpont (origó) van feltüntetve. Az origó aktiválódását engedélyezõ fehérje (Licensing Factor = LF) csak Cdk aktivitás hiányában képes kapcsolódni az origóhoz, mert a Cdk/ciklin komplex foszforilezi és ennek következtében gyorsan lebomlik. A replikáció megindulása viszont Cdk aktivitás megjelenését igényli, mert a Cdk/ciklin komplex feltehetõen foszforilezi a replikációs apparátus egy vagy több fehérjéjét (ld. fekete kör). Ahhoz, hogy a sejtek a DNS-üket újrareplikálhassák, a Cdk aktivitásnak le kell csökkennie. Mivel az eukarióta sejtek DNS-üket csak kromoszóma szegregációt (amit az APC indít el) követõen replikálhatják újra, ezért a Cdk aktivitás csökkenés az APC aktiválódásának kell függvénye legyen. Ez a kapcsolat egyszerûen úgy valósul meg, hogy az APC a ragasztó fehérjékkel egyidejûleg ubikvitinezi a B-típusú ciklineket is (8. ábra), ezért az APC-t szokás cikloszómának is nevezni (Sudakin et al., 1995). A ragasztó fehérjék lebomlása a kromoszómák szegregációját eredményezi, míg a ciklinek lebomlása a DNS-replikáció Cdk általi gátlását oldja fel (Nasmyth, 1996b). A DNS replikációs origók állapota alapján az eukarióta sejtciklusnak két jellegzetes állapota különböztethetõ meg (Nasmyth, 1996b): 1. G1 állapot: a replikációs origókon prerc-k alakulnak ki, mert a Cdk aktivitás alacsony. 2. S/G2/M állapot: Cdk aktivitás hatására megindul a DNS-replikáció és a prerc-k postrc-kké alakulnak át. 19

3. A matematikai leírás szükségessége kromoszóma szegregáció APC szegregációs apparátushoz nem tapadt kromoszómák Cdk Ciklin ciklin lebontás Cdk 8. ábra: Az Anafázis Serkentõ Faktor (APC) kettõs szerepe a mitózisban. Az APC mind a kromoszómákat (piros vonalak) összetartó ragasztó fehérjéket (sárga vonalak), mind a mitózisos ciklineket (sárga ellipszoid) ubikvitinezi és ezáltal gyors lebontásra készteti. 20

3. A matematikai leírás szükségessége 3. A matematikai leírás szükségessége Mivel a sejtciklus különbözõ eseményeit általában különbözõ Cdk-k különbözõ ciklinekkel alkotott komplexei indítják el, ezért könnyû elképzelni, hogy egy igen komplex biokémiai reakciórendszerrõl van szó. A sejtciklust irányító biokémiai gépezet, tehát nem más mint Cdkk, ciklinek, CKI-k, valamint egyéb protein-kinázok és foszfatázok szövevényes hálózata. Ez a biokémiai gépezet nagyon hasonló a különbözõ fejlettségû eukarióta (valódi sejtmagvas) sejtekben, ami különös fontosságot ad megismerésének. Igaz, hogy a magasabbrendû sejtek szabályozó rendszere több komponenst használ az összetettebb feladatok megoldása érdekében, de a mechanizmus lényegében nagyon hasonló az egyszerûbb eukarióta sejtekéhez (pl. élesztõk). A sejtciklust szabályozó molekuláris hálózat bonyolultsága felveti a rész és egész problémájának kérdését. Nevezetesen egy ilyen komplikált reakciórendszer esetén miként lehet a részekbõl (molekulák) megjósolni az egész rendszer (a sejt) fiziológiai viselkedését. Ezen kérdés megválaszolásának pedig különös jelentõsége van, amikor ellenõrizni szeretnénk, hogy molekuláris ismereteink összhangban állnak-e az egész sejtet leíró fiziológiai kísérletek eredményeivel. 3.1. A reakciókinetika alkalmazhatósága A kémiában az ilyen és ehhez hasonló nehézségek feloldására jól bevált módszer van: a kémiai reakciókinetika módszere. Ennek lényege és alkalmazásának fõbb lépései a következõk: 1. a feltételezett reakciómechanizmus alapján sebességi egyenleteket kell felírni, vagyis egy differenciálegyenletet minden egyes kémiai komponens koncentrációjának idõbeli változási sebességére, 2. az egyenletek megoldásával kiszámolható a feltételezett mechanizmus várható viselkedése, 3. amit összevetve a kérdéses reakció kísérletes megfigyelésével, 4. a mechanizmus addig módosítandó, amíg a kísérletek és az elmélet között megfelelõ egyezést nem szolgáltat. Miért ne lehetne ezt a módszert a sejtciklust szabályozó reakcióhálózat mechanizmusá-nak felderítésében is alkalmazni? 1991-ben John Tyson professzorral (Virginia Polytechnic Institute and State University, Biológia Tanszék) közös munkába kezdtünk, amelynek célja az eukarióta sejtciklus matematikai modellezése a molekuláris biológiai ismeretek alapján a kémiai reakciókinetika módszerével. 21

