Analitikai módszerek a 20. század közepén és az ezredfordulón Módszer 1950 Ezredforduló Klasszikus módszerek Gravimetria, titrimetria (vizes közegben, indikátoros végpontjelzéssel) Titrimetria (vizes, nemvizes közegben, potenciometrikus végpontjelzéssel) Elektroanalitika Potenciometria, konduktometria, voltammetria, coulombmetria Ugyanez + ionszelektív elektródok, szenzorok, elektrokémiai felületvizsgáló módszerek Termoanalitika Termogravimetria, DTG DTG, DTA, DSC, kapcsolt módszerek Spektroszkópia UV (kolorimetria), fluorimetria UV (diódasoros detektor), fluorimetria IR, Raman (alapok) Fourier transzformációs IR és Raman MS (alapok) MS/(MS), változatos ionizációs technikák, széleskörű alkalmazás - NMR széleskörű alkalmazása, ESR Emissziós spektroszkópia, lángfotometria, atom-, eletron-spektroszkópia (alapok) Emissziós (ICP), atomabszorpciós, atomfluoreszcenciás, fotoelektronspektroszkópiás (PES, XPS, AES) módszerek Kromatográfiás és elektroforetikus elválasztási módszerek Papírkromatográfia, oszlopkromatográfia, gázkromatográfia (alapok), elektroforézis (alapok) Vékonyréteg- (TLC), nagyhatékonyságú folyadék- (HPLC), szuperkritikus folyadék- (SFC), kapilláris elektro- (CEC) kromatográfia, kapilláris- (CE), gél-elektroforézis, micelláris elektrokinetikus kromatográfia, stb. Kapcsolt módszerek - HPLC,CE,CEC,TLC,FIA/UV, GC(IR)/MS, HPLC,SFC,CE,CEC/MS, HPLC/NMR(MS), ICP/MS, stb. Röntgen módszerek Diffraktometria, emissziós és fluoreszcenciás módszerek (alapok) Por- és egykristály-diffraktometriás kristály és molekulaszerkezet vizsgálatok, felületanalitikai módszerek Magkémiai módszerek Aktivációs analízis, izotóphigításos módszerek Ugyanezek továbbfejlesztései, radioimmunoassay (RIA), Mössbauer spektroszkópia, pozitron alapú analitika Királis analitika Optikai forgatóképesség mérése, ORD-CD spektroszkópia (alapok) ORD-CD spektroszkópia, királis GC, HPLC, TLC, CE, SFC, CEC Immun-analitika - Radio-, enzim-, fluoreszcenciás immunoassay, ELISA, stb. Automatikus elemzés - Komputerizálás, automatizálás, robottechnika, kemometria
Gyógyszeralapanyagok tartalmi meghatározására használt analitikai módszerek metodika szerinti megoszlása az Európai és az US Gyógyszerkönyvekben [12] * Módszer Ph. Eur. 4 USP 27 HPLC 15.5% 44% GC 2% 2.5% Titrálás Sav-bázis Vizes közeg Indikátoros Potenciometrikus Nem-vizes közeg Indikátoros Potenciometrikus Redox (Jodometria, nitritometria, stb.) Egyéb (komplexometria, argentometria, stb.) UV-VIS spektrofotometria Saját fényelnyelés alapján Kémiai reakciókra alapozott kolorimetria 69.5% 57.5% 21% 6.5% 14.5% 36.5% 9.5% 27% 6.5% 5.5% 9.5% 8.5% 1% 40.5% 29.5% 5.5% 4.5% 1% 24% 14% 10% 5.5% 5.5% 8.5% 6.5% 2.0% Mikrobiologiai mérés (antibiotikumok) 3% 2.5% Egyéb (IR, NMR, polarimetria, fluorimetria, atomabszorpciós spectroszkópia, polarográfia, gravimetria, stb.) 0.5% 2% * Természetes és szintetikus szerves kismolekulák, szerves savak és bázisok sói. Nem tartalmazza a táblázat a szervetlen sókat, fehérjéket, enzimeket, egyéb makromolekulákat, radioaktív készítményeket, vérkészítmények, rekombináns DNS technológia termékeit és kiszerelési segédanyagokat.
