EREDETI KÖZLEMÉNY A D-VITAMIN-RECEPTOR-GÉN BSMI-POLIMORFIZMUSÁNAK VIZSGÁLATA RHEUMATOID ARTHRITISBEN ÉS TÁRSULÓ OSTEOPOROSISBAN RASS PÉTER, PÁKOZDI ANGÉLA, LAKATOS PÉTER, SZABÓ ZOLTÁN, VÉGVÁRI ANIKÓ, SZÁNTÓ SÁNDOR, SZEGEDI GYULA, BAKÓ GYULA, SZEKANECZ ZOLTÁN Vitamin D receptor gene BsmI polymorphism in rheumatoid arthritis and associated osteoporosis Experimental data AIM: Rheumatoid arthritis (RA) is commonly associated with secondary osteoporosis.the BsmI polymorphism of the vitamin D receptor (VDR) gene has been implicated in the pathogenesis of osteoporosis. However, little data is available on the relationship between rheumatoid arthritis and the BsmI polymorphism. In this study, Hungarian frequencies of BsmI polymorphism genotypes were compared with those found in other countries. METHODS: In this study, 64 RA patients and 40 healthy controls were tested for VDR gene BsmI polymorphism genotypes.the frequencies of the B and b alleles were correlated with densitometric and laboratory markers of bone metabolism as well as with laboratory markers of arthritis. RESULTS: Among control subjects, the frequency of the BB genotype (27,5%) was relatively higher than in other European populations. In RA patients with secondary osteopenia/osteoporosis the BB genotype was rarer, while the bb was more common than in control subjects. Markers of bone metabolism showed that the presence of the B allele in RA patients was associated with a lower bone mineral density and an increased bone loss, while the bb genotype was associated with a higher bone mineral content. An increased osteoclast and osteoblast activity was observed in patients with the B allele, as determined by biochemical markers of bone metabolism. Rheumatoid factor titer, an important laboratory marker of disease progression in RA, was significantly higher in bb patients compared to patients carrying the B allele. CONCLUSION: Our data suggest that the imbalance in B and b allele expression may be involved in the pathogenesis of osteoporosis and perhaps of rheumatoid arthritis. Rheumatoid arthritis, osteoporosis, gene polymorphism, vitamin D receptor BEVEZETÉS Rheumatoid arthritisben gyakran szekunder osteoporosis alakul ki. Az osteoporosis patogenezisében felvetették a D-vitamin-receptor- (VDR-) gén BsmIpolimorfizmusának jelentõségét. A rheumatoid arthritis és a BsmI-polimorfizmus kapcsolatáról alig van adat. A szerzõk vizsgálatukban összevetették a különbözõ országok BsmIgenotípus-megoszlásának adatait az általuk vizsgált kontrollok értékeivel. MÓDSZEREK A vizsgálatban 64 rheumatoid arthritises betegnél és 40 egészséges kontrollszemélynél határozták meg a VDR-gén BsmI-polimorfizmusát. A genotípusokat összevetették a csontanyagcserére jellemzõ denzitometriás és laboratóriumi paraméterekkel, valamint az arthritisre utaló laboratóriumi markerekkel. EREDMÉNYEK A kontrollok között a homozigóta BB genotípus elõfordulása európai viszonylatban is nagyon magas (27,5%). Rheumatoid arthritises betegeknél (mindannyian osteopeniás/osteoporosisos betegek) a BB genotípus elõfordulása ritkább, a bb gyakoribb, mint a nem osteoporosisos, kontrollegyénekben. A csontanyagcsere indikátorai vizsgálatukban a B haplotípussal függtek össze. A B allél alacsonyabb csontsûrûséggel és fokozottabb csontvesztéssel járt. A bb genotípus magasabb csontásványianyag-tartalommal mutatott összefüggést. A csontanyagcsere markereinek vizsgálata során a szerzõk a B alléllel rendelkezõknél fokozott osteoclast- és osteoblastaktivitást figyeltek meg. A rheumafaktor titere, amely a rheumatoid arthritis lefolyását jellemzõ egyik fontos laboratóriumi marker, a b haplotípussal függött össze a vizsgálatban, a bb genotípusú betegeknél szignifikánsan magasabb titert mértek. KÖVETKEZTETÉSEK Mindezek alapján feltételezhetõ, hogy a bb/bb arány eltolódása szerepet játszhat az osteoporosis, illetve esetleg az arthritis kialakulásában. rheumatoid arthritis, osteoporosis, génpolimorfizmus, D-vitamin-receptor 23 É RKEZETT: 2002. JÚNIUS 4. CA É S C SONT 2002;5(1 2):23 30. ELFOGADVA: 2002. OKTÓBER 25.