3. A matematikai leírás szükségessége A biológiában azonban ez a megközelítés korántsem olyan elterjedt. Talán senki sem tagadja a sejtciklus modellezésének szükségességét, de a legtöbben azt túl korainak tartják, mondván még rengeteg molekuláris részletet nem ismerünk. Szerintünk a helyzet éppen fordított: a sejtciklus szabályozási rendszerrõl összegyûjtött ismereteink már most túllépték azt a mértéket, hogy a róluk történõ gondolkodásunkat egyszerûen intuícióink irányítsák. A probléma ugyanis igen hasonló egy olyan kirakós játékhoz ( puzzle ), amelynek a fedõképét nem ismerjük, és biztosak lehetünk abban is, hogy bizonyos darabok hiányoznak a dobozból, továbbá az egyes elemek összeillesztésére nem áll rendelkezésünkre egy sima felület. A reakciókinetika módszere asztallapként használható fel a sejtciklus puzzle kirakásában, mely azzal a további elõnnyel is jár, hogy a szabályozási rendszer dinamikai aspektusai is megjeleníthetõk. 22

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa 4. A primitív eukarióta sejt ciklusa Mint minden más komplikált biológiai folyamattal, így a sejtciklus szabályozásával kapcsolatban is felmerül a kérdés, hogyan alakulhatott ki egy ilyen komplikált szabályozó rendszer az evolúció során a sejtek szaporodásának irányítása érdekében? Más szavakkal fogalmazva, mi lehetett az a minimális szabályozó rendszer, amely eleget tesz az eukarióta sejtciklus követelményeinek. A kérdés megválaszolásához célszerû pontosan összefoglalni ezeket a követelményeket: 1. A kromoszómás ciklus (kromoszóma replikáció és szegregáció) összehangolt a citoplazma növekedésével. 2. A DNS-replikáció és kromoszóma szegregáció felváltva következnek be. 3. A kromoszóma szegregáció csak a kromoszómák teljes replikációját követõen és szegregációs apparátushoz történt tapadásukat követõen indul meg. Feltételezhetõ, hogy a legegyszerûbb, primitív eukariótának csupán egyetlen Cdk/ciklin komplexe volt (továbbiakban CDK) és ez a komplex valószínûleg a mai Cdk1/ciklin-B komplexhez (MPF) volt nagyon hasonló (Nasmyth, 1995; Stern & Nurse, 1996). Alátámasztja ezt a feltételezést, hogy a mitózis serkentõ Cdk1/ciklin-B komplex (MPF) mind a hasadó mind a sarjadzó élesztõben alkalmas a DNS-replikációhoz szükséges Cdk aktivitás biztosítására (Amon et al., 1994; Fisher & Nurse, 1996). Kim Nasmyth (1995) feltételezte, hogy a legegyszerûbb eukarióta sejtciklus szabályozó rendszer, amely eleget tesz a fenti követelményeknek, egyetlen CDK és az APC antagonisztikus kölcsönhatásán alapulhatott (9. ábra). Miként valósul meg a CDK és az APC antagonisztikus kölcsönhatása? Az APC nemcsak a kromoszómákat összetartó fehérjé(ke)t, hanem a ciklineket is megjelöli ubikvitines lebontás céljából (Holloway et al., 1993; Irniger et al., 1995). Mivel a ciklin lebontás eredményeként a Cdk elveszti az aktivitását, ezért az APC negatív hatást gyakorol a CDK-ra. De hogyan gyakorol a CDK negatív hatást az APC-re? Az APC nagyon sok különbözõ fehérjét ubikvitinez és ehhez különbözõ szubsztrátokat felismerõ fehérjékre van szüksége. A B-típusú ciklinek APC általi felismeréséhez sarjadzó élesztõben a Hct1-re (Homologue of Cdc twenty) van szükség (Schwab et al., 1997; Visintin et al., 1997). A homológ fehérjét hasadó élesztõben Srw1-nek illetve Ste9-nek (Kitamura et al., 1998; Sipiczki, 1988; Yamaguchi et al., 1997) nevezik. Ha ezeknek a ciklin felismerõ fehérjéknek az aktivitását a CDK foszforilezéssel gátolja, akkor megkapjuk a kívánt negatív hatást. Az ábrákon a továbbiakban az egyszerûség kedvéért az APC-t a ciklin felismerõ fehérjékkel együtt APCnek fogom jelölni. 23

