DNS munka a gyakorlatban 2012.10.12. Természetvédelmi genetika
Munka fázisok DNS kivonás elektroforézis (fakultatív lépés) PCR Elektroforézis Szekvenálás Szekvencia elemzés faji azonosítás; variabilitás, heterozigócia, filogenetika
DNS kivonás menete 1. szövet roncsolás 2. sejtfeltárás 3. további lépések módszer függőek Fotó: Velekei Balázs Fotó: Velekei Balázs
Vér minta Mintavétel szakértelmet és körültekintést igényel Gyorsan feldolgozható (előny) Invazív eljárás (hátrány)
Izom szövet Könnyen és eredményesen feldolgozható Hosszú ideig tartó fagyasztás után is jó eredményt ad
Májszövet Könnyen és eredményesen feldolgozható Alkalmazása: elsősorban vadászható fajoknál
Szőr, toll Genomiális DNS: szőrhagyma, tollszár mtdns: akár szőrhagyma nélküli részekből is Emésztési idő és hőmérséklet sarkalatos pont
Nagy zsírtartalmú szövetek Feltárásuk nehezebb: erősebb detergensek (guanidium, szodium citrát) használata alacsony hőmérséklet (4 C) toxikus, szerves oldószerek (fenol:kloroform:izoamilalk ohol)
DNS kivonás rovarokból Probléma: Heterogén csoport Kis méretű minta Eltérő szklerotinizáltság Eltérő zsírtest tartalom Paraziták és parazitoidok
Gombák, Növények Vastag sejtfal Polifenolok Poliszaharidok
Kis méretű, alacsony DNS tartalmú minták Megnövelt emésztési idő Alacsonyabb hőmérséklet Fotó: Helga Schöps
Mintavétel védett élőlényekből Élőlény csoportonként eltérő metodika Nem-invazív eljárások támogatottak Fotó: Velekei Balázs
Védett élőlények Példa: a farkos kétéltűek esetében elfogadott módszer a farokvég néhány mm-es darabjának lemetszése Alternatív megoldás: hám kaparék steril mintavevő pálcikával Fotó: Velekei Balázs
DNS kivonás módszerei 1. Ki sózáson alapuló módszerek 2. Anion-cserélő gyanták (AIX) és társaik 3. Mágneses elválasztás 4. Charge Switch technology 5. Direct Kit-ek
Ki sózáson alapuló módszerek eltérő módon csapják ki a DNS-t és a szennyező anyagokat 1. Kaotrópok: a makromolekulák térszerkezetét rongálják, így növelik a víz oldékonyságukat ("salting in") pl. guanidiumizotiocianát 2. Kozmotrópok: stabilizálják a térszerkezetet, ezáltal csökkentik az oldékonyságot ("salting out") pl. K-acetát Erélyes szerves oldószereket használnak
Anion-cserélő gyanták (AIX) és társaik Nukleinsavak nagyméretű negatív töltéssel rendelkező molekulák), ezért pozitív töltésű adszorbenshez kötődik Ált. kaotropok segítik a szilikához, hidroxiapatithoz kötődést Gyors, kényelmes, Hatékonyság : erősen módszer függő Fosszilis mintákból is!!! Előre gyártott Kit-ek
Charge Switch technology ph-tól függően változtatják a töltésüket (alacsony ph-n pozitív, 8,5 ph n semleges, 6,5-ös ph n köti meg a DNS-t vagy RNS-t) DNS és RNS tisztítására is alkalmas 100%-ig vizes alapú eljárás, nem használ szerves oldószereket Plate, Eppendorf cső belsejére bevonatként felvihető Felesleges szennyeződéseket egy egyszerű mosási lépéssel távolítjuk el Megj.: kis DNS tartalmú minták esetén hatékony, pl. ásatag csontokból
Mágneses elválasztás DNS és RNS a mágnesgyöngyhöz köthető Gyakran a szilika alapú elválasztást kombinálják mágneses mikrogyöngyökkel Megj.: nagy tisztaságú DNS-t eredményez
DNS-kivonás: Kit használatával Fotó: Velekei Balázs Fotó: Velekei Balázs Fotó: Velekei Balázs Fotó: Velekei Balázs
DNS kivonás lépései módszerenként Kisózáson alapuló módszerek szövet roncsolás sejtfeltárás fehérjék kicsapása, és a DNS dehidratálása DNS tartalmú csapadék mosása a tisztított DNS rehidratálása Anion-cserélő gyanták (AIX) és társaik szövetroncsolás sejt feltárás Adszorpció, a DNS adszorbenshez kötése mosás leoldás az adszorbensről
Szövetroncsolás Mechanikai eljárások Fagyasztva törés (folyékony nitrogénnel) Dörzs mozsár gyöngy malmok Kézihomogenizátorok, Potter-féle homogenizátorok
Sejt feltárás 1. Membrán detergensekkel (SDS, Triton X-100) 2. Fehérje bontó enzimekkel (proteináz- K) 3. A kettőt kombinálva Fontos: Megfelelő ph biztosítása puffer oldatokkal (EDTA, TRIS)
Hibaforrások Kis térfogatokkal történő gyakori pipettázás gyakori vortexelés fenol nehézfémek Tökéletlen sejtfeltárás -> nukleázok Nem megfelelő ph (ph- 6,00-9,00; ált. 8,6) UV fény Mintában visszamaradó EtOH (elektroforézisnél, PCR-nél)
Elektroforézis Töltéssel rendelkező molekulák elektromos térben vándorolnak Hogyan? Láthatóvá tétel: EtBr + UV : toxikus!!! Fluoreszcens festékek + gerjesztés
Polymerase Chain Reaction kezdeti denaturációs lépés 2 perc 94 C denaturálás 30 másodperc 94 C annealing 1 perc 47 C polimerizáció 1 perc 30 sec 72 C utolsó polimerizációs lépés 10 perc 72 C 34 ciklus.
PCR
PCR Recept: mit mérjünk össze? végtérfogat 25 H2O 10.875 Puffer oldat 5 MgCl2 1.5 dntps (10mM) 0.5 F (10µM) primer 2.5 R (10µM) primer 2.5 Taq DNA polimeráz 0.125 DNA 2
Szekvenálás Sanger-féle (1977) metódus (Hagyományos) Lézerrel gerjesztik a festékeket
Adatanalízis /szoftverek Lásd. élőben
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!