DR. RASS PÉTER, DR. PÁKOZDI ANGÉLA, DR. SZABÓ ZOLTÁN, DR.VÉGVÁRI ANIKÓ, DR. SZÁNTÓ SÁNDOR, DR. SZEGEDI GYULA, DR. BAKÓ GYULA, DR. SZEKANECZ ZOLTÁN: Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Reumatológia Tanszék, Debrecen/University of Debrecen, Medical and Health Science Center, 3rd Department of Internal Medicine, Rheumatology Division; DR. LAKATOS PÉTER: Semmelweis Egyetem, ÁOK, I. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest/Semmelweis University, Faculty of Medicine, 1st Department of Internal Medicine, Budapest. Levelezési cím/correspondence: dr. Szekanecz Zoltán, DEOEC III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Reumatológia Tanszék, Debrecen, Móricz Zs. krt. 22. Tel.: (52) 311-087, fax: (52) 414-489, e-mail: szekanecz@iiibel.dote.hu R heumatoid arthritisben a betegek túlnyomó többségénél saját adataink szerint mintegy háromnegyedüknél elõbb-utóbb szekunder osteopenia vagy osteoporosis alakul ki (1 5). Mind a rheumatoid arthritis, mind az osteoporosis kialakulásában valószínûsíthetõ a genetikai faktorok szerepe. Feltételezik, hogy mindkét betegség patogenezisében szerepet játszik számos, fontos funkciójú génben kialakuló polimorfizmus. Rheumatoid arthritis esetén elsõsorban a citokinek génjeiben, a kemokinek, a tumorantigének, a regulálófehérjék génjeiben írtak le polimorfizmusokat (6 8). Az osteoporosis tekintetében a legtöbb adat a D-vitamin-receptor- (VDR-) gén polimorfizmusaira vonatkozik. Legismertebb a BsmI-polimorfizmus, ahol a restrikciós enzim hasítási képessége alapján B, illetve b alléleket különböztetünk meg. Emellett ismeretesek a TaqI-, ApaI- és FokIpolimorfizmusok is (9 12). Számos országban vizsgálják a VDR-gén polimorfizmusának összefüggését az osteoporosissal; az adatok igen ellentmondásosak. Egyes munkacsoportok köztük hazai kutatók összefüggést találtak a B allél és az alacsonyabb csontásványianyag-tartalom között (9 21), mások fordítva, a b allél vonatkozásában írtak le hasonló összefüggést (22, 23); egyes kutatók a VDR-gén BsmI-polimorfizmusa és a csontanyagcsere között semmilyen összefüggést sem találtak (24 27). A különbségekért valószínûleg geográfiai és populációgenetikai tényezõk tehetõk felelõssé, bár érdekes, hogy sok esetben egy országon belül is más-más kutatócsoportok eltérõ eredményeket kaptak (28 36). A rheumatoid arthritis és a VDR BsmI-polimorfizmusa tekintetében látszólag nem olyan egyértelmû összefüggést keresni. Pedig a D-vitamin és receptora szerepet játszhat a gyulladásos synovitis kialakulásában. Ismeretes, hogy a D-vitamint a monocyta/macrophagok is termelik, és a gyulladás során immunmoduláns hatásai vannak (37). A gyulladt synoviumban a macrophagok aktív D-vitamint termelnek, amelyet a synovialis fibroblastok szabályoznak. Ráadásul a synovialis macrophagok és fibroblastok, valamint a chondrocyták is expresszálnak VDR-t (38). A rheumatoid arthritis és a VDR-gén összefüggéseit kutató eddigi néhány vizsgálat negatív eredménnyel járt, azaz nem sikerült összefüggést kimutatni az alapbetegség és a génpolimorfizmus között (39, 40). Emiatt is végeztük el az alább bemutatandó vizsgálatokat. B ETEGEK ÉS MÓDSZEREK A vizsgálatba 64, a DEOEC III. Számú Belgyógyászati Klinika Reumatológia Tanszék gondozása alatt álló rheumatoid arthritises beteget és 40 egészséges önkéntest vontunk be. A rheumatoid arthritises betegek átlagéletkora 51,2±23,2 év, az egészségesek átlagéletkora 46,7±19,4 év volt. Minden beteg megfelelt az Amerikai Reuma Társaság 1987-ben felállított diagnosztikus kritériumainak (41). Egyik rheumatoid arthritises beteg vagy kontrollszemély sem szenvedett az osteoporosistól eltérõ csontanyagcserezavarban. A betegektõl önkéntes beleegyezési nyilatkozatot kértünk. A vizsgálat idején minden rheumatoid arthritises beteg esetében meghatároztuk a klinikai aktivitási markereket [EULAR core set: duzzadt és érzékeny ízületek száma, szubjektív fájdalomérzet a vizuális analóg skálán (VAS), a beteg, illetve az orvos globális megítélése a VAS szerint] és a laboratóriumi, aktivitást jelzõ paramétereket (We, CRP). Összefüggést kerestünk továbbá a reumafaktor titere mint a rheumatoid arthritis lefolyásának egyik laboratóriumi indikátora és a többi paraméter között is (42). A CSONTANYAGCSERE VIZSGÁLATA Jelen vizsgálat elõtt minden betegnél csontdenzitometriás vizsgálatot végeztünk a DEOEC Nõi Klinikán mûködõ Lunar-DPX-L DEXA készülékkel; meghatároztuk a lumbalis 2 4. csigolyák területén a BMD-értéket és a T- score-t. A vizsgálatba bevont 64 beteg mindegyike osteopeniás vagy osteoporosisos volt (T-score < 1) (43). A betegek 70%-a szedett rendszeresen antiporotikumot. A csontanyagcserére jellemzõ laboratóriumi vizsgálatok közül a kalciumürítést a hazánkban Lakatos és munka- 24 R ASS PÉTER: A D-VITAMIN-RECEPTOR-GÉN BSMI-POLIMORFIZMUSA RHEUMATOID ARTHRITISBEN