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa replikáció prerc LF lebontja Cdk Ciklin hozzáadása - - APC inaktiválja LF lebontása szegregáció postrc 9. ábra: Az APC és a CDK versengése hozza létre a sejtciklus két alapvetõ állapotát. Az APC a ciklin komponens lebontása révén gátolja a CDK aktivitást, a CDK pedig valószínûleg az APC ciklin felismerõ fehérje-alegységének foszforilezésével gátolja az APC aktivitását. Ezen antagonisztikus hatások eredményeként alakulhat ki a sejtciklus két alternatív állapota, amiket az különböztet meg, hogy a replikációs origókhoz engedély fehérje (LF) kötõdik-e vagy sem. Ennek tükrében a CDK és az APC kölcsönhatása (10. ábra) két differenciálegyenlettel (DE) írható le (Novák et al., 1998b): d CDK dt = k 1. mass - [v 2 (1- APC) v 2. APC) ]. CDK (1a) d APC dt = (k 3 k 3. ACT) (1 - APC) J 3 1 - APC - (k 4 k 4. CDK) APC J 4 APC (1b) ahol CDK(t) a Cdk/ciklin komplexek (CDK) sejtmagbeli koncentrációját, az APC(t) pedig az APC aktív hányadát jelenti. k 1 a ciklinek szintézisének sebessége egységnyi citoplazma térfogatban, míg a mass a citoplazma tömegére (térfogatra) utal. Az ACT az APC-t a CDK-val szemben aktiváló enzimre utal, aminek aktivitását egyelõre konstansnak tekintjük. Feltételezzük, hogy a ciklinek a sejt citoplazmájában annak tömegével arányosan. szintetizálódnak (k 1 mass), gyorsan asszociálódnak a feleslegben lévõ Cdk alegységekkel és a Cdk/ciklin dimerek (CDK) gyorsan transzportálódnak a sejtmagba. A sejttömeg ilyetén történõ bevezetése a CDK DE-be a citoplazma növekedés és a kromoszómás ciklus összekapcsolását eredményezi (ld. késõbb). A CDK aktivitás ebben az egyszerû modellben csak az APC-függõ ciklin degradáció eredményeként csökken. A ciklin lebontás sebessége az 24