Királis elválasztások Dr. Horváth Péter Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet
Természetes és félszintetikus 28 % Akirális 0,32 % Királis 27,68 % Racém 0,43 % Gyógyszeranyag 100 % Akirális 43,2 % Enantiomer tiszta 27,15 % Szintetikus 72 % Királis 28,8 % Racém 25,24 % Enantiomer tiszta 3,56 % EUTOMER -- DISZTOMER
A kiralitás megjelenési formái Centrális (C, N, S, P), A A D E B B E D Helikális Planáris Axiális, P M O 2 N CO 2 H HO 2 C NO 2
Tofisopam
Királis centrumok (elemek) száma = n; optikai izomerek száma= 2 n Minden királis centrum ellentétes konfigurációjú = ENANTIOMER Minden más esetben =DIASZTEREOMER (speciális eset: epimer, anomer) DIASZTEREOMEREK megkülönböztetése nem probléma (többnyire) ENANTIOMEREK megkülönböztetése csak királspecifikus módszerekkel Kiroptikai spektroszkópia (CD, ORD) Királis elválasztástechnika
Királis elválasztás mechanizmusa I. Kölcsönhatásokért felelős kötések: Ionos, H-híd, dipol, töltésátvitel (p-p), hidrofób,
Királis elválasztás mechanizmusa II. Konformációs szabadság konformációs igazodás Topográfiai tulajdonságok sztérikus illeszkedés A kötődést befolyásoló tényezők: oldószer hőmérséklet ph
ABS Hőmérséklet hatás Ketamin enantiomerek b-cd állófázison 20000 15000 25C (1,249) 20C (1,292) 15C (1,355) 10000 5000 0 15 20 25 Time (min)
Hőmérséklet hatás
Hőmérséklet hatás nebivolol (Nebilet) eltérő hatású enantioés diasztereomerek Chiralpack AD, etanol
Oldószer hatás
ph hatás
Királis elválasztási lehetőségek (Diasztereomer-párképzés homokirális reagenssel) I. On-line II. Pre-kromatográfiás I/a.) Állófázison -- normál fázisú -- fordított fázisú I/b.) Mozgófázissal Előzetes kémiai reakcióval Ideális esetben: (+)E; (-)E és (+)R Termékek: +E+R és E+R
R- és S-metilbenzilamin kámforszulfonsav-amid elválasztása fordított fázison
Példa: 80% -E és 20% +E enantiomer keverék 99% -R és 1% +R reagens -E (80%) +E (20%) -R (99%) -E-R (79,2%) +E-R (19,8%) +R (1%) -E+R (0,8%) +E+R(0,2%) Ebből enantiomer viszonyban van - E-R és +E+R összesen 79,4% -E+R és +E-R összesen 20,6%
Kromatográfiás módszerek és a tipikusan alkalmazott elválasztási lehetőségek Technika Állófázis Mozgófázis GC + - LC + + TLC ++ (+) CE - + GC: gázkromatográfia; LC: folyadékkromatográfia; TLC: vékonyréteg kromatográfia; CE: kapilláris elektroforézis;
Állófázisok típusai: biopolimerek: fehérjék, poli- és oligoszaharidok félszintetikus poli- és oligoszaharidok makrociklusus antibiotikumok szintetikus szelektorok - Pirkle típusú - korona éterek - aminosav származékok - szintetikus helikális polimerek
Poliszaharid állófázisok (fizikailag kötött) Cellulóz észterek: Amilóz karbamátok: triacetát (Chiracel OA) tris(3,5-dimetil-fenil karbamát) tribenzoát (Chiracel OB) (Chiralpak AD) tris(4-metilbenzoát) (Chiracel OJ) tris(1-feniletil karbamát) Cellulóz karbamátok: (Chiralpak AS) tris(fenil karbamát) (Chiracel OC) tris(3,5-dimetil-fenil karbamát) Ciracel (OD)