társai által validált paraméter, a reggeli vizelet kalcium/kreatinin hányadosa alapján határoztuk meg (44). Minden betegnél meghatároztuk a szérumkalcium- és -foszforszintet is. A csontbiokémiai markereket illetõen a csontképzést tükrözõ markerek közül a szérumoszteokalcint (Novocalcin, Metra), a reszorpció indikátorai közül a vizelet-dpyd-keresztkötést (Pyrilinks-D, Metra) határoztuk meg (ELISA módszerrel), valamint a DPYD/ kreatinin hányadost. Emellett minden beteg esetében megmértük a szérum TNF-α- és IL-1-szintjét, ELISA módszerrel (Biosource mindkét esetben). A vizsgált paraméterek normálértékeit az 1. táblázat tartalmazza. A GÉNPOLIMORFIZMUS VIZSGÁLATA A génpolimorfizmust korábban már közölt módszerrel határoztuk meg (9, 10). A folyamat elsõ lépésében a betegektõl levett vérmintákból, Promega Wizard kit használatával, DNS-t izoláltunk. Az izolálást a minták centrifugálásával kezdtük, 5 percig 3000/perc fordulatszámon. A felülúszó eltávolítása után a jól látható fehérvérsejtréteget pipettával Eppendorf-csövekbe helyeztük. Ehhez a fehérvérsejtréteghez 900 µl sejtlizáló oldatot kevertünk, 10 percig állni hagytuk, majd újabb fél percig centrifugáltuk, ezúttal 13 000/perc fordulatszámmal. Ezáltal a fehérvérsejteket még jobban megtisztítottuk a lizált vörösvértesteket tartalmazó rétegtõl, amit el is távolítottunk. 1. táblázat. A vizsgált klinikai és laboratóriumi paraméterek normálértékei Paraméter Normális tartomány A rheumatoid arthritis aktivitási markerei Duzzadt ízületek száma (n) 0 28* Érzékeny ízületek száma (n) 0 28* Fájdalom-VAS (cm) 0 10* Globális VAS (cm) 0 10* We (mm/h) < 10 CRP (g/l) < 3,3 Reumafaktor-titer (kitevõ: 2 n ) < 5** Csontdenzitometria BMD (g/cm 2 ) korfüggõ T-score (SD) < 1 Biokémiai markerek Szérumoszteokalcin (ng/ml) 3,7 10 Vizelet DPYD/kreatinin (nm/mm) 3 7,4 Vizelet kalcium/kreatinin (mm/mm) < 0,93 Citokinek Szérum-TNF-α (pg/ml) < 15 Szérum-IL-1 (pg/ml) < 15 * A rheumatoid arthritis klinikai aktivitási paraméterei esetében nem a normális, hanem a mérési tartomány szerepel ** A reumafaktor esetében az ábrázolhatóság érdekében a 2 kitevõjét tüntettük fel (1:32 = 1:2 5 ) A megmaradt fehérvérsejtréteghez 400 µl maglizáló oldatot adtunk, majd alapos elkeverés után 4 µl ribonukleázt kevertünk. Az elegyet 37,3 C-on 15 percig inkubáltuk, majd állni hagytuk, amíg szobahõmérsékletûre hûlt. Ekkor hozzáadtunk 100 µl proteinprecipitációs oldatot, elõbb fél percig vortex segítségével kevertük, majd 4-5 percig centrifugáltuk. Eppendorf-csõbe 350 ml izopropanololdatot mértünk ki, és hozzáadtuk az elõbb lecentrifugázott mintából leszívott felülúszót. Óvatos rázogatás hatására a DNS kicsapódott. Ez után a mintából óvatosan felszívott DNS-t 70%-os etanolhoz mértük és egy percig centrifugáltuk, majd eltávolítottuk a felül elhelyezkedõ etanolréteget. A mintát 100 µl TE-pufferrel (DNA dehydration solution) elegyítettük, egy napig szobahõmérsékleten állni hagytuk, majd 20 C-on tároltuk. Az izolált DNS-eket PCR, azaz polimeráz láncreakció segítségével amplifikáltuk (Hybaid Thermal Cycler). A láncreakció lényege az, hogy két megfelelõ oligonukleotid primer jelenlétében az eredeti DNS-szekvencia egy része megsokszorozható. Ehhez egy kettõs szálú DNS-target, egy DNS-polimeráz (Taq) és két olyan oligonukleotid primer szükséges, amelyek a DNS két különbözõ szálával hibridizálnak úgy, hogy a 3 végük egymással szembenéz. A PCR lépései a következõk: a kettõs szálú DNS denaturálása hõkezeléssel 95 C-on; két komplementer oligonukleotid hibridizálása az egyes DNS-szálakhoz úgy, hogy az egyikük az egyik, másikuk a másik szálhoz kötõdjön. A kapcsolat stabilizálásához az elegyet le kell hûteni 62 C-ra, illetve az oligonukleotidokat nagy feleslegben kell alkalmazni; új DNS-szálak szintézise dntp- és DNS-polimeráz segítségével. Majd a ciklusok ismétlése többször. A reakciót e két primer felhasználásával végeztük el: 5 CAA CCA AGA CTA CAA GTA CCG CGT CAG TGA 3 (sense) és 5 AAC CAG CGG GAA GAG GTC AAG GG 3 (antisense). A reakcióhoz két keveréket készítettünk el. Az elsõ elegy 20,6 µl desztillált vizet, 4 µl PCR-puffert, 4 µl MgCl 2 -t, 1 µl dtnp-keveréket, 0,2 µl primer 1 -oldatot, 0,2 µl primer 2 -oldatot tartalmazott. Keverés után ezt az elegyet 10 µl izolált DNS-sel összemértük, belehelyeztük a PCR-készülékbe, és 3 percig 95 C-on kezeltük, majd a gép 85 C-on tartotta a mintát. Ezalatt elkészítettük a második oldatot is, amelybe 7,6 µl desztillált vizet, 1 µl PCR-puffert, 1 µl MgCl 2 -t és 0,4 µl Promega Taq-polimerázt mértünk. A már 85 C-on lévõ elsõ oldat és DNS-keverékhez hozzáadtuk a második oldatot is. Ez úgynevezett hot start módszer, amikor a hatékonyabb mûködés érdekében az elõinkubált mintákhoz adjuk hozzá a polimerázt. Ezután a PCR-reakció lépései a következõk: Fél perc 95 C-on, 1 perc 72 C-on és még egy perc 25 C A ÉS CSONT 2002;5(1 2):23 30.