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa APC aktív (APC) és kevésbé aktív (1 - APC) formák közti megoszlásának függvénye (a két forma összkoncentrációját egységnyinek tételezzük fel). v 2 és v 2 a kevésbé aktív és az aktív forma aktivitására ( turnover szám) utal. Az APC aktiválódási és inaktiválódási sebességét Michaelis-Menten kinetikával írjuk le: k 3 és k 4 az ACT és a CDK maximális aktivitásaira utalnak, míg a k 3 és k 4 az aktiválás és az inaktiválás háttér enzimeinek V max értékeit fejezik ki, míg J 3 és J 4 a Michaelis állandók. inaktív APC APC aktív sejtmag Cdk lebontott ciklin Ciklin Cdk Cdk Ciklin Cdk asszociáció (gyors) Ciklin szintézis AS 10. ábra: Az APC -CDK antagonizmusa a primitív eukarióta sejtben. A ciklin alegységek a citoplazmában szintetizálódnak és a Cdk-val való kapcsolódás után gyorsan a sejtmagba (zöld kompartment) transzportálódnak. A sejtmagban az APC lebontja a Cdk/ciklin dimer ciklin alegységét és felszabadítja az inaktív katalitikus alegységet. Ez egészen addig tart, amíg a Cdk/ciklin komplex (CDK) a sejtmagban el nem ér egy kritikus koncentrációt, ami elégséges az APC inaktiválásához. A két DE tulajdonságai legegyszerûbben a fázissíkon tanulmányozhatók. A fázissíkon kitüntetett szerepe van az ún. egyensúlyi görbéknek, melyek mentén ellentétes irányú folyamatok sebességei éppen kiegyensúlyozzák egymást. A CDK egyensúlyi görbe: CDK = és az APC egyensúlyi görbe: k 1. mass v 2 (1 - APC) v 2. APC (2a) CDK = (k 3 k 3. ACT ) (1 - APC) k 4. APC. J 4 APC J 3 1 - APC - k 4 k 4 (2b) 25

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa tulajdonképpen nullklínák, melyek mentén az 1a-1b DE-k baloldala nullával egyenlõ. Az APC nullklína szigmoid alakú, a Cdk nullklína pedig egy hiperbola. A felhasznált paraméter értékeknél a két egyensúlyi görbe három steady state-ben is metszheti egymást (11. ábra). Ezek közül a két szélsõ steady state stabil (csomópont), a középsõ pedig instabil (nyeregpont). G1 stabil csomópont APC nyeregpont CDK S/M stabil csomópont 11. ábra: Az APC - CDK szabályozó fázissík diagramja. Az APC (piros) és a CDK (kék) nullklína három pontban (steady state) is metszhetik egymást. A bal felsõ steady state-ben az APC aktív és a CDK aktivitás alacsony (G1 állapot), míg a jobb alsó steady state-ben (S/M állapot) pedig éppen fordítva (APC inaktív és a CDK aktivitás nagy). A két stabil steady state a primitív sejtciklus két alapvetõ állapotát reprezentálja: 1. G1 állapot: alacsony Cdk és nagy APC aktivitás, amikor a prerc -k kialakulhatnak, 2. S/M állapot: nagy Cdk és alacsony APC aktivitás, amikor a DNS-replikáció és a kromoszómák magorsófonalakhoz való kapcsolódása történik. A modellben a sejttömeg ( mass ) egy bifurkációs paraméter, és emiatt a modell a méretkontroll tulajdonságával rendelkezik. A citoplazma tömegének (térfogatának) növekedésével a CDK egyensúlyi görbe felfelé mozdul el, aminek eredményeként az alacsony Cdk aktivitású steady state megszûnik (12. ábra). A kritikus méret felett pedig a nagy CDK aktivitású steady state az egyedüli állapot. Ez a nyereg-csomó bifurkáció a sejtciklus Start 26