Makrociklusos glikopeptidek (antibiotikumok) tulajdonság vankomycin teicoplanin Mw 1449 1877 Sztereogén centr. 18 23 vankomycin Makrociklus 3 4 Cukor komponens 2 3 Aromás gyűrű 5 7 Hidroxil-csoport 9 15 Amid-csoport 7 7 Amin-csoport 2 1 ph tartomány 4-7 3,8-6,5 teicoplanin
Fehérjék fehérje Mw (kd) Szénhidrát tart% IEP ALBUMINOK HSA 66 0 4,7 BSA 65 0 4,7 GLUKOPROTEINEK AGP 41 45 2,7 Ovoglükoprotein 30 25 4,1 Avidin 66 7 10 ENZIMEK Cellobiohidroláz 64 6 3,9 Pepsin 34,6 0 <1
Chirex állófázisok (amid és urea) Kis molekulasúlyú szintetikus királis szelektorok Pirkle
Kis molekulasúlyú szintetikus királis szelektorok A: DNP-fenilglicin N-(3,5-dinitrobenzoil)-fenilglicin-amid B: Chy-Ro-Sine-A N-(3,5-dinitrobenzoil)-tyrozin-butilamid C: b-gem 1 N-(3,5-dinitrobenzoil)-3-amino-3-fenil-2- (1,1-dimetil-etil)-propanoát D: Whelk-O 1 1-N-(3,5-dinitrobenzamido)1,2,3,4- tetrahidrofenantrén E: ULMO N-(3,5-dinitrobenzoil)-1,2-difenil-1,2- diaminoetán
Ciklodextrin álló- és mozgófázisok
Néhány fontosabb ciklodextrin származék
Abs Abs Abs Abs C 18 ; MetOH-víz 20:80 bcd SF127_8 /2 SF127-8 /3 5 4 3 2 29,49667 H H H H N O O N N H H OH 3 2 1 1,58667 18,98 21,74333 1 1,53 0 0-1 -1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Time (min) -2 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) 5 4 3 31,78667 SF127-12 /1 H H N O 3 2 SF127-12 /3 2 1 1,50667 0 H H O N N H HO H 1 0-1 -1 0 10 20 30 40 Time (min) -2 0 5 10 15 20 25 30 Time (min)
CD CD UV UV 1000 500 BCD stationary phase S 40000 35000 0 30000-500 25000-1000 R RP18 stationary phase + BCD 20000 10 20 30 40 Time (min) 45000 500 0 40000-500 35000-1000 -1500 30000-2000 25000 0 5 10 15 20 Time (min)
Gentamicin izomerek forgatóképességi detektálása alapanyagokban és tejben Contaminated Milk Sample
A kettős detektáláson alapuló enantiomer meghatározás elve G c l c l A -100-150 -200-250 -300-350 3.0 2.5 2.0 1.5-400 Ellipticitás (bal) G (bal) 1.0-450 Abszorpció (jobb) 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 D-fenilglicin koncentráció (mmol/l) 200 150 100 50 G 0-50 -100-150 -200 0 20 40 60 80 100 c szenny G tiszta 2 G - G tiszta mért 100 D-phenylglycine concentration [%]
Oxazepam hemisuccinate a: S 78% b: S 40.9% c: R 37% d: R 76.8 % Hypersil CN hexan/methylen chlorid/ethanol/ach 50:50:1:0.5, 1 ml/min, 265 nm Bertucci, Andrisano, Cavrini, Castiglioni; Chirality 12 (2000) 84-92
A kettős detektálás egyéb felhasználási lehetőségei 150 30 20.a 0,3 100 20.b 24 18 CD [mdeg] (bal)) UV [AU] (jobb) 0,2 50 0 12 6 0,1-50 0 0,0-100 0 120 240 360 480 600 720 840 960-150 0 120 240 360 480 600 720 840 960 0,3 0,2 20.c UV detektor jel kodein jele a f elbontás után hidrokodon jele a f elbontás után 30 20 20.d CD detektor jel [mdeg] kodein jele a f elbontás után hidrokodon jele a f elbontás után 0,1 10 0,0 0 0 120 240 360 480 600 720 840 960 0 120 240 360 480 600 720 840 960 Time [sec]