72 C-on. Ezt a ciklust ötször ismételtük meg úgy, hogy ciklusonként 2 C-kal csökkentettük a hõmérsékletet, 72 C-ról 64 C-ig. Fél perc 95 C-on, fél perc 62 C-on és 1 perc 72 Con. Ezt a ciklust harmincszor ismételtük. Fél perc 95 C-on, 1 perc 62 C-on és 2 perc 72 C-on. Ezt a ciklust ötször ismételtük. 10 perc 72 C-on, majd a felhasználásig 4 C-on tartottuk a mintákat. Az így amplifikált termékeket 20 Con tároltuk. E PCR-reakció segítségével a betegek vérébõl kinyert fehérvérsejtek DNS-tartalma megsokszorozódott, így a további vizsgálatokat elvégezhettük rajta. A PCR-terméket restrikciós enzimmel, a BsmI enzimmel emésztettük. Ehhez 20 µl PCR-termékhez 2,5 µl puffert, 1,5 µl desztillált vizet és 1 µl BsmI enzimet (Promega) adtunk, majd 65 Con 3-4 órán keresztül inkubáltuk. Ezután a mintát agarózgélen futtattuk, ahol a minta elmozdulása a kiindulási ponthoz viszonyítva a tömegétõl függött: a kisebb tömegû minta távolabbra futott, mint a nagyobb tömegû. A gél elkészítéséhez 1 g agarózhoz adtuk a 10 ml TBE-puffer és 40 ml desztillált víz keverékét. Az agarózgél tartalmazott ezenkívül még 3 µl Cybergreen DNS-festéket, amely UV fényben zöld színnel jelzi a minták helyét a gélen. Az agarózgélt megszáradás után TBEpufferrel töltöttük fel. Az emésztett PCR-termék 10 µléhez 1,1 µl nyomjelzõ (load dye) festéket adtunk. A mintát (mintákat) a gélen kialakított vájatokba pipettáztuk és 110 V-tal 30-40 percig futtattuk Hybaid PS3000P elektroforézis-készülékben. A futtatás végeztével a gélt egy Multiimage Light Cabinet-ben UV fényben értékeltük Alpha Imager 1220 analizátor (Alpha Innotech Co.) segítségével. Egy reprezentatív minta fényképe látható az 1. ábrán. Amennyiben az enzim nem hasított a PCR-termékben, egy nagyobb tömegû termék maradt, amely a legkevésbé futott a kiindulási ponthoz képest, ez a B allél. Ahol az enzim rendelkezett restrikciós hellyel, ott az enzim hasítása következtében egy rövidebb és egy hosszabb bázispárnyi szakasz keletkezett, amelyek kisebb tömegüknél fogva nagyobb távolságot futottak. Ez a két DNS-szakasz felel meg a b allélnak. Ennek megfelelõen ha egy, lassan futó csíkot látunk, akkor BB, ha egy, gyorsan futó csíkot, akkor bb, ha összesen három csíkot látunk, akkor Bb a genotípus. S TATISZTIKAI ELEMZÉS 1. ábra. VDR-gén BsmI-polimorfizmusa, reprezentatív minta. A világító sávok a különbözõ alléloknak felelnek meg. Jobb szélen a marker futása látható Minden vizsgált paraméter esetében meghatároztuk az átlagértéket és az átlagszórást (standard error of mean, SEM). A rheumatoid arthritises és a kontrollcsoport között az egyes genotípusok (BB, Bb és bb) gyakoriságát χ 2 - próbával elemeztük. Az egyes klinikai és laboratóriumi markerek és a genotípusok közti összefüggéseket varianciaanalízissel (ANOVA) hasonlítottuk össze. Két-két genotípus összehasonlítását (BB versus Bb, BB versus bb és Bb versus bb) kétmintás t-próbával hasonlítottuk össze. Mindehhez SPSS v7.0 szoftvert használtunk. A szignifikanciaszint mindenhol p < 0,05 volt. E REDMÉNYEK A vizsgált betegek és egészséges személyek eloszlása a VDR-gén BsmI-genotípusának megfelelõen a 2. táblázatban látható. A kontrollegyéneknél a BB genotípus aránya tendenciájában magasabb volt mintegy 27,5%, míg rheumatoid arthritises betegeknél ez 20,3%-nak bizonyult. A rheumatoid arthritises betegeknél a bb genotípus aránya volt magasabb (39,1%) a kontrollokhoz képest (32,5%). Egyik esetben sem tapasztaltunk szignifikáns különbséget. A heterozigóták genotípus-eloszlásában nem észleltünk lényeges különbséget a kontrollok és a betegek között (40,0%, illetve 40,6%). Ha saját adatainkat összevetjük az irodalomból ismert 2. táblázat. A VDR-gén BsmI-polimorfizmusának genotípus szerinti eloszlása Rheumatoid Kontroll Szignifikancia arthritis (n=40) (n=64) BB 20,3% (n=13) 27,5% (n=11) NS Bb 40,6% (n=26) 40,0% (n=16) NS Bb 39,1% (n=25) 32,5% (n=13) NS NS: nem szignifikáns 26 R ASS PÉTER: A D-VITAMIN-RECEPTOR-GÉN BSMI-POLIMORFIZMUSA RHEUMATOID ARTHRITISBEN
3. táblázat. A VDR-gén BsmI-polimorfizmusának földrajzi eloszlása saját adatokkal* BB (%) Bb (%) Bb (%) Kína 0,4 6,6 93 Japán 1,1 19,3 79,6 Korea 1,4 12,9 85,7 Dánia 23 49 28 Finnország 16 34,5 49,5 Szlovénia 18,6 57,8 23,6 Brazília 12,8 45,7 41,5 Magyarország (9) 25,6 42,2 32,2 Saját adatok: kontrollcsoport 27,5 40,0 32,5 rheumatoid arthritises betegek 20,3 40,6 39,1 * Az adott országban leggyakoribb genotípus dõlttel van szedve p<0,05 vs. Bb 2. ábra. A csont ásványianyag-tartalma (BMD) BB, Bb és bb genotípusú betegekben * Szignifikáns különbség a bb csoportban a Bb csoporthoz képest (p<0,05). nemzetközi és más hazai adatokkal (3. táblázat), akkor látható, hogy saját eredményeink szerint az egyes genotípusoknak megfelelõ megoszlás a hazai és az európai megoszlásnak felel meg. Ezek szerint mindkét vizsgálati csoportban a Bb heterozigóták aránya a legnagyobb, és a kontrolloknál nagyjából hasonló a BB és bb homozigóták aránya. Ezzel szemben a rheumatoid arthritises betegeknél eltolódás tapasztalható, a bb gyakoribbá, a BB ritkábbá válik. A következõkben, csupán a rheumatoid arthritises betegeket tekintve, az egyes genotípus-alcsoportok összehasonlító vizsgálatának eredményeit mutatjuk be. A vizsgálat idején meghatározott csontsûrûség (BMD) tekintetében a BB (0,84±0,11 g/cm 2 ) és a Bb (0,82±0,07 g/ cm 2 ) genotípusúaknál a BMD alacsonyabb volt, mint a bb genotípusúak esetében (0,91±0,17 g/cm 2 ). A különbség a Bb és bb genotípusúak között szignifikáns volt (p<0,05). A B allélre homozigóta és a heterozigóta egyének csontsûrûsége között jelentõs különbséget nem találtunk (2. ábra). A vizeletben mért DPYD-ürítés kreatininre normalizált értéke (DPYD/kreatinin) magasabb volt a BB (9,34±1,53 nm/mm) és a Bb genotípusúaknál (11,74±1,26 nm/mm), mint a bb csoportban (6,81±0,83 nm/mm). A különbség a Bb és bb csoportok között statisztikailag szignifikáns volt (p<0,05) (3. ábra). A vizelet deoxipiridinolin-ürítése az I. típusú kollagén degradációjának, azaz a csont reszorpciójának markere, az osteoclastaktivitást jellemzi. A B alléllel rendelkezõk körében ez a hányados szignifikánsan magasabb volt, mint a b allélre homozigóta egyének esetén, tehát a B alléllal rendelkezõkben fokozott osteoclastaktivitás és ennek következtében fokozott csontvesztés mutatkozott. A vizelettel ürített kalcium mértéke ugyancsak a csontreszorpció jelzõje. A vizelet kalcium/kreatinin hányadosa a BB homozigótákban szignifikánsan magasabb p<0,05 vs. Bb 3. ábra. Vizelet DPYD/kreatinin ürítés BB, Bb és bb genotípusú betegeknél * Szignifikáns különbség a bb csoportban a Bb csoporthoz képest (p<0,05). volt (0,61±0,10 mm/mm), mint a Bb (0,37±0,06 mm/mm) és a bb genotípusúaknál (0,38±0,03 mm/mm) (p<0,05) (4. ábra). Ez a kalcium/kreatinin hányados tehát ismét a B allélt hordozókban volt magasabb. A szérum oszteokalcinszintje az osteoblastaktivitás jó markere, a csontképzés indikátora. Az összoszteokalcinkoncentráció a szérumban a BB genotípusú betegeknél igaz nem szignifikánsan emelkedett volt (11,1± 0,9 ng/ml) a Bb (8,5±0,6 ng/ml) és bb genotípusú betegekhez képest (8,4±0,6 ng/ml) (5. ábra). A B allél hordozása tehát magasabb oszteokalcinszintekkel járt együtt. A csontanyagcsere markerei után a rheumatoid arthritisre, a betegség klinikai aktivitására elsõsorban jellemzõ paraméterekkel kerestünk összefüggéseket. A reumafaktor-titer a rheumatoid arthritis lefolyásának egyik laboratóriumi markere. Amennyiben a felezõ 27 C A ÉS CSONT 2002;5(1 2):23 30.
4. ábra. Vizelet kalcium/kreatinin ürítés BB, Bb és bb genotípusú betegeknél * Szignifikáns különbség a BB csoportban, a Bb és bb csoporthoz képest (p<0,05). 6. ábra. A rheumatoid faktor titere BB, Bb és bb genotípusú betegeknél. Az Y tengelyen a hígítást a 2 hatványaként, a kitevõ ábrázolásával demonstráltuk * Szignifikáns különbség a BB csoportban, a Bb csoporthoz képest (p<0,05). találtunk szignifikáns különbségeket a kontrollcsoporton belül az egyes genotípusok esetén (nem ábrázolt adatok). M EGBESZÉLÉS 5. ábra. Szérumoszteokalcin-szintek BB, Bb és bb genotípusú betegeknél hígításnak megfelelõen a titert a 2 hatványaként ábrázoljuk (2 n ), látható, hogy a legkisebb reumafaktor-titert, azaz a legalacsonyabb reumafaktor-koncentrációt a BB csoportban észleltük (4,1±0,6). Ez alacsonyabb volt, mint a Bb (6,1±0,9) vagy a bb csoportban (6,3±0,7). A különbség a BB és Bb csoport között bizonyult statisztikailag szignifikánsnak (p<0,05). Az elõzõekkel ellentétben tehát itt a b allél hordozása jelentett magasabb reumafaktor-titert (6. ábra). Az egyéb, rheumatoid arthritisre jellemzõ paraméterek tekintetében (We, CRP, szérum TNF-α, IL-1) nem találtunk értékelhetõ különbségeket (nem ábrázolt adatok). A kontrollcsoportban is megpróbáltunk összefüggéseket keresni a BB, Bb, illetve bb genotípus, valamint a csontanyagcsere paraméterei között. Ezekben az esetekben azonban a BMD mindenkinél normális volt, és ehhez alacsony szérumoszteokalcin-szint, valamint DPYD- és kalciumürítés társult. Semmilyen vonatkozásban nem A rheumatoid arthritis és az osteoporosis is krónikus, a populációban viszonylagosan gyakori megbetegedések, amelyek következményeik, szövõdményeik alapján a betegre és a társadalomra egyaránt komoly terhet rónak (42, 45). A két betegség társulása nyilvánvalóan még nagyobb gondot jelent. Mind az irodalmi adatok, mind saját vizsgálataink szerint a rheumatoid arthritises betegek 70 80%- ánál osteopenia vagy osteoporosis alakul ki (1 4). Mindezek alapján nem véletlen, hogy számos munkacsoport vizsgálja a rheumatoid arthritis, illetve az osteoporosis patogenezisében szerepet játszó tényezõket, beleértve a genetikai faktorokat is. A rheumatoid arthritis kialakulásában a HLAasszociáció mellett non-hla-gének is szerepet játszanak. Utóbbiak közül a VDR-gén polimorfizmusaira, ezen belül a BsmI-polimorfizmusra vonatkozóan alig található adat. Két közlemény született, amelyekben nem találtak összefüggést a VDR-gén BsmI-, TaqI- és ApaI-polimorfizmusa, valamint az ízületi eróziók számát jelzõ Sharp-index, illetve a rheumatoid arthritissel szembeni fogékonyság között (39, 40). Ezzel szemben számos közlemény született a világ minden tájáról, amelyekben osteoporosisban a BsmI- és más VDR-gén-polimorfizmusok szerepét tárgyalják. Ezen publikációkból az szûrhetõ le, hogy jelentõs geográfiai különbségek vannak a BB, Bb és bb genotípusok megoszlásában (3. táblázat). Ezen túlmenõen, mint láttuk, egyes kuta- 28 R ASS PÉTER: A D-VITAMIN-RECEPTOR-GÉN BSMI-POLIMORFIZMUSA RHEUMATOID ARTHRITISBEN
tók egyöntetûen állítják, hogy a B allélt hordozók hajlamosabbak csontvesztésre, míg mások nem találtak ilyen öszszefüggéseket. Sokszor még egy országon belül is ellentmondóak az adatok, mint azt már említettük. Jelen vizsgálatunkban 64, rheumatoid arthritises betegbõl, illetve 40 egészséges kontrollból álló két populációban határoztuk meg a VDR-gén BsmI-genotípusainak megoszlását. Az európai, észak-amerikai és a korlátozott számban elérhetõ hazai adatokhoz hasonlóan bár eredményeink nem mutattak szignifikáns különbségeket a tendenciákat tekintve egészségeseknél a Bb genotípus volt a leggyakoribb (40%), ennél ritkább a BB (27,5%) és bb (32,5%) elõfordulása. Hazai vizsgálatokban mások is hasonló eloszlásokat tapasztaltak (2, 31). Ezzel szemben a rheumatoid arthritises betegeknél gyakorlatilag változatlan Bb-gyakoriság mellett (40,6%) a BB genotípus elõfordulásának csökkenését (20,3%) és a bb frekvenciájának növekedését (39,1%) figyelhettük meg. Véleményünk szerint ez önmagában is felhívja a figyelmet a b allél valószínû jelentõségére rheumatoid arthritisben. Tekintettel arra, hogy a rheumatoid arthritis és a VDR BsmI-polimorfizmusa kapcsolatára vonatkozóan két közleményt találtunk, amelyek negatív eredményt hoztak az összefüggések tekintetében, eredményeinket nem tudtuk másokéval összevetni (39, 40). A rheumatoid arthritises betegcsoportban megpróbáltunk összefüggéseket keresni a BsmI-genotípusok, illetve számos, a csontanyagcserére, az alapbetegség aktivitására, progresszivitására vonatkozó paraméter között. Sok esetben nehéz különválasztani, hogy mely változásokért felelõs maga a rheumatoid arthritis, és melyekért az osteoporosis. A rheumatoid arthritis klinikai és laboratóriumi aktivitási markerei egyértelmûen az alapbetegséget tükrözik, viszont a vizelettel ürülõ DPYD-keresztkötés mennyisége a generalizált osteoporosis mellett az ízületben zajló, a gyulladás következtében kialakuló lokális csontreszorpciónak is indikátora (3 5, 46, 47). A BMD, a szérumoszteokalcin azonban egyértelmûen inkább a csontanyagcserét fémjelzik. A rheumatoid arthritises betegpopuláción belül a BB és Bb genotípust hordozók esetében alacsonyabb BMDértékeket találtunk, mint a bb csoportban. Bár, mint láttuk, a rheumatoid arthritis és a BsmI-polimorfizmus kapcsolatára nincs adat, a hazai, európai és észak-amerikai, osteoporosisra vonatkozó adatok ugyancsak ezt az összefüggést támasztják alá, döntõen a lumbalis gerincre vonatkozóan (9, 10, 13, 16, 20, 29, 30, 48, 49). Igaz, több európai munkacsoport (24, 28, 31, 33, 35), számos ázsiai (23, 26), dél-amerikai (32, 36) és ausztrál vizsgáló (25) nem talált hasonló összefüggéseket. Rheumatoid arthritisben egyedül a VDR-gén TaqI-polimorfizmusát vizsgálták; az osteoporosisban igazoltan fokozott csontvesztéssel járó t allél esetében igazolták az összefüggést a rheumatoidarthritis-asszociált csontvesztés mértéke és a t allél frekvenciája között (48). A csontépítés, így az osteoblastfunkció egyik legjobb indikátora a szérumoszteokalcin-koncentráció (50, 51). Munkacsoportunk a BB genotípusúak körében emelkedett szérumoszteokalcin-szintet talált a Bb és bb csoportokhoz képest. Korábban rheumatoidarthritis-asszociált osteoporosisban általánosságban emelkedett szérumoszteokalcinszinteket találtunk (5). Az osteoporosis vizsgálatakor Kucsera és munkatársai is emelkedett szérumoszteokalcin-szinteket mértek a BB homozigótákban (10). Japán szerzõk is fokozott oszteokalcintermelést találtak a B allélhez asszociáltan (21). Szlovéniában viszont a bb genotípust hordozóknál észleltek magasabb oszteokalcinszintet, igaz, etidronátkezelés mellett, ami befolyásolhatta az eredményeket (16). A csontreszorpció, így az osteoclastaktivitás markereire rátérve, a BB és Bb csoportokban nagyobb DPYD-ürítést észleltünk a bb genotípusúakhoz képest. Magunk és más szerzõk is fokozott DPYD-ürítést írtak le rheumatoid arthritishez társuló osteoporosisban (5, 48, 52 54). A BsmI-polimorfizmussal és a DPYD-ürítéssel kapcsolatban irodalmi adatok híján ugyancsak nem tudunk összehasonlítást végezni. A vizelettel történõ kalciumürítés is reszorpciós markernek tekinthetõ. Vizsgálatunkban a BB genotípust hordozók fokozott kalciumürítést mutattak, a Bb és bb csoportokhoz viszonyítva. Összességében mindhárom érték a normális határok között mozog, így hypercalciuriáról nem beszélhetünk. Figyelemre méltó azonban a BB homozigóták viszonylag fokozott kalciumürítése. A rheumatoid arthritis klinikai és laboratóriumi aktivitási markereit tekintve végképp nem találtunk irodalmi vonatkozásokat. Az általunk vizsgált paraméterek közül egyedül a rheumatoid arthritis egyik prognosztikai markereként számon tartott reumafaktor-titer esetében találtunk szignifikáns összefüggéseket. A titert a 2 hatványaként kifejezve és a kitevõt figyelembe véve magasabb reumafaktor-titert találtunk a Bb és bb csoportokban, mint a BB csoportban. Laboratóriumunkban az 1:32 hígítás (5. kitevõ) a normális felsõ határa, így csak a bb csoport esetében volt kórosan magas a reumafaktortiter. Adataink tehát arra utalnak, hogy rheumatoid arthritisben az elsõdlegesen a csontanyagcserét jelzõ paraméterek (BMD, szérum-oc, vizelet DPYD/kreatinin, vizelet kalcium/kreatinin) növekedése inkább a B, míg a rheumatoid arthritis patogenezisére, progresszivitására jellemzõ indikátor (reumafaktor-titer) inkább a b allélt tartalmazó genotípusokkal mutatnak összefüggést. Utóbbi esetben a b allél összefüggései további vizsgálatokat igényelnek. Ezen koncepció pontosabb igazolásához további, nagyobb betegcsoporton végzett vizsgálatok szükségesek. 29 C A ÉS CSONT 2002;5(1 2):23 30.
Köszönetnyilvánítás A munka az ETT 314/96, ETT 60/2001 és FKFP 18/2000 pályázatok támogatásával valósult meg. A csontmarkerek és gyulladásos mediátorok laboratóriumi méréséért a III. Számú Belgyógyászati Klinika Regionális Immunológiai Laboratórium dolgozóinak, a DEXA-mérésekért a DEOEC Nõi Klinika oszteodenzitometriás laboratórium dolgozóinak mondunk köszönetet. Köszönettel tartozunk Hodosi Katalinnak a statisztikai elemzésért és dr. Semsei Imrének a molekuláris biológiai technikákban nyújtott szakmai segítségéért. IRODALOM 1. Cortet B, Flipo RM, Blanckaert F. Evaluation of bone mineral density in patients with rheumatoid arthritis, influence of disease activity and glucocorticoid therapy. Rev Rheum Eng Ed 1997;64:451-8. 2. Henderson NK, Sambrook PN. Relationship between osteoporosis and arthritis and effect of corticosteroid and other drugs on bone. Curr Opin Rheumatol 1996;8:365-9. 3. Szekanecz Z, Elek I, Bettembuk P, Szegedi Gy. Szekunder osteoporosis rheumatoid arthritisben. Magyar Belorv Arch 1998;51:267-71. 4. Szekanecz Z, Elek I, Szegedi Gy. Rheumatoid arthritishez társuló osteoporosis: irodalmi áttekintés. Ca és Csont 1998;1:45-51. 5. Szekanecz Z, Szántó S, Szabó Z, Kovács I, Kulcsár A, Lakos G, et al. Biokémiai és gyulladásos markerek vizsgálata rheumatoid arthritishez társuló osteopeniában és osteoporosisban. Ca és Csont 2000;3:62-71. 6. Field M. Tumour necrosis factor polymorphisms in rheumatic diseases. QJM 2001;94: 237-46. 7. Vamvakopoulos J. Interleukin 1 gene polymorphisms. Ann Rheum Dis 2001;60:718-9. 8. Wollheim FA. Approaches to rheumatoid arthritis in 2000. Curr Opin Rheumatol 2001;13:193-201. 9. Bori Z, Speer G,Takács I, Nagy Z, Horvath C, Lakatos P. Interactive effect of vitamin D and estradiol receptor genotypes as a determinant of bone mineral density. J Bone Miner Res 1999;14(Suppl1):333. 10. Kucsera M,Takács I, Nagy Z, Speer G, Bori Z, Demeter J, et al. A D-vitamin-receptor génjének polimorfizmusa és a szérum alulkarboxilált oszteokalcinszintjének összefüggése. Ca és Csont 1999;2:54-8. 11. Lakatos P. D-vitamin. In: A kalciumháztartás és a csontszövet anyagcsere-betegségei (Lakatos P, ed.). Budapest: Medicina; 1999. p. 98-104. 12. Lakatos P. D-hormon: a legújabb adatok. Ca és Csont 1998;1:S5-S10. 13. Ferrari S, Rizzoli R, Chevalley T, Slosman D, Eisman JA, Bonjour JP. Vitamin-D-receptor-gene polymorphisms and change in lumbar-spine bone mineral density. Lancet 1995;345:423-4. 14. Kobayashi T, Sugimoto T, Kobayashi A, Chihara K.Vitamin D receptor genotype is associated with cortical bone loss in Japanese patients with primary hyperparathyroidism. Endocr J 1998;45:123-5. 15. Krall EA, Parry P, Lichter JB, Dawson-Hughes B. Vitamin D receptor alleles and rates of bone loss: influences of years since menopause and calcium intake. J Bone Miner Res 1995;10:978-84. 16. Marc J, Prezelj J, Komel R, Kocijancic A. Association of vitamin D receptor gene polymorphism with bone mineral density in Slovenian postmenopausal women. Gynecol Endocrinol 2000;14:60-64. 17. McClure L, Eccleshall TR, Gross C, Villa ML, Lin N, Ramaswamy V, et al. Vitamin D receptor polymorphisms, bone mineral density, and bone metabolism in postmenopausal Mexican-American women. J Bone Miner Res 1997;12:234-40. 18. Murakami F, Hagino H, Shimomura T, Ikawa S, Hirano Y, Iijima K, et al. Association of bone mineral density with vitamin D receptor gene polymorphism-changes in radial bone mineral density with long-term follow-up: longitudinal study. Rinsho Byori 1998;46:766-73. 19. Riggs BL, Nguyen TV, Melton LJ 3 rd, Morrison NA, O Fallon WM, Kelly PJ, et al. The contribution of vitamin D receptor gene alleles to the determination of bone mineral density in normal and osteoporotic women. J Bone Miner Res 1995;10:991-6. 20. Sigurdsson G, Magnusdottir DN, Kristinsson JO, Kristjansson K, Olafsson I. Association of BsmI vitamin-d receptor gene polymorphism with combined bone mass in spine and proximal femur in Icelandic women. J Intern Med 1997;241:501-5. 21. Tokita A, Matsumoto H, Morrison NA,Tawa T, Miura Y, Fukamauchi K, et al. Vitamin D receptor alleles, bone mineral density and turnover in premenopausal Japanese women. J Bone Miner Res 1996;11:1003-9. 22. Houston LA, Grant SF, Reid DM, Ralston SH. Vitamin D receptor polymorphism, bone mineral density, and osteoporotic vertebral fracture: studies in a UK population. Bone 1996;18:249-52. 23. Zhao J, Zhou X, Meng X, Liu G, Xing X, Liu H, et al. Polymorphisms of vitamin D receptor gene and its association with bone mineral density and osteocalcin in Chinese. Chin Med J (Engl) 1997;110:366-71. 24. Garnero P, Borel O, Sornay-Rendu E, Arlot ME, Delmas PD. Vitamin D receptor gene polymorphisms are not related to bone turnover, rate of bone loss, and bone mass in postmenopausal women: the OFELY Study. J Bone Miner Res 1996;11:827-34. 25. Ho YV, Briganti EM, Duan Y, Buchanan R, Hall S, Seeman E. Polymorphism of the vitamin D receptor gene and corticosteroid-related osteoporosis. Osteoporos Int 1999;9:134-8. 26. Tsai KS, Hsu SH, Cheng WC, Chen CK, Chieng PU, Pan WH. Bone mineral density and bone markers in relation to vitamin D receptor gene polymorphisms in Chinese men and women. Bone 1996;19:513-8. 27. Vandevyver C, Wylin T, Cassiman JJ, Raus J, Geusens P. Influence of the vitamin D receptor gene alleles on bone mineral density in postmenopausal and osteoporotic women. J Bone Miner Res 1997;12:241-7. 28. Fontova Garrofe R, Gutierrez Fornes C, Broch Montane M, Aguilar Crespillo C, Pujol del Pozo A, Vendrell Ortega J, et al. Polymorphism of the gene for vitamin D receptor, bone mass, and bone turnover in women with postmenopausal osteoporosis. Rev Clin Esp 2000;200:198-202. 29. Gennari L, Becherini L, Masi L, Mansani R, Gonnelli S, Cepollaro C, et al. Vitamin D and estrogen receptor allelic variants in Italian postmenopausal women: evidence of multiple gene contribution to bone mineral density. J Clin Endocrinol Metab 1998;83:939-44. 30. Gomez C, Naves ML, Barrios Y, Diaz JB, Fernandez JL, Salido E, et al. Vitamin D receptor gene polymorphisms, bone mass, bone loss and prevalence of vertebral fracture: differences in postmenopausal women and men. Osteoporos Int 1999;10:175-82. 31. Hansen TS, Abrahamsen B, Henriksen FL, Hermann AP, Jensen LB, Horder M, et al. Vitamin D receptor alleles do not predict bone mineral density or bone loss in Danish perimenopausal women. Bone 1998;22:571-5. 32. Hauache OM, Lazaretti-Castro M, Andreoni S, Gimeno SG, Brandao C, Ramalho AC, et al. Vitamin D receptor gene polymorphism: correlation with bone mineral density in a Brazilian population with insulin-dependent diabetes mellitus. Osteoporos Int 1998;8:204-210. 33. Jorgensen HL, Scholler J, Sand JC, Bjuring M, Hassager C, Christiansen C. Relation of common allelic variation at vitamin D receptor locus to bone mineral density and postmenopausal bone loss: cross sectional and longitudinal population study. BMJ 1996;313:586-90. 34. Langdahl BL, Gravholt CH, Brixen K, Eriksen EF. Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and bone mass, bone turnover and osteoporotic fractures. Eur J Clin Invest 2000;30:608-17. 35. Poggi M, Aterini S, Nicastro L, Chiarugi V, Ruggiero M, Pacini S, et al. Lack of association between body weight, bone mineral density and vitamin D receptor gene polymorphism in normal and osteoporotic women. Dis Markers 1999;15:221-7. 36. Ramalho AC, Lazaretti-Castro M, Hauache O, Kasamatsu T, Brandao C, Reis AF, et al. Fractures of the proximal femur: correlation with vitamin D receptor gene polymorphism. Braz J Med Biol Res 1998;31:921-7. 37. Casteels K, Bouillon R, Waer M, Mathieu C. Immunomodulatory effects of 1,25- dihydroxyvitamin D 3. Curr Opin Nephrol Hypertens 1995;4:313-9. 38. Tetlow LC, Smith SJ, Mawer EB,Woolley DE. Vitamin D receptors in the rheumatoid lesion. Ann Rheum Dis 1999;58:118-21. 39. Garcia-Lozano JR, Gonzalez-Escribano MF, Valenzuela A, Garcia A, Nunez-Roldan A. Association of vitamin D receptor genotypes with early onset rheumatoid arthritis. Eur J Immunogenet 2001;28:89-93. 40. Lee CK, Hong JS, Cho YS,Yoo B, Kim GS, Moon HB. Lack of relationship between vitamin D receptor polymorphism and bone erosion in rheumatoid arthritis. J Korean Med Sci 2001;16:188-92. 41. Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988;31:315-24. 42. Harris ED. Rheumatoid arthritis. Philadelphia: WB Saunders; 1997. 43. Horváth Cs. Oszteodenzitometria. In: A kalciumháztartás és a csontszövet anyagcserebetegségei (Lakatos P, ed.). Budapest: Medicina; 1999. p. 208-29. 44. Lakatos P, Takács I, Büki B. A kalciumürítés vizsgálata. Multicentrikus tanulmány. Orv Hetil 1997;138:1405-9. 45. Surányi P. A rheumatoid arthritis klinikai képe. In: Reumatológia (Gömör B ed). Budapest: Medicina; 2001. p. 147-52. 46. Horowitz MC. Cytokines and estrogen in bone. Science 1993;260:626-8. 47. Manolagas SC, Jilka RL. Bone marrow, cytokines and bone remodelling. N Engl J Med 1995;332:305-11. 48. Gough A, Sambrook P, Devlin J, Lilley J, Huisoon A, Betteridge J, et al. Effect of vitamin D receptor gene alleles on bone loss in early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1998;25: 864-8. 49. Viitanen A, Karkkainen M, Laitinen K, Lamberg-Allardt C, Kainulainen K, et al. Common polymorphism of the vitamin D receptor gene is associated with variation of peak bone mass in young finns. Calcif Tissue Int 1996;59:231-4. 50. Christenson RH. Biochemical markers of bone metabolism: an overview. Clin Biochem 1997;30:573-93. 51. Lakatos P. A csontanyagcsere egyéb biokémiai markerei. In: A kalciumháztartás és a csontszövet anyagcsere-betegségei (Lakatos P, ed.). Budapest: Medicina; 1999. p. 167-73. 52. Hall GM, Spector TD, Delmas PD. Markers of bone metabolism in postmenopausal women with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1995;38:902-6. 53. Spector TD, James IT, Hall GM. Increased levels of urinary collagen crosslinks in females with rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol 1993;12:240-44. 54. St. Clair EW, Moak SA, Wilkinson WE. A cross-sectional analysis of 5 different markers of collagen degradation in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1998;25:1472-9. 30 R ASS PÉTER: A D-VITAMIN-RECEPTOR-GÉN BSMI-POLIMORFIZMUSA RHEUMATOID ARTHRITISBEN