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa eseményének felel meg. A Start esemény elõtt a G1 ellenõrzési mechanizmus egy stabil steady state-ben tartja az APC - CDK szabályozót. 1.2 inaktív aktív APC 0.8 G1 APC Cdk Ciklin APC 0.4 S/M 0.0 0.01 0.1 1 CDK CDK (sejtmagban) (nuclear) növekedés 12. ábra: A Start a primitív eukarióta sejtben. A sejtnövekedéssel párhuzamosan a CDK a sejtmagban akkumulálódik, ezért a CDK nullklína (kék) felfelé mozdul el (ld. szaggatott vonal), aminek következtében a G1 stabil steady state összeolvad a nyeregponttal és ezáltal megszûnik. A nagy CDK aktivitású S/M állapotból a kis CDK aktivitású állapotba az APC aktiválódásával jut a rendszer, amire a mitózis meta/anafázis határán kerül sor. Az APC mitózis alatti aktiválódásának molekuláris részletei azonban még nem tisztázottak (ld. Cohen- Fix & Koshland, 1997), ezért ennek leírására kidolgoztunk egy lehetséges mechanizmust (Novák et al., 1998b). Feltételezünk egy mitózis aktivátor fehérjét 9 (ACT), mely az APC aktiválására képes, valamint azt, hogy APC aktiváló hatásának kifejtéséhez az aktivátornak aktiválódnia kell (13. ábra). Könnyû belátni, hogy a ciklusos mûködés megkívánja, hogy az aktivátor összkoncentrációja (ACT T ) fluktuáljon a sejtciklus alatt (nagy legyen az értéke a mitózisnál és alacsony a Start-nál). Ennek érdekében feltételeztük, hogy az aktivátor inaktív formája folyamatosan szintetizálódik, lebomlása viszont APC függõ folyamat 10. Mindezek figyelembevételével az aktivátor dinamikája leírható az alábbi két DE-vel: 9 Ez az aktivátor a hasadó élesztõ Slp1 (Kim et al., 1998), a sarjadzó élesztõ Cdc20 (Hwang et al., 1998) és az ecetmuslica fizzy (Dawson et al., 1995), valamint az emlõs p55 CDC -nak felel meg (Weinstein, 1997). Tulajdonképpen ezek a fehérjék ugyancsak az APC szubsztrátfelismerõ fehérjéi, melyek a B-típusú ciklinektõl eltérõ APC szubsztrátok felismerését szolgálják. Feltehetõen ezen fehérjék által felismert egyik APC szubsztrát fehérje lebontása vezet a B-típusú ciklinek lebontását segítõ Hct1 (Srw1/Ste9) fehérjék aktiválódásához. 10 Egy alternatív megoldás, hogy az ACT szintézise CDK függõ, lebomlása viszont nem szabályozott (konstitutív) folyamat. 27

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa d ACT T dt = k as - [k ad (1 - APC) k ad. APC ]. ACT T (1c) d ACT dt = k aa (ACT T - ACT) - k. ai ACT - [k ad (1-APC) k ad. APC] ACT (1d) ahol ACT T = ACT apoact. k as apoact k ad magorsóhoz nem tapadt kromoszómák nem-replikált DNS k ai k aa degradált aktivátor inaktív APC k 3 k 4 ACT APC aktív k 1 Cdk Ciklin k 2 Cdk degradált ciklin 13. ábra: Az aktivátor (ACT) szerepe az APC - CDK szabályozóban. Az aktivátor (ACT) illetve pontosabban annak inaktív formája (apoact) folyamatosan szintetizálódik és lebontása APC függõ. Amíg a DNS replikáció be nem fejezõdött és a kromoszómák mindegyike nem tapadt a mitózisos orsóhoz, addig az ACT inaktiválási sebessége gyors, ezért nem képes aktiválódni. Az aktivátor molekulák megoszlása aktív (ACT) és inaktív (apoact) formák között a DNSreplikáció (k ais ) és a mitózisos ellenõrzési pont (k aim ) függvénye (k ai = k ais k aim ). Ha a sejtben nem replikált DNS vagy a kromoszómákon szabad mikrotubulus kötõhely (kinetokór) van jelen, akkor az aktivátor inaktiválási reakciója (k ai ) gyors és az egyensúly az inaktív forma irányába van eltolva. A fázissíkon jól bemutatható az aktivátor hatása (14. ábra). Ha a szabályozó rendszer az S/M állapotba jutott, akkor az aktivátor koncentrációja növekszik, mert az APC inaktív, és az aktívátor lassan bomlik. Elõször azonban az aktivátor molekulák inaktív formában akkumulálódnak, mert a k ai értéke nagy. Amikor a DNS replikálódott és a kromoszómák 28

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa kivétel nélkül a mitózisos orsóhoz tapadtak, akkor a k ai értéke leesik, és ezért az ACT aktív formájának koncentrációja gyorsan megnövekszik. Ez a hatás az APC egyensúlyi görbét jelentõs mértékben jobbra tolja el, mert megnövekszik az a kritikus CDK koncentráció mely az APC inaktiválásához szükséges. Láthatóan az S/M steady state (ismét nyereg-csomó bifurkációval) eltûnik, és a G1 steady state újraképzõdik. A szabályozási rendszer ennek megfelelõen a G1 steady state-be tart: az APC aktiválódik és a CDK aktivitás csökken. Ez a sejtciklus meta/anafázis átmenete és feltételezhetjük, hogy az APC aktiválódás hatására a sejt elosztódik (tömege felezõdik). 1.2 G1 apoact APC 0.8 0.4 APC inaktív ACT APC aktív S/M 0.0 0.01 0.1 1 CDK CDK (sejtmagban) (nuclear) 14. ábra: Az APC aktiválódása a meta/anafázis határán. Ha az APC, CDK, ACT T és ACT DE-ket (1a-1d egyenletek) kiegészítjük a sejtnövekedést leíró alábbi DE-vel: d mass dt = µ. mass (1e) akkor ezen öt DE (1a - 1e) numerikus megoldásával a primitív eukarióta sejtciklusa szimulálható (15. ábra) 11. A szimuláció jól mutatja, hogy a modell rendelkezik az eukarióta sejtciklus minden jellegzetes tulajdonságával: 1. A két osztódás között eltelt idõ azonos a sejttömeg duplázódás idejével (ln2/µ) és ez a megállapítás eltérõ növekedési sebességekre is érvényes. 2. A CDK aktivitás kis és nagy értékek között változik, mely lehetõvé teszi a DNS komplett replikációját, és a kromoszóma replikáció és szegregáció alternálását. 11 A szimulációval kapcsolatos további részletek (pl. paraméter értékek, valamint k ai idõbeli változása) megtalálhatók az eredeti publikációban (Novák et al., 1998b). 29

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa 2 sejttömeg 1 1.2 0.8 APC Cdk Ciklin 0.4 0.0 1.6 1.2 ACT T 0.8 0.4 0.0 ACT 0 40 80 120 160 200 240 Time (min) 15. ábra: A primitív APC-CDK szabályozó mechanizmus numerikus szimulációja. A szimulációval kapcsolatos technikai részleteket illetõen ld. Novák et al., (1998b). 30

4. A primitív eukarióta sejt ciklusa 4.1. Hiszterézis a primitív eukarióta sejtciklus modellben Könnyen bizonyítható, hogy a sejtciklus minimális szabályozó rendszere a hiszterézis tulajdonságával rendelkezik (Novák et al., 1998b). Ennek illusztrálására a sejttömegnek az aktivátor aktivitásához viszonyított arányát: mass k 3 k 3. ACT használhatjuk bifurkációs paraméterként. A 16. ábra az APC steady state értékeit mutatja a bifurkációs paraméter függvényében. A görbe felsõ és alsó ága a stabil csomópontokat, míg a középsõ ága instabil nyeregpontot reprezentál. A szaporodó sejtek ezen a hiszterézis körön forognak az óramutató járásával egyezõen. Az újszülött sejtek a felsõ ágon tartózkodnak és a sejtnövekedés következtében jobbra haladnak, amíg el nem érik a bifurkációs pontot. Ekkor egy nyereg-csomó bifurkáció eredményeként a G1 steady state megszûnik és az egyetlen stabil állapot az S/M steady state lesz (Start átmenet). Majd a sejtek mindaddig az alsó ágon maradnak, amíg a DNS teljesen nem replikálódik és a kromoszómák a mitózisos orsóhoz nem tapadnak. Ekkor az ACT aktiválódik (a nevezõ megnõ és a bifurkációs paraméter lecsökken) és a rendszer visszaugrik a felsõ ágra (meta/anafázis átmenet). 1 0.8 APC növekedés csomópont 0.6 APC 0.4 meta/ana nyeregpont Start 0.2 APC 0-0.2 csomópont DNS replikáció és kromoszóma-mikrotubulus kapcsolat 0 2 4 6 8 10 sejttömeg mass/activator/ aktivátor 16. ábra: Hiszterézis a primitív eukarióta modellben